CN101849005A - 杂合融合报道子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了编码可用于例如蛋白质互补测定中的杂合融合蛋白的载体以及编码不同杂合融合蛋白的一系列载体。

Description

杂合融合报道子及其应用
与相关申请的交叉参考
本申请要求2007年11月5日提交的美国申请60/985,585的权益，其公开内容援引加入本文。
背景
萤光素酶生物传感器已被描述。例如Sala-Newby et al.(1991)揭示了Photinus pyralis萤光素酶cDNA被体外扩增以产生环状AMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点。特别地，第217位的缬氨酸被突变为精氨酸以产生位点RRFS，七肽kemptide，猪丙酮酸激酶的磷酸化位点，被加入到萤光素酶的N或C末端。Sala-Newby et al.涉及携带磷酸化位点的蛋白质由它们的比活性、pI、pH对发射光颜色的作用及蛋白激酶A的催化亚基在ATP存在下的作为而鉴定。他们发现仅一个重组蛋白(RRFS)显著不同于野生型萤光素酶，RRFS突变体具有更低比活性，更低pH最佳值，在低pH发射更绿的光，当磷酸化时降低其活性高达80％。后一作用被揭示由磷酸酶逆转。
Waud et al.(1996)将蛋白激酶识别序列及蛋白酶位点工程化入Photinuspyralis萤光素酶cDNA中。萤光素酶的两个结构域被Waud et al.修饰；一个位于氨基酸209-227之间，另一个在C末端，在氨基酸537-550之间。Waud et al.揭示残基290-227之间氨基酸突变降低生物发光活性至野生型重组体的1％以下，而在C末端工程化肽序列导致在野生型重组萤光素酶的0.06％-120％的比活性。Waud et al.还揭示了向变体萤光素酶中加入环状AMP依赖性蛋白激酶催化亚基导致30％活性降低，所述变体萤光素酶掺入激酶识别序列LRRASLG(SEQ ID NO：80)，在氨基酸位置543具有丝氨酸。碱性磷酸酶处理恢复活性。Waud et al.进一步揭示含有凝血酶识别序列LVPRES(SEQ ID NO：81)在氨基酸542-543之间具有裂解位点的变体萤光素酶的生物发光活性当在凝血酶存在下保温时降低50％。
Ozawa et al.(2001)描述了生物传感器，其基于合理设计的萤火虫萤光素酶片段的蛋白质剪接诱导的互补。蛋白质剪接是翻译后蛋白质修饰，通过其intein(内部蛋白)从前体融合蛋白被切掉，侧翼extein(外部蛋白)被连接成连续多肽。揭示了来自Synechocystis sp.PCC6803的N和C末端inteinDnaE分别各自融合萤光素酶的N和C末端片段。蛋白质-蛋白质相互作用激发DnaE intein的折叠，导致蛋白质剪接，由此连接的萤光素酶的extein恢复其酶活性。Ozawa et al.揭示已知结合配偶体磷酸化胰岛素受体底物l(IRS-1)与其靶PI 3-激酶的N末端SH2结构域之间的相互作用用分离(split)萤光素酶在胰岛素存在下监测。
Paulmurugan et al.(2002)采用基于分离(split)萤火虫萤光素酶的测定在细胞培养物中及在小鼠中监测两种蛋白质即MyoD和Id之间的相互作用，使用互补策略及intein介导的重构策略。为保持报道子活性，在互补策略中，融合蛋白需要蛋白质相互作用，即经过蛋白质配偶体MyoD和Id的相互作用，而在重构策略中，经intein介导的剪接形成的新的完整甲壳虫萤光素酶保持其活性，甚至在蛋白质配偶体之间持续相互作用不存在下也如此。
蛋白质片段互补测定在Michnick et al.(U.S.Patent Nos.6,270,964，6,294,330 and 6,428,951)中揭示。特别地，Michnick描述了基于分离鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的测定，其中DHFR的N末端片段及DHFR的C末端片段各自融合GCN4亮氨酸拉链序列。DHFR活性在表达两个融合蛋白的细胞中检测。Michnick et al.还描述了另一种互补途径，其中氨基糖苷激酶(AK)基因中S1核酸酶产生的缺失的嵌套组被导入亮氨酸拉链构建体，所得构建体组被导入细胞并筛选AK活性。
另外，一些酶可以被环状变换(circularly permuted)并可以保留活性(参见例如Cheltsov et al.，2003，Jougard et al.，2002，and Nagai et al.，2001)。
因此，酶可以保留催化活性，甚至当它们的结构被实质改变时也可如此，例如通过环状变换它们的氨基酸序列或者将酶分离成两个片段。
发明概述
融合蛋白对(杂合蛋白系统)可用于揭示及分析细胞内蛋白质相互作用，例如当一个融合蛋白具有融合于(第一个)异源氨基酸序列(一种被选择与另一个(第二个)异源氨基酸序列相互作用或可疑与其相互作用的序列)的报道蛋白的一部分(片段)，另一个融合蛋白具有功能不同蛋白质的一部分，其互补所述报道蛋白部分的活性并融合于所述第二个异源氨基酸序列。所述片段的N和/或C末端在全长野生型蛋白质序列的耐受修饰的一个残基或一个区域。“功能不同的蛋白质(functionally disctinctive protein)”是一种蛋白质，相对于报道蛋白，其来自不同的催化类别，是作用于结构独立的非重叠底物的酶，具有不同的生理学功能，具有小于大约80％、包括小于大约70％、60％、50％、40％、30％或更低氨基酸序列相同性，或者其任何组合，所述报道蛋白例如突变的水解酶或生物发光酶如突变的脱卤素酶或萤光素酶。例如，卤代烷脱卤素酶与Renilla萤光素酶的氨基酸序列对比揭示它们具有大约30％相同性，因此是功能独立的。另外，卤代烷脱卤素酶的生理学功能是通过裂解卤素基团代谢卤代烷，而Renilla萤光素酶的生理学功能是产生光。卤代烷脱卤素酶属于水解酶催化类别，而Renilla萤光素酶属于单氧化酶催化类别。卤代烷脱卤素酶作用于卤代烃，而Renilla萤光素酶作用于腔肠素(coelenterazine)。由于这些原因的每种，卤代烷脱卤素酶和Renilla萤光素酶是功能独立的。蛋白质如报道蛋白例如生物发光酶的“片段”或“部分”，如本文所用，是小于相应野生型蛋白全长序列的序列，具有实质降低的或无报道子活性，但是其与功能独立的蛋白质片段紧密邻近，显示实质增加的报道子活性。在一个实施方案中，报道蛋白的片段(部分)有相应全长报道蛋白的至少20个、例如至少50个连续残基，可非必须包括相应全长报道蛋白的N末端或C末端残基或N末端或C末端序列。例如，300个氨基酸的全长生物发光蛋白的片段，所述片段可以由功能独立蛋白质的片段互补，可包括生物发光蛋白的残基1-225、5-250、150-300或150-295，因为相应于生物发光蛋白的残基1-大约10，大约145-大约155，大约145-大约155，大约220-大约230或大约290-300的区域中的残基耐受修饰。
在一个实施方案中，感兴趣蛋白质互相相互作用例如结合。在另一个实施方案中，第一个感兴趣蛋白质与样品中的生理学分子相互作用，该相互作用抑制或增强第一个感兴趣蛋白质与第二个感兴趣蛋白质的相互作用。在另一个实施方案中，物质(一或多个感兴趣物质)或一定条件的存在改变感兴趣蛋白质的相互作用。
在一个实施方案中，本发明提供了杂合蛋白系统，其具有美国公申请20060024808(其引入本文做参考)中揭示的突变的水解酶的一部分及生物发光酶的互补部分。尽管突变的水解酶不是酶，但是水解酶底物与其稳定结合依赖于正确的蛋白质结构并且当两个融合蛋白物理邻近时发生。在另一个实施方案中，本发明提供了杂合蛋白系统，其具有生物发光酶的一部分以及功能独立蛋白的互补部分，所述功能独立蛋白例如脂酰基连接酶，脂酰基转移酶，亲脂性结合蛋白等等，见例如NCBI登录号AAF56245，P02690，P02696和P29498，其揭示引入本文做参考。
作为突变的水解酶的例子，突变的脱卤素酶提供了在活细胞或其裂解物内有效标记。这个标记在蛋白质表达及标记的底物存在下仅仅是条件性的。具有突变的脱卤素酶的一部分(片段)的融合蛋白的标记依赖于发生在细胞或裂解物内的特异蛋白质相互作用，所述相互作用在该融合蛋白与具有功能不同蛋白质的互补部分的第二个融合蛋白之间，其为相应野生型水解酶的标记底物。例如，β-视紫红质抑制蛋白可以与突变的水解酶的C末端部分融合，G偶联受体可以与功能不同的蛋白质的互补片段例如Renilla萤光素酶的N末端部分融合。在存在标记的脱卤素酶底物的情况下发生受体刺激时，β-视紫红质抑制蛋白结合受体导致突变的水解酶部分的标记。
在一个实施方案中，本发明提供了多个表达载体。所述载体包括第一个表达载体，其包含第一个多核苷酸，该多核苷酸包含与第一个融合蛋白的开放读框可操纵连接的启动子，所述第一个融合蛋白具有报道蛋白的片段和第一个异源氨基酸序列，所述片段具有相应全长报道蛋白的至少50个连续氨基酸残基但是比其少至少50个氨基酸残基。第二个表达载体包括第二个多核苷酸，该多核苷酸包含与第二个融合蛋白的开放读框可操纵连接的启动子，所述第二个融合蛋白具有相对于报道蛋白功能不同的蛋白质的片段和第二个异源氨基酸序列，所述片段具有相应功能不同的蛋白质的至少50个连续氨基酸残基但是比其少至少50个氨基酸残基。报道蛋白片段的报道活性在功能不同的蛋白质片段的存在下增加，并且依赖于第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用。一个实施方案中，所述报道蛋白是突变体卤代烷脱卤素酶。一个实施方案中，所述报道蛋白是水解酶。一个实施方案中，所述报道蛋白是生物发光酶。一个实施方案中，所述功能不同的蛋白质是珊瑚虫萤光素酶，例如Renilla萤光素酶。一个实施方案中，所述功能不同的蛋白是单氧化酶。一个实施方案中，所述报道蛋白是Oplophorus萤光素酶，所述功能不同的蛋白质不是生物发光蛋白，例如所述功能不同的蛋白质是亲脂转运蛋白，视黄醇结合蛋白，脂肪酸结合蛋白，或FABP样家族蛋白中的蛋白质。一个实施方案中，所述第一和第二表达载体在相同的核酸分子上，例如所述核酸分子是质粒。
在一个实施方案中，本发明提供了用于检测分子相互作用的测定，或者可改变分子相互作用的物质或条件。所述测定包括分别融合于分子结构域的功能不同蛋白质的片段，其中分子结构域的相互作用通过至少一个不同的蛋白质的活性重构检测。
本发明还提供了测试分子相互作用的方法。所述方法包括提供包含第一个蛋白质的片段及第一个异源氨基酸序列的第一个融合蛋白，及包含相对于第一个蛋白质功能不同的蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列的第二个融合蛋白，所述第二个异源氨基酸序列与第一个异源氨基酸序列相互作用或可疑与其相互作用。第一个和第二个异源氨基酸序列互相接触，然后确定第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用产生的第一个蛋白质的活性和/或第二个蛋白质的活性。
在一个实施方案中，本发明提供了组合物。所述组合物包括第一个多核苷酸，该多核苷酸包含与编码第一个融合蛋白的开放读框，所述第一个融合蛋白具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用。所述脱卤素酶片段在相对于脱卤素酶功能不同蛋白质的片段的存在下能稳定结合相应全长野生型脱卤素酶的脱卤素酶底物，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基。所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的一个残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基包含至少一个氨基酸取代，所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成一个键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定。在一个实施方案中，组合物包括第二个多核苷酸，其包含编码第二个融合蛋白的开放读框，所述第二个融合蛋白包含功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段结合增加，其中功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的一个残基或区域中。一个实施方案中，所述第一个或第二个异源氨基酸序列长度至少5个氨基酸残基。一个实施方案中，所述第一个异源氨基酸序列位于脱卤素酶片段的N末端。一个实施方案中，所述第一个异源氨基酸序列位于脱卤素酶片段的C末端。一个实施方案中，所述第二个异源氨基酸序列位于功能不同的蛋白质片段的N末端。一个实施方案中，所述第二个异源氨基酸序列位于功能不同的蛋白质片段的C末端。一个实施方案中，所述突变脱卤素酶相对于相应的全长野生型脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，其中第二个取代位于全长野生型脱卤素酶的活性位点腔中的氨基酸残基。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置，例如相应于氨基酸残基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，缬氨酸，谷氨酸，门冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸或半胱氨酸，其中在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸，甘氨酸，门冬酰胺，门冬氨酸，苏氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于对应氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。一个实施方案中，所述突变体还包含第三个或可选的第四个位于全长野生型脱卤素酶的活性位点腔中的氨基酸残基的取代。一个实施方案中，突变体脱卤素酶的序列与野生型脱卤素酶具有至少85％的氨基酸序列相同性。还提供了包含多核苷酸的分离的宿主细胞。一个实施方案中，所述第一个和第二个多核苷酸在相同的核酸分子上，例如质粒。还提供了包含一或多个编码的融合蛋白的分离的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其具有第一个融合蛋白，所述第一个融合蛋白包含具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用。所述脱卤素酶片段在相对于脱卤素酶功能不同蛋白质的片段的存在下能稳定结合相应全长野生型脱卤素酶的脱卤素酶底物，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基。所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的一个残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基的至少一个氨基酸取代，所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成一个键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定。在一个实施方案中，组合物进一步包括第二个融合蛋白，所述第二个融合蛋白包含功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段结合增加，其中功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的残基或区域中。一个实施方案中，所述第一个或第二个异源氨基酸序列长度至少5个氨基酸残基。一个实施方案中，所述第一个异源氨基酸序列位于脱卤素酶片段的N末端。一个实施方案中，所述第一个异源氨基酸序列位于脱卤素酶片段的C末端。一个实施方案中，所述第二个异源氨基酸序列位于功能不同的蛋白质片段的N末端。一个实施方案中，所述第二个异源氨基酸序列位于功能不同的蛋白质片段的C末端。一个实施方案中，所述功能不同的蛋白质是Renilla萤光素酶。一个实施方案中，所述突变脱卤素酶相对于相应的全长野生型脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，其中第二个取代位于全长野生型脱卤素酶的活性位点腔中的氨基酸残基。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置，例如相应于氨基酸残基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，缬氨酸，谷氨酸，门冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸或半胱氨酸，其中在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸，甘氨酸，门冬酰胺，门冬氨酸，苏氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于对应氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。一个实施方案中，所述突变体还包含第三个或可选的第四个位于全长野生型脱卤素酶的活性位点腔中的氨基酸残基的取代。一个实施方案中，突变体脱卤素酶的序列与野生型脱卤素酶具有至少85％的氨基酸序列相同性。还提供了包含融合蛋白的分离的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了多个表达载体。一个表达载体具有与第一个融合蛋白的开放读框可操纵连接的启动子，所述第一个融合蛋白包含具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用。所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基的至少一个氨基酸取代。所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成一个键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定。组合物还包括第二个表达载体，其包含与第二个融合蛋白的开放读框可操纵连接的第二个启动子，所述第二个融合蛋白包含相对于脱卤素酶功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基。所述功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的一个残基或区域中，其中其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段结合增加。一个实施方案中，脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置。
在一个实施方案中，编码本发明杂合系统的两个融合蛋白的载体被导入细胞、细胞裂解物、体外转录/翻译混合物或上清中。在一个实施方案中，本发明提供了检测样品中两个蛋白质之间相互作用的方法。所述方法包括在有效允许第一个和第二个异源氨基酸序列缔合的条件下，提供样品，所述样品具有表达由多个本发明表达载体编码的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，以及报道蛋白如水解酶例如脱卤素酶的底物，具有至少一个官能团的底物。表达蛋白的存在、量或位置，或者样品中附着底物的至少一个官能团被检测，由此检测两个异源序列是否相互作用。
