CN113186174B - 一种Tn5突变酶的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Tn5突变酶的制备和应用，属于生物技术领域。对现有E54K，L372P突变的Tn5转座酶进行突变，显著提高片段化反应的效率。所述突变改变了Tn5转座酶的蛋白序列，以删减掉Tn5转座酶的冗余氨基酸序列，解决了原始Tn5标签化反应的效率低和偏好性问题。所述突变型Tn5转座酶可以更有效的提升反应效率，并且酶的稳定性有显著改善。
Description
技术领域
本发明涉及一种Tn5突变酶的制备和应用，属于生物技术领域。
背景技术
科学家最初在对玉米的研究中发现了转座现象，随后的几十年间，研究者陆续在生物界发现了转座现象的广泛存在。转座现象发生时，基因组会发生变化，因此对转座系统充分研究并加以改造，可以把转座系统开发成研究基因的利器。转座标签技术是目前应用最广泛的转座工具，其基本原理是转座体可以识别一段固定的DNA序列，并将其切断，随后将其携带的DNA片段连接在切口两端。但由于天然存在的转座酶的转座活性很低，因此对天然转座酶的突变改造，进而增加其在体外的转座活性成为目前的主流方案。
Tn5转座酶首次发现于大肠杆菌的卡那霉素抗性基因研究中，Tn5通过转座的方式实现卡那霉素抗性基因在不同基因组之间的传递。在Tn5介导的转座过程中，Tn5酶可以特异性的结合处于转座子序列两端的OE序列(Outside End，外部序列)形成稳定的Tn5-DNA复合体结构，参与DNA磷酸二酯键的水解。同时，Tn5转座酶活化水分子，从而促进转座子序列两端3’-OH亲核基团的形成。3’-OH攻击互补链，形成发卡结构。Tn5-DNA复合体离开供体DNA后，前者发卡结构被另一活化的水分子水解，形成带有3’-OH亲核基团的平末端。序列3’-OH的亲核基团进攻靶DNA分子并与5’-P形成共价键，从而完成整个转座子序列的高效转移。后来研究发现，整个转座子序列并不是转座过程所必需，只要有转座子末端核心序列的存在，Tn5转座酶即能将该部分序列随机插入任意靶DNA中。根据此原理，将部分测序接头中带有末端核心序列，通过Tn5转座体的转座过程，在随机打断DNA的同时，也将测序接头插入片段化的DNA分子两端，最后通过PCR加上测序Index，完成含P5端与P7端完整接头的DNA文库的构建。Tn5转座酶作为RNA-seq中重要的工具酶，在文库构建过程中发挥着巨大作用。
大肠杆菌中野生型的Tn5转座酶活性很低，经E54K突变后的Tn5转座酶对OE末端的偏爱性大大提高，经L372P突变后的转座酶，其三维空间构象发生变化，多聚化能力减弱，酶活得到显著提升。
尽管经突变的Tn5转座酶的活性和亲和性得到了有效提升，但目前酶的稳定性仍有待提高，经装配好的Tn5转座体在-20℃保存半年后，酶活就会表现出大幅度的降低，表现为标签化效率的大幅下降，甚至可能会出现装配接头脱落的现象。因此，延长Tn5转座体的稳定保存时间对Tn5转座酶在科研以及商品化应用上有着重要意义。此外现有E54K，L372PTn5转座酶对靶DNA具有偏好性，这大大限制了Tn5转座酶对不同物种来源DNA的片段化反应。因此降低Tn5转座酶的靶DNA偏好性，扩充Tn5转座酶对各种物种DNA片段化的应用，对提高Tn5转座酶在科研中的应用价值同样具有重大意义。
发明内容
鉴于目前Tn5转座酶稳定性差、对靶DNA偏好性高等问题，本发明通过对E54K，L372PTn5转座酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，进行了多种改造，主要包括序列的删减、氨基酸的定点突变等，获得了一种性能提升的突变型的Tn5转座酶，提高了Tn5转座酶标签化反应效率和储存稳定性，能够适应NGS测序建库的需求。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种Tn5转座酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的Tn5转座酶的基础上发生突变，将第2-6位、第373-391位氨基酸删除，并将第466位的氨基酸突变为半胱氨酸。
本发明提供了编码所述突变型Tn5转座酶的基因。
在一种实施方式中，编码所述突变型Tn5转座酶的基因可以如SEQ ID NO.2所示；由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列并不局限于SEQ NO.2所示序列，也可以是由与SEQ NO.2所示核苷酸序列突变一个或几个核苷酸形成同义突变得到可编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明提供了携带所述基因的重组质粒。
本发明提供了表达所述突变体，或携带所述重组质粒的微生物细胞。
本发明提供了一种反应体系，是利用权利要求1所述突变体，切割DNA。
在一种实施方式中，所述DNA包括微生物、植物、动物和/或病毒的基因组DNA。
在一种实施方式中，反应体系中含有基因组DNA、Tris-HCl、MgCl2、含有19bp转座子接头引物。
在一种实施方式中，在50-60℃下反应5-10min。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述突变体。
本发明还提供了所述突变体、所述基因、或所述试剂盒在DNA测序和/或DNA建库中的应用。
本发明的有益效果：
本发明对现有E54K，L372P Tn5转座酶进行酶活和稳定性的改造，具体是将C端和N端的部分氨基酸序列删减，从而改善了Tn5转座酶的活性，将E54K，L372P Tn5转座酶氨基酸序列中第466位氨基酸丙氨酸突变为半胱氨酸，增强Tn5转座酶的稳定性。与E54K，L372P转座酶相比，使用本发明改造后的所述突变型Tn5转座酶构建的cDNA文库的测序饱和度高，并且在测序结果上无明显的5’或3’端偏好性，并且更加稳定，不易降解，更适于各种场景的应用。
