CN110511951B - Plb蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种PLB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用，利用PLB蛋白成功构建获得具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体。本发明通过构建含类伴侣样蛋白的pET‑PLB1表达载体、测试目标蛋白融合蛋白表达载体以及测试目标蛋白pET载体，经过目标蛋白表达的对比测试，发现提高了测试目标蛋白的可溶性表达效率，从而为蛋白质表达科学研究和工业生产提供了一项有用的工具。

Description

PLB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体 中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，特别涉及蛋白质融合表达技术领域，具体涉及一种PLB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。

背景技术

蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。而蛋白质表达(生产)工程中，获得天然结构蛋白，是蛋白质可溶性表达的先决条件，也是保证目标蛋白生理功能的基础，更是蛋白质工业化生产过程节省成本的环节。

天然蛋白质的功能取决于蛋白质的生理构象。分子生物化学科学认为，蛋白质分子的三维结构完全取决于蛋白质分子的氨基酸序列。但近30年来的大量研究资料表明，很多生物体蛋白质的折叠与装配有其它蛋白或酶的参与，尤其是高等生物的组成蛋白的天然结构的形成，其中蛋白质分子伴侣就是最重要的、也是研究得最多的一类蛋白。分子伴侣是一类进化上非常保守的蛋白质，能与结构、大小、定位和最终功能都不相同的蛋白的多肽链非特异性结合，催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运。新合成的多肽链必须先经折叠和装配后形成特定的三维结构才具有活性。在多肽链折叠过程中，往往会产生折叠异常蛋白，或因未折叠或不全折叠，导致蛋白质分子中疏水区相互吸引，形成集聚体，在基因工程蛋白质表达领域，称为包涵体(Inclusion)。包涵体是不溶性的、没有功能的“死蛋白”。在具有伴侣样作用的蛋白质分子存在下，可有效地调控其它多肽链的正确折叠，从而避免包涵体的形成。

蛋白质分子伴侣的概念是由Dr.Laskey等人在1978年首先提出的。他们在研究非洲爪蟾核小体形成时，发现了一种酸性核蛋白(Nucleoplasmin)。实验表明它在DNA与组蛋白装配成核小体的过程中是必需的。在生理离子强度下，体外把DNA与组蛋白混合在一起，不能自我组装，形成沉淀。但如果把组蛋白与过量Nucleoplasmin蛋白混合，再加入DNA，则可形成核小体结构，而且最终形成的核小体中不包含Nucleoplasmin分子。现在认为Nucleoplasmin的作用可能是避免带负电的DNA与带正电的组蛋白之间强静电吸引而形成非特异结合的不溶聚合物。

同是1987年，Dr.Ikemura发现枯草杆菌素(subtilisin)的折叠需要前肽(propeptide)的帮助。这类前肽常位于信号肽与成熟多肽之间，在蛋白质合成过程中与其介导的蛋白质多肽链是一前一后合成出来的，并以共价键相连接，是成熟多肽正确折叠所必需的，成熟多肽完成折叠后即通过水解作用与前肽脱离。Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣(intramolecular chaperones)。

1993年，E11is对分子伴侣做了更为确切的定义：即分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白，能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，有控制的结合和释放，促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等，并且不是组装完成的蛋白质在发挥其正常的生物功能时的组成部分。

蛋白质分子伴侣的分类：目前已知帮助新生肽折叠的蛋白(也称辅助蛋白)和蛋白体组装的蛋白质分子伴侣至少有三大类：

第一类，普遍意义的分子伴侣，帮助正确折叠，阻止和修正不正确折叠。

第二类，具有酶活力的分子伴侣，又称折叠酶。至今有2个折叠酶：一是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI)。二是肽基脯氨酰顺反异构(peptidylprodylcis—trans isomerase，PPI)。

第三类，分子内分子伴侣，一些研究表明，许多含前导肽(Pro肽)的前体形式合成的蛋白质折叠与成熟必须要有前导肽的存在才能完成，并不完全遵守Anfinsen规则。这类前导肽称为分子内分子伴侣(intramolecular chaperone，IMC)。