在一个实施方案中，本发明提供了检测改变两个蛋白质的相互作用的物质的方法。所述方法包括在有效允许第一个和第二个异源序列缔合的条件下提供样品，所述样品具有表达由多个本发明表达载体编码的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，报道蛋白的底物例如具有至少一个官能团的脱卤素酶的底物，以及可疑改变第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用的物质。所样品中报道蛋白的存在或量、或者附着于底物的至少一个官能团相对于不含该物质的样品被检测。一个实施方案中，所述物质促进相互作用。一个实施方案中，所述物质抑制相互作用。一个实施方案中，所述底物是式(I)：R-接头-A-X所示的化合物，其中R是一或多个官能团，接头是分离R和A的基团；A-X是脱卤素酶底物；X是卤素，其中接头是多原子直链或支链，包括C，N，S，或O或包含一或多个环的基团。一个实施方案中，所述第一个或第二个异源氨基酸序列是选择标记蛋白，膜蛋白，细胞溶质蛋白，细胞核蛋白，结构蛋白，酶，酶底物，受体蛋白，转运蛋白，转录因子，通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein)，激酶，信号蛋白，代谢蛋白，线粒体蛋白，受体结合蛋白，核酸结合蛋白，细胞外基质蛋白，分泌的蛋白，受体配体，血清蛋白，免疫原性蛋白，荧光蛋白，或具有反应性半胱氨酸的蛋白。一个实施方案中，所述突变脱卤素酶相对于相应的全长野生型脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，一个取代位于全长野生型脱卤素酶活性位点腔中的氨基酸残基。一个实施方案中，位置272的一个取代氨基酸是苯丙氨酸，甘氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺或门冬酰胺。一个实施方案中，位置106的一个取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置。第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置，例如相应于氨基酸残基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，缬氨酸，谷氨酸，门冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸或半胱氨酸，其中在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸，甘氨酸，门冬酰胺，门冬氨酸，苏氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于对应氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。
在一个实施方案中，本发明提供了检测改变两个蛋白质的相互作用的条件的方法。所述方法包括提供样品置于一种条件，其中所述样品包含由多个本发明表达载体编码的的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，将报道蛋白的底物例如具有至少一个官能团的脱卤素酶的底物加入到样品。样品中报道蛋白的存在或量、或者附着于底物的至少一个官能团相对于不在该条件下的样品被检测。一个实施方案中，所述条件促进相互作用。一个实施方案中，所述条件抑制相互作用。一个实施方案中，所述底物是式(I)：R-接头-A-X所示的化合物，其中R是一或多个官能团，接头是分离R和A的基团；A-X是脱卤素酶底物；X是卤素，其中接头是多原子直链或支链，包括C，N，S，或O或包含一或多个环的基团。一个实施方案中，所述第一个或第二个异源氨基酸序列是选择标记蛋白，膜蛋白，细胞溶质蛋白，细胞核蛋白，结构蛋白，酶，酶底物，受体蛋白，转运蛋白，转录因子，通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein)，激酶，信号蛋白，代谢蛋白，线粒体蛋白，受体结合蛋白，核酸结合蛋白，细胞外基质蛋白，分泌的蛋白，受体配体，血清蛋白，免疫原性蛋白，荧光蛋白，或具有反应性半胱氨酸的蛋白。一个实施方案中，所述突变脱卤素酶相对于相应的全长野生型脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，一个取代位于全长野生型脱卤素酶活性位点腔中的氨基酸残基。一个实施方案中，位置272的一个取代氨基酸是苯丙氨酸，甘氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺或门冬酰胺。一个实施方案中，位置106的一个取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置。第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置，例如相应于氨基酸残基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，缬氨酸，谷氨酸，门冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸或半胱氨酸，其中在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸，甘氨酸，门冬酰胺，门冬氨酸，苏氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于对应氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。
在一个实施方案中，本发明提供了检测样品中两个蛋白质之间的相互作用的方法。所述方法包括在有效允许第一个和第二个异源氨基酸序列缔合的条件下提供样品，所述样品具有表达由多个本发明表达载体编码的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应。一个融合体包括生物发光报道蛋白的片段，另一个融合体包括功能不同的蛋白质的互补片段。然后测量生物发光。一个实施方案中，所述底物是式(I)：R-接头-A-X所示的化合物，其中R是一或多个官能团，接头是分离R和A的基团；A-X是脱卤素酶底物；X是卤素，其中接头是多原子直链或支链，包括C，N，S，或O或包含一或多个环的基团。一个实施方案中，所述第一个或第二个异源氨基酸序列是选择标记蛋白，膜蛋白，细胞溶质蛋白，细胞核蛋白，结构蛋白，酶，酶底物，受体蛋白，转运蛋白，转录因子，通道蛋白，含磷蛋白(phosphor-protein)，激酶，信号蛋白，代谢蛋白，线粒体蛋白，受体结合蛋白，核酸结合蛋白，细胞外基质蛋白，分泌的蛋白，受体配体，血清蛋白，免疫原性蛋白，荧光蛋白，或具有反应性半胱氨酸的蛋白。一个实施方案中，所述突变脱卤素酶相对于相应的全长野生型脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，一个取代位于全长野生型脱卤素酶活性位点腔中的氨基酸残基。一个实施方案中，位置272的一个取代氨基酸是苯丙氨酸，甘氨酸，丙氨酸，谷氨酰胺或门冬酰胺。一个实施方案中，位置106的一个取代的氨基酸是半胱氨酸或谷氨酰胺。一个实施方案中，第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置。第二个取代在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175，176或273的位置，例如相应于氨基酸残基175的位置上的取代的氨基酸是甲硫氨酸，缬氨酸，谷氨酸，门冬氨酸，丙氨酸，亮氨酸，丝氨酸或半胱氨酸，其中在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸，甘氨酸，门冬酰胺，门冬氨酸，苏氨酸，丙氨酸或精氨酸，或其中位于对应氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸，甲硫氨酸或半胱氨酸。
在一个实施方案中，本发明提供了检测改变两个蛋白质的相互作用的物质的方法。所述方法包括在有效允许第一个和第二个异源序列缔合的条件下提供样品，所述样品具有表达由多个本发明表达载体编码的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，报道蛋白的底物例如具有至少一个官能团的脱卤素酶的底物，以及物质。一个融合体包括生物发光报道蛋白的片段，另一个融合体包括功能不同的蛋白质的互补片段。所述物质可疑改变第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用。然后测量生物发光。
在一个实施方案中，本发明提供检测改变两个蛋白质相互作用的条件的方法。所述方法包括提供样品置于一种条件，其中所述样品包含由多个本发明表达载体编码的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物或者表达由所述多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应。一个融合体包括生物发光报道蛋白的片段，另一个融合体包括功能不同的蛋白质的互补片段。然后测量生物发光。
因此，不同的蛋白质的两个片段，其中一个是报道蛋白，一起提供杂合报道系统。在一个实施方案中，报道蛋白片段是生物发光酶的片段，其结构上与全长野生型(天然)生物发光酶相关(基本上序列相应)。在一个实施方案中，报道蛋白片段是突变的水解酶片段，其结构上与全长野生型(天然)水解酶相关(基本上序列相应)，但是相对于相应全长野生型水解酶包括至少一个氨基酸取代，在一些实施方案中至少2个氨基酸取代。全长突变的水解酶相对于相应全长野生型水解酶缺乏或具有降低的催化活性，特异性结合可被相应全长野生型水解酶结合的底物，但是，在导致相应全长野生型水解酶和底物之间反应形成产物的条件下，从突变的水解酶和底物之间的相互作用不形成产物，或者形成实质较少的产物，例如少2、10、100或1000倍。突变的水解酶缺乏产物形成或者产物形成量降低是由于在全长突变的水解酶中至少一个取代所致，所述取代导致在突变的水解酶中与底物形成的键臂相应全长野生型水解酶与底物之间形成的键更稳定。优选地，底物和全长突变的水解酶之间或者底物和互相邻近的两个融合蛋白(一个具有突变的水解酶片段，另一个具有功能不同的蛋白质的互补片段)之间形成的键的半衰期(即t1/2)比相应全长野生型水解酶和底物之间在导致相应全长野生型水解酶形成产物的条件下形成的键的t1/2高，例如高至少2倍，更优选高至少4倍或甚至10倍，直至高100倍、1000倍或10000倍。优选地，底物和全长突变的水解酶之间或者底物和融合蛋白之间形成的键的t1/2为至少30分钟，优选至少4小时，直至至少10小时，以及抗洗涤、蛋白质变性剂和/或高温的破坏，例如所述键对于在SDS中煮沸是稳定。
本发明水解酶片段的至少一个末端的氨基酸序列是在耐受修饰的一个位点(残基)或区域中，例如耐受插入、缺失、环状交换或其任何组合。因此，在一个实施方案中，本发明包括具有水解酶片段的洗脱，所述片段在相应于如下区域的残基的N或C末端，所述区域包括水解酶如SEQ ID NO：1的DhaA的残基14-24、残基25-35、残基52-62、残基73-83、残基93-103、残基131-141、残基149-159、残基175-185、残基190-200、残基204-220、残基230-268或残基289-299。在一个实施方案中，本发明包括具有水解酶片段的系统，所述片段具有在相应于水解酶如DhaA的残基73-83、93-103或204-220的区域中的残基的N或C末端。相应位置可以通过对比水解酶序列鉴别。
在本发明的一个实施方案中，所述系统具有生物发光酶片段，所述片段具有在耐受修饰的区域中的残基的N或C末端，如在如下残基或区域中，其相应于Renilla萤光素酶的残基2-12、26-47、残基64-74、残基86-116、残基146-156、残基164-174、残基188-198、残基203-213、残基218-234、残基246-264、残基269-279或残基301-311，Gaussia萤光素酶的残基43-53、残基63-73、残基79-89、残基95-105、残基105-115、残基109-119、残基121-131或残基157-168，Oplophorus萤光素酶的残基45-55、残基79-89、残基108-188或残基130-140，萤火虫萤光素酶的残基2-12、残基32-53、残基70-88、残基112-126、残基139-165、残基183-203、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408、残基485-495或残基535-546。相应位置可以通过对比萤光素酶序列鉴别。
在一个实施方案中，水解酶片段的一个末端相应于全长野生型水解酶的N末端或C末端内部的位点或区域，另一个可以位于或邻近全长水解酶序列的N末端或C末端。在一个实施方案中，水解酶片段与4个或更多个，例如5、10、20、50、100、200、300或更多个、但少于大约1000个、例如大约700个或者之间的任何整数个异源氨基酸残基融合。在一个实施方案中，水解酶片段包括5％，10％，15％，25％，33％或50％或更多的全长水解酶序列，例如全长水解酶序列的1-20个残基、1-50个残基、1-75个残基、1-100个残基、1-125个残基或者1至从50至125的任何整数个。在一个实施方案中，一个水解酶片段是脱卤素酶的片段，相应于全长脱卤素酶的C末端50、75、100、150、200或250个或者之间任何整数个残基。
在一个实施方案中，生物发光蛋白片段的一个末端相应于全长野生型生物发光蛋白的N末端或C末端内部的位点或区域，另一个可以位于或邻近全长生物发光蛋白序列的N末端或C末端。在一个实施方案中，生物发光蛋白片段与4个或更多个，例如5、10、20、50、100、200、300或更多个、但少于大约1000个、例如大约700个或者之间的任何整数个异源氨基酸残基融合。在一个实施方案中，生物发光蛋白片段包括5％，10％，15％，25％，33％或50％或更多的全长生物发光蛋白序列，例如全长生物发光蛋白序列的1-20个残基、1-50个残基、1-75个残基、1-100个残基、1-125个残基或者1至从50至125的任何整数个。在一个实施方案中，生物发光蛋白的片段是全长生物发光蛋白的C末端50、75、100、150、200或250个或者之间任何整数个残基。
在一个实施方案中，任选地在一或多种外源物质不存在下，异源序列基本上相同并且互相特异性结合，例如形成二聚体。在另一个实施方案中，任选地在一或多种外源物质不存在下，异源序列不同并且互相特异性结合。在一个实施方案中，报道蛋白片段融合于异源序列，该异源序列与细胞分子相互作用。例如，在雷帕霉素存在下，融合于雷帕霉素结合蛋白(FRB)和来自功能不同的蛋白质的另一片段的水解酶片段与FK506结合蛋白(FKBP)融合，产生两种融合蛋白的复合物。在一个实施方案中，在外源物质存在下或者在不同条件下，融合蛋白的复合物不形成。在一个实施方案中，一个异源序列包括例如3或更多个氨基酸残基的结构域，其任选地可被共价修饰，例如磷酸化，其与在另一个异源序列中的结构域非共价相互作用。报道蛋白片段和功能不同的蛋白质可以被用于检测可逆的相互作用，例如两或多个分子的结合，或者其它构象变化或条件变化，如pH、温度或溶剂疏水性，或者不可逆相互作用。
用于本发明的异源序列包括但非限于体外和/或体内相互作用的那些。例如，融合蛋白可以包含水解酶片段和感兴趣的酶，例如萤光素酶、RNasin或RNase，和/或通道蛋白，受体，膜蛋白，细胞溶胶蛋白，核蛋白，结构蛋白，磷蛋白，激酶，信号蛋白，代谢蛋白，线粒体蛋白，受体相关蛋白，荧光蛋白，酶底物，转录因子，转运蛋白和/或靶向序列，例如十四烷基化序列，线粒体定位序列，或者核定位序列或者，其指导水解酶片段例如融合蛋白到特定位置。与报道蛋白片段或互补蛋白片段融合的感兴趣的蛋白质可以是野生型蛋白质的片段，例如蛋白质的功能或结构结构域，如激酶结构域、转录因子等。感兴趣的蛋白质可以融合于报道蛋白片段或互补蛋白片段的N末端或C末端。任选地，融合体中的蛋白质由连接(connector)序列分隔，例如该序列优选具有至少2个氨基酸残基，如具有13-17个氨基酸残基。本发明融合蛋白中连接序列的存在相对于每个蛋白质的功能基本上不改变融合体中每个蛋白质的功能。对于融合体中蛋白质的任何特定组合，可以采用许多种连接序列。在一个实施方案中，连接序列是由酶识别的序列，例如可裂解序列，或者是光裂解序列。
举例的异源序列包括但非限于这样的序列，如在FRB和FKBP中的那些序列，蛋白激酶的调节亚基(PKa-R)和蛋白激酶的催化亚基(PKa-C)，src同源性区域(SH2)及能被磷酸化的序列，例如含有酪氨酸的序列，14-3-3的同种型，例如14-3-3t(参见Mils et al.，2000)，及能被磷酸化的序列，具有WW区域(蛋白质中结合富含脯氨酸分子的序列)的蛋白质(参见Ilsley et al.，2002；and Einbond et al.，1996)及能被磷酸化的异源序列，例如含有丝氨酸和/或苏氨酸的序列，以及二氢叶酸还原酶(DHFR)和促旋酶B(GyrB)中的序列。
编码融合蛋白的表达载体以及具有一或多个载体的宿主细胞及包含载体的试剂盒也被提供。宿主细胞包括原核细胞或真核细胞如植物或脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，包括但非限于人类、非人灵长类、犬、猫、牛、马、绵羊或啮齿类(例如兔、大鼠、雪貂或小鼠)细胞。优选地，表达载体包含启动子，例如组成型或调节型启动子，可操纵地与融合蛋白之一的编码区连接。在一个实施方案中，表达载体含有诱导型启动子。任选地，本发明核酸分子中采用编码融合蛋白的优化的核酸序列，例如人类密码子优化的序列。核酸序列的优化是本领域已知的，例如参见WO 02/16944。在一个实施方案中，提供了宿主细胞，其瞬时、可控制、组成型或稳定表达本发明的一种表达载体。载体或其基因产物可以通过转染、电穿孔、感染、细胞融合或任何其它方式提供。
在一个实施方案中，水解酶是突变水解酶，如突变脱卤素酶，其在相应于野生型脱卤素酶例如SEQ ID NO：1的5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，175，176，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，273，277，282，291或292，或其多个的位置具有突变。突变脱卤素酶因此可以具有多个取代，包括在相应于SEQ ID NO：1的位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，277，282，291或292的位置的多个取代，其中至少一个赋予改良的表达或结合动力学，并且可以包括在耐受取代的位置的进一步取代。在一个实施方案中，突变脱卤素酶可以具有多个取代，包括在相应于SEQ ID NO：1的位置5，7，11，12，20，30，32，47，54，55，56，58，60，65，78，80，82，87，88，94，96，109，113，116，117，118，121，124，128，131，134，136，144，147，150，151，155，157，160，161，164，165，167，172，175，176，180，182，183，187，195，197，204，218，221，224，227，231，233，250，256，257，263，264，273，277，280，282，288，291，292，和/或294的位置的多个取代。
本发明的杂合融合蛋白系统可以用于测量或检测各种条件和/或感兴趣分子。例如，蛋白质-蛋白质相互作用对于细胞生物学的几乎所有方面均是关键的，范围包括基因转录、蛋白质翻译、信号转导和细胞分裂和分化。蛋白质互补测定(PCA)是用于监测蛋白质-蛋白质相互作用的若干方法之一。在PCA中，蛋白质-蛋白质相互作用使酶的两个非功能半区(halves)互相物理接近，使得重折叠成功能酶。相互作用因此被酶活性监测。在蛋白质互补标记(PCL)中，检测酶被突变以捕获底物，例如经酰基突变的酶中间体。因此，在底物和重构的突变酶之间产生共价键，使得随时间累积标记，因此增加检测弱蛋白质-蛋白质相互作用的敏感性。
附图简述
图1A显示DhaA.H272F蛋白的分子模型。螺旋帽结构域(helical capdomain)以浅蓝色示出。α/β水解酶核心结构域(深蓝色)含有催化三联体残基。邻近帽及核心结构域界面的红色阴影残基代表H272F及D106亲核体。黄色阴影残基表示E130位置及卤化物螯合残基W107。