附图说明
图1为现有E54K，L372P Tn5转座酶和本发明实施例1中突变型Tn5转座酶的片段化反应的比较结果图；泳道1为DNA marker，泳道2为E54K，L372PTn5转座酶构建文库，泳道3为突变型Tn5转座酶构建文库。
图2为E54K，L372P Tn5转座酶和突变型Tn5转座酶的稳定性比较图；泳道1为marker，泳道2为E54K，L372PTn5转座酶构建文库，泳道3为突变型Tn5转座酶构建文库。
图3为E54K，L372P Tn5转座酶突变型Tn5转座酶构建cDNA文库的饱和曲线比较图。
图4为E54K，L372P Tn5转座酶和突变型Tn5转座酶构建cDNA文库的基因覆盖度比较图。
具体实施方式
实施例1：突变型Tn5转座酶的制备
1、构建含编码所述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体
(1)将E54K，L372P Tn5转座酶的N端第2-6位氨基酸删除、第373-391位氨基酸删除并且将第466位的丙氨酸突变为半胱氨酸。利用基因合成的方法，合成突变型Tn5转座酶的核苷酸序列(包含突变型Tn5转座酶，内含肽和几丁质结合域)，连接至pTXB1载体的NdeI和BamHI酶切位点中间，形成完整的质粒。
(2)取20ul连接后产物，加入100ul BL21(DE3)感受态大肠杆菌中，轻轻弹动管壁数次，将管子置于冰上放置30min。42℃热激90s，冰上冷却2min。将管子中加入900ul SOC培养基，37℃下摇菌1h。取100ul菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板上。将平板倒置，放于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单克隆，测序验证。测序结果表明：本发明合成的突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、含有突变型Tn5转座酶重组菌的构建
将测序验证无误的载体，取10μg以同样转化方法转化到BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养。第二天挑取单克隆。
3、突变型Tn5酶的获得
将步骤2中长出的单克隆重组细胞挑入5ml LB液体培养基中，37℃摇菌10h，然后转接扩大培养至200ml LB液体培养基中，37℃摇菌5h，加入IPTG至终浓度为1mM，继续摇菌过夜，诱导目的蛋白表达。收集菌液，10000g离心10min，收集菌泥。向菌泥中加入10ml洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.8，0.5M NaCl，10mM EDTA，0.1％TritonX-100，10％甘油)，超声裂解菌体，将裂解液高速离心(10000g，15min)，留下上清。将20g硫酸铵加入上清，迅速混匀，高速离心(12000g，15min)，将蛋白沉淀重新溶解在10ml洗脱缓冲液中，用洗脱缓冲液平衡1ml几丁质柱，将上清缓缓通过几丁质柱，再用10倍柱体积洗脱缓冲液冲洗柱子，洗去未结合蛋白，再用3倍柱体积的含有30mM DTT的洗脱缓冲液(切割缓冲液)快速冲洗柱子，关闭出样口，将10倍柱体积的切割缓冲液封闭于柱子中，将柱子放于4℃过夜。次日放出缓冲液并收集，将缓冲液放于储存缓冲液(50mM Tris-HCl pH＝7.8，0.1M NaCl，1mM EDTA，2mMDTT，0.1％TritonX-100，50％甘油)中4℃透析过夜。将透析过后的Tn5转座酶溶液进行超滤浓缩，浓缩至原体积的1/20。浓缩后，将酶放于-80℃保存。
实施例2：突变型Tn5转座酶和E54K，L372P转座酶的性质比较
(1)片段化DNA文库的构建
配制以基因组DNA为模板的处理体系，反应体系如下：25mM Tris-HCl pH＝8.5，5mM MgCl2，200nM实施例1中所得的突变型Tn5转座酶，100ng基因组DNA，1ng含有19bp转座子序列的接头引物；反应条件：55℃，7min。
含有19bp转座子接头引物包括：转座酶识别序列、第一接头序列；第二接头序列。
转座酶识别序列：AGATGTGTATAAGAGACAG；
第一接头序列(XXXXXX代表Index序列)：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
第二接头序列(XXXXXX代表Index序列)：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTC TTCCGATC。
作为对比的E54K，L372P转座酶进行DNA片段化的反应体系为25mM Tris-HCl pH＝8.5，5mM MgCl2，200nMTn5转座酶，100ng基因组DNA模板。
将经由E54K，L372P Tn5转座酶和突变Tn5转座酶打断处理过的DNA模板分别用HiFi PCR Mix for NGS(CWBIO)进行文库PCR扩增，对DNA片段化处理并进行文库构建。
将构建得到的文库中的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，由图1可知，实施例1所提供的突变型Tn5转座酶扩增构建的片段化DNA的文库条带更多且亮度更高，表明突变型Tn5转座酶标签化效率显著高于原始的E54K，L372P Tn5转座酶。
(2)突变型Tn5转座酶稳定性测定
