CN109750055B - 基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法；首先设计携带非天然氨基酸的把手H‑tag，其次构建含有H‑tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，再次表达纯化在H‑tag中含有非天然氨基酸的融合重组蛋白，最后对融合蛋白H‑tag中非天然氨基酸和核酸底物上的耦合基团进行高效点击化学连接。本方法使用α螺旋把手为非天然氨基酸提供可控的蛋白表面反应条件，避免待测蛋白表面复杂的结构、电荷和极性纳米环境，从而实现对蛋白与核酸进行高效点击化学连接等目标。
Description
技术领域
本发明属于药物化学生物学领域，尤其是涉及一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法。
背景技术
目前生物耦合是研究生物大分子相互作用的重要工具，对于深刻理解大分子在细胞生命活动中的功能和药物在调节大分子生物活性的动态机制中具有重大意义，已经成为药物、化学和生物学交叉领域的前沿方向。生物耦合可以发生在蛋白与蛋白、蛋白与核酸、核酸与核酸、以及药物与蛋白核酸之间。常用的生物耦合反应有点击化学、二硫键和马来酰亚胺反应等。参与蛋白耦合的天然氨基酸的基团有氨基、羧基和巯基等。天然氨基酸的修饰基团位点多，总体反应活性高，易于进行生物耦合；但是缺点是位点选择特异性低，无法进行定点修饰。生物正交技术允许细胞使用翻译机器在蛋白中定点引入非天然氨基酸。这突破了天然氨基酸生物耦合基团的选择局限性，极大的丰富了修饰基团库。虽然蛋白的任一位置可通过定点遗传突变引入非天然氨基酸，但是蛋白表面的纳米环境复杂，导致难以预测非天然氨基酸耦合基团的反应活性。影响非天然氨基酸耦合基团反应活性的主要因素包括引入位点的溶剂暴露程度、氨基酸自身和周围电荷水平、以及临近氨基酸基团的极性特征等。通过非天然氨基酸进行蛋白耦合，需要经历复杂的突变位点优化选择程序，并且面临蛋白耦合效率低下的困境。此外，蛋白与核酸的生物耦合对于研究蛋白与核酸的相互作用至关重要。因此，开发一种携带非天然氨基酸引入位点的通用把手，用于对蛋白和核酸进行高效生物耦合，是非常必要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，用于优化设计蛋白耦合基团位置，特别是基于耦合反应的生物大分子相互作用探测。
本发明采用的技术方案是：基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，使用连接多肽将α螺旋把手与蛋白的末端进行连接，利用扩展遗传编码将非天然氨基酸插入α螺旋把手的特定位点，通过点击化学，实现了蛋白与核酸的高效生物耦合。
具体步骤为：
步骤一基于蛋白二级结构α螺旋，设计携带非天然氨基酸的把手H-tag，通过多肽与待测蛋白的一个末端连接；
步骤二通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成非天然氨基酸密码子，通过原核表达载体构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，转入感受态细胞后筛选获得稳定遗传的克隆菌株；
步骤三将含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒和能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转化获得原核表达菌株，在培养基中添加非天然氨基酸，使用诱导剂诱导表达融合了H-tag的待测蛋白；
步骤四裂解诱导表达后的原核表达菌株细胞，借助重组蛋白的亲和标签，纯化获得H-tag-待测蛋白的可溶蛋白；
步骤五通过点击化学对H-tag-待测蛋白和核酸底物上的耦合基团进行高效连接，使用凝胶电泳检测反应效率。
优选地，非天然氨基酸为非天然氨基酸耦合叠氮基团，具体为叠氮苯丙氨酸。
优选地，点击化学为张力驱动的叠氮-炔基环化反应。
优选地，步骤一中H-tag长度大于5个氨基酸，设计在待测蛋白的氨基端或羧基端；
优选地，连接多肽长度大于8个氨基酸；
优选地，非天然氨基酸在H-tag序列中的优选位置满足在电中性，极性氨基酸环境和氨基酸数值相对溶剂可及性为2-3的条件。
优选地，步骤二中原核表达载体为pET系列载体；
优选地，非天然氨基酸密码子为琥珀密码子；
优选地，含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒的构建能够通过依赖于连接的克隆方法或无缝克隆方法。
优选地，步骤三中培养基含有5％甘油和1mM非天然氨基酸；