如上所述，蛋白质伴侣是一组从细菌到人广泛存在的蛋白质，非共价地与新生肽链和解折叠的蛋白质肽链结合，并帮助它们折叠和转运，通常不参与靶蛋白的生理功能和亚基构成。

总之，以上分类研究的蛋白质分子伴侣有两个共同特点：1)天然性，自己存在；2)同源性，即伴侣和被伴侣蛋白在同一生物体内编码和表达。

然而，随着基因工程与蛋白质表达组学的研究，人们似乎忽略了另一类蛋白伴侣的存在，这类蛋白伴侣或伴侣样蛋白被人工重组到基因表达载体中，形成蛋白质表达工具。对于这类尚未归类的伴侣样蛋白，此处姑且称为“类蛋白伴侣”或“蛋白伴侣样蛋白”，这类伴侣蛋白的空间位置类似“分子内伴侣”，其用在载体中的特点如下：

1)人工重组在基因表达载体中，有些已经商业化销售近40年，如Pharmacia公司的pGEX系列载体和其包含的GST蛋白，NEB公司的的pMAL系列载体和其用麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)。实践证明，BST和MBP均有不同程度增加融合蛋白可溶性表达和表达量的作用，而研发厂家的初衷是用做便于分离纯化的“标签”蛋白。

2)天然或非天然蛋白序列，即未经突变修饰或突变修饰的氨基酸序列。严格意义上来说，均属于非天然蛋白质序列，因为或是取其部分序列，如细菌的HSP片段GroE，GST的C端添加的蛋白酶切识别位点，以及所有融合蛋白表达载体的人工添加的多克隆区(MCS)序列或“柔性接头”区(Flexible Linker)，这些相当于末端插入突变。

3)同源或异源性，在类伴侣样蛋白表达载体系统中，同源性和异源性概念包含两个方面，一是表达载体携带的类伴侣样蛋白对表达宿主的同源性和异源性，如大肠杆菌来源的GST和MBP对于表达宿主大肠杆菌而言是同源性的蛋白；而大肠杆菌表达载体上的酵母或人类来源的SUMO(小泛素样修饰蛋白)或FABP6(人类游离脂肪酸结合蛋白-6)类伴侣样蛋白对于表达宿主大肠杆菌来说，就是异源性的蛋白。在融合蛋白表达载体中，融合蛋白本身上下游的两个蛋白在绝大部分情况下都是异源性的，毕竟这些载体大多数用来表达人类蛋白，因为很大一部分真核细胞蛋白在原核细胞中表达成包涵体，需要借助上游类伴侣样蛋白辅助增加可溶性表达量和辅助分自折叠。

4)融合表达或非融合表达。自然情况下存在一类分子蛋白质内部构成伴侣，在成熟肽时已经切除或保留。有些蛋白质在自体或异体表达时，呈现自折叠高可溶性，如DNA聚合酶，FABP。有些蛋白质体外变性后具有极强的自复性能力，如RNase A,Taq酶等，这些蛋白分子内部可能存在构成行蛋白伴侣。人工构建的类伴侣样蛋白融合蛋白表达载体就类似于分子内伴侣，可诱导下游蛋白提高正确折叠效率。有些商业化表达载体采用双表达框(TwoOperons)，其中一个表达框表达某种非特异性蛋白伴侣，另一个表达框表达目标蛋白。

5)高度自折叠性和对宿主无毒。高度自折叠性形成高可溶性蛋白表达，对宿主无毒使得中、高或超高表达可能。

由于这类类伴侣样蛋白表达载体不仅具有重要的科研价值(方便不同蛋白测试可溶性表达和功能研究)，同时具有重要的工业价值(用于蛋白质发酵生产)。但是，现有类伴侣样蛋白表达载体非常有限，而且对不同目标蛋白的辅助折叠作用存在一定的、机制不明的差异，因此有必要进一步增加类伴侣样蛋白表达载体的可选性。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种PLB蛋白在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用，旨在提供一种具有类伴侣蛋白作用的融合蛋白表达载体。

为实现上述目的，本发明提出如SEQ ID NO：1～5中任一所示的蛋白L的B结构域片段或合并序列在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。

可选地，将如SEQ ID NO：6,7所示的经优化后的所述PLB1蛋白编码序列插入融合蛋白表达载体中作为表达框上游的类伴侣样蛋白。

本发明还提出一种融合蛋白表达载体，所述融合蛋白表达载体的克隆区上游包含编码如上所述的经优化后的PLB1蛋白的核酸序列，所述融合蛋白表达载体的DNA序列如SEQID NO：28所示。