将E54K，L372P Tn5转座酶和突变型Tn5转座酶在37℃放置3天，通过SDS-PAGE验证，结果图2所示，泳道2和3分别为E54K，L372P Tn5转座酶和突变型Tn5转座酶，可见，E54K，L372P Tn5转座酶发生显著的降解，而突变型Tn5转座酶仍能保持较好的稳定性，大部分条带在52KDa处。
(3)突变型Tn5转座酶饱和度测定
将步骤1中构建好的文库，通过琼脂糖凝胶电泳图跑胶、并胶回收后，将回收产物送至测序公司进行测序比较，结果如图3和图4所示，突变型Tn5转座酶构建的文库饱和度高于E54K，L372P Tn5转座酶所构建的文库，并且突变型Tn5转座酶构建的文库无明显5’或3’端偏好性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种Tn5突变酶的制备和应用
<130> BAA210416A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met His Arg Ala Ala Asp Trp Ala Lys Ser Val Phe Ser Ser Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gly Asp Pro Arg Arg Thr Ala Arg Leu Val Asn Val Ala Ala Gln
20 25 30
Leu Ala Lys Tyr Ser Gly Lys Ser Ile Thr Ile Ser Ser Glu Gly Ser
35 40 45
Lys Ala Met Gln Glu Gly Ala Tyr Arg Phe Ile Arg Asn Pro Asn Val
50 55 60
Ser Ala Glu Ala Ile Arg Lys Ala Gly Ala Met Gln Thr Val Lys Leu
65 70 75 80
Ala Gln Glu Phe Pro Glu Leu Leu Ala Ile Glu Asp Thr Thr Ser Leu
85 90 95
Ser Tyr Arg His Gln Val Ala Glu Glu Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile
100 105 110
Gln Asp Lys Ser Arg Gly Trp Trp Val His Ser Val Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Ala Thr Thr Phe Arg Thr Val Gly Leu Leu His Gln Glu Trp Trp Met
130 135 140
Arg Pro Asp Asp Pro Ala Asp Ala Asp Glu Lys Glu Ser Gly Lys Trp
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Ala Thr Ser Arg Leu Arg Met Gly Ser Met Met Ser
165 170 175
Asn Val Ile Ala Val Cys Asp Arg Glu Ala Asp Ile His Ala Tyr Leu
180 185 190
Gln Asp Lys Leu Ala His Asn Glu Arg Phe Val Val Arg Ser Lys His
195 200 205
Pro Arg Lys Asp Val Glu Ser Gly Leu Tyr Leu Tyr Asp His Leu Lys
210 215 220
Asn Gln Pro Glu Leu Gly Gly Tyr Gln Ile Ser Ile Pro Gln Lys Gly
225 230 235 240
Val Val Asp Lys Arg Gly Lys Arg Lys Asn Arg Pro Ala Arg Lys Ala
245 250 255
Ser Leu Ser Leu Arg Ser Gly Arg Ile Thr Leu Lys Gln Gly Asn Ile
260 265 270
Thr Leu Asn Ala Val Leu Ala Glu Glu Ile Asn Pro Pro Lys Gly Glu
275 280 285
Thr Pro Leu Lys Trp Leu Leu Leu Thr Ser Glu Pro Val Glu Ser Leu
290 295 300
Ala Gln Ala Leu Arg Val Ile Asp Ile Tyr Thr His Arg Trp Arg Ile
305 310 315 320
Glu Glu Phe His Lys Ala Trp Lys Thr Gly Ala Gly Ala Glu Arg Gln
325 330 335
Arg Met Glu Glu Pro Asp Asn Leu Glu Arg Met Val Ser Ile Leu Ser
340 345 350
Phe Val Ala Val Arg Leu Leu Gln Leu Arg Glu Ser Phe Thr Pro Ser
355 360 365
Ala Glu Thr Val Leu Thr Pro Asp Glu Cys Gln Leu Leu Gly Tyr Leu
370 375 380
Asp Lys Gly Lys Arg Lys Arg Lys Glu Lys Ala Gly Ser Leu Gln Trp
385 390 395 400
Ala Tyr Met Ala Ile Ala Arg Leu Gly Gly Phe Met Asp Ser Lys Arg
405 410 415
Thr Gly Ile Ala Ser Trp Gly Ala Leu Trp Glu Gly Trp Glu Ala Leu