优选地，诱导剂使用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；
优选地，诱导表达时间优选12-20h，优选为16h；
优选地，能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒中的正交对编码基因可以是单拷贝或多拷贝。
优选地，步骤四中在蛋白酶抑制剂作用下裂解细胞，蛋白酶抑制剂优选苯甲基磺酰氟，浓度为0.1-1mM；
优选地，亲和标签为六聚组氨酸或谷胱甘肽巯基转移酶；
优选地，裂解细胞采用超声破碎仪，功率设置为200W，循环开4秒关6秒，总时间设置为25-40min；
优选地，使用层析技术纯化蛋白，优选为亲和层析，具体为金属螯合亲和层析或复合使用离子交换层析。
优选地，步骤五中核酸底物上的耦合基团为聚乙二醇二苯基环辛炔基团；
优选地，融合蛋白和核酸底物的摩尔比为1:2.5-5，优选为1:5；
优选地，反应温度为12℃，反应时间为24h；
优选地，凝胶电泳为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺的浓度为12％(v/v)，凝胶厚度为0.75mm，电压200V，电泳时间45min。
一种用于连接蛋白和核酸的α螺旋把手，α螺旋把手的特定位点含有非天然氨基酸；
优选地，所述非天然氨基酸为叠氮苯丙氨酸；
优选地，所述核酸连接有耦合基团，优选为聚乙二醇二苯基环辛炔基团；
优选地，所述α螺旋把手与待测蛋白通过连接多肽连接。
本发明具有的优点和积极效果是：该方法使用α螺旋把手为非天然氨基酸提供可控的蛋白表面反应条件，避免待测蛋白表面复杂的结构、电荷和极性纳米环境，从而实现对蛋白与核酸进行高效点击化学连接等目标。
附图说明
图1：基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法操作流程；
图2：H-tag-PfAMA1-pET-21d重组表达质粒图谱；
图3：携带tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒pEvol-pAzFRS.1.t1图谱；
图4：实施例1中H-tag融合蛋白结构示意图；
图5：实施例1中待测蛋白PfAMA1三维结构图；
图6：实施例1中DBCO修饰的单链核酸结构；
图7：实施例1中张力驱动的叠氮-炔基环化反应示意图；
图8：实施例1中十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的一个实施例做出说明。实施例中未标注具体条件的实验方案，皆按照常规方案或产品说明书中所建议的反应条件。实施例中的通用设备、材料和试剂等，如无特指，皆可从商业购买。
设计蛋白点击化学耦合把手的原则是为非天然氨基酸提供反应活性最高的锚点，二级结构是设计蛋白耦合把手的第一要素，α螺旋提供稳定的耦合反应锚点，是优先考虑的把手结构，命名为H-tag。α螺旋的氨基酸序列决定了蛋白耦合反应锚点的局域环境。
基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，使用连接多肽将α螺旋把手与蛋白的末端进行连接，利用扩展遗传编码将非天然氨基酸插入α螺旋把手的特定位点，通过点击化学，实现了蛋白与核酸的高效生物耦合。首先设计携带非天然氨基酸密码子的把手H-tag，其次构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，再次表达纯化在H-tag中含有非天然氨基酸的融合重组蛋白，最后对融合蛋白H-tag中非天然氨基酸和核酸底物上的耦合基团进行高效点击化学连接，其流程如图1所示。
操作步骤为：
步骤一基于蛋白二级结构α螺旋，设计携带非天然氨基酸的把手H-tag，通过多肽与待测蛋白的一个末端连接；
步骤二通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成非天然氨基酸密码子，通过原核表达载体构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，转入感受态细胞后筛选获得稳定遗传的克隆菌株；
步骤三将含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒和能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转化获得原核表达菌株，在培养基中添加非天然氨基酸，使用诱导剂诱导表达融合了H-tag的待测蛋白；
步骤四裂解诱导表达后的原核表达菌株细胞，借助重组蛋白的亲和标签，纯化获得H-tag-待测蛋白的可溶蛋白；