图1B示出玫瑰色红球菌脱卤素酶(DhaA)蛋白的序列(Kulakova et al.，1997)(SEQ ID NO：1)。催化三联体残基Asp(D)，Glu(E)和His(H)下划线。组成帽结构域的残基斜体示出。DhaA.H272F和DhaA.D106C蛋白突变体能与烷基卤化物底物产生共价连接，含有分别由Phe(F)和Cys(C)置换的催化三联体His(H)和Asp(D)残基。
图1C示出DhaA.H272F与烷基卤化物底物形成共价中间体的机制。卤化物基团由Asp106的亲核置换后接共价酯中间体的形成。用Phe残基置换His272防止水激活并且捕获共价中间体。
图1D描绘了DhaA.D106C与烷基卤化物底物形成共价中间体的机制。卤化物由Cys106硫醇盐(thiolate)的亲核置换产生水解稳定的硫醚中间体。
图1E描绘了DhaA.H272F变体与位于活性位点活性的共价附着的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl配体的结构模型。邻近帽及核心结构域界面的红色阴影残基代表H272F及D106亲核体。黄色阴影残基表示E130位置及卤化物螯合残基W107。
图1F示出DhaA.H272F底物结合通道(tunnel)的结构模型。
图2A-B示出DhaA.H272F的位置175、176和273的hits的序列(组A)及DhaA.D106C的位置175和176的序列hits(组B)。
图3提供了本发明范围内的突变的脱卤素酶的举例序列(SEQ ID No.4-19和50-58)。作为克隆结果两个额外残基在3′末端编码(Gln-Tyr)。具有那两个额外残基的密码子的编码突变的脱卤素酶的核酸分子表达水平类似于或高于不具有那些残基的突变的脱卤素酶的表达水平。
图4示出在pHT2中的DhaA.H272H11YL的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)及氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。列出的限制位点被掺入以促进产生功能性N和C末端融合。
图5提供额外取代，其改良具有那些取代的DhaA突变体在大肠杆菌中的表达。
图6示出蛋白质互补标记(PCL)的示意图。
图7描绘了Renilla萤光素酶和脱卤素酶序列的对比。
图8A示出突变的脱卤素酶的结构示意图及用于修饰的举例位点。
图8B描绘了预期的PCL结果。
图8C示出使用脱卤素酶的PCL结果。
图9示出本发明杂合融合蛋白的FluoroTect(A)和Texas Methyl Red(TMR)(B)凝胶。M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，和11kDa。M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，28/20，和14kDa。泳道1)全长突变的DhaA(HTv7)；泳道2)FRB-HTv7(1-78)+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全长Renilla萤光素酶(hRL)；泳道5)FRB-hRL(1-91)+FKBP-hRL(92-311)；泳道6)FRB-HTv7(1-78)+FKBP-hRL(92-311)；泳道7)FRB-hRL(1-91)+FKBP-HTv7(79-297)；泳道8)无DNA。NA：不适用于这个实验。HTv7和Renilla萤光素酶的催化部分位于各自的C末端部分(分别为残基78-297或者98-297及残基92-311或者112-311)。注意每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素(rapamycin)，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素。
图10示出本发明杂合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝胶。M1(FluoroTect and TMR)从上至下：155，98，63，40，32，和21kDa。泳道1)无DNA；泳道2)全长突变的DhaA(HTv7)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全长Renilla萤光素酶(hRL)；泳道5)FRB-hRL(1-111)+FKBP-hRL(112-311)；泳道6)FRB-HTv7(1-98)；泳道7)FRB-hRL(1-111)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道8)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-hRL(112-311)；泳道9)FKBP-HTv7(99-297)；泳道10)FRB-hRL(1-111)；泳道11)FKBP-hRL(112-311)。注意每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素。
图11A-B描绘了PCA Renilla萤光素酶测定中的RLU。
图12示出本发明杂合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝胶。M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，和11kDa。M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，36，28/20，和14kDa。泳道1)全长突变的DhaA(HTv7)；泳道2)HTv7(1-78)-FRB+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)HTv7(1-98)-FRB+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)全长Renilla萤光素酶(hRL)；泳道5)hRL(1-91)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道6)hRL(1-111)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道7)HTv7(1-78)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道8)HTv7(1-98)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道9)hRL(1-91)-FRB+FKBP-HTv7(79-297)；泳道10)hRL(1-111)-FRB+FKBP-HTv7(99-297)；泳道11)无DNA。注意每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素。
图13示出本发明杂合融合蛋白的RLU。
图14提供了本发明的杂合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝胶。M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，和11kDa。M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，36，28/20，和14kDa。泳道1)全长HTv7；泳道2)HTv7(79-297)-FKBP+FRB-HTv7(1-78)；泳道3)HTv7(99-297)-FKBP+FRB-HTv7(1-98)；泳道4)全长Renilla萤光素酶(hRL)；泳道5)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-91)；泳道6)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-111)；泳道7)HTv7(79-297)-FKBP+FRB-hRL(1-91)；泳道8)HTv7(99-297)-FKBP+FRB-hRL(1-111)；泳道9)hRL(92-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-78)；泳道10)hRL(112-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-98)；泳道11)无DNA。
图15示出本发明杂合融合蛋白的RLU。
图16提供了本发明的杂合融合蛋白的Fluorotect(A)和TMR(B)凝胶。样品M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，11kDa，M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，36，28/20，14kDa。泳道1)全长HTv7；泳道2)FRB-HTv7(1-78)+FKBP-HTv7(79-297)；泳道3)FRB-HTv7(1-98)+FKBP-HTv7(99-297)；泳道4)luc8(1-91)-FRB+Rluc8(92-311)-FKBP；泳道5)Rluc8(1-111)-FRB+Rluc8(112-311)-FKBP；泳道6)Rluc8(1-91)-FRB+FKBP HTv7(79-297)；泳道7)Rluc8(1-111)-FRB+FKBP HTv7(99-297)；泳道8)Rluc8(92-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-78)；泳道9)Rluc8(112-311)-FKBP+FRB-HTv7(1-98)；泳道10)Rluc8(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-78)；泳道11)Rluc8(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-98)；泳道12)FL Rluc8；泳道13)无DNA(仅+雷帕霉素在SDS-PAGE上电泳)。HTv7和Renilla萤光素酶的催化部分分别位于(resided and reside)C末端(残基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素，泳道13除外，其仅有+雷帕霉素电泳。
图17示出PCA Renilla萤光素酶测定中的RLU。
图18示出本发明的杂合融合蛋白的FluoroTect凝胶。样品M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，11kDa。泳道1)全长Renilla萤光素酶(FL-hRL)；泳道2)hRL(1-91)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道3)hRL(1-111)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道4)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-91)；泳道5)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-111)；泳道6)hRL(1-13)-(HTv7(2-78)-FRB+FKBP-hRL(92-311)；泳道7)hRL(1-13)-(HTv7(2-98)-FRB+FKBP-hRL(112-311)；泳道8)hRL(92-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(2-78)；泳道9)hRL(112-311)-FKBP+FRB-hRL(1-13)-HTv7(2-98)；泳道10)无DNA。HTv7和Renilla萤光素酶的催化部分分别位于C末端(残基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素，泳道13除外，其仅有+雷帕霉素电泳。
图19示出PCA Renilla萤光素酶测定中RLU。
图20提供了本发明的杂合融合蛋白的FluoroTect(A)和TMR(B)凝胶。样品M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，11kDa；M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，36，28/20，14kDa。泳道1)全长HTv7；泳道2)FRB-H78+FKBP-H79；泳道3)FRB-H98+FKBP-H99；泳道4)FRB-H78+H79-FKBP；泳道5)FRB-H98+H99-FKBP；泳道6)H78-FRB+FKBP-H79；泳道7)H98-FRB+FKBP-H99；泳道8)H78-FRB+H79-FKBP；泳道9)H98-FRB+H99-FKBP；泳道10)FRB-hRL91+FKBP-H79；泳道11)FRB-hRL111+FKBP-H99；泳道12)FRB-hRL91+H79-FKBP；泳道13)FRB-hRL111+H99-FKBP；泳道14)hRL91-FRB+FKBP-H79；泳道15)hRL111-FRB+FKBP-H99；泳道16)hRL91-FRB+H79-FKBP；泳道17)hRL111-FRB+H99-FKBP；泳道18)RLuc8-91-FRB+FKBP-H79；泳道19)RLuc8-111-FRB+FKBP-H99；泳道20)FRB-RLuc8-91+H79-FKBP；泳道21)FRB-RLuc8-111+H99-FKBP；泳道20)无DNA。HTv7和Renilla萤光素酶的催化部分分别位于C末端(残基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。每个样品第一个泳道不具有雷帕霉素，每个样品第二个泳道具有雷帕霉素，泳道13除外，其仅有+雷帕霉素电泳。
图21示出各种杂合融合蛋白的标准化结果。
图22示出本发明杂合融合蛋白的Fluorotect(A)和TMR(B)结果。M1(FluoroTect)从上至下：155，98，63，40，32，21，11kDa；M2(TMR)从上至下：200，97，66，42，36，28/20，14kDa。泳道1)全长HTv7；泳道2)FRB-hRL91+H79-FKBP；泳道3)hRL91-FRB+FKBP-H79；泳道4)RLuc8-91-FRB+H79-FKBP；泳道5)RLuc8-91-FRB+FKBP-H79；泳道6)FRB-H78+H79-FKBP；泳道7)H78-FRB+FKBP-H79；泳道8)无DNA。HTv7和Renilla萤光素酶的催化片段分别位于C末端(残基78-297，98-297，92-311和112-311)片段上。
图23示出各种杂合融合蛋白的标准化结果。
图24提供了举例的杂合融合蛋白的序列(SEQ ID No.20-46)。
图25提供了酰基-CoA连接酶、酰基-硫醇连接酶、脂酰基-CoA合成酶、亲脂性转运蛋白、视黄醇结合蛋白或脂肪酸结合蛋白的举例序列(SEQ IDNo.90-99)，它们可用于本发明的杂合融合蛋白中。还参见NCBI登录号YP703428，AAX98210，P97524，A1AD19，POC061，POC062，CAL16433，Q55DR6，YP00191167，Q688CK6，P08592，Q5K4L6，P02696，P21760，P55054，NP074045，和AAA686627，其援引加入本文做参考。
发明详述
定义
如本文所用，“底物”包括具有反应基团及任选一或多个官能团的底物。包括一或多个官能团的底物通常在本文称为本发明底物。底物例如本发明底物还可任选包括接头，例如可裂解接头，其物理分离一或多个官能团和底物中的反应基团，在一个实施方案中，接头优选长度为12-30个原子。接头可以不总是存在于本发明底物中，但是在一些实施方案中，反应基团与官能团的物理分离可能是需要的，以便反应基团可以与突变的水解酶中的反应残基相互作用以形成共价键。优选地，相对于缺少接头的相应底物与野生型或突变的水解酶的特异性或反应性，当存在时，接头基本上不改变例如削弱具有接头的底物与野生型或突变的水解酶的特异性或反应性。另外，接头的存在优选基本上不改变例如削弱官能团的一或多种性质例如功能。例如，对于一些突变的水解酶，即具有深催化口袋的那些，本发明底物可以包括足够长度和结构的接头，以便本发明底物的一或多个官能团不干扰相应蛋白质例如水解酶蛋白(野生型或突变的)的3D结构。
如本文所用，“官能团”是可检测或能检测的分子，例如可通过直接或间接手段测量的分子(例如光活化分子、地高辛、镍NTA(次氮基三乙酸)、生色团、荧光团或发光团)，可以结合或附着于第二种分子(例如生物素、半抗原或交联基团)，或者可以是固体支持物。官能团可具有一种以上性质如能检测或能结合另一种分子。
如本文所用，“反应基团”是由特定野生型或本发明突变的水解酶特异识别的底物中最小数目原子。底物中反应基团与野生型水解酶的相互作用产生产物及野生型水解酶的再生。
如本文所用，术语“异源”核酸序列或蛋白质是指相对于参照序列具有不同来源的序列，例如源自外来物种，或者如果来自相同物种，其可以从原始形式实质上修饰。
术语“融合多肽”或“融合蛋白”是指嵌合蛋白，其含有在N和/或C末端与一或多个异源序列连接的参照蛋白(例如报道蛋白如水解酶或者生物发光蛋白)。在一些实施方案中，在不存在感兴趣外源物质或分子时，或者在一定条件下，融合多肽中的异源序列可以保留相应于异源序列的相应全长(非融合)多肽的至少一些或基本上相同的活性。在其它实施方案中，在存在感兴趣外源物质或分子时或者在一定条件下，融合多肽中的异源序列可以保留相应于异源序列的相应全长(非融合)多肽的至少一些或基本上相同的活性。
“生物发光蛋白”包括介导在发光生物体中发现的发光反应的酶。例子是甲壳虫萤光素酶，其全部催化ATP介导的甲壳虫萤光素的氧化；珊瑚虫(anthozoan)萤光素酶，其全部催化coelenterazine的氧化；Ca(2+)-调节的光蛋白，其也全部催化coelenterazine的氧化。萤光素酶可以分离或得自各种发光生物，如Photinus pyralis的萤火虫萤光素酶或者Renilla reniformis的Renilla萤光素酶。本文所用“萤光素酶”应指任何类型的萤光素酶，源自任何天然、合成或遗传改变的来源，包括但非限于：来自萤火虫Photinuspyralis的萤光素酶或者其它甲壳虫萤光素酶(如得自click beetles(例如Pyrophorus plagiophthalamus)或glow worms(Pheogodidae spp.)的萤光素酶)，海肾Renilla reniformis，Vargula物种，例如Vargula hilgendorfii，桡脚亚纲的动物，例如Gaussia或Metridia物种，十足类，例如Oplophorus物种，帽贝Latia neritoides，和发光细菌例如Xenorhabdus luminescens和Vibriofisherii。
“亲核体”是提供电子的分子。
如本文所用，“标记基因”或“报道基因”是赋予表达该基因的细胞独特表型的基因，因此允许具有该基因的细胞与不具有该基因的细胞区分开。这种基因可编码可选择或可筛选的标记，这根据标记是否赋予可以通过化学手段“选择”的性状，即通过使用选择剂(例如除草剂、抗生素或类似物)选择，或者是否其简单地是可以通过观测或测试即通过“筛选”鉴别的“报道”性状。本发明的元件通过使用特定标记基因举例示出。当然，合适标记基因或报道基因的许多例子是现有技术已知的并且可以用于本发明实践。因此，应理解下述讨论是举例的而非除外的。基于本文解释的技术及本领域已知的一般重组技术，本发明使得改变任何基因称为可能。举例的修饰的报道蛋白由包含修饰的报道基因的核酸分子编码，其包括但非限于如下基因的修饰：neo基因、β-gal基因、gus基因、cat基因、gpt基因、hyg基因、hisD基因、ble基因、mprt基因、bar基因、腈水解酶基因、半乳糖吡喃糖苷基因、木糖苷酶基因、胸苷激酶基因、阿拉伯糖苷酶基因、突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)或乙酰乙酸合酶基因(AAS)、氨甲喋呤抗性dhfr基因、茅草枯脱卤素酶基因、赋予对5-甲基色氨酸抗性的突变的氨基苯甲酸合酶基因(WO 97/26366)、R-基因座基因、β-内酰胺酶基因、xylE基因、α-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因、萤光素酶(luc)基因(例如Renillareniformis萤光素酶基因、萤火虫萤光素酶基因或者click beetle萤光素酶(Pyrophorus plagiophthalamus)基因、水母发光蛋白基因、红色荧光蛋白基因或者绿色荧光蛋白基因。术语内包括的选择或筛选标记基因还是编码“分泌标记”的基因，其分泌可以作为鉴别或选择转化细胞的手段而被检测。例子包括编码可通过抗体相互作用鉴别的分泌抗原的标记，或者甚至可以通过它们的催化活性检测的分泌酶。分泌蛋白落入许多类别，包括小的可扩散蛋白，可以例如通过ELISA检测，及插入或捕获在细胞膜中的蛋白质。
