CN105296517B - 一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体 - Google Patents
一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体，所述表达载体克隆区上游包含编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列，人类游离脂肪酸结合蛋白下游优选包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白的多克隆区。本发明提供了一种新型融合蛋白表达载体，其功能具有类似伴侣样蛋白的作用。并且采用了人类自身的蛋白质，具有非排异性或免疫原性微弱的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白表达技术，尤其是涉及一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体，属于基因工程和蛋白质表达工程领域。
背景技术
蛋白质的功能取决于蛋白质的天然构象。一般认为，蛋白质分子的三级和四级结构完全决定于多肽的氨基酸顺序。但近年来的一些研究表明，很多蛋白质的折叠与装配有其它蛋白或酶的参与，其中分子伴侣就是研究得最多的一种。分子伴侣是一类进化上非常保守的蛋白质，能与结构、大小、定位和最终功能都不相同的多肽链非特异性结合，催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配与转运。
分子伴侣的概念是Laskey等(1978)首先提出的。他们在研究非洲爪蟾核小体形成时发现一种酸性核蛋白—Nucleoplasmin。实验表明它在DNA与组蛋白装配成核小体时是必需的。在生理离子强度下，体外把DNA与组蛋白混合在一起，不能自我组装，而是形成沉淀。如果把组蛋白与过量Nucleoplasmin混合，再加入DNA，则可形成核小体结构，而且最终形成的核小体中没有Nucleoplasmin。现在认为Nucleoplasmin的作用可能是避免带负电的DNA与带正电的组蛋白之间强静电吸引而形成非特异结合的不溶聚合物。
分子伴侣(Molecular chaperone)是进化上非常保守的一类蛋白质超家族，广泛分布于各种生物体内，首次以HSP(heat shock protein)形式被鉴定出来。新合成的多肽链必须先经折叠和装配后形成特定的三维结构才具有活性。在多肽链折叠过程中，往往会产生折叠异常蛋白，形成集聚体，在基因工程蛋白质表达体系中，称为包涵体(Inclusion)。具有伴侣样作用的蛋白质分子可有效地调控其它多肽链的正确折叠，从而避免包涵体的形成。
1993年.E11is对分子伴侣做了更为确切的定义：即分子伴侣是一类相互之间有关系的蛋白，能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，它们的功能是帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装，有控制的结合和释放，促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等，并且不是组装完成的蛋白质在发挥其正常的生物功能时的组成部分[3]。现已知道帮助新生肽折叠的蛋白(也称辅助蛋白)至少有三大类：一类是普遍意义的分子伴侣，帮助正确折叠，阻止和修正不正确折叠。另一类是具有酶活力的分子伴侣，又称折叠酶。至今有2个折叠酶：一是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI)；另一是肽基脯氨酰顺反异构(peptidylprodylcis—trans isomerase，PPI)。当时Ellis明确指出PDI不是分子伴侣[3]，现已证明这两种异构酶既是酶又是分子伴侣[4]。第三类是分子内分子伴侣，一些研究表明，许多含前导肽(Pro肽)的前体形式合成的蛋白质折叠与成熟必须要有Pro肽的存在才能完成，并不完全遵守Anfinsen规则。这类前导肽称为分子内分子伴侣(intramolecular chaperone，IMC)。
近来，董晓燕等利用固定化分子伴侣GroE，研究了其对变性溶菌酶的复性作用，解决了分子伴侣的重复利用问题。Teshima等利用固定化分子伴侣，在体外辅助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折叠复性。还有报道利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性，它们能有效的促进亲环蛋白A、硫氰酸酶以及芽抱杆菌RNA酶的复性。
细菌的谷胱甘肽S-转移酶(GST)是一类自折叠能力很强的蛋白质，最早被Pharmacia公司用于构建pGEX系列原核表达载体，由于GST的高表达和自折叠能力强，使得许多融合于其下游的许多外源性蛋白质得以高表达，或提高了可溶性表达，因而出现了“伴侣样蛋白”蛋白的概念。
NEB公司用麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein)构建了pMAL系列原核表达载体，也能促进部分融合蛋白的可溶性表达，具有伴侣样蛋白特性，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用直链淀粉(Amylose)柱对融合蛋白进行亲和纯化。
Novagen用二硫键形成蛋白A(Disulfide bond formation protein A,DsbA)是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶，使用这类分泌型原核表达载体可有助于被表达的外源性蛋白可溶性提高。DsbA属于伴侣蛋白质。
Takara Bio INC.构建和出售包含cpn60的系列共转染原核表达载体，试图提高表达的外缘蛋白复性，取得了良好的效果。既往的研究显示，GroEL在体外实验中能显著提高基因工程蛋白蝎毒Cn5、亲环蛋白A和吲哚3一甘油磷酸合成酶等的复性效率。
小泛素样修饰蛋白广泛存在于真核生物中，是一类小分子多肽，参与蛋白质翻译后修饰，其在大肠杆菌表达过程中，自折叠性能良好，也具有诱导某些位于其下游的融合蛋白的折叠作用，统归为伴侣样蛋白。这类包含SUMO的原核表达载体已经在国外有较广范围的应用。
发明内容
鉴于上述发现，本发明的目的是提供了一种新型融合蛋白表达载体，其功能具有类似伴侣样蛋白的作用。并且采用了人类自身的蛋白质，具有非排异性或免疫原性微弱的特点。