步骤五通过点击化学对H-tag-待测蛋白和核酸底物上的耦合基团进行高效连接，使用凝胶电泳检测反应效率。
其中，非天然氨基酸为非天然氨基酸耦合叠氮基团，具体可为叠氮苯丙氨酸，相应的，点击化学为张力驱动的叠氮-炔基环化反应，H-tag-待测蛋白和核酸底物通过叠氮基团和二苯基环辛炔基团实现快速连接。把手H-tag长度大于5个氨基酸，并且小于30个氨基酸，可以连接在待测蛋白的氨基端或羧基端，少于5个氨基酸在α螺旋上做突变可能会破坏α螺旋这种二级结构，当其长度超过30个氨基酸后，其连接效果会随之降低；连接多肽长度大于8个氨基酸，小于20个氨基酸，当连接多肽少于8个氨基酸会起不到与蛋白表面氨基酸环境的隔离作用。并且非天然氨基酸在H-tag序列中的优选位置，需要满足如下条件，电中性、极性氨基酸环境和适中的表面暴露度，表面暴露度可通过在线软件sable(http://sable.cchmc.org/)，预测氨基酸的数值相对溶剂可及性，总范围是0-5，本方案中选择数值是2或3的氨基酸残基作为候选突变位点。通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成非天然氨基酸密码子，非天然氨基酸密码子可以是琥珀密码子，也可以是能实现非天然氨基酸插入功能的其它密码子。
设计蛋白点击化学耦合把手的原则是为非天然氨基酸提供反应活性最高的锚点，二级结构是设计蛋白耦合把手的第一要素，α螺旋提供稳定的耦合反应锚点，是优先考虑的把手结构，命名为H-tag，α螺旋的氨基酸序列决定了蛋白耦合反应锚点的局域环境。
具体操作步骤如下：
步骤一基于蛋白二级结构α螺旋，设计携带叠氮苯丙氨酸的把手H-tag，通过多肽与待测蛋白的一个末端连接；设计H-tag如序列SEQ ID NO:1所示，连接肽段如序列SEQ IDNO:2所示；
SEQ ID NO:1DITQQAKDIG
SEQ ID NO:2GSGGGSGG
将H-tag的核酸序列，如SEQ ID NO:3所示，置于待测蛋白核酸序列的5’端，中间通过编码一个连接肽段的核酸序列，如SEQ ID NO:4所示，进行连接，从而形成一个完整的融合蛋白。
SEQ ID NO:3GATATAACACAACAAGCTAAAGATATAGGC
SEQ ID NO:4GGTAGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT
步骤二通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成琥珀密码子或者是能实现非天然氨基酸插入功能的其它密码子，其结构如图4所示；例如将编码H-tag氨基酸序列的第5位Gln的密码子定点遗传突变为TAG，用于引入叠氮苯丙氨酸，再与原核表达载体构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，转入到感受态细胞后，筛选能够稳定遗传的克隆菌株；
其中原核表达载体可选用pET系列原核表达载体，用于筛选的克隆菌株的感受态细胞选用大肠杆菌DH5α细胞，或执行同样功能的其它大肠杆菌菌株；构建重组表达质粒的方法可以是通过限制性核酸内切酶消化后使用T4连接酶连接，也可以是不依赖于连接的克隆方法(Ligation-independent cloning)，譬如无缝克隆(Seamless Cloning)。
步骤三从克隆菌株中提取含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，将含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒和能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转化获得原核表达菌株，在原核表达菌株培养基中添加非天然氨基酸，4-叠氮基-L-苯丙氨酸，使用诱导剂诱导表达融合了H-tag的待测蛋白；
其中，菌株培养基含有5％甘油和1mM 4-叠氮基-L-苯丙氨酸，诱导剂使用1mMIPTG，诱导表达时间12-20h；tRNA/氨酰tRNA合成酶质粒中的正交对编码基因可以是单拷贝或多拷贝，用于引入非天然氨基酸，本方案使用的质粒是携带tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒pEvol-pAzFRS.1.t1，购自“NTCC典型培养物保藏中心，货号：Plasmid 73547”，结构如图3所示。
步骤四裂解诱导表达后的原核表达菌株细胞，借助重组蛋白的亲和标签，纯化获得H-tag-待测蛋白的可溶蛋白；