“选择标记蛋白”编码酶活性，赋予细胞在缺乏否则是必需营养素的培养基中生长的能力(例如酵母细胞中的TRP1基因)，或者在具有抗生素或其它药物的培养基中生长的能力，即编码选择标记蛋白的基因在细胞中的表达赋予该细胞相对于无该基因的相应细胞对抗生素或药物的抗性。当宿主细胞必须表达选择标记以在选择性培养基中生长时，标记被称为阳性选择标记(例如抗生素抗性基因，其赋予在合适抗生素存在下生长的能力)。选择标记也可以用于选择除去含有特定基因(例如sacB基因，其如果表达则杀死在含有5％蔗糖的培养基中生长的细菌宿主细胞)的宿主细胞；以此方式使用的选择标记被称为阴性选择标记或反选择标记(counter-selectablemarker)。常用选择标记基因序列包括编码对抗生素抗性的那些基因序列，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、嘌呤霉素、博来霉素、链霉素、潮霉素、新霉素、ZeocinTM，等。可选择的营养缺陷型基因序列包括例如hisD，其允许在组氨醇存在下在无组氨酸培养基中的生长。合适的选择标记基因包括博来霉素抗性基因、金属硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸转移酶基因、AURI基因、腺苷脱氨酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、胸苷激酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，等。
“核酸”如本文所用是共价连接的核苷酸序列，其中一个核苷酸的戊糖的3′位置通过磷酸二酯基团与下一个的戊糖的5′位置连接，以及其中核苷酸残基(碱基)以特异序列连接，即核苷酸线性顺序，并且包括其类似物，如具有一或多个修饰碱基、糖和/或磷酸骨架的那些。“多核苷酸”如本文所用是含有大约大于100个核苷酸长度序列的核酸。“寡核苷酸”或“引物”如本文所用是短多核苷酸或者多核苷酸的一部分。术语“寡核苷酸”或“寡聚物”如本文所用定义为由2或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子，优选大于3个、通常大于10个、但是小于250个、优选小于200个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、扩增例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录(RT)，或其组合。“引物”是寡核苷酸，当置于起始引物延伸的条件下时其能作为核酸合成的起始点。选择引物以便在其3′末端上具有基本互补于靶(模板)的特异序列的区域。引物必须足够互补以与靶杂交用于发生引物延长。引物序列无需反映靶的精确序列。例如，非互补核苷酸片段可以附着于引物的5′末端，引物序列的其余部分与靶基本互补。非互补碱基或更长序列可以散布在引物中，条件是引物序列与靶序列具有足够互补性以杂交及由此形成复合物用于合成引物延伸产物。与基因序列匹配或互补的引物可以用于扩增反应、RT-PCR等中。
核酸分子被称为具有“5′末端”和“3′末端”是因为核酸磷酸二酯键发生在取代单核苷酸的戊糖环的5′碳和3′碳。其中新连键是5′碳的多核苷酸的末端是其5′末端核苷酸。其中新连键是3′碳的多核苷酸的末端是其3′末端核苷酸。末端核苷酸如本文所用是在3′或5′末端的末端位置的核苷酸。
DNA分子被称为具有“5′末端”和“3′末端”是因为单核苷酸反应以制备寡核苷酸，从而一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸在一个方向经磷酸二酯键附着于其相邻的3′氧。因此，如果其5′磷酸未连接单核苷酸戊糖环的3′氧，寡核苷酸的一个末端称为“5′末端”，以及称为“3′末端”，如果其3′氧未连接后一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸。
如本文所用，核酸序列即使位于更大寡核苷酸或多核苷酸内部，也可以被称为具有5′和3′末端。在线性或环状DNA分子中，分立的元件被称为在“下游”或3′元件的“上游”或5′。这个术语反映了这样事实，转录沿DNA链以5′至3′方式行进。典型地，指导连接的基因(例如开放读框或编码区)转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5′或上游。但是，增强子元件甚至当位于启动子元件及编码区的3′时也可以发挥其作用。转录终止及聚腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。
术语“密码子”如本文所用是基本遗传编码单位，由3个核苷酸序列组成，限定了掺入多肽链的特定氨基酸，或者起始或终止信号。术语“编码区”当用于结构基因时是指编码在作为mRNA分子翻译结果的新生多肽中发现的氨基酸的核苷酸序列。典型地，编码区在5′侧由核苷酸三联体“ATG”限制，其编码起始甲硫氨酸，在3′侧由终止密码子限制(例如TAA、TAG、TGA)。在一些情况中，编码区也已知由核苷酸三联体“TTG”起始。
如本文所用，“分离的”是指核酸分子、多肽、肽或蛋白质的体外制备、分离和/或纯化，从而其不与体内物质缔合。因此，术语“分离的”当用于与核酸相关时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，是指从其一般在其来源中缔合的至少一种污染物鉴别和分离的核酸序列。分离的核苷酸以不同于其天然发现的形式或设置存在。相反，未分离的核酸(例如DNA和RNA)以它们在自然界中存在的状态被发现。例如，一给定DNA序列(例如基因)在宿主细胞染色体上发现邻近相邻基因；RNA序列(例如编码特异蛋白质的特异mRNA序列)在细胞中作为与许多其它编码多种蛋白质的mRNA的混合物而发现。因此，对于包括基因组、cDNA或者合成来源的多核苷酸或者其一些组合的“分离的核酸分子”，“分离的核酸分子”(1)不与其中“分离的核酸分子”在自然界发现的多核苷酸的全部或部分缔合，(2)可操纵地与其在自然界不连接的多核苷酸连接，或者(3)不在自然界中作为更大序列的部分而发生。分离的核酸分子可以以单链或双链形式存在。当核酸分子被用于表达蛋白质时，所述核酸含有至少有义或编码链(即核酸可以是单链的)，但是可以含有有义及反义链(即核酸可以是双链的)。
术语“分离的”当与多肽相关使用时，如“分离的蛋白质”或“分离的多肽”，是指从其一般在其来源中缔合的至少一种污染物鉴别和分离的多肽。因此分离的多肽(1)不与在自然界发现的蛋白质缔合，(2)不含来自相同来源的其它蛋白质，例如不含人类蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或者(4)不在自然界发生。因此，分离的多肽以不同于其天然发现的形式或设置存在。相反，未分离的多肽(例如蛋白质和酶)以它们在自然界中存在的状态被发现。术语“分离的多肽”、“分离的肽”或“分离的蛋白质”包括由cDNA或重组RNA包括合成来源的或其一些组合编码的多肽、肽或蛋白质。
术语“基因”是指DNA序列，其包含编码序列及任选的用于从所述DNA序列产生多肽所需的控制序列。
术语“野生型”如本文所用是指基因或基因产物，其具有分离自天然发生来源的该基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此被任意指定为该基因的“野生型”形式。相反，术语“突变体”是指基因或基因产物，其当与野生型基因或基因产物相比时展示序列和/或功能性质中的修饰(即改变的特征)。注意天然发生的突变体可以被分离；它们由如下事实鉴别，即当与野生型基因或基因产物相比时它们具有改变的特征。
已知核酸含有不同类型突变。“点”突变是指在来自野生型序列的一个单碱基位置的核苷酸序列中的改变。突变也可以指插入或缺失一或多个碱基，从而核酸序列与参照例如野生型序列不同。
术语“重组DNA分子”是指杂合DNA序列，其包含在自然界不在一起发现的至少两个核苷酸序列。术语“载体”用于指可以插入或克隆DNA片段的核酸分子，其可以用于转移DNA节段进入细胞中以及能在细胞中复制。载体可以衍生自质粒、噬菌体、病毒、粘粒等等。
术语“重组载体”、“表达载体”或“构建体”如本文所用是指DNA或RNA序列，其含有希望的编码序列及在特定宿主生物体中表达可操纵连接的编码序列所需的合适的DNA或RNA序列。原核表达载体包括启动子、核糖体结合位点、在宿主细胞中自主复制的复制起点及可能的其它序列，例如任选的操纵子序列、任选的限制酶位点。启动子定义为指导RNA聚合酶结合DNA及起始RNA合成的DNA序列。真核表达载体包括启动子，任选地聚腺苷酸化信号及任选地增强子序列。
具有“编码肽、蛋白质或多肽”的核苷酸序列的多核苷酸是指包含所述肽、蛋白质或多肽的编码区的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可以是单链的(即有义链)或者双链的。合适的控制元件如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等可以置于基因编码区的紧邻，如果需要，以允许转录的合适起始和/或一级RNA转录物的正确加工。或者，用于本发明表达载体中的编码区可以含有内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、聚腺苷酸化信号等。在进一步实施方案中，编码区可含有内源及外源控制元件的组合。
术语“转录调节元件”或“转录调节序列”是指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件或序列。例如，启动子是促进可操纵连接的编码区的转录起始的调节元件。其它调节元件包括但非限于转录因子结合位点、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号和增强子元件，以及包括增加或降低连接的序列例如在反式作用元件存在下的转录的元件。
真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由短DNA序列阵列组成，它们与参与转录的细胞蛋白相互作用。启动子和增强子元件已分离自多种真核来源，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞中的基因。启动子和增强子元件也已分离自病毒，类似控制元件如启动子也在原核中发现。特定启动子和增强子的选择依赖于用于表达感兴趣蛋白质的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有宽宿主范围，而其它仅在有限细胞类型亚集中有功能。例如SV40早期基因增强子在来自许多哺乳动物物种的许多细胞类型中非常有活性并且已广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质。在宽范围哺乳动物细胞类型中有活性的启动子/增强子元件的两个其它例子是来自人延长因子1基因和Rous肉瘤病毒的长末端重复的那些；以及人巨细胞病毒。
术语“启动子/增强子”代表含有能同时提供启动子和增强子功能的序列的DNA节段(即如上所述启动子元件和增强子以及提供的功能)。例如，逆转录病毒的长末端重复同时含有启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子/启动子是与基因组中给定基因天然连接的。“外源的”或“异源的”增强子/启动子是通过遗传操作(即分子生物学技术)被置于与基因并列的，从而基因的转录由连接的增强子/启动子指导。
“剪接信号”在表达载体上的存在经常导致重组转录物在真核宿主细胞中更高水平表达。剪接信号介导从一级RNA转录物中除去内含子，并且由剪接供体和受体位点组成(Sambrook et al.，1989)。常用的剪接供体和受体位点是来自SV40的16S RNA的剪接点。
重组DNA序列在真核细胞中的有效表达需要指导所得转录物的有效终止及聚腺苷酸化信号的表达。转录终止信号通常在聚腺苷酸化信号下游发现，长度为几百个核苷酸。术语“poly(A)位点”或“poly(A)序列”如本文所用是指指导新生RNA转录物的终止及聚腺苷酸化的DNA序列。重组转录物的有效聚腺苷酸化是希望的，引物缺乏poly(A)尾的转录物是不稳定的并迅速降解。表达载体中使用的poly(A)信号可以是“异源的”或者“内源的”。内源的poly(A)信号是在基因组中给定基因的编码区的3′末端天然发现的poly(A)信号。异源poly(A)信号是已分离自基因并且位于另一个基因的3′的poly(A)信号。常用的异源poly(A)信号是SV40poly(A)信号。SV40poly(A)信号包含在237bp BamH I/Bcl I限制片段上，指导终止及聚腺苷酸化(Sambrook et al.，1989)。
真核表达载体还可以含有“病毒复制子”或“病毒复制起点”。病毒复制子是允许病毒在表达合适复制因子的宿主细胞中染色体外复制的病毒DNA序列。含有SV40或多瘤病毒复制起点的载体在表达合适病毒T抗原的细胞中复制到高拷贝数(直至104拷贝/细胞)。相反，含有来自牛乳头瘤病毒或Epstein-Barr病毒的复制子的载体以低拷贝数染色体外复制(大约100拷贝/细胞)。
术语“体外”是指人工环境及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境包括但非限于测试试管及细胞裂解物。术语“原位”是指细胞培养物。术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)及在天然环境内发生的过程或反应。
术语“表达系统”是指用于确定(例如检测)感兴趣基因的表达的任何测定或系统。分子生物学领域技术人员理解可以使用许多表达系统中的任一种。许多合适哺乳动物细胞可得自许多来源(例如美国典型培养物保藏中心，Rockland，MD)。转化或转染方法及表达载体的选择依赖于选择的宿主系统。转化及转染方法在例如Sambrook et al.，1989中描述。表达系统包括体外基因表达测定，其中感兴趣基因(例如报道基因)连接调节序列，基因的表达在用抑制或诱导基因表达的物质处理后监测。基因表达检测可以通过任何合适手段，包括但不限于检测表达的mRNA或蛋白质(例如报道基因的可检测产物)或者通过表达感兴趣基因的细胞表型中的可检测变化。表达系统还可包含测定，其中检测裂解事件或者其它核酸或细胞变化。
如本文所用，术语“杂交”是指互补序列与靶核酸的退火，即含有互补序列的两个核酸聚合物(多核苷酸)通过碱基配对退火的能力。术语“退火”和“杂交”互换使用，意在包括互补序列和靶核酸之间的任何特异性和可重复相互作用，包括结合具有仅部分互补性的区域。在天然核酸中不经常发现的一些碱基可以包括在本发明核酸中，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。核酸技术领域技术人员可以考虑一些变量凭经验确定双螺旋稳定性，包括例如互补序列长度、碱基组成及寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对的发生。核酸双螺旋的稳定性通过熔融温度或“Tm”测定。特定核酸双螺旋在特定条件下的Tm是平均一半碱基对解离的温度。
术语“严格性”用于指进行核酸杂交的温度、离子强度及存在其它化合物的条件。使用“高严格性”条件，核酸碱基配对仅在具有高频率互补碱基序列的核酸配对之间发生。因此，当希望互相不完全互补的核酸杂交或退火在一起时，通常需要“中等”或“低”严格性条件。本领域熟知可以采用许多等价条件以包括中等或低严格性条件。杂交条件的选择通常对于本领域技术人员是显然的，通常由杂交目的、杂交类型(DNA-DNA或DNA-RNA)、两个序列之间的希望的相关性水平指导(例如Sambrook et al.，1989；Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，WashingtonD.C.，1985，方法的一般讨论)。
核酸双螺旋的稳定性已知随错配碱基数增加而降低，另外根据杂合双螺旋中错配的相对位置而降低至更大或更小程度。因此，杂交严格性可以用于最大化或者最小化这种双螺旋的稳定性。杂交严格性可以如下改变：调整杂交温度；调整杂交混合物中螺旋去稳定剂如甲酰胺百分比；调整洗涤溶液的温度和/或盐浓度。对于滤膜杂交，杂交的最终严格性经常由用于杂交后洗涤的盐浓度和/或温度确定。
“高严格性条件”当用于指核酸杂交时包括等价于如下的条件，在42℃在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)，0.5％SDS，5X Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在包含0.1X SSPE，1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤，当采用大约500个核苷酸长度的探针时。
“中等严格性条件”当用于指核酸杂交时包括等价于如下的条件，在42℃在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)，0.5％SDS，5X Denhardt′s试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在包含1.0X SSPE，1.0％SDS的溶液中在42℃洗涤，当采用大约500个核苷酸长度的探针时。
“低严格性条件”当用于指核酸杂交时包括等价于如下的条件，在42℃在由5X SSPE(43.8g/l NaCl，6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，pH用NaOH调整至7.4)，0.1％SDS，5X Denhardt′s试剂[50X Denhardt′s每500ml含有：5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)，5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100g/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后在包含5X SSPE，0.1％SDS的溶液中在42℃洗涤，当采用大约500个核苷酸长度的探针时。
“肽”、“蛋白质”和“多肽”是指任何氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(糖基化或磷酸化)。除非另有说明，术语是可互换的。本发明的核酸分子编码水解酶片段或者功能不同的蛋白质，包括天然发生的(野生型)或野生型蛋白质的变体(突变体)的序列，其具有与相应突变体或野生型蛋白质的氨基酸序列基本相同、例如至少85％、优选90％、最优选95％或99％相同的氨基酸序列。术语“同源性”是指互补性程度。可以有部分同源性或完全同源性(即相同性)。同源性经常用序列分析软件测量(例如Sequence AnalysisSoftware Package of the Genetics Computer Group.University of WisconsinBiotechnology Center.1710 University Avenue.Madison，WI 53705)。这种软件通过给各种取代、缺失、插入和其它修饰赋值(assigning)同源性程度而匹配相似序列。保守取代典型包括下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