可选地，选用用于改造的商业化空载体为原始亲本载体，所述原始亲本载体包括pET系统表达载体、酵母系统表达载体、昆虫细胞系统表达载体和哺乳动物细胞系统表达载体中的任意一种。

可选地，所述PLB1蛋白的序列上游添加有如SEQ ID NO：8,9所示的转录起始适配序列；和/或，

所述经优化后的PLB1蛋白的序列下游包含一段柔性接头区、蛋白酶酶切位点识别区和用于插入下游目标蛋白的多克隆区。

可选地，所述蛋白酶酶切位点识别区包括凝血因子Xa蛋白酶酶切位点识别区、凝血酶酶切位点识别区、肠激酶酶切位点识别区和烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点识别区中的任意一种。

可选地，所述柔性接头区的序列如SEQ ID NO：10,11所示，所述蛋白酶酶切位点识别区的序列如SEQ ID NO：12,13所示，所述用于插入下游目标蛋白的多克隆区的序列如SEQID NO：14,15所示。

可选地，所述经优化后的PLB1蛋白的同源性与天然PLB1蛋白的同源性不低于85％。

本发明还提出如上所述的融合蛋白表达载体作为新的亲本表达载体在表达目标蛋白中的应用。

更进一步地，本发明还提出一种表达包含类伴侣样蛋白的融合蛋白的方法，包括以下步骤：

将目标蛋白编码序列插入如上所述的融合蛋白表达载体中类伴侣样蛋白下游的多克隆区，得到含目标蛋白编码序列的融合蛋白重组表达载体；

将所述融合蛋白重组表达载体转染宿主细胞，培养宿主细胞表达融合蛋白。

本发明提供的技术方案中，利用新发现的蛋白L的B结构域(Protein L B-domain1to 5，PLB1～5)的类伴侣样蛋白作用，构建得到的融合蛋白表达载体能够促进或诱导被融合的下游目标蛋白的折叠，具有类似伴侣蛋白的特性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的融合蛋白表达载体的一实施例中PLBx表达框示意图；

图2为实施例1中制得的pET28-PLB1表达载体物理图；

图3为实施例2中制得的pET28-PLB1-hTFF3融合蛋白表达载体物理图；

图4为实施例2中制得的pET28-hTFF3表达载体物理图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

类伴侣样蛋白表达载体不仅具有重要的科研价值(方便不同蛋白测试可溶性表达和功能研究)，同时具有重要的工业价值(用于蛋白质发酵生产)。但是，现有类伴侣样蛋白表达载体十分有限，而且对不同目标蛋白的辅助折叠作用存在一定的、机制不明的差异，已因此，在实际应用时，如果类伴侣样蛋白融合表达载体库愈大，其选择性就愈大，对蛋白学研究和蛋白质工业表达效率提高、促进也愈显著。

为了增加类伴侣样蛋白表达载体的可选性，本发明提出一种如SEQ ID NO：1～5中任一所示的蛋白L的B结构域片段或合并序列在构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中的应用。

蛋白L(Protein L)最初从大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)细胞表面分离得到，分子全长719氨基酸残基，因为发现其能与免疫球蛋白(抗体)的L链结合，故而命名为蛋白L(Protein L,PL)。PL不含任何分子内二硫键或由二硫键维系的亚基，等电点(pI)4.0。PL的B结构域(B1～B5)能分别结合人类抗体的卡帕轻链(Kappa链)的VκI、VκIII、VκIV亚型、小鼠抗体的VκI卡帕轻链亚型。本发明经过实践发现蛋白L的B结构域(Protein L B-domain 1to 5,PLB1～5)具有一种类伴侣样蛋白活性，属于蛋白L的一种新特性，此前并未有人提出蛋白L的B结构域具有此特性，本发明以此构建成包含类伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体，可以提高蛋白质的可溶性表达效率。为便于描述，本文中将如SEQ ID NO：1～5所示的蛋白L的B结构域片段分别对应命名为PLB1、PLB2、PLB3、PLB4和PLB5，在本发明提供的应用中，可以是将上述五个片段中的任意一段序列应用到构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中，也可以是将上述五个片段中的其中两种或两种以上的合并序列应用到构建具有类伴侣样蛋白作用的融合蛋白表达载体中。

本发明提供的技术方案中，利用蛋白L的B结构域(Protein L B-domain 1to 5,PLB1～5)的类伴侣样蛋白作用，构建得到的融合蛋白表达载体能够促进或诱导被融合的下游目标蛋白的折叠，具有类似伴侣蛋白的特性。