细胞的裂解在蛋白酶抑制剂的作用下进行，蛋白酶抑制剂优选苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)，浓度为0.1-1mM，也可选择其它蛋白酶抑制剂；裂解细胞采用超声破碎仪，功率设置为200W，循环开4秒关6秒，总时间设置为25-40min；亲和标签可以选择六聚组氨酸，也可以选择谷胱甘肽巯基转移酶(GST)，或其它类似功能的标签；纯化蛋白使用层析技术，层析技术可以选择亲和层析，譬如金属螯合亲和层析，也可以复合使用离子交换层析。
步骤五通过张力驱动的叠氮-炔基环化反应对纯化所得的H-tag-待测蛋白和核酸底物上的耦合基团进行高效连接，反应示意图如图7所示，其核酸底物上的耦合基团为聚乙二醇二苯基环辛炔基团，如图6所示，融合蛋白和核酸底物的摩尔比为1:2.5-5，优选为1:5，反应温度为12℃，反应时间为24h；使用凝胶电泳检测反应效率，凝胶电泳为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺的浓度为12％(v/v)，凝胶厚度为0.75mm，电压200V，电泳时间45min。
本方案具有一定的普适性，尤其适用于可溶性蛋白和包涵体蛋白，下面以PfAMA1蛋白为例详述本发明方案。实施例中未标注具体条件的实验方案，皆按照常规方案或产品说明书中所建议的反应条件。实施例中的通用设备、材料和试剂等，如无特指，皆可从商业购买。
实施例：H-tag应用于PfAMA1蛋白与单链核酸的高效生物耦合
1H-tag的设计
设计H-tag序列如SEQ ID NO:1，为蛋白耦合反应中非天然氨基酸叠氮苯丙氨酸提供适中的表面暴露度，电中性和极性氨基酸环境。设计连接肽段如序列SEQ ID NO:2，为linker或桥梁将蛋白与H-tag(螺旋标签)连接，能够将待测目的蛋白与点击化学耦合把手隔离，降低蛋白表面复杂环境对连接效率的影响。
SEQ ID NO:1DITQQAKDIG
SEQ ID NO:2GSGGGSGG
将H-tag的核酸序列如SEQ ID NO:3，置于待测蛋白PfAMA1(结构如图5)的核酸序列的5’端，中间通过编码一个连接肽段的核酸序列连接，连接肽段序列如SEQ ID NO:4，从而形成一个完整的融合蛋白编码序列，其序列如SEQ ID NO:5。其中，将编码H-tag氨基酸序列的第5位Gln的密码子定点遗传突变为TAG(琥珀密码子)，用于引入叠氮苯丙氨酸。
SEQ ID NO:3GATATAACACAACAAGCTAAAGATATAGGC
SEQ ID NO:4GGTAGCGGTGGCGGAAGCGGCGGT
SEQ ID NO:5
atggctgatataacacaataggctaaagatataggcggtagcggtggcggaagcggcggtaattatatgggtaatccttggacggaatatatggcaaaatatgatattgaagaagttcatggttcaggtataagagtagatttaggagaagatgctgaagtagctggaactcaatatagacttccatcagggaaatgtccagtatttggtaaaggtataattattgagaattcaaatactacttttttaacaccggtagctacgggaaatcaatatttaaaagatggaggttttgcttttcctccaacagaacctcttatgtcaccaatgacattagatgaaatgagacatttttataaagataataaatgtgtaaaaaatttagatgaattgactttatgttcaagacatgcaggaaatatgattccagataatgataaaaattcaaattataaatatccagctgtttatgatgacaaagataaaaagtgtcatatattatatattgcagctcaagaaaataatggtcctagatattgtaataaagacgaaagtaaaagaaacagcatgttttgttttagaccagcaaaagatatatcatttcaaaactatacatatttaagtaagaatgtagttgataactgggaaaaagtttgccctagaaagaatttacagaatgcaaaattcggattatgggtcgatggaaattgtgaagatataccacatgtaaatgaatttccagcaattgatctttttgaatgtaataaattagtttttgaattgagtgcttcggatcaacctaaacaatatgaacaacatttaacagattatgaaaaaattaaagaaggtttcaaaaataagaacgctagtatgatcaaaagtgcttttcttcccactggtgcttttaaagcagatagatataaaagtcatggtaagggttataattggggaaattataccacagaaacacaaaaatgtgaaatttttaatgtcaaaccaacatgtttaattaacaattcatcatacattgctactactgctttgtcccatcccatcgaagttgaactcgagcaccaccaccaccaccac