多肽分子被称为具有“氨基末端”(N末端)和“羧基末端”(C末端)是因为在第一个氨基酸残基的骨架氨基基团和第二个氨基酸残基的骨架羧基基团之间发生肽键。术语“N末端”和“C末端”与多肽序列相关时是指分别包括多肽的N末端和C末端区域的多肽区域。包括多肽的N末端区域部分的序列包括主要来自多肽链的N末端半区(half)的氨基酸，但是非限于这种序列。例如，N末端序列可包括多肽序列的内部部分，包括从多肽的N末端和C末端半区的碱基。这同样适用于C末端区域。N末端和C末端区域可以但非必须包括分别限定多肽的最N末端和最C末端的氨基酸。
术语“重组蛋白质”或“重组多肽”如本文所用是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。相反，术语“天然蛋白质”是指分离自天然发生(即非重组)来源的蛋白质。分子生物学技术可用于产生重组形式的蛋白质，其与该蛋白质的天然形式相比具有相同性质。
术语“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”如本文所用可互换使用，所有这种命名均包括这些命名的后代或潜在后代。“转化细胞”是指其中(或者其祖先中)已导入本发明的核酸分子的细胞。任选地，本发明的核酸分子可以被导入合适细胞系以产生能产生由所述核酸分子编码的蛋白质或多肽的稳定转染的细胞系。构建这种细胞系的载体、细胞和方法是本领域熟知的。词语“转化体”或“转化细胞”包括衍生自原始转化细胞的原代转化细胞，不考虑转移次数。所有后代由于有意或无意突变在DNA含量中可以不精确相同。然而，具有与原始转化细胞筛选的相同的功能性的突变的后代包括在转化体定义中。
术语“可操纵连接”如本文所用是指核苷酸序列的连接方式是能指导给定基因的转录和/或希望的蛋白质分子的合成的核酸分子被产生。该术语还指编码氨基酸的序列的连接方式是有功能的(例如酶学活性的，能结合结合配偶体的，能抑制的，等等)蛋白质或多肽或其前体，例如蛋白质或多肽的前(pre-)或前原(prepro-)形式被产生。
本文鉴别的所有氨基酸残基是天然L-构型。与标准多肽命名一致，氨基酸残基缩写示于如下对应表。
对应表
1-字母   3-字母     氨基酸
Y        Tyr        L-酪氨酸
G        Gly        L-甘氨酸
F        Phe        L-苯丙氨酸
M        Met        L-甲硫氨酸
A        Ala        L-丙氨酸
S        Ser        L-丝氨酸
I        Ile        L-异亮氨酸
L        Leu        L-亮氨酸
T        Thr        L-苏氨酸
V        Val        L-缬氨酸
P        Pro        L-脯氨酸
K        Lys        L-赖氨酸
H        His        L-组氨酸
Q        Gln        L-谷氨酰胺
E        Glu        L-谷氨撒
W        Trp        L-色氨酸
R        Arg        L-精氨酸
D        Asp        L-天冬氨酸
N        Asn        L-天冬酰胺
C        Cys        L-半胱氨酸
术语“纯化的”或“纯化”是指从感兴趣成分如蛋白质或核酸中除去一些污染物的任何方法的结果。纯化成分的百分比因此在样品中增加。
如本文所用，“纯的”是指一种目的种类(object species)是存在的主要种类(即基于摩尔，其比组合物中任何其它个体种类更丰富)，优选基本上纯化的级分是一种组合物，其中目的种类包括存在的所有大分子种类的至少50％(基于摩尔)。通常，“基本上纯的(substantially pure)”组合物包括存在于组合物中的所有大分子种类的大于大约80％，更优选大于大约85％、大约90％、大约95％、大约99％。最优选地，目的种类纯化至基本均质(污染物种类不能通过常规检测方法在组合物中检测到)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
用于制备片段的水解酶
本发明范围内的水解酶包括但非限于经重组技术例如定点诱变或递归(recursive)诱变制备的那些，并且包含一或多个氨基酸取代，其使得所产生的突变的水解酶能与底物形成稳定的例如共价键，所述底物如被修饰含有一或多个功能基团的底物，对于相应非突变(野生型)水解酶，所述键比相应野生型水解酶和底物之间形成的键更稳定。本发明范围内的水解酶包括但非限于肽酶、酯酶(例如胆固醇酯酶)、糖苷酶(例如葡糖淀粉酶)、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)等。例如，水解酶包括但非限于作用于酯键的酶如羧基酯水解酶、硫酯(thiolester)水解酶、磷酸一酯水解酶、硫酸酯水解酶、二磷酸一酯水解酶、磷酸三酯水解酶、产生5′-磷酸一酯的外脱氧核糖核酸酶(exodeoxyribonucleases)、产生3′-磷酸一酯的外核糖核酸酶(exoribonucleases)、用核糖核酸或脱氧核糖核酸活化的外切核酸酶、用核糖核酸或脱氧核糖核酸活化的外切核酸酶、产生5′-磷酸一酯的内切脱氧核糖核酸酶、产生除5′-磷酸一酯之外的内切脱氧核糖核酸酶、特异于改变的碱基的位点特异性内切脱氧核糖核酸酶、产生5′-磷酸一酯的内切核糖核酸酶、产生除5′-磷酸一酯之外的内切核糖核酸酶、用核糖核酸或脱氧核糖核酸活化的内切核糖核酸酶、用核糖核酸或脱氧核糖核酸糖基化酶活化的内切核糖核酸酶；糖基化酶，例如水解O-和S-糖基，及水解N-糖基化合物的酶；作用于醚键的酶如三烷基锍(trialkylsulfonium)水解酶或醚水解酶；作用于肽键的酶(肽水解酶)如氨基肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧基肽酶、金属羧基肽酶、半胱氨酸型羧基肽酶、Ω肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶、苏氨酸内肽酶、和未知催化机制的内肽酶；作用于除肽键之外的碳-氮键的酶，如在线性酰胺中、在环酰胺中、在线性脒中、在环脒中、在腈中或其它化合物中的那些碳-氮键；作用于酸酐如在含磷酐中及在含磺基酐中的那些的酶；作用于酸酐(催化跨膜运动)的酶；作用于酸酐或参与细胞或亚细胞运动的酶；作用于碳-碳键(例如在酮物质中)的酶；作用于卤化物键(例如在C-卤化合物中)的酶；作用于磷-氮键的酶；作用于硫-氮键的酶；作用于碳-磷键的酶；及作用于硫-硫键的酶。作用于卤化物键举例的水解酶包括但非限于烷基卤化酶、2-卤代酸脱卤素酶、卤代乙酸脱卤素酶、甲状腺素脱碘酶(thyroxine deiodinase)、卤代烷脱卤素酶、4-氯苯甲酸脱卤素酶、4-氯苯甲酰-CoA脱卤素酶及阿特拉嗪氯水解酶(chlorohydrolase)。作用于环酰胺中的碳-氮键的举例水解酶包括但非限于丙二酰脲酶，二氢嘧啶酶、二氢乳清酸酶、羧甲基乙内酰脲酶、尿囊素酶、β-内酰胺酶、咪唑啉酮丙酸酶(imidazolonepropionase)、5-羟脯氨酸酶(ATP-水解)、肌酸酐酶、L-赖氨酸内酰胺酶、6-氨基己酸-环-二聚体水解酶、2，5-二氧代哌嗪(dioxopiperazine)水解酶、N-甲基乙内酰脲酶(ATP-水解)、氰尿酸酰胺水解酶、密胺水解酶。“β-内酰胺酶”如本文所用包括A类、C类和D类β-内酰胺酶以及D-ala羧基肽酶/转肽酶、酯酶EstB、青霉素结合蛋白2X、青霉素结合蛋白5和D-氨基肽酶。优选地，β-内酰胺酶是丝氨酸β-内酰胺酶，例如在相应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PC1的丝氨酸β-内酰胺酶的残基70的位置具有催化丝氨酸残基，以及在相应于金黄色葡萄球菌PC1的丝氨酸β-内酰胺酶的残基166的位置具有谷氨酸残基，任选在相应于金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的残基73的位置具有赖氨酸残基，及还任选在相应于金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的残基234的位置具有赖氨酸残基。
在一个实施方案中，突变水解酶片段的序列基本上相应于具有至少一个在一个残基中酸取代的突变水解酶的序列，所述残基在野生型水解酶中与活化水分子相关，例如在催化三联体中的残基或者辅助残基(auxiliaryresidue)，其中活化的水分子裂解野生型水解酶中的催化残基和水解酶底物之间形成的键。如本文所用，“辅助残基”是改变另一个残基活性的残基，例如其增强活化水分子的残基的活性。本发明范围内的活化水的残基包括但非限于参与酸-碱催化中的那些，例如组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一个实施方案中，所述至少一个氨基酸取代是在一个残基中，该残基在野生型水解酶中通过水解酶底物的亲核攻击形成酯键。
在另一个实施方案中，突变水解酶片段的序列包含至少两个氨基酸取代，一个取代在一个在野生型水解酶中与活化水分子相关的残基中，或者在一个在野生型水解酶中通过水解酶底物的亲核攻击形成酯键的残基中，另一个取代在一个在野生型水解酶中位于或邻近于水解酶底物结合位点的残基中，例如所述残基位于结合于野生型水解酶的水解酶底物的3-5
Figure GPA00001133133200351
内，但是不在一个在相应野生型水解酶中与活化水分子相关或者与底物形成酯中间体的残基中。在一个实施方案中，第二个取代是在一个在野生型水解酶中排列位点用于底物进入水解酶催化口袋的残基中，例如位于活性位点腔(cavity)及位于结合于野生型水解酶的水解酶底物的3-5
Figure GPA00001133133200352
内的残基，如在底物通道中的残基，其不是在相应野生型水解酶中与活化水分子相关或者与底物形成酯中间体的残基。额外取代优选增加突变体与相应全长野生型水解酶的底物形成稳定共价键的速率。在一个实施方案中，一个取代位于一个在野生型水解酶中活化水分子的残基中，例如组氨酸残基，以及位于相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基272的位置，例如在相应于氨基酸残基272的位置的取代的氨基酸是苯丙氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，一个取代位于一个在野生型水解酶中与底物形成酯中间体的残基中，例如天冬氨酸残基，以及位于相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106的位置。在一个实施方案中，第二个取代位于在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的位置175、176或273的氨基酸残基中，例如在相应于氨基酸残基175的位置的取代的氨基酸是甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，在相应于氨基酸残基176的位置的取代的氨基酸是丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，和/或在相应于氨基酸残基273的位置的取代的氨基酸是亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。在另一个实施方案中，突变水解酶进一步包含第三个和任选第四个取代，其在野生型水解酶中位于活性位点腔及位于结合于野生型水解酶的水解酶底物的3-5
Figure GPA00001133133200353
内的残基，例如第三个取代是在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置中，第四个取代是在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置中。在一个实施方案中，本发明突变水解酶包含至少两个氨基酸取代，其中至少一个与稳定键形成相关，例如野生型水解酶中活化水分子的残基，例如组氨酸残基，以及位于相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基272的位置中，例如，取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸，至少一个其它取代与改良的功能表达、结合动力学或FP信号相关，例如在相应于SEQ ID NO：1的位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，175，176，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，273，277，282，291或292的位置(见图1B)。突变水解酶可包括其它取代，例如被导入以促进相应基因或其部分的克隆的那些，和/或位于或邻近N和/或C末端的额外残基，例如被导入以促进相应基因或其部分的克隆但非必须具有活性的那些，例如不是能独立检测到的。
例如，野生型脱卤素酶DhaA裂解卤代烃(HaloC3-HaloC10)中的碳-卤素键。DhaA的催化中心是经典催化三联体，包括亲核体、酸和组氨酸残基。三联体中的氨基酸位于DhaA催化口袋的深内侧(大约10Δ长及大约20Δ2横截面)。DhaA的卤代底物的卤素原子，例如Cl-烷底物中的氯原子，位于DhaA催化中心的紧邻。DhaA结合底物，可能形成ES复合物，通过DhaA的Asp106(编号基于DhaA的蛋白质序列)亲核攻击底物形成酯中间体。DhaA的His272任何活化水，活化的水水解中间体，从催化中心释放产物。突变DhaA，例如DhaA.H272F突变体，基于计算机模型研究及野生型DhaA(DhaA.WT)的基本物理化学特征可能保留3D结构，不能水解野生型酶的一或多个底物，例如对于Cl-烷，释放由野生型酶释放的相应醇。突变的丝氨酸β-内酰胺酶，例如BlaZ.E166D突变体、BlaZ.N170Q突变体和BlaZ.E166D:N170Q突变体不能水解野生型丝氨酸β-内酰胺酶的一或多个底物。
在一个实施方案中，水解酶片段是突变的卤代烷脱卤素酶片段，例如在革兰氏阴性(Keuning et al.，1985)和革兰氏阳性利用卤代烷的细菌(Keuninget al.，1985；Yokota et al.，1987；Scholtz et al.，1987；Sallis et al.，1990)中发现的那些。卤代烷脱卤素酶，包括来自Xanthobacter autotrophicus GJ10的DhlA(Janssen et al.，1988，1989)、来自玫瑰色红球菌的DhaA及来自Spingomonas paucimobilis UT26的LinB(Nagata et al.，1997)是催化相应烃水解脱卤素的酶。进行转化的卤代脂族烃包括C2-C10饱和的脂族烃，其具有一或多个附着的卤素基团，其中至少两个卤素位于相邻碳原子上。这种脂族烃包括挥发性氯代脂族(VCA)烃。VCA包括例如脂族烃如二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷和1，2，3-三氯丙烷。术语“卤代烃”如本文所用是指卤代脂族烃。如本文所用术语“卤素”包括氯、溴、碘、氟、砹等。优选卤素是氯。
在一个实施方案中，本发明的突变水解酶片段饱和至少两个氨基酸取代，至少其中一个与稳定键形成相关，例如在野生型水解酶中活化水分子的残基，例如组氨酸残基，并且位于相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基272的位置，例如取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸，至少其中另一个与改良的功能表达、结合动力学或FP信号相关，例如位于相应于SEQ ID NO：1的位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，175，176，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，273，277，282，291或292的位置。
用于本发明片段的融合配偶体
编码水解酶或其它报道蛋白的片段的本发明的多核苷酸可以与其它核酸序列如天然序列如cDNA或已经体外操作的序列一起采用以例如制备N末端、C末端或者N末端和C末端融合蛋白。合适的融合配偶体的许多例子是本领域已知的并且可以用于实践本发明。
例如，本发明提供了融合蛋白，其包含报道蛋白片段和感兴趣蛋白质或肽的氨基酸序列，例如感兴趣的酶，例如蛋白酶，核酸结合蛋白，胞外基质蛋白，分泌蛋白，抗体或其部分如Fc，生物发光蛋白，报道配体，调节蛋白，血清蛋白，免疫原性蛋白质，荧光蛋白，具有反应性半胱氨酸的蛋白质，受体蛋白，例如NMDA受体，通道蛋白，例如离子通道蛋白如钠、钾或钙敏感性通道蛋白包括HERG通道蛋白，膜蛋白，细胞溶胶蛋白，核蛋白，结构蛋白，磷蛋白，激酶，信号蛋白，代谢蛋白，线粒体蛋白，受体相关蛋白，荧光蛋白，酶底物，例如蛋白酶底物，转录因子，蛋白质去稳定化序列，或者转运蛋白，例如EAAT1-4谷氨酸转运蛋白，以及靶向信号，例如质体靶向信号，如线粒体定位序列，核定位序列或者十四烷基化序列，其指导融合体到特定位置。
融合配偶体可包括具有酶活性的那些。例如，功能蛋白序列可以编码激酶催化结构域(Hanks and Hunter，1995)，产生可以将磷酸部分酶学添加到特定氨基酸的融合蛋白，或者可以编码Src Homology 2(SH2)结构域(Sadowski et al.，1986；Mayer and Baltimore，1993)，产生特异结合磷酸化酪氨酸的融合蛋白。
融合体也可以包括亲和性结构域，包括可以与结合配偶体相互作用的肽序列，例如固定化在固体支持物上，用于鉴别或纯化。举例的亲和性结构域包括HisV5(HHHHH)(SEQ ID NO：62)，HisX6(HHHHHH)(SEQ IDNO：63)，C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：64)，Flag(DYKDDDDK)(SEQID NO：65)，SteptTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：66)，血凝素，例如HA Tag(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：67)，GST，硫氧还蛋白，纤维素结合结构域，RYIRS(SEQ ID NO：68)，Phe-His-His-Thr(SEQ ID NO：69)，几丁质结合结构域，S-肽，T7肽，SH2结构域，WEAAAREACCRECCARA(SEQ ID NO：70)，金属结合结构域，例如锌结合结构域，或钙结合结构域如来自钙结合蛋白的那些，例如钙调蛋白，肌钙蛋白C，钙调磷酸酶B，肌球蛋白轻链，恢复蛋白，S-modulin，视锥蛋白，VILIP，神经钙蛋白，hippocalcin，frequenin，钙牵蛋白，钙蛋白酶大亚基，S100蛋白，小白蛋白，钙结合蛋白D9K，钙结合蛋白D28K，和钙视网膜蛋白，inteins，生物素，链霉抗生物素蛋白，MyoD，Id，亮氨酸拉链序列，和麦芽糖结合蛋白。
例如，异源序列可包括具有磷酸化酪氨酸的蛋白质结构域(例如在Src，Ab1和EGFR中)，其检测ErbB2的磷酸化，Src、Ab1和EGFR中的酪氨酸的磷酸化，MKA2的活化(例如使用MK2)，PKA的活化，例如使用CREG的KID，CrkII的磷酸化，例如使用SH2结构域pTyr肽，bZIP转录因子和REL蛋白的结合，例如bFos和bJun ATF2和Jun，或者p65 NFkappaB，或者微管结合，例如使用kinesin。在一个实施方案中，异源序列可以包括蛋白质结合结构域，如结合IL-17RA的结构域，例如IL-17A，或者IL-17RA的IL-17A结合结构域，Erg的Jun结合结构域，或者Jun的EG结合结构域；钾离子通道电压感应结构域，例如用于检测蛋白质构象变化的该结构域，Cdc42或rac靶的GTPase结合结构域，或者其它GTPase结合结构域，与激酶或磷酸酶活性相关的结构域，例如调节肌球蛋白轻链，PKCδ，含普列克底物蛋白的PH和DEP结构域(pleckstrin containing PH and DEPdomains)，其它磷酸化识别结构域和底物；葡萄糖结合蛋白结构域，谷氨酸/天冬氨酸结合蛋白结构域，PKA或cAMP-依赖性结合底物，InsP3受体，GKI，PDE，雌激素受体配体结合结构域，apoK1-er，或钙调蛋白结合结构域。