本发明通过以下技术方案得以实现：
SEQ ID NO:1～9中任一项所述的人类游离脂肪酸结合蛋白在构建类似伴侣样蛋白的作用的融合蛋白表达载体中的应用。
所述的应用，优选经优化后的所述的人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列插入融合蛋白表达载体中作为上游蛋白。
一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体，其克隆区上游包含编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列。
所述的融合蛋白表达载体，人类游离脂肪酸结合蛋白下游优选包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白的多克隆区。
其中，所述的编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列为经过密码子优化的编码序列，所编码的人类游离脂肪酸结合蛋白的同源性与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等于或大于85％。
所述的编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列进一步优选如SEQ ID NO:10所示。
所述的表达载体中位于编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列下游的柔性接头区和多克隆区序列优选如SEQ ID NO:13所示。
所述的表达载体中编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列的上游还优选包含编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列，进一步优选编码组氨酸标签的序列。
本发明所述的表达载体在表达目标蛋白中的应用。
一种表达伴侣样蛋白的融合蛋白的方法，将目标蛋白编码序列插入权利要求3～8中任一项所述的表达载体柔性接头区下游的多克隆区得到含融合蛋白编码序列的重组表达载体，将该载体转染宿主细胞，培养宿主细胞表达融合蛋白。
有益效果：
1.本发明构建的重组表达载体能够促进或诱导被融合的下游蛋白的折叠,具有蛋白伴侣样蛋白的特性；
2.该FABP蛋白为人源性,理论上不存在对人体的免疫原性,适于制药工业中解决目标蛋白包涵体问题,并且可以保留融合蛋白一同治药。
附图说明
图1、hFABP融合蛋白示意图
图2、pET28a-hFABP6表达载体物理图
图3、pET28-hFABP-hEGF融合蛋白表达载体物理图
图4、pET28-hEGF表达载体物理图
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的应用进行说明，所举的实施例仅是对本发明的应用作概括性例示，有助于更好地理解本发明的用途，但并不会限制本发明应用范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、hFABP的编码DNA的人工合成和优化，本实施例以hFABP6为例(SEQ ID NO:6)：
(1)取hFBP6氨基酸序列逆向翻译成DNA编码序列，经过密码子优先性、核糖体结合区序列优化获得序列(SEQ ID NO:10),但不限于此序列，以翻译后的蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85％为限。
(2)将该编码序列分段合成寡核苷酸单链DNA(SEQ ID NO:11～24)。
(3)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列，包含5’-6xHisTag(SEQ IDNO:25,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:26)、hFBP6氨基酸编码序列、3’-柔性接头序列(Linker)和多克隆区(SEQ ID NO:27,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:28)。
(4)经测序反应验证全长DNA序列(SEQ ID NO:29,其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:30所示)。
步骤二、载体制备：
(1)将步骤一合成得到的hFABP6编码序列(SEQ ID NO:29)，包含5’-6xHisTag、3’-柔性接头序列(Linker)和多克隆区，经限制性内切酶酶切消化、琼脂糖凝胶纯化，获得两端分别是Nco I和Xho I的粘性接头的插入片段。
(2)制备表达载体pET28a，但不限于该表达载体：
①取pET28a载体1μg，用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切。
②琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性化后的pET28a载体。
③用T4DNA连接酶将包含hFABP6序列的插入片段和步骤②制备好的pET28a表达载体连接。
④转化大肠杆菌感受态菌株DH5α，含卡那霉素(Kan)抗生素的培养皿培养过夜，然后挑取单菌落，PCR法鉴定阳性克隆，常规制备DNA质粒。
⑤将阳性克隆质粒送交DNA序列分析，选取和保留正确序列的克隆供表达测试。
⑥载体命名为pET28a-hFABP6(SEQ ID NO:31)
步骤三、载体的表达测试：
(1)将步骤二得到的pET28a-hFABP6载体DNA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得Kan抗性的菌落。
(2)挑取单菌落数个，LB培养基培养，IPTG诱导4-12小时，收集菌液1mL，离心收集菌体，1×PBS洗涤一次，再悬浮于0.5mL 1×PBS，超声破碎菌体，离心去沉淀。
(3)取适量20μL上清与上样缓冲液混合，95℃加热变性10分钟，离心收集至管底，至于冰上。
(4)取10μL上样15％聚丙烯酰胺电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白质条带和hFABP6蛋白的表达情况。
(5)重组hFABP6，包括N-HisTag、柔性接头、多克隆区，共158aa,分子量17.2kDa。hFABP6占菌体总蛋白的20％，可溶性表达。