2氨基端带有H-tag序列的PfAMA1融合重组蛋白表达载体的构建
以融合蛋白编码序列为模板，使用上游引物(如SEQ ID NO:6)和下游引物(如SEQID NO:7)，通过聚合酶链式反应PCR获得目的序列；上下游引物分别包括限制性核酸内切酶位点NcoI和XhoI；在含有缓冲液(10mM Tris-HCl，(pH8.5),10mM MgCl2,100mM KCl,0.1mg/mL BSA)的50μl体积中，将目的序列(5μg)和大肠杆菌原核表达载体pET-21d(5μg)使用NcoI(10U)和XhoI(10U)限制性核酸内切酶在37℃酶切消化1小时，经1％琼脂糖凝胶电泳(120V，20分钟)分离，切胶回收，纯化获得含有粘性末端的目的序列和载体。在含有缓冲液(40mMTris-HCl,10mM MgCl2,10mM DTT,0.5mM ATP)的10μl体积中，利用T4DNA连接酶(1U)将目的序列(30ng)与载体(51ng)连接构成重组表达质粒H-tag-PfAMA1-pET-21d。该质粒含有氨苄青霉素编码基因，可用于阳性克隆的筛选。
SEQ ID NO:6CATGCCATGGCTGATATAACACAATAGGCTAAAGATATAGGCGGTAGCGGTGGCGG
SEQ ID NO:7CCGCTCGAGTTCAACTTCGATGGGATGGGAC
3重组蛋白H-tag-PfAMA1的表达
将重组表达质粒H-tag-PfAMA1-pET-21d(如图2所示)与携带tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒pEvol-pAzFRS.1.t1(如图3所示)共转大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，转化方法参考《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社2002，黄培堂等译)。挑取单个阳性克隆，接种于含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的5ml LB培养基，继而在37℃恒温摇床震荡(220转/分钟)培养12小时。将菌液转接至含100μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml氯霉素的1L LB培养基，在37℃恒温摇床(220转/分钟)继续培养，当菌液光密度OD600达到0.6-0.8时加入终浓度为1mM IPTG、1mM叠氮苯丙氨酸(4-azido-L-Phenoalanine)和5％甘油，在37℃恒温摇床(220转/分钟)诱导表达16小时。4000转/分钟离心收集细胞。用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,400mM NaCl,5％甘油)重悬细胞，细胞悬液可直接进行下一步纯化实验或于-80℃保存。
4重组蛋白H-tag-PfAMA1的纯化
向步骤3中的细胞悬液中加入终浓度为2mM的乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1％曲拉通X-100(Triton X-100)，并定容至100ml。使用超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SCIENTZ-IID)功率为200W，循环开4秒关6秒，总时间40分钟，充分裂解细胞。细胞裂解液于18000转/分离心40分钟，弃去上清液，保留沉淀的蛋白质。用40ml清洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,2M尿素,0.5mM EDTA)清洗两次沉淀蛋白质。用50ml溶解缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,6M盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GdnHCl),2mM 2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-ME)溶解沉淀的蛋白质12小时。将溶解液于18000转/分离心40分钟，收集上清液中溶解的蛋白质，弃去沉淀。用缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,6M GdnHCl)将蛋白溶液调整浓度为20μg/ml，并定容至50ml。将盛有蛋白溶液的透析袋放置于3L复性缓冲液(20mM Tris–HCl,pH 8.0,0.5mM EDTA,1M尿素,200mM NaCl,2mM 2-ME,0.2mM胱胺二盐酸盐(Cystamine–HCl))中，于4℃搅拌透析12小时，进行复性。复性完成后将蛋白溶液转移至3L裂解缓冲液，于4℃搅拌透析12小时。18000转/分离心40分钟除去因错误折叠而析出的蛋白沉淀。取上清，过3ml Ni亲和层析柱，4℃孵育3小时。用含20mM咪唑的裂解缓冲液洗去杂蛋白。用含500mM咪唑裂解缓冲液洗脱目的蛋白。将洗脱的蛋白溶液透析至3L阴离子交换层析结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,40mM NaCl)，于4℃搅拌透析12小时。随后，蛋白质溶液经过阴离子交换层析和阳离子交换层析，纯化获得目的蛋白。在存储缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 8.0,200mM NaCl,5％甘油)中冻存于-80℃。
5 H-tag-PfAMA1与ssDNA的点击化学耦合
点击化学反应底物之一是单链ssDNA，如SEQ ID NO:8所示，经商业公司合成，长度为14个脱氧核糖核苷酸，其3’末端修饰有单个聚乙二醇二苯基环辛炔基团(Dibenzocyclooctyne-polyethylene glycol,DBCO-PEG)(如图6所示)。从-80℃冰箱取出蛋白质，冰上融化。分别以1:5和1:2.5的摩尔比例混合蛋白与ssDNA，摩尔比例为1:5时，蛋白与ssDNA终浓度分别为40μM与200μM，摩尔比例为1:2.5时，蛋白与ssDNA终浓度分别为80μM与200μM。添加缓冲液((20mM Tris-HCl,pH 8.0,200mM NaCl)，调节最终反应体积至5微升。移液器反复吹打10次直至混合均匀，然后在12℃反应25小时。通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定点击化学反应产物。12％凝胶的厚度是0.75毫米。电压是200伏特，电流是400毫安，电泳时间40分钟。在考马斯亮蓝R-250染色液(0.1％(w/v)考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇(v/v)，10％冰醋酸(v/v))中染色10分钟，在考马斯亮蓝染色脱色液(10％(v/v)醋酸，5％(v/v)乙醇)中脱色，脱色时间以能看到清晰蛋白条带，基本无背景色为准。使用全能型成像系统(SYNGENE，型号：PXi903030611)进行拍照。如图8所示，在PfAMA1内部选择并引入叠氮苯丙氨酸突变位点的蛋白底物，与ssDNA进行点击化学反应，产率是10％。在PfAMA1的氨基端引入H-tag，并在H-tag上进行叠氮苯丙氨酸定点突变，与ssDNA的点击化学产率是50％，两相对比，H-tag蛋白的生物耦合效率提高了40％。
SEQ ID NO:8CGTCTGACCGTAAC
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 南开大学
<120> 基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法
<130> 2019
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Thr Gln Gln Ala Lys Asp Ile Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatataacac aacaagctaa agatataggc 30
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtagcggtg gcggaagcgg cggt 24
<210> 5
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggctgata taacacaata ggctaaagat ataggcggta gcggtggcgg aagcggcggt 60
aattatatgg gtaatccttg gacggaatat atggcaaaat atgatattga agaagttcat 120
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Claims (10)