在一个实施方案中，异源序列包括但非限于这样的序列，如FRB和FKBP中的那些，蛋白激酶的调节亚基(PKa-R)和蛋白激酶的催化亚基(PKa-C)，src同源性区域(SH2)及能被磷酸化的序列，例如含有酪氨酸的序列，14-3-3的同种型，例如14-3-3t，及能被磷酸化的序列，具有WW区域(蛋白质中结合富含脯氨酸分子的序列)的蛋白质及能被磷酸化的异源序列，例如含有丝氨酸和/或苏氨酸的序列，以及二氢叶酸还原酶(DHFR)和促旋酶B(GyrB)中的序列，或者雌激素受体(ER)中的序列。
优化的水解酶序列，编码水解酶的载体及宿主细胞
还提供了分离的核酸分子(多核苷酸)，其包含编码水解酶片段或其融合体的核酸序列。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含被优化用于在至少一种选择的宿主中表达的核酸序列。优化的序列包括被密码子优化的序列，即相对于另一个生物体例如远缘相关的生物体在一个生物体中更经常被采用的密码子，以及增加或修饰Kozak序列和/或内含子的修饰，和/或除去不希望序列例如潜在的转录因子结合位点的修饰。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码脱卤素酶的核酸序列，所述核酸序列被优化用于在选择的宿主细胞中表达。在一个实施方案中，优化的多核苷酸不再与相应的非优化的序列杂交，例如不与非优化序列在中等或高严格性条件下杂交。在另一个实施方案中，所述多核苷酸与相应非优化序列具有小于90％、例如小于80％的核酸序列相同性，并且任选编码与由非优化序列编码的多肽具有至少80％、例如至少85％、90％或更高的氨基酸序列相同性的多肽。还提供了包含所述分离的核酸分子的构建体，例如表达盒，及载体，以及包含所述分离的核酸分子、构建体或载体的试剂盒。
包含编码水解酶片段或与水解酶片段的融合体的核酸序列的核酸分子任选被优化以用于在特定宿主细胞中表达，及还任选与转录调节序列可操纵连接以形成表达盒，所述转录调节序列例如为一或多个增强子、启动子、转录终止信号或其组合。
在一个实施方案中，编码水解酶片段或其融合体的核酸序列通过用在特定(选择的)细胞中优先采用的密码子置换野生型或突变水解酶序列中的密码子而优化。优先的密码子在选择的细胞中具有相对较高的密码子使用频率，优选地它们的导入导致导入相对较少的针对选择的宿主细胞中存在的转录因子的转录因子结合位点，及相对较少的其它不希望的结构属性。因此，优化的核酸产物具有改良的密码子使用频率所致的改良的表达水平及由不希望的转录调节序列数目降低所致的降低的不合适转录行为的风险。
本发明的分离的和优化的核酸分子可具有与相应野生型核酸序列有大于30％、35％、40％或者大于45％、例如50％、55％、60％或更多的不同的密码子的密码子组成。用于本发明的优选的密码子是在特定生物体中比相同氨基酸的至少一种其它密码子更经常被采用的那些，以及不是该生物体中的低使用密码子，及不是在用于克隆或筛选核酸分子表达的生物体中的低使用密码子。另外，一定氨基酸(即具有三个或更多个密码子的那些氨基酸)的优选密码子可以包括比其它(非优选)密码子更经常被采用的两个或多个密码子。在一个生物体中比在另一个生物体中更经常被采用的核酸分子中密码子的存在导致核酸分子当被引入更经常采用那些密码子的生物体的细胞中时在该细胞中表达水平高于野生型或亲本核酸序列在那些细胞中的表达。
在本发明的一个实施方案中，不同的密码子是在哺乳动物中更经常被采用的那些，而在另一个实施方案中，不同的密码子是在植物中更经常被采用的密码子。不同生物体优选的密码子是本领域已知的，例如见www.kazusa.or.jp./codon/。特定类型的哺乳动物例如人类可以具有不同于另一类型哺乳动物的优选密码子集合。相似地，一特定类型的植物可具有不同于另一类型植物的优选密码子集合。在本发明的一个实施方案中，大部分不同的密码子是在希望的宿主细胞中的优选的密码子。包括哺乳动物(例如人类)和植物在内的生物体优选的密码子是本领域已知的(例如，Wada etal.，1990；Ausubel et al.，1997)。例如，优选的人类密码子包括但非限于CGC(Arg)，CTG(Leu)，TCT(Ser)，AGC(Ser)，ACC(Thr)，CCA(Pro)，CCT(Pro)，GCC(Ala)，GGC(Gly)，GTG(Val)，ATC(Ile)，ATT(Ile)，AAG(Lys)，AAC(Asn)，CAG(Gln)，CAC(His)，GAG(Glu)，GAC(Asp)，TAC(Tyr)，TGC(Cys)和TTC(Phe)(Wada et al.，1990)。因此，在一个实施方案中，本发明的合成核酸分子具有不同于野生型核酸序列的密码子组成，其具有增加数目的优选的人密码子，例如CGC，CTG，TCT，AGC，ACC，CCA，CCT，GCC，GGC，GTG，ATC，ATT，AAG，AAC，CAG，CAC，GAG，GAC，TAC，TGC，TTC，或其任何组合。例如，本发明的核酸分子相对于野生型核酸序列可以具有增加数目的CTG或TTG亮氨酸编码密码子、GTG或GTC缬氨酸编码密码子、GGC或GGT甘氨酸编码密码子、ATC或ATT异亮氨酸编码密码子、CCA或CCT脯氨酸编码密码子、CGC或CGT精氨酸编码密码子、AGC或TCT丝氨酸编码密码子、ACC或ACT苏氨酸编码密码子、GCC或GCT丙氨酸编码密码子，或其任意组合。在另一个实施方案中，优选的C.elegans密码子包括但非限于UUC(Phe)，UUU(Phe)，CUU(Leu)，UUG(Leu)，AUU(Ile)，GUU(Val)，GUG(Val)，UCA(Ser)，UCU(Ser)，CCA(Pro)，ACA(Thr)，ACU(Thr)，GCU(Ala)，GCA(Ala)，UAU(Tyr)，CAU(His)，CAA(Gln)，AAU(Asn)，AAA(Lys)，GAU(Asp)，GAA(Glu)，UGU(Cys)，AGA(Arg)，CGA(Arg)，CGU(Arg)，GGA(Gly)，或其任意组合。在另一个实施方案中，优选的果蝇密码子包括但非限于UUC(Phe)，CUG(Leu)，CUC(Leu)，AUC(Ile)，AUU(Ile)，GUG(Val)，GUC(Val)，AGC(Ser)，UCC(Ser)，CCC(Pro)，CCG(Pro)，ACC(Thr)，ACG(Thr)，GCC(Ala)，GCU(Ala)，UAC(Tyr)，CAC(His)，CAG(Gln)，AAC(Asn)，AAG(Lys)，GAU(Asp)，GAG(Glu)，UGC(Cys)，CGC(Arg)，GGC(Gly)，GGA(gly)，或其任意组合。优选酵母密码子包括但非限于UUU(Phe)，UUG(Leu)，UUA(Leu)，CCU(Leu)，AUU(Ile)，GUU(Val)，UCU(Ser)，UCA(Ser)，CCA(Pro)，CCU(Pro)，ACU(Thr)，ACA(Thr)，GCU(Ala)，GCA(Ala)，UAU(Tyr)，UAC(Tyr)，CAU(His)，CAA(Gln)，AAU(Asn)，AAC(Asn)，AAA(Lys)，AAG(Lys)，GAU(Asp)，GAA(Glu)，GAG(Glu)，UGU(Cys)，CGU(Trp)，AGA(Arg)，CGU(Arg)，GGU(Gly)，GGA(Gly)，或其任意组合。类似地，具有增加数目的在植物中更被经常采用的密码子的核酸分子具有不同于野生型或亲本核酸序列的密码子组成，其具有增加数目的植物密码子，包括但非限于CGC(Arg)，CTT(Leu)，TCT(Ser)，TCC(Ser)，ACC(Thr)，CCA(Pro)，CCT(Pro)，GCT(Ser)，GGA(Gly)，GTG(Val)，ATC(Ile)，ATT(Ile)，AAG(Lys)，AAC(Asn)，CAA(Gln)，CAC(His)，GAG(Glu)，GAC(Asp)，TAC(Tyr)，TGC(Cys)，TTC(Phe)，或其任意组合(Murray et al.，1989)。不同类型植物的优选的密码子可以不同(Wada et al.，1990)。
在一个实施方案中，编码水解酶片段或其融合体的优化的核酸序列相对于编码相应水解酶片段或其融合体的非优化核酸序列具有小于100％、例如小于90％或小于80％的核酸序列相同性。例如，编码DhaA的优化的核酸序列相对于编码相应DhaA的非优化(野生型)核酸序列具有小于大约80％的核酸序列相同性，所述优化的核酸序列编码的DhaA任选与相应野生型DhaA具有至少85％氨基酸序列相同性。在一个实施方案中，由所述优化的核酸序列编码的DhaA的活性至少是由非优化序列编码的DhaA活性的至少10％、例如50％或更多，例如，由所述优化的核酸序列编码的突变DhaA结合底物的效率与由非优化核酸序列编码的突变DhaA结合相同底物基本上相同，即至少50％、80％、100％或更高。
举例的优化的DhaA基因具有下述序列：
hDhaA.v2.1-6F(FINAL，具有侧翼序列)
NNNNGCTAGCCAGCTGGCgcgGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATTGGGACAGGGTTcCCTTT
TGATCCTCAcTATGTtGAaGTGCTGGGgGAaAGAATGCAcTAcGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGG
GACcCCaGTGCTGTTcCTcCAcGGGAAcCCTACATCTagcTAcCTGTGGAGaAAtATTATaCCTCATGTt
GCTCCTagtCATAGgTGcATTGCTCCTGATCTGATcGGGATGGGGAAGTCTGATAAGCCTGActtaGA
cTAcTTTTTTGATGAtCATGTtcGATActTGGATGCTTTcATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGG
TGCTGGTGATaCAcGAcTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCAcTGGGCTAAaAGgAATCCgGAGAGA
GTGAAGGGGATTGCTTGcATGGAgTTTATTcGACCTATTCCTACtTGGGAtGAaTGGCCaGAGTTTG
CcAGAGAGACATTTCAaGCcTTTAGAACtGCcGATGTGGGcAGgGAGCTGATTATaGAcCAGAATG  
CTTTcATcGAGGGGGCTCTGCCTAAaTGTGTaGTcAGACCTCTcACtGAaGTaGAGATGGAcCATTAT
AGAGAGCCcTTTCTGAAGCCTGTGGATcGcGAGCCTCTGTGGAGgTTtCCaAATGAGCTGCCTATT
GCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGGCTCTGGTGGAaGCcTATATGAAcTGGCTGCATCAGagTCCa
GTGCCcAAGCTaCTcTTTTGGGGGACtCCgGGaGTtCTGATTCCTCCTGCcGAGGCTGCTAGACTGG
CTGAaTCcCTGCCcAAtTGTAAGACcGTGGAcATcGGcCCtGGgCTGTTTTAcCTcCAaGAGGAcAAcC
CTGATCTcATcGGGTCTGAGATcGCacGgTGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGT
AgGCGGCCGCNNNN(SEQ ID NO：1).
核酸或表达盒可以导入载体中，例如质粒或病毒载体，其任选包括选择标记基因，所述载体导入感兴趣细胞中，例如原核细胞如大肠杆菌、链霉菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等，以及真核细胞包括植物(双子叶或单子叶)、真菌、酵母例如毕赤氏酵母、糖酵母或裂殖酵母、或者哺乳动物细胞。优选的哺乳动物细胞包括牛、山羊、绵羊、犬、猫、非人灵长类例如猴、及人细胞。优选的哺乳动物细胞系包括但非限于CHO，COS，293，Hela，CV-1，SH-SY5Y(如成神经细胞瘤细胞)、HEK293和NIH3T3细胞。
编码的水解酶片段的表达可以通过能在原核细胞或真核细胞中表达的任何启动子控制。优选的原核启动子包括但非限于SP6，T7，T5，tac，bla，trp，gal，lac或麦芽糖启动子。优选的真核启动子包括但非限于组成型启动子，例如病毒启动子如CMV、SV40和RSV启动子，以及调节型启动子，例如诱导型或阻遏型启动子如tet启动子、hsp70启动子和由CRE调节的合成启动子。用于细菌表达的优选载体包括pGEX-5X-3，用于真核表达的包括pCIneo-CMV。
本发明的核酸分子、表达盒和/或载体可以经任何方法导入细胞，包括但非限于钙介导的转化、电穿孔、显微注射、脂转染、颗粒轰击等。
用于水解酶底物的官能团
用于本发明底物和方法中的官能团是可检测的或能检测的分子。本发明范围内的官能团能被共价连接于双官能接头的一个反应取代基或水解酶的底物，以及作为本发明底物的部分，具有不与天然发现的底物连接的官能团基本上相同的活性并且能与突变水解酶形成稳定复合物。官能团因此具有促进具有该官能团的底物与突变水解酶之间的稳定复合物的检测和任选分离的一或多种性质。例如，官能团包括具有特征性电磁谱性质的那些，如发射或吸收、磁性、电子自旋共振、电容、介电常数或电导率，以及是铁磁性、顺磁性、反磁性、发光、电化学发光、荧光、磷光、有色、抗原性或具有独特质量的官能团。官能团包括但非限于核酸分子即DNA或RNA，例如寡核苷酸或核苷酸，如具有核苷酸类似物的一个，能结合蛋白质的DNA，相应于感兴趣基因的单链DNA，相应于感兴趣基因的RNA，缺乏终止密码子的mRNA，氨酰起始tRNA，氨酰琥珀抑制子tRNA，或者用于RNAi的双链RNA，蛋白质，例如发光蛋白，肽，肽核酸，由配体识别的表位，例如生物素或链霉抗生物素蛋白，半抗原，氨基酸，脂质，脂质双层，固体支持物，荧光团，生色团，报道分子，放射核素，如用于例如放射活性测量的放射性同位素或用于如同位素编码的亲和性标记(ICAT)方法中的稳定同位素，不透电子的分子(electron opaque molecule)，X射线对比试剂，MRI造影剂，例如镁、釓或铁氧化物颗粒等。在一个实施方案中，官能团是氨基酸，蛋白质，糖蛋白，多糖，三联体敏化剂(triplet sensitizer)例如CALI，核酸分子，药物，毒素，脂质，生物素或固体支持物如自组装单层(参见例如Kwon et al.，2004)，结合Ca2+，结合K+，结合Na+，pH敏感，是不透电子(electron opaque)的，是生色团，是MRI造影剂，在存在NO时发荧光或者对活性氧敏感，纳米颗粒，酶，酶底物，酶抑制剂，例如自杀底物(参见例如Kwon et al.，2004)，辅因子，例如NADP，辅酶，琥珀酰亚胺基酯或醛，萤光素，谷胱甘肽，NTA，生物素，cAMP，磷脂酰肌醇，cAMP配体，金属，用作自旋捕获的硝基氧或nitrone(由电子自旋共振(ESR)检测)，金属螯合剂，例如用于造影剂，在时间分辨荧光中或捕获金属，photocaged化合物，例如其中照射时释放caged化合物如荧光团，嵌入剂，例如补骨脂素或用于结合DNA或作为可光活化分子的另一种嵌入剂，三磷酸酯或亚磷酰胺，例如允许底物掺入DNA或RNA中，抗体，或者异双功能交联剂如用于缀合蛋白质或其它分子的那些，交联剂，包括但非限于酰肼(hydrazide)，芳基叠氮化物(aryl azide)，马来酰亚胺，碘乙酰胺/溴乙酰胺，N-羟基琥珀酰亚胺基酯，混合的二硫化物如吡啶基二硫化物，乙二醛/苯基乙二醛，乙烯基砜/乙烯基磺酰胺，丙烯酰胺，硼酸酯，氧肟酸，酰亚胺酯，异氰酸酯/异硫氰酸酯，或者氯三嗪/二氯三嗪。
例如，官能团包括但非限于一或多个氨基酸，例如天然发生的氨基酸或非天然氨基酸，肽或多肽(蛋白质)，包括抗体或其片段，His标记，FLAG标记，Strep标记，酶，辅因子，辅酶，酶的肽或蛋白质底物，例如分支肽底物(例如Z-氨基苄氧基(Abz)-Gly-Pro-Ala-Leu-Ala-4-硝基苄基酰胺(NBA))，自杀底物，或者受体，一或多个核苷酸(例如ATP，ADP，AMP，GTP或GDP)包括其类似物，例如寡核苷酸，相应于基因或其部分的双链或单链DNA，例如能结合蛋白质的DNA如转录因子，相应于基因的RNA，例如缺乏终止密码子的mRNA，或其一部分，用于RNAi或其载体的双链RNA，糖蛋白，多糖，肽核酸(PNA)，脂质包括脂质双层；或者是固体支持物，例如沉降颗粒如磁性颗粒，琼脂糖或纤维素珠，膜，玻璃，例如玻片，纤维素，藻酸盐，塑料或其它合成制备的聚合物，例如eppendorf管或多孔板的孔，自组装单层，表面等离子体共振芯片，或者具有导电表面的固体支持物，以及包括药物，例如化疗剂如阿霉素，5-氟尿嘧啶，或camptosar(CPT-11；Irinotecan)，氨酰tRNA如氨酰起始tRNA或氨酰琥珀抑制子tRNA，结合Ca2+的分子，结合K+的分子，结合Na+的分子，pH敏感的分子，放射核素，不透电子(electronopaque)的分子，造影剂，例如钡、碘或其它MRI或X射线造影剂，在存在NO时发荧光或者对活性氧敏感的分子，纳米颗粒例如免疫金颗粒、顺磁性纳米颗粒、上转化纳米颗粒或者量子点，酶的非蛋白质底物，酶抑制剂，可逆或不可逆抑制剂，螯合剂，交联基团，例如琥珀酰亚胺基酯或醛，谷胱甘肽，生物素或其它抗生物素蛋白结合分子，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，cAMP，磷脂酰肌醇，血红素，cAMP配体，金属，NTA，以及在一个实施方案中，包括一或多种染料，例如夹氧杂蒽染料，钙敏感性染料，例如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧基-9-呫吨基)-苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(Fluo-3)，钠敏感性染料，例如1，3-苯二羧酸，4，4′-[1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮杂环十八烷-7，16-二基双(diylbis)(5-甲氧基-6，2-苯并呋喃二基)]双(PBFI)，NO敏感性染料，例如4-氨基-5-甲基氨基-2′，7′-二荧光素，或者其它荧光团。在一个实施方案中，官能团是半抗原或者免疫原性分子，即由特异于该分子的抗体结合的分子。在一个实施方案中，官能团不是放射核素。在另一个实施方案中，官能团是放射核素，例如3H，14C，35S，125I，131I，包括用于诊断方法中的分子。
检测特定官能团的方法是本领域已知的。例如，核酸分子可以用杂交、扩增、与特异于该核酸分子的核酸结合蛋白结合、酶测定(例如如果核酸分子是核酶)检测，或者如果核酸分子本身包含可检测或能检测的分子例如放射性标记或生物素，其可以通过适合于该分子的测定检测。
举例的官能团包括半抗原，例如用于增强免疫原性的分子，如匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)，可裂解标记，例如光裂解生物素，及荧光标记，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NSH)修饰的香豆素和琥珀酰亚胺或磺基琥珀酰亚胺修饰的BODIPY(其可以用UV和/或可见光激发的荧光检测而检测)，罗丹明，例如R110，rhodols，CRG6，Texas Methyl Red(羧基四甲基罗丹明)，5-羧基-X-罗丹明，或者荧光素，香豆素衍生物，例如7氨基香豆素，和7-羟基香豆素，2-氨基-4-甲氧基萘，1-羟基芘，resorufin，芴酮或苯并芴酮(美国专利号4,812,409)，吖啶酮(美国专利号4,810,636)，蒽，和α-和β-萘醇的衍生物，氟代夹氧杂蒽衍生物包括氟代荧光素和rhodols(例如美国专利号6,162,931)，生物发光分子，例如萤光素，coelenterazine，萤光素酶，化学发光分子，例如稳定化的二噁二酮(dioxetanes)，以及电化学发光分子。通过与相应野生型水解酶底物连接而连接于突变水解酶的荧光(或发光)官能团可以用于实时感应系统中的变化，如磷酸化。另外，荧光分子如金属离子的化学感应物(chemosensor)，例如9-羰基蒽修饰的甘氨酰-组氨酰-赖氨酸(GHK)用于本发明底物中的Cu2+，可以被用于标记结合底物的蛋白质。发光或荧光官能团如BODIPY、罗丹明绿、GFP或红外染料也用作官能团，可以例如用于相互作用研究，例如使用BRET，FRET，LRET或电泳。