在本发明提供一优选应用实施例中，对所述PLB1进行优化后插入到融合蛋白表达载体中，得到具有类似伴侣蛋白特性的融合蛋白表达载体，具体为将如SEQ ID NO：6,7所示的经优化后的PLB1蛋白编码序列插入融合蛋白表达载体中作为表达框上游的类伴侣样蛋白，其中，SEQ ID NO：6所示为优化后的PLB1的氨基酸序列，SEQ ID NO：7所示为优化后的PLB1的DNA序列。

本发明还提出一种融合蛋白表达载体，包括如上所述的经优化后的PLB1序列。在本发明提供的融合蛋白表达载体的一实施例中，将经过序列优化后的PLB1接入到大肠杆菌表达载体中，得到包含类伴侣样蛋白的大肠杆菌表达载体(作为目标蛋白表达载体的重组亲本载体)，具体为所述融合蛋白表达载体的克隆区上游包含编码如上所述的经优化后的PLB1蛋白(序列如SEQ ID NO：6,7所示)的核酸序列，所述融合蛋白表达载体的DNA序列如SEQ ID NO：28所示。可以理解的是，所述经优化后的PLB1序列并不限于此序列，以与PLB1蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85％为限。

对于上述包含类伴侣样蛋白的大肠杆菌表达载体而言，其选用用于改造的商业化空载体为原始亲本载体，而所述原始亲本载体又可以选用pET系统表达载体、酵母系统表达载体、昆虫细胞系统表达载体和哺乳动物细胞系统表达载体中的任意一种，优选为pET系统表达载体，更优选为pET28(本文下述实施例中以所述原始亲本载体选用pET28为例进行说明)，获得的融合蛋白表达载体命名为pET28-PLB1，该载体为携带有类伴侣样蛋白的“融合蛋白表达载体”，其对插入在下游的目标蛋白具有类伴侣样蛋白的作用，但也可以看做是一种“空载体(empty vector)”，其对用于目标蛋白重组表达载体而言，又被视作亲本载体，可以商业化作为表达载体出售(即为商业化“空载体”)，用以构建融合蛋白。而该载体在用作载体用于表达目标蛋白时，在其下游插入目标蛋白编码序列后，即可对应获得插入有融合蛋白的融合蛋白表达载体。

较佳地，在本实施例中，所述经优化后的PLB1蛋白的序列上游添加有如SEQ IDNO：8,9所示的转录起始适配序列，其中，SEQ ID NO：8所示为所述转录起始适配序列的氨基酸序列，SEQ ID NO：9所示为所述转录起始适配序列的DNA序列。

进一步地，在本实施例中，所述经优化后的PLB1蛋白的序列下游包含一段柔性接头区、蛋白酶酶切位点识别区和用于插入下游目标蛋白的多克隆区，所构成的PLB1表达框示意图如图1所示，在图1中：RBS表示核糖体结合位点或mRNA转录起始区；PLBx表示蛋白L的B结构域(B1～B5)，x表示其中任意一个B结构域，在本实施例中为PLB1；FL表示柔性接头(Flexible Linker，FL)；PRS表示蛋白酶识别位点(Proteinase Recognition Site，PRS)；MCS表示多克隆插入位点区(Multiple Cloning Site，MCS)；6xHis表示6个组氨酸并联的镍柱分离标签(6x Histidine Tag)。

所述蛋白酶酶切位点识别区包括凝血因子Xa(简称FXa)蛋白酶酶切位点识别区、凝血酶酶切位点识别区、肠激酶酶切位点识别区和烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点识别区中的任意一种，从而使得在需要对所述融合蛋白表达载体进行蛋白酶酶切去除类伴侣样蛋白时，选用凝血因子蛋白酶、凝血酶、肠激酶或烟草蚀纹病毒蛋白酶中的任意一种均可。