实施例2
pET28-hFABP-hEGF融合蛋白表达载体构建
一、由pET28a-hFABP6构建hFABP-hEGF：
1、人工合成编码hEGF成熟肽的DNA序列(SEQ ID NO：32)；
2、PCR方法引入Kpn I(5’-端)和Xho I(3’-端)双酶切克隆位点；
上游引物：5’–TTTTGGTACCAACTCTGACTCTGAATGCC-3’(SEQ ID NO:33),下游引物：5'-TTTTCTCGAGTTAACGCAGCTCCCACCATTTGAG-3’,(SEQ ID NO:34)
3、Kpn I/Xho I双酶切处理表达载体pET28a-hFABP6；
4、分别胶回收hEGF编码DNA插入片段和pET28a-hFABP6载体片断；
5、T4DNA连接酶连接pET28a-hFABP6载体片段与hEGF插入片段DNA，形成的重组表达载体中含包括SEQ ID NO:35所示的组氨酸标签编码序列-hFABP6蛋白编码序列-柔性接头区-hEGF插入片段DNA,其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；
6、上一步得到的重组表达载体直接转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落PCR鉴定，所用PCR引物为pET28a的测序引物T7-primer(SEQ ID NO:37)和T7-terminator。(SEQ ID NO:38)
7、保留含有比pET28a-hFABP6空载体PCR片段更大条带的阳性克隆，送DNA序列分析，保留正确序列的克隆，供测试表达分析。
8、正确克隆命名为pET28-hFABP-hEGF(SEQ ID NO:39)。
二、对照克隆pET28-hEGF的构建
1、人工合成编码hEGF成熟肽的DNA序列；
2、PCR方法引入Nco I(5’-端)和Xho I(3’-端)双酶切克隆位点和起始密码子ATP；上游引物：5’–TTTTCCATGAACTCTGACTCTGAATGCC-3’(SEQ ID NO:40),下游引物：5'-TTTTCTCGAGTTAACGCAGCTCCCACCATTTGAG-3’(SEQ ID NO:34)
3、Nco I/Xho I双酶切处理表达载体pET28a；
4、分别胶回收hEGF编码DNA插入片段和pET28a载体片断；
5、T4DNA连接酶连接pET28a DNA片段与hEGF DNA片段；
6、直接转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落PCR鉴定，所用PCR引物为pET28a的测序引物T7-Primer(SEQ ID NO:37)和T7-Terminator。(SEQ ID NO:38)
7、保留含有比pET28a空载体PCR片段更大条带的阳性克隆，送DNA序列分析，保留正确序列的克隆，供测试表达分析。
8、正确克隆命名为pET28-hEGF(SEQ ID NO:41)。
二、测试表达分析
1、分别扩增含pET28-hFABP-hEGF和pET28-hEGF质粒DNA的BL21(DE3)菌株；
2、IPTG诱导蛋白质表达；
3、收集菌体，×PBS洗涤一次，再加1×PBS 500μL，超声波破碎细胞；
4、离心保留上清，沉淀部分加1×PBS 500μL悬浮，分别取50μL加等量2×LoadingBuffer，95℃变性10分钟，上样，20％聚丙烯酰胺凝胶电泳；
5、考马斯亮蓝染色、脱色后观察结果。
6、结果发现，hFABP6-hEGF融合表达的蛋白上清中可溶性表达占50％，而hEGF单独表达的全部为包函体，说明上游蛋白hFABP6具有促进hEGF折叠的作用。
7、结论：pET28-hFABP6-hEGF融合蛋白表达载体中，上游蛋白hFABP6具有促进hEGF折叠的蛋白伴侣样作用。
Claims (10)
1.SEQ ID NO:6所示的人类游离脂肪酸结合蛋白在构建类似伴侣样蛋白的作用的融合蛋白表达载体，促进或诱导被融合的下游蛋白的折叠中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将SEQ ID NO: 10所示的经优化后的所述人类游离脂肪酸结合蛋白编码基因序列插入融合蛋白表达载体中作为上游蛋白。
3.一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体，其特征在于克隆区上游包含编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列;所述的人类游离脂肪酸结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白表达载体，其特征在于人类游离脂肪酸结合蛋白编码基因下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白的多克隆区。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白表达载体，其特征在于所述的编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
6.根据权利要求4所述的融合蛋白表达载体，其特征在于所述的表达载体中位于编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列下游的柔性接头区和多克隆区序列如SEQ ID NO: 13所示。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白表达载体，其特征在于所述的表达载体中编码人类游离脂肪酸结合蛋白的核酸序列的上游还包含编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列。
8.权利要求7所述的融合蛋白表达载体，其特征在于所述的编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列为编码组氨酸标签的序列。
9.权利要求3~8中任一项所述的表达载体在表达目标蛋白中的应用。
10.一种表达伴侣样蛋白的融合蛋白的方法，其特征在于将目标蛋白编码序列插入权利要求3~8中任一项所述的表达载体柔性接头区下游的多克隆区得到含融合蛋白编码序列的重组表达载体，将该载体转染宿主细胞，培养宿主细胞表达融合蛋白。
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