1.基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：设计携带非天然氨基酸的α螺旋把手H-tag；
构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒；
表达纯化在H-tag中含有非天然氨基酸的融合重组蛋白，融合重组蛋白中通过连接多肽将α螺旋把手与待测蛋白末端连接，利用扩展遗传编码将非天然氨基酸插入α螺旋把手特定位点，插入位置满足在电中性，极性氨基酸环境和氨基酸数值相对溶剂可及性为2-3的条件，所述非天然氨基酸为非天然氨基酸耦合叠氮基团；
最后对融合蛋白H-tag中非天然氨基酸和核酸底物上的耦合基团进行高效点击化学连接，核酸底物上的耦合基团为聚乙二醇二苯基环辛炔基团，通过张力驱动的叠氮-炔基环化反应，实现蛋白与核酸的高效生物耦合。
2.根据权利要求1所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：具体步骤为：
步骤一基于蛋白二级结构α螺旋，设计把手H-tag，通过连接多肽与待测蛋白的末端连接；
步骤二通过定点遗传将把手H-tag的一个密码子突变成非天然氨基酸密码子，通过原核表达载体构建含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒，转入感受态细胞后筛选获得稳定遗传的克隆菌株；
步骤三将含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒和能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒共转化获得原核表达菌株，在培养基中添加所述非天然氨基酸，使用诱导剂诱导表达融合了H-tag的待测蛋白；
步骤四裂解诱导表达后的原核表达菌株细胞，借助重组蛋白的亲和标签，纯化获得H-tag-待测蛋白的可溶蛋白；
步骤五通过点击化学对H-tag-待测蛋白和核酸底物上的耦合基团进行高效连接，使用凝胶电泳检测反应效率。
3.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：步骤一中所述H-tag长度大于5个氨基酸，设计在待测蛋白的氨基端或羧基端。
4.根据权利要求3所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：所述连接多肽长度大于8个氨基酸。
5.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：所述步骤二中原核表达载体为pET系列载体；非天然氨基酸密码子为琥珀密码子。
6.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：含有H-tag和待测蛋白的融合重组表达质粒的构建能够通过依赖于连接的克隆方法或无缝克隆方法。
7.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：所述步骤三中培养基含有5%甘油和1 mM非天然氨基酸；
诱导剂使用1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；
诱导表达时间为12-20h。
8.根据权利要求7所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：能够表达tRNA/氨酰tRNA合成酶的质粒中的正交对编码基因是单拷贝或多拷贝。
9.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：所述步骤四中在蛋白酶抑制剂作用下裂解细胞，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟，浓度为0.1-1 mM；
所述亲和标签为六聚组氨酸或谷胱甘肽巯基转移酶；
裂解细胞采用超声破碎仪，功率设置为200 W，循环开4秒关6秒，总时间设置为25-40min；
使用层析技术纯化蛋白，具体为金属螯合亲和层析或复合使用离子交换层析。
10.根据权利要求2所述的基于α螺旋把手提高蛋白核酸生物耦合效率的方法，其特征在于：融合蛋白和核酸底物的摩尔比为1:2.5-5；
反应温度为12℃，反应时间为24h；
凝胶电泳为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺的浓度为12%（v/v），凝胶厚度为0.75 mm，电压200 V，电泳时间45min。
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