更进一步地，在本实施例中，以所述蛋白酶酶切位点识别区为凝血因子Xa为例进行说明。对应地，所述柔性接头区的序列如SEQ ID NO：10,11所示(SEQ ID NO：10所示为所述柔性接头区的氨基酸序列，SEQ ID NO：11所示为所述柔性接头区的DNA序列)，所述蛋白酶酶切位点识别区的序列如SEQ ID NO：12,13所示(SEQ ID NO：12所示为所述蛋白酶酶切位点识别区的氨基酸序列，SEQ ID NO：13所示为所述蛋白酶酶切位点识别区的DNA序列)，所述用于插入下游目标蛋白的多克隆区的序列为DNA限制性内切酶识别序列，如SEQ IDNO：14,15所示(SEQ ID NO：14所示为多克隆区DNA编码的氨基酸序列，SEQ ID NO：15所示为所述用于插入下游目标蛋白的多克隆区的DNA序列)。

可选地，所述经优化后的PLB1蛋白的同源性与天然PLB1蛋白的同源性不低于85％，从而有利于扩大利用PLB1构建的融合蛋白表达载体的应用范围，避免因蛋白质存在同源性差异而导致应用范围受限的问题。

本发明还提出如上所述的包含类伴侣样蛋白PLB1的融合蛋白表达载体作为新的亲本表达载体在表达目标蛋白中的应用，所述融合蛋白表达载体在用于表达目标蛋白时，具有可溶性表达效率提高的优点，为蛋白质表达科学研究和工艺生产提供了一项有用的工具。

本发明还进一步提出一种表达包含类伴侣样蛋白的融合蛋白的方法，使用如上所述的融合蛋白表达载体进行。在本发明提供的表达包含类伴侣样蛋白的融合蛋白的方法的一实施例中，所述表达包含类伴侣样蛋白的融合蛋白的方法包括以下步骤：

将目标蛋白编码序列插入如上所述的包含类伴侣样蛋白PLB1的融合蛋白表达载体中类伴侣样蛋白下游的多克隆区(也即所述经优化后的PLB1的下游设置的用于插入下游目标蛋白的多克隆区，其序列如SEQ ID NO：14,15所示)，得到含目标蛋白编码序列的融合蛋白重组表达载体；

将所述融合蛋白重组表达载体转染宿主细胞，培养宿主细胞表达融合蛋白。

使所述融合蛋白重组表达载体转染宿主细胞以及培养宿主细胞表达融合蛋白的具体操作方法可参照现有技术进行，在此不做赘述。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1包含类伴侣样蛋白的大肠杆菌表达载体的构建

步骤一、PLB插入子的基因合成与载体制备：

选用如SEQ ID：1所示的PLB1，进行PLB1编码DNA的密码子优化、转录起始区的添加突变和DNA序列优化、柔性接头的选择和密码子优化、凝血因子Xa(FXa)识别序列氨基酸密码子优化，具体步骤如下：

(1)取PLB1氨基酸序列逆向翻译成DNA编码序列，经过密码子优先性选择本身编码序列(SEQ ID NO：6,7)。

(2)选择高表达翻译起始区肽段序列(MASTYKLILNGKTS)、优化其编码序列并插入到PLB1编码DNA的5’-端(SEQ ID NO：6～9)。

(3)选择PLB1编码区与PBS编码区之间的柔性接头(KEKTPEEQL)，并插入到紧接PLB1编码DNA的3’-端(SEQ ID NO：6，7，10，11)。

(4)将FXa的PRS序列(IEGR)密码子优化，并顺向插入到柔性接头(FL)的下游(SEQID NO：6，7，12，13)。

(5)设定MCS所需的DNA限制性内切酶种类，并串联其识别区DNA序列(依次为“EcoRI-KpnI-BamHI-PstI-SpeI-XhoI”)，插入到PRS的3’-端(SEQ ID NO：6，7，14，15)。

(6)借助MCS的XhoI连接到pET28载体上，可获得载体携带的6xHis寡聚组氨酸标签和终止密码(SEQ ID NO：6，7，16，17)。

(7)将以上拼接序列(除6xHis组氨酸标签和终止密码子TGA以外)，用NCBI的DNAWorks在线软件设计基因合成引物10条(SEQ ID NO：18～27)，并在起始引物5’-端添加[5’-CC-3’]与PLB1编码框5’-端的[5’-ATGG-3’]形成NcoI[CCATGG]限制性内切酶切点(SEQID NO：18)；在NcoI酶切点的5’-端和末端引物的XhoI酶切位点5’-端分别添加[5’-TTTT-3’]作为酶切位点保护碱基(SEQ ID NO：18，27)。