另一类官能团是选择性与含有接纳体基团的分子相互作用的分子(“亲和性”分子)。因此，包括亲和性分子的水解酶底物可以促进具有这种底物和突变水解酶的复合物的分离，因为亲和性分子与另一种分子例如可以是生物学或非生物学来源的接纳体分子选择性相互作用。例如，亲和性分子相互作用的特异分子(称为接纳体分子)可以是小有机分子，化学基团如巯基基团(-SH)或大生物分子如抗体或亲和性分子的其它天然发生配体。结合性质是正常化学的，并且可涉及共价或非共价键的形成或相互作用如离子或氢键。接纳体分子可以是在溶液中游离的或者本身结合于固体或半固体表面、聚合酶基质，或者位于固体或半固体基质表面上。相互作用还可以由外部因素激发，如光、温度、压力或添加作为催化剂的化学或生物学分子。复合物从反应混合物的检测和/或分离由于在亲和性分子和接纳体分子之间的相互作用、正常是一种类型的结合、而发生。
亲和性分子的例子包括分子如免疫原性分子，例如蛋白质的表位，肽，碳水化合物或脂质，即用于制备特异于该分子的抗体的任何分子；生物素，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，及其衍生物；金属结合分子；及这些分子的片段和组合。举例的亲和性分子包括His5(HHHHH)(SEQ ID NO：72)，HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO：73)，C-myc(EQKLISEEDL)(SEQ IDNO：74)，Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：75)，SteptTag(WSHPQFEK)(SEQID NO：66)，HA标记(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：77)，硫氧还蛋白，纤维素结合结构域，几丁质结合结构域，S-肽，T7肽，钙调蛋白结合肽，C末端RNA标记，金属结合结构域，金属结合反应基团，氨基酸反应基团，inteins，生物素，链霉抗生物素蛋白和麦芽糖结合蛋白。突变水解酶和底物之间的复合物中生物素的存在允许复合物选择性结合抗生物素蛋白分子，例如包被在表面例如珠、微孔、硝基纤维素等上的抗生物素蛋白分子例如链霉抗生物素蛋白分子。合适的表面包括用于层析分离的树脂，塑料如组织培养表面或结合平板，微滴定板和珠，陶瓷和玻璃，颗粒包括磁性颗粒，聚合物和其它基质。处理的表面用例如磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，以除去缺乏生物素的分子，分离含生物素复合物。在一些情况中，这些材料可以是生物分子传感装置如光纤、chemfets和等离子体检测器的部分。
亲和性分子的另一个例子是丹磺酰赖氨酸。与丹磺酰环相互作用的抗体是可商业获得的(Sigma Chemical；St.Louis，MO)或者可以用已知方案制备，如在Antibodies：A Laboratory Manual(Harlow and Lane，1988)中所述。例如，抗丹磺酰抗体被固定化在层析柱的填充材料上。这个方法，亲和性柱层析，通过导致突变水解酶和本发明底物之间的复合物由于其与固定化抗体的相互作用而保留在柱上而其它分子通过柱而实现分离。复合物然后可以通过破坏抗体-抗原相互作用而释放。特异的层析柱材料如离子交换或亲和性Sepharose，Sephacryl，Sephadex和其它层析树脂是可商业获得的(Sigma Chemical；St.Louis，MO；Pharmacia Biotech；Piscataway，N.J.)。丹磺酰赖氨酸可以由于其荧光性质而方便检测。
当采用抗体作为接纳体分子时，可以通过其它生物化学分离方法进行分离，如免疫沉淀和固定化抗体到滤膜或其它表面如珠、平板或树脂上。例如，本发明的突变水解酶和底物的复合物可以通过用亲和性分子特异性或水解酶特异性抗体包被磁珠而分离。珠经常用磁场从混合物中分离。
另一类功能分子包括可用电磁辐射检测的分子，包括但非限于夹氧杂蒽荧光团，丹磺酰荧光团，香豆素和香豆素衍生物，荧光吖啶鎓部分，基于苯并芘的荧光团，以及7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑和3N-(7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑-4-基)-2，3-二氨基-丙酸。优选地，荧光分子在不同于天然氨基酸的波长具有高量子产额，更优选具有可以在光谱的可见光部分或者同时在UV和可见光部分激发的荧光的量子产额。在预选波长激发后，分子可以肉眼或用常规荧光检测方法在低浓度检测到。电化学发光分子如钌螯合物及其衍生物活在硝基氧氨基酸及其衍生物可以在飞摩尔范围和以下检测到。
在一个实施方案中，光学可检测的官能团包括一或多个荧光团，如夹氧杂蒽，香豆素，色原烯，吲哚，异吲哚，噁唑，BODIPY，BODIPY衍生物，咪唑，嘧啶，噻吩，芘，苯并芘，苯并呋喃，荧光素，罗丹明，rhodol，芴酮(phenalenone)，吖啶酮(acridinone)，resorufin，萘，蒽，吖啶鎓，α-萘醇，β-萘醇，丹磺酰，花菁，嗪，硝基苯并噁唑(NBD)，dapoxyl，萘酰亚胺，苯乙烯基等。
在一个实施方案中，光学可检测的官能团包括如下之一：
Figure GPA00001133133200481
Figure GPA00001133133200491
其中R1是C1-C8。
除了荧光分子之外，可以使用多种具有基于相互作用的物理性质及分子对电磁场和放射的应答的分子检测突变水解酶或其片段与底物之间的复合物。这些性质包括UV吸收、电磁谱的可见及红外区域、Raman活性的并且可以进一步由共振Raman光谱术增强的生色团的存在、电子自旋共振活性和核磁共振及分子质量，例如经质谱仪。
检测和/或分离具有亲和性分子的复合物的方法包括层析技术包括凝胶过滤、快压或高压液相层析、反相层析、亲和层析和离子交换层析。蛋白质分离的其它方法也可用于检测及随后分离突变水解酶或其片段与底物之间的复合物，例如电泳、等电聚焦和质谱。
用于水解酶底物中的举例的接头
术语“接头”也由符号＞L＝表示，是指将一或多个官能团共价附着于包括反应基团的底物或者共价附着于反应基团的基团。如本文所用接头不是单个共价键。接头的结构不是关键的，只要其产生能被其靶酶结合的底物即可。在一个实施方案中接头可以是二价基团，其通过长度大约5埃至大约1000埃(包括端点)将官能团(R)与反应基团分开。其它合适接头包括通过大约5埃至大约100埃将R与反应基团分开的接头，以及通过大约5埃至大约50埃、大约5埃至大约25埃、大约5埃至大约500埃或者大约30埃至大约100埃将R与底物分开的接头。
在一个实施方案中，接头是氨基酸。
在另一个实施方案中，接头是肽。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代，其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选用非过氧化物-O-、-S-或-NH-置换及其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子用芳环或杂芳环置换。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代，其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选用非过氧化物-O-、-S-或-NH-置换及其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子用一或多个(例如1、2、3或4个)芳环或杂芳环置换。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代，其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选用非过氧化物-O-、-S-或-NH-置换及其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子用一或多个(例如1、2、3或4个)杂芳环置换。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代，其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选用非过氧化物-O-、-S-或-NH-置换。
在另一个实施方案中，接头是式-W-F-W-的二价基团，其中F是(C1-C30)烷基、(C2-C30)链烯基、(C2-C30)炔基、(C3-C8)环烷基或(C6-C10)，其中W是-N(Q)C(＝O)-、-C(＝O)N(Q)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(Q)-、-C(＝O)-或直接键；其中每个Q独立是H或(C1-C6)烷基。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约30个碳原子。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约20个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约20个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键。
在另一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含大约2-大约20个碳原子。
在另一个实施方案中，接头是-(CH2CH2O)-1-10。
在另一个实施方案中，接头是-C(＝O)NH(CH2)3-；-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)-；-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)-；-C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-；-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-；-(CH2)4C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-；-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-。
在另一个实施方案中，接头包含一或多个二价杂芳基。
特别地，(C1-C30)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基；(C3-C8)环烷基可以环丙基、环丁基、环戊基或环己基；(C2-C30)链烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基或癸烯基；(C2-C30)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基或癸炔基；(C6-C10)芳基可以是苯基、茚基或萘基；杂芳基可以是呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基(oxazoyl)、异噁唑基(isoxazoyl)、噻唑基、异噻唑基(isothiazoyl)、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基(或其N-氧化物)、噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、吲哚基、异喹啉基(或其N-氧化物)或喹啉基(或其N-氧化物)。
术语芳族包括芳基和杂芳基基团。
芳基是指苯基或具有大约9-10个环原子、其中至少一个环是芳环的邻位稠合的双环碳环基(ortho-fused bicyclic carbocyclic radical)。
杂芳基包含通过单环芳香环的环碳连接的基，所述单环芳香环包含5或6个环原子，其由碳和1-4个杂原子组成，所述杂原子的每一个选自非过氧化物氧，硫和N(X)组成的组，其中X不存在或是H，O，(C1-C4)烷基，苯基或苄基，以及由此衍生的8-10个环原子的邻位稠合的双环杂环，具体是苯衍生物或通过稠合丙烯，三亚甲基，或四亚甲基二基而与其连接。
术语“氨基酸”当用于指接头时，包含D或L形式的天然氨基酸残基(例如Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Hyl，Hyp，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val)，以及非天然氨基酸(例如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸；马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、statine、1，2，3，4，-四氢异喹啉-3-羧酸、青霉胺、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对-苯甲酰苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸(propargylglycine)、肌氨酸和叔丁基甘氨酸)。该术语还包括携带常规氨基保护基(例如乙酰基或苄氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基末端被保护的天然和非天然氨基酸(例如作为(C1-C6)烷基、苯基或苄基酯或酰胺)。其它合适的氨基和羧基保护基是本领域技术人员已知的(参见例如Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981，及其引用的参考文献)。氨基酸可以通过羧基末端、氨基末端或通过任何其它方便的附着点例如通过半胱氨酸的硫与另一个分子连接。
术语“肽”当用于指接头时，描述了2-25个氨基酸的序列(如上述)或者肽基残基。序列可以是线性或环状的。例如，环状肽可以制备或得自在序列中的两个半胱氨酸残基之间形成二硫键。肽可以通过羧基末端、氨基末端或通过任何其它方便的附着点例如通过半胱氨酸的硫与另一个分子连接。优选地肽保护3-25或5-21个氨基酸。肽衍生物可以如美国专利号4,612,302；4,853,371；和4,684,620中所述制备。本文特别描述的肽序列以左侧氨基末端和右侧羧基末端书写。
举例的底物
在一个实施方案中，水解酶底物具有式(I)的化合物：R-接头-A-X，其中R是一或多个官能团，其中接头是包括C、N、S或O的多原子直链或支链，或者包含一或多个环例如饱和或未饱和环的基团，如一或多个芳环、杂芳环或其任何组合，其中A-X是脱卤素酶例如卤代烷脱卤素酶或者裂解脂族或芳香卤代底物中的碳-卤素键的脱卤素酶的底物，如红球菌(Rhodococcus)，假平胞菌(Sphingomonas)，葡萄球菌(Staphylococcus)，假单胞菌(Pseudomonas)，伯霍尔德杆菌(Burkholderia)，土壤杆菌(Agrobacterium)或茁平胞菌(Xanthobacter)脱卤素酶的底物，其中X是卤素。在一个实施方案中，烷基卤化物共价附着于接头L，L是共价附着一或多个官能团以形成脱卤素酶底物的基团。
在一个实施方案中，本发明的具有接头的脱卤素酶底物具有式(I)：
R-接头-A-X  (I)
其中R是一或多个官能团(如荧光团、生物素、发光团或者荧光或发光分子，或者是固体支持物，包括微球、膜、聚合物平板、玻璃珠、玻片等)，其中接头是包括C、N、S或O的多原子直链或支链，其中A-X是脱卤素酶底物，其中X是卤素。在一个实施方案中，A-X是脱卤素酶的卤代脂族或卤代芳族底物。在一个实施方案中，接头是二价支链或非支链碳链，包含从大约12个到大约30个碳原子，所述链任选包括一或多个(例如1、2、3或4个)双键或三键，以及所述链任选用一或多个(例如2、3或4个)羟基或氧基(＝O)基团取代，其中链中的一或多个(例如1、2、3或4个)碳原子任选用非过氧化物-O-、-S-或-NH-置换。在一个实施方案中，接头包含3-30个原子，例如11-30个原子。在一个实施方案中，接头包含(CH2CH2O)y且y＝2-8。在一个实施方案中，A是(CH2)n且n＝2-10，例如4-10。在一个实施方案中，A是CH2CH2或CH2CH2CH2。在另一个实施方案中，A包含芳基或杂芳基。在一个实施方案中，脱卤素酶如红球菌脱卤素酶的底物中的接头是包括C、N、S或O的多原子直链或支链，优选地当官能团R包括芳环系统或是固体支持物时为11-30个原子。
在另一个实施方案中，本发明的具有接头的脱卤素酶底物具有式(II)：
R-接头-CH2-CH2-CH2-X    (II)
其中X是卤素，优选氯。在一个实施方案中，R是一或多个官能团，如荧光团、生物素、发光团或者荧光或发光分子，或者是固体支持物，包括微球、膜、玻璃珠等。当R是放射性标记或者小的可检测原子如光谱活性同位素时，接头可以是0-30个原子。
举例的脱卤素酶底物描述于美国公开申请号2006/0024808和2005/0272114，其引入本文作参考。
用于水解酶融合体中的举例的突变脱卤素酶
羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl/羧基荧光素-C10H21NO2-Cl和5-羧基-X-罗丹明-C10H21NO2-Cl结合DhaA.H272F但不结合DhaA.WT。生物素-C10H21NO2-Cl结合DhaA.H272F但不结合DhaA.WT。底物与DhaA.H272F之间的键非常强，因为用SDS煮沸不破坏键。
DhaA.H272突变体即H272F/G/A/Q结合羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl。DhaA.H272以高特异性方式结合底物，因为用一种底物预处理完全阻断另一种底物(羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl)的结合。
DhaA中残基106的D用D之外的亲核氨基酸残基取代，例如C、Y和E，其可以与底物形成比野生型DhaA和底物之间形成的键更稳定的键。特别地，半胱氨酸是基于半胱氨酸的酶中的亲核体，那些酶已知不活化水。
分析了对照突变体DhaA.D106Q、单突变体DhaA.D106C、DhaA.D106Y和DhaA.D106E以及双突变体DhaA.D106C:H272F，DhaA.D106E:H272F、DhaA.D106Q:H272F和DhaA.D106Y:H272F对羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的结合。羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl结合DhaA.D106C、DhaA.D106C:H272F、DhaA.D106E和DhaA.H272F。因此，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和突变体DhaA中的残基106的半胱氨酸或谷氨酸之间形成的键相对于羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和DhaA.WT之间形成的键稳定。在106位的其它取代单独或组合在DhaA中其它残基的取代可以产生相似结果。另外，在106位的一些取代单独或组合在DhaA中其它残基的取代可以产生仅与一些底物形成键的突变DhaA。