420 425 430
Gln Ser Lys Leu Asp Gly Phe Leu Ala Cys Lys Asp Leu Met Ala Gln
435 440 445
Gly Ile Lys Ile
450
<210> 2
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgcatcgtg cggcggattg ggcgaaaagc gtgttttcta gtgctgcgct gggtgatccg 60
cgtcgtaccg cgcgtctggt gaatgttgcg gcgcaactgg ccaaatatag cggcaaaagc 120
attaccatta gcagcgaagg cagcaaagcc atgcaggaag gcgcgtatcg ttttattcgt 180
aatccgaacg tgagcgcgga agcgattcgt aaagcgggtg ccatgcagac cgtgaaactg 240
gcccaggaat ttccggaact gctggcaatt gaagatacca cctctctgag ctatcgtcat 300
caggtggcgg aagaactggg caaactgggt agcattcagg ataaaagccg tggttggtgg 360
gtgcatagcg tgctgctgct ggaagcgacc acctttcgta ccgtgggcct gctgcatcaa 420
gaatggtgga tgcgtccgga tgatccggcg gatgcggatg aaaaagaaag cggcaaatgg 480
ctggccgctg ctgcaacttc gcgtctgaga atgggcagca tgatgagcaa cgtgattgcg 540
gtgtgcgatc gtgaagcgga tattcatgcg tatctgcaag ataaactggc ccataacgaa 600
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gatcacctga aaaaccagcc ggaactgggc ggctatcaga ttagcattcc gcagaaaggc 720
gtggtggata aacgtggcaa acgtaaaaac cgtccggcgc gtaaagcgag cctgagcctg 780
cgtagcggcc gtattaccct gaaacagggc aacattaccc tgaacgcggt gctggccgaa 840
gaaattaatc cgccgaaagg cgaaaccccg ctgaaatggc tgctgctgac cagcgagccg 900
gtggaaagtc tggcccaagc gctgcgtgtg attgatattt atacccatcg ttggcgcatt 960
gaagaatttc acaaagcgtg gaaaacgggt gcgggtgcgg aacgtcagcg tatggaagaa 1020
ccggataacc tggaacgtat ggtgagcatt ctgagctttg tggcggtgcg tctgctgcaa 1080
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ctgggctatc tggataaagg caaacgcaaa cgcaaagaaa aagcgggcag cctgcaatgg 1200
gcgtatatgg cgattgcgcg tctgggcggc tttatggata gcaaacgtac cggcattgcg 1260
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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Ala Ala Lys Asp Leu Met Ala Gln Gly Ile Lys Ile
465 470 475
Claims (10)
1.一种Tn5转座酶突变体，其特征在于，在氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的Tn5转座酶的基础上发生突变，将第2-6位、第373-391位氨基酸删除，并将其第466位的氨基酸突变为半胱氨酸。
2.编码权利要求1所述Tn5转座酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求3所述重组质粒的微生物细胞。
5.一种切割DNA的方法，其特征在于，利用权利要求1所述突变体，切割DNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DNA包括微生物、植物和/或动物的基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在含有基因组DNA、Tris-HCl、MgCl2 、含有19bp转座子接头引物的反应体系中切割DNA。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在50-60℃下反应5-10min。
9.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述突变体。
10.权利要求1所述突变体、权利要求2所述基因、或权利要求9所述试剂盒在DNA测序和/或DNA建库中的应用。
Priority Applications (1)
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