(8)PLB1插入子(Insert)全基因合成步骤：

①将引物以去离子水配成5μM浓度，各取1μL加入200μL PCR管，用TakaraPyrobest PCR Kit，做成50μL反应体积。

②引物延伸多聚酶链式反应(Overlap PCR)条件：预变性95℃/3min；变性94℃/20sec，复性56℃/20sec，延伸72℃/30sec；16个循环，补全延伸72℃/1min，降至4℃取出。

③全长多聚酶链式反应(Full-length PCR)：从第②步PCR产物中取1μL作模板，置入一个新的PCR管，取上游引物4μL，下游最末端引物4μL(SEQ ID NO：18，27)，以TakaraPyrobest PCR Kit，做成50μL反应体积。PCR条件：预变性95℃/3min；变性94℃/30sec,复性58℃/30sec，延伸72℃/1min；25个循环，补全延伸72℃/2min，降至4℃待取出。

④电泳鉴定合成的DNA片段，硅胶柱纯化PCR片段，NcoI/XhoI双酶切处理PCR片段DNA过夜，同时用NcoI/XhoI双酶切处理pET28空载体过夜。琼脂糖凝胶电泳结合硅胶柱纯化线性化的pET28载体和插入片段双酶切产物。

步骤二、重组连接、转化、克隆分析：

(1)以pET28作为重组改造的亲本载体，将步骤一合成、酶切、纯化获得的PLB1插入子和酶切后纯化的pET28载体，以T4DNA连接酶连接，4℃过夜反应。

(2)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，含卡那霉素(Kan)抗生素的培养皿培养过夜，然后挑取单菌落，PCR法鉴定阳性重组子克隆，常规制备DNA质粒。

(3)将阳性重组子质粒送DNA序列分析，选取和保留正确序列的克隆供表达测试。

(4)正确重组子表达载体质粒命名为pET28-PLB1(SEQ ID NO：28)。

步骤三、含类伴侣样蛋白PLB1表达载体pET28-PLB1的表达测试：

(1)将步骤二得到的pET28-PLB1载体DNA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得Kan抗性的菌落。

(2)挑取单菌落数个，LB培养基培养，IPTG诱导6～8小时，收集菌液1mL，离心收集菌体，1×PBS洗涤一次，再悬浮于0.5mL 1×PBS，超声破碎菌体，离心取上清，保留沉淀物下一步处理。

(3)取20μL上清液与上样缓冲液混合，95℃加热变性10min，离心收集取上清，至于冰上，等待作为可溶性蛋白上样。将步骤(2)离心沉淀物以250μL 8M尿素溶解悬浮，取10μL与上样缓冲液混合，同法加热，离心取上清，至于冰上，等待作为包涵体蛋白上样。

(4)各取10μL上样15％聚丙烯酰胺-SDS变性胶电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白质条带和PLB1蛋白的表达情况。

(5)重组PLB1，包括N-HisTag、柔性接头、多克隆区，共122aa,分子量约13.5kDa。PLB1占菌体总蛋白的15％，可溶性表达。

实施例2 pET28-PLB1融合蛋白表达载体测试系统构建

步骤一、以pET28-PLB1作为亲本载体，以hTTF3为测试目标蛋白，构建pET28-PLB1-hTFF3融合蛋白表达载体和表达菌株：

1、人工合成编码hTFF3成熟肽(SEQ ID NO：28)的DNA序列，DNA密码子经过DNAWorks软件优化(SEQ ID NO：29)，全基因合成引物6条(SEQ ID NO：31～36)，PCR全基因合成方法同实施例1(见步骤一，第(8)节)。

2、PCR全基因合成引物中引入了重组所需的DNA限制性内切酶位点：EcoR I(5’-端引物，SEQ ID NO：31)和Xho I(3’-端引物，SEQ ID NO：36),便于双酶切重组连接；

3、hTFF3基因合成的PCR产物和pET28-PLB1载体分别用EcoRI/XhoI双酶切处理，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶后硅胶柱纯化。

4、T4DNA连接酶连接pET28-PLB1线性化载体DNA与hTFF3插入片段DNA，形成重组pET28-PLB1-hTFF3融合蛋白表达载体，融合蛋白中含重组PLB1、柔性接头、FXa PRS和hTFF3C-端组氨酸标签，如SEQ ID NO：37～39所示。

4、正确克隆命名为pET28-PLB1-hTFF3(SEQ ID NO：39)，5728bps。

5、连接产物转化感受态菌DH5α细胞，挑取克隆扩增、制备质粒、DNA测序分析，保留正确pET28-PLB1-hTFF3重组体质粒。

6、将pET28-PLB1-hTFF3质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落PCR鉴定，所用PCR引物为PLB1的上游引物(SEQ ID NO：18)和hTFF3的下游引物(SEQ ID NO：36)。

7、保留阳性克隆菌落，再次送质粒DNA序列分析以确定表达菌株含目标质粒pET28-PLB1-hTFF3，保留正确的pET28-PLB1-hTFF3/BL21(DE3)克隆，供测试表达分析。

步骤二、对照克隆pET28-hTFF3表达载体的构建和表达菌株建立：

1、人工设计并商业合成hTFF3成熟肽的PCR引物(SEQ ID NO：40，41)。

2、在新合成的hTFF3成熟肽编码区中，以PCR引物引入NcoI(5’-端)和XhoI(3’-端)限制性内切酶酶切识别位点、起始密码子ATP和酶切点保护碱基；上游引物序列：5’–TTTTCCATGGAAGAATACGTTGGT-3’(SEQ ID NO:40)，下游引物序列：5'-TTTTCTCGAGGAAGGTGCATTCCGCTTCC-3’(SEQ ID NO:41)。

3、以pET28-PLB1-hTFF3质粒DNA为模板，常规PCR方法扩增hTFF3，经分子量电泳鉴定、PCR产物纯化后备用。

4、以NcoI/XhoI双酶切分别处理表达载体pET28和上一步得到的hTFF3PCR产物，37℃，酶切过夜。然后分别胶回收纯化pET28线性化载体和hTFF3的双酶切产物(插入片段)。

5、T4DNA连接酶连接pET28DNA片段与hTFF3插入片段。

6、直接转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落PCR鉴定，所用PCR引物为pET28的通用测序引物T7和T7-Terminator。

7、保留含有比pET28空载体PCR片段更大条带的阳性克隆，送DNA序列分析，保留正确序列的克隆和菌株pET28-hTFF3/BL21(DE3)，供测试表达分析。

8、正确重组载体命名为pET28-hTFF3(SEQ ID NO:44)，5413bps。表达的目标蛋白hTFF3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。

步骤三、测试表达对照分析

1、分别扩增pET28-PLB1-hTFF3/BL21(DE3)和pET28-hTFF3/BL21(DE3)菌株，37℃恒温摇床，200RPM震荡至OD＝0.6，然后，IPTG加至0.5mM，25℃/200RPM诱导过夜；

2、分别收集菌体1mL，1×PBS洗涤一次，再加1×PBS 500μL，超声波破碎细胞，然后分别离心保留上清，各自沉淀部分分别加8M尿素250μL悬浮溶解，再加250μL 1×PBS，分别取上清和沉淀溶解物50μL加等量2×Loading Buffer，95℃变性10分钟，上样，20％聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳；

3、考马斯亮蓝染色、脱色后观察电泳结果。

结果发现，pEET28-PLB1-hTFF3/BL21(DE3)融合蛋白表达菌株的上清中可溶性表达约占70％，而pET28-hTFF3/BL21(DE3)非融合蛋白表达菌株表达的hTFF3蛋白全部为包涵体状态存在，说明该包含类蛋白伴侣样蛋白的大肠杆菌表达系统的上游蛋白PLB1具有诱导促进被融合蛋白hTFF3的分子折叠作用。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种融合蛋白表达载体，其特征在于，所述融合蛋白表达载体的克隆区上游包含如SEQ ID NO：7所示的经优化后的PLB1蛋白编码序列，所述PLB1蛋白编码序列插入融合蛋白表达载体中作为表达框上游的类伴侣样蛋白，所述融合蛋白表达载体的DNA序列如SEQ IDNO：28所示，且选用大肠杆菌pET28作为亲本载体。

2.如权利要求1所述的融合蛋白表达载体作为新的亲本表达载体在表达目标蛋白中的应用。

3.一种表达包含类伴侣样蛋白的融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将目标蛋白编码序列插入如权利要求1所述的融合蛋白表达载体中类伴侣样蛋白下游的多克隆区，得到含目标蛋白编码序列的融合蛋白重组表达载体；

将所述融合蛋白重组表达载体转染宿主细胞，培养宿主细胞表达融合蛋白。

Images