在一个实施方案中，本发明的突变脱卤素酶包含至少两个氨基酸取代，其中至少一个与稳定的键形成相关，例如在野生型水解酶中的活化水分子的残基，例如组氨酸残基，并且位于相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基272的位置，例如，取代的氨基酸是天冬酰胺、甘氨酸或苯丙氨酸，至少另一个与改良的功能表达、结合动力学或FP信号相关，例如在相应于SEQ ID NO：1的位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88，94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172，175，176，187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，273，277，282，291或292的位置。
用于诱变的残基的鉴别
残基编号基于DhaA的一级序列，其不同于公布的晶体结构的编号(1BN6.pdb)。使用DhaA底物模型，鉴别了在结合的底物的3
Figure GPA00001133133200551
和5内的脱卤素酶残基。这些残基代表第一种用于诱变的潜在靶。从这个列表选择残基，当它们被置换时，很可能去除立体位阻或不利的相互作用，或者导入有利的电荷、极性或其它相互作用。例如，在位置175的Lys残基位于DhaA表面在底物通道入口：除去这个大的带电侧链可能改善底物进入通道。在位置176的Cys残基排在通道中，其大侧链导致通道收缩：除去这个侧链可能打开通道并改善底物进入。在位置245的Val残基排在通道中，并与结合的底物的两个氧紧密接近：用苏氨酸置换这个残基可增加氢键合机会，可改善底物结合。最后，Bosma et al.(2002)报道了分离了具有氨基酸取代Tyr273Phe的DhaA催化高效(proficient)突变体。这个突变当与Cys 176Tyr取代重组时，产生在脱卤素1，2，3-三氯丙烷(TCP)中比野生型脱卤素酶近乎高8倍有效的酶。基于这些结构分析，除了产生定点V245T突变植物，在位置175、176和273的密码子被随机化。筛选所得突变体的改良的与荧光(例如式VI或VIII的化合物)和生物素偶联的DhaA底物形成共价键的速率。
文库产生及筛选
所有文库和突变体构建的起始材料均是含有编码DhaA.H272F和DhaA.D106C的基因的基于pGEX5X3的质粒。这些质粒携带编码能与卤代烷配体形成稳定共价键的亲代DhaA突变体的基因。在DhaA.H272F和DhaA.D106C模板中的位置175、176和273的密码子用NNK位点饱和诱变策略随机化。除了在这些位置的单位点文库外，还构建了组合175/176NNK文库。
评估了三种测定作为DhaA突变体文库初级筛选工具。第一个是体内标记测定，基于大肠杆菌中的改良的DhaA突变体具有优异标记性质这个假设。在用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的短暂标记期及细胞洗涤之后，优异克隆应具有更高的在575nm的荧光强度。仅筛选一个96孔板DhaA.H272F175/176文库就成功鉴别了一些潜在改良(即hits)。4个克隆具有比亲代克隆高2倍的强度水平。尽管这个测定的潜在用途，但是没有选择它作为初级筛选，因为自动化程序遇到困难以及由于活性DhaA突变体的简单过表达可能给出假阳性这个事实。
被考虑作为初级筛选的第二个测定是体外测定，其通过将饱和量的DhaA突变体捕获在96孔形式的固定化抗FLAG抗体上而有效针对蛋白质浓度标准化。与体内测定类似，这个测定也能够清楚从亲代活性大背景鉴别潜在的改良的DhaA突变体。一些克隆产生比亲代DhaA.H272F高4倍的信号。但是这个测定是昂贵的，因为试剂费用和测定准备时间，以及多个保温和洗涤步骤的自动化。另外，这个测定不能捕获先前分离并鉴定为优异的一些突变体。
自动化基于MagneGSTTM的测定被用于筛选DhaA突变蛋白质文库。筛选基于DhaA.H272F和DhaA.D106C的175单位点文库未能揭示比亲代克隆显著更好的hits。筛选鉴别了一些具有比亲代对照优异的标记性质的克隆。3个具有显著更高标记性质的克隆可以从包括DhaA.H272F亲代的背景明显区分。对于具有比DhaA.H272F亲代高至少50％的活性的克隆，检查的文库的整体命中率在1-3％之间变化。DhaA.D106C文库获得类似筛选结果(数据未示出)。由最初初级筛选鉴别的hits被置于主平板中，固结(consolidated)，重新生长并用MagneGSTTM测定再次分析。仅那些在再次分析中具有比亲代对照高至少2倍的信号的DhaA突变体被选择用于序列分析。
DhaA hits的序列分析
图2A显示筛选DhaA.H272F文库后鉴别的DhaA突变体的密码子这个分析鉴别了7个单176位氨基酸取代(C176G，C176N，C176S，C176D，C176T，C176A，及C176R)。令人感兴趣地，分离了三个不同丝氨酸密码子。还鉴别了在175和176位的许多双氨基酸取代(K175E/C176S，K175C/C176G，K175M/C176G，K175L/C176G，K175S/C176G，K175V/C176N，K175A/C176S，和K175M/C176N)。尽管在这些双突变体中在175位发现7种不同氨基酸，但是在位置176仅鉴别3种不同氨基酸(丝氨酸、甘氨酸和天冬酰胺)。在文库质量评估中鉴别的单K175M突变包括在分析中。另外，还鉴别了一些优异的单Y273取代(Y273C，Y273M，Y273L)。
图2B显示在DhaA.D106C文库中鉴别的DhaA突变体的突变密码子。除了单C176G突变之外，大多数鉴别的克隆含有双175/176突变。总共11种不同氨基酸在175位被鉴别。相反，仅3种氨基酸(Gly，Ala和Gln)在位置176被鉴别，Gly在几乎3/4的D106C双突变体中出现。
DhaA突变体的鉴定
由筛选程序鉴别的一些基于DhaA.H272F和D106C的突变体在MagneGST测定中产生比亲代克隆显著更高的信号。基于DhaA.H272F的突变体A7和H11以及基于DhaA.D106C的突变体D9用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl产生比各自亲代显著更高的信号。另外，在273位鉴别的所有基于DhaA.H272F的突变体(Y273L″YL″，Y273M″YM″和Y273C″YC″)使用生物素-PEG4-14-Cl底物看起来比亲代克隆显著改良。这些分析结果与用SDS-PAGE fluorimage凝胶分析进行的蛋白质标记研究一致。在确定DhaA.H272F背景中鉴别的最佳突变的组合释放是否是加合的努力中，在残基273的3个突变与DhaA.H272F A7和DhaA.H272F H11突变重组。为了区分这些重组的蛋白质突变体与在第一轮筛选中鉴别的突变体(第一代)，它们被称为“第二代”DhaA突变体。
为促进比较动力学研究，一些改良的DhaA突变体被选择用GlutathioneSepharose 4B树脂纯化。一般地，基于DhaA.H272F and DhaA.D106C的融合体在大肠杆菌中的产生是丰富的，尽管单氨基酸变化可能对DhaA产生具有负面结果。作为蛋白质生产中的这一变化，DhaA突变体的整体产率也显著变化(1-15mg/mL)。初步动力学标记研究用一些DhaA.H272F衍生的突变体进行。许多(如果不是全部)选择用于分析的突变体具有比H272F亲代更快的标记动力学。事实上，更紧密观察时程时，一些DhaA突变体包括第一代突变体YL和两个第二代突变体A7YM和H11YL突变体的标记似乎在2分钟完成。在DhaA.H272F A7和两个第二代DhaA.H272F突变体A7YM和H11YL上进行更扩展的时程分析。两个第二代克隆的标记反应大部分在第一个时间点(20秒)完成。另一方面，A7突变体看起来仅在最后时间点(7分钟)达到完成。凝胶上的荧光条带被定量，确定产物形成的相对速率。为了确定标记速率，H11YL的浓度从50ng降低到10ng，进行更精确的时程。在这些标记条件下可以测量线性初始速率。荧光成像的(fluorimaged)凝胶数据的定量允许计算二级速率常数。基于观察的斜率，DhaA.H272F H11YL的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记的二级速率常数是5.0x105M-1 sec-1。
荧光偏振(FP)对于小荧光配体结合蛋白质的研究是理想的。其在用于分析分子结合的方法中是独特的，因为其给出底物结合/游离比率的直接近乎瞬时测量。因此，FP测定被开发为纯化DhaA突变体的fluorimage凝胶分析的替代途径。在所用标记条件下，第二代突变体DhaA.H272F H11YL比其A7和H272F对应物显著更快。为使这个速率比例正确(in perspective)，在反应中分别需要多大约42倍或420倍的A7和亲代DhaA.H272F蛋白质以获得可测量速率。在所用标记条件下，很显然H11YL突变体也比A7和亲代DhaA.H272F蛋白质与基于荧光素底物更快。但是看起来用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记H11YL比用相应羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物标记显著更慢。多4倍的H11YL蛋白用于羧基荧光素-C10H21NO2-Cl反应(150nM)，相比于羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl反应(35nM)，观测到的速率看起来定性上比观测的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl速率低。
基于这个测定的灵敏性和真同质性质，使用FP鉴定用荧光偶联底物对纯化的DhaA突变体的标记性质。来自这些研究的数据然后用于计算每个DhaA突变体-底物对的二级速率常数。用于这个研究的两个亲代蛋白质DhaA.H272F和DhaA.D106C被发现用基于羧基四甲基罗丹明和羧基荧光素的底物具有可比的速率。但是在每种情况中，标记比用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物慢。所有用FP鉴定的第一代DhaA突变体具有比相应亲代蛋白质快7-3555倍的速率。到目前为止，单氨基酸取代对标记速率的最大影响用DhaA.H272F背景中的273位的3种置换(Y273L，Y273M和Y273C)发生。然而，在每个测试的第一代DhaA.H272F突变体中，用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物标记总是以较慢速率发生(1.6-46倍)。大多数第二代DhaA.H272F突变体比甚至最改良的第一代突变体显著更快。一个突变体特别是H11YL用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的计算二级速率常数比DhaA.H272F亲代高4个数量级。H11YL速率常数2.2x106M-1 sec-1几乎与羧基四甲基罗丹明偶联的生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用的计算的速率常数相同。这个值与用表面等离子体共振分析(Qureshi et al.，2001)确定的针对生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的结合速率5x106M-1 sec-1一致。一些第二代突变体还具有用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物的改良速率，但是如前所述，这些速率总是比用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物慢。例如DhaA.H272F H11YL突变体的羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记速率比羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记速率低100倍。
举例的方法
本发明提供了监测细胞中分子的表达、定位和/或运输，以及监测细胞内微环境中的变化的方法，以例如成像、鉴别、定位、展示或检测可能存在于样品例如细胞中的一或多个分子，所述方法采用杂合蛋白质系统。本发明方法中采用的试剂优选可溶于水溶液或大多数水溶液中，包括水及具有大于或等于大约6的pH的水溶液。但是，底物的原液可以在稀释进水溶液或缓冲液中之前溶解在有机溶剂中。优选的有机溶剂是非质子极性溶剂如DMSO、DMF、N-甲基吡咯烷酮、丙酮、乙腈、二噁烷、四氢呋喃和其它非羟基完全水混溶溶剂。使用的试剂的浓度依赖于实验条件和希望的结果，例如在合理时间内获得结果，具有最低背景或不希望的标记，例如对于PCL反应。例如，水解酶底物的浓度典型从纳摩尔到微摩尔。报道蛋白底物和合适融合蛋白的所需浓度可以通过底物和/或融合蛋白量中的系统差异确定直至实现满意信号，例如标记。起始范围容易地从本领域已知方法确定。
在一个实施方案中，包括具有光学性质的官能团的水解酶底物被用于检测异源序列之间或者分子如细胞分子和一或多个异源序列与包括具有水解酶片段的融合体的融合蛋白之间的相互作用。这种底物与包含融合蛋白的感兴趣样品组合一段足以使异源序列与细胞分子相互作用例如结合以及水解酶片段/互补功能不同蛋白质片段结合底物的时间，之后在选择引起官能团的光学应答的波长光照样品任选地，样品被洗涤以除去残余的、过量的或未结合的底物。在一个实施方案中，使用标记以通过进一步比较该光学应答与标准或预期应答而确定样品的指定特征。例如，结合的底物用于监测样品的特异成分在样品中的空间及时间分布。或者，结合的底物用于确定或检测某一分子的存在或数量。
在一个实施方案中，基于生物发光蛋白的杂合系统被用于检测异源序列之间或者分子如细胞分子和一或多个异源序列与包括具有生物发光蛋白片段的融合体的融合蛋白之间的相互作用。生物发光蛋白的底物与包含融合蛋白的感兴趣样品组合一段足以使异源序列与细胞分子相互作用例如结合以及生物发光蛋白片段/互补功能不同蛋白质片段结合底物的时间，之后检测或测量由生物发光蛋白产生的信号。任选地，样品被洗涤以除去残余的、过量的或未结合的底物。在一个实施方案中，信号与标准或对照比较。
可检测的光学应答是指能通过直接观察或仪器察觉到的测试系统中的参数的变化或发生。这种可检测应答包括颜色、生物发光、荧光、反射、化学发光、光偏振、光散射或X-射线散射中的变化或出现。在一个实施方案中，可检测应答是荧光中的变化，如荧光强度、激发或发射波长分布、荧光寿命、荧光偏振或其组合中的变化。可检测的光学应答可在样品全部或在样品局部部分发生。比较光学应答程度与标准或预期应答可以用于确定样品是否具有给定特征及到何种程度。
包含本发明融合蛋白的样品典型用被动手段标记，即与底物保温。但是，可以使用将底物导入样品的任何方法如将底物显微注射进细胞或细胞器，以将底物导入样品。本发明的底物在使用浓度内通常对于活细胞及其它生物学成分是无毒的。
包含本发明融合蛋白的样品可以在与本发明底物接触后立即观测。包含本发明融合蛋白的样品可以任选与检测过程中的其它溶液组合，例如标记、包括洗涤溶液、透化和/或固定溶液以及其它含有额外检测试剂的溶液。与底物接触后的洗涤可以改善光学应答的检测，因为洗涤后降低非特异性背景。不洗涤也可以有满意的观察，例如对于基于PCL的反应，使用较低的标记浓度。本领域已知许多固定剂和固定条件，包括甲醛、低聚甲醛、福尔马林、戊二醛、冷甲醇和3∶1甲醇∶乙酸。固定典型用于保存细胞形态学及当用病原性样品工作时降低生物危害。底物的选择的实施方案，例如具有官能团的水解酶底物，在细胞中良好保持。固定任选后接或者伴随透化，如用丙酮、乙醇、DMSO或各种去污剂透化，以允许大底物根据本领域已知的方法跨过细胞膜。任选地，在包含突变水解酶或其融合蛋白的样品中，底物的使用可以与额外检测试剂的使用组合，所述额外检测试剂产生由特异细胞成分、细胞内物质或者细胞条件所致的可检测应答。当额外检测试剂具有不同于底物的光谱性质，多颜色应用是可能的。
在一个实施方案中，在与具有官能团(该官能团具有光学性质)的水解酶底物接触之后或期间的任何时间，包含融合蛋白(其中之一包括水解酶片段)的样品用导致可检测光学应答的光波长光照，并且用检测光学应答的手段观测。尽管一些底物可用环境光比色检测，但是其它底物通过亲本荧光团的荧光性质检测。在如用紫外或可见波长发射灯、弧光灯、激光或者甚至太阳光或者普通室内光光照后，底物、包括结合于互补特异性结合对成员的底物显示致密的可见光吸收以及荧光发射。用于光照本发明底物的选择的仪器包括但非限于手持紫外灯、汞弧光灯、氙灯、氩激光器、激光二极管和YAG激光器。这些光源任选集成激光扫描仪、荧光微板读出器、标准或小荧光计或者色谱检测器。这个比色吸光度或荧光发射任选用肉眼观察，或者使用任何下列装置：CCD相机、摄像机、照相胶卷、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、表面荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微板读出器，或者通过扩增信号的手段如光电倍增管。当包含突变水解酶或其融合蛋白的样品用流式细胞仪、荧光显微镜或荧光计检查时，所述仪器任选用于区分和辨认包含是荧光团的官能团的底物和具有可检测的不同光学性质的第二个荧光团，典型地是通过区分底物的荧光应答及第二个荧光团的荧光应答。当样品用流式细胞仪检查时，样品的检查任选包括用淘选装置基于底物的荧光应答分离样品内的颗粒。
本发明通过下述非限制性实施例描述。
实施例1
对于DhaA.H272F H11YL(图4，HT2)的DNA进行如下定点诱变，发现D78G、F80S、P291A和P291G相对于DhaA.H272F H11YL在大肠杆菌中的功能表达得以改善。
应用在DhaA.H272F H11YL中密码子80、272和273的位点饱和诱变，产生含有在每个这些位置所有可能氨基酸的文库。将所述文库在大肠杆菌中过表达，使用含有的脱卤素酶底物(C31H31ClNO8)的羧基荧光素(FAM)和荧光偏振法(FP)筛选功能性表达/改良的动力学。筛选使得可以鉴别具有改良的表达以及改良的动力学的蛋白质。特别地，筛选可以排除具有较低内在动力学(intrinsic kinetics)的突变体。具有希望的性质的取代包括如下取代：F80Q、F80N、F80K、F80H、F80T、H272N、H272Y、Y273F、Y273M以及Y273L。在这些取代中，Y273F示出改良的内在动力学。
HT2中在272位置的Phe缺乏与Glu-130形成氢键的能力。据认为His-272与Glu-130之间的相互作用发挥结构作用，因此这个键的缺少可以使HT2不稳定。此外，Phe与在273位置的Tyr-＞Leu改变的邻近可以提供这些相邻残基的侧链之间潜在的协同相互作用。在273位置是Leu或Phe的情况中，Asn被鉴别是在272位置最佳的残基。当建模含有Asn-272的HT2结构时，显然1)Asn充填与His相比具有相似几何学的空间，以及2)Asn可以与Glu-130形成氢键。发现在272位置具有Asn取代的HT2在大肠杆菌、无细胞系统以及哺乳动物细胞中产生较高水平功能蛋白，很可能是改良该蛋白质的整体稳定性的结果。
使用两轮诱变PCR以在HT2整个编码序列导入突变，频率是每个序列1-2个氨基酸取代。这种方法使得可以靶向整个序列，且不依赖于HT2结构/功能的任何现有知识。在第一轮诱变中，在HT2的N末端融合于人源化Renilla萤光素酶作为模板的情况中，固定Asn-272、Phe-273和Gly-78。鉴别有益于改良针对FAM配体的FP信号的6个突变(S58T、A155T、A172T、A224E、P291S、A292T；V2)，且确定除了A172T之外的每个取代均使得大肠杆菌中蛋白质产生增加。然而，A172T突变提供改良的内在动力学。然后组合这6个取代(包括Leu+/-273)产生合成序列(V3/V2)，当其与多个配偶体及以两个方向融合时提供明显改良的蛋白质产生以及内在标记动力学。
在第二轮诱变中，使用6个不同的模板：V3或者V2在C末端融合人源化Renilla萤光素酶(RL)、萤火虫萤光素酶，或者Id。如上述进行诱变PCR，组合经鉴别有益于3个配偶体中的至少2个配偶体的突变，产生V6(Leu-273)。在第二轮诱变PCR中，使用升高的温度(30℃)诱导蛋白质表达，以尝试选择赋予热稳定性的序列。提高突变DhaA融合体的内在结构稳定性可以更有效地产生蛋白质。
与希望的性质相关的随机突变包括如下突变：G5C、G5R、D11N、E20K、R30S、G32S、L47V、S58T、R60H、D65Y、Y87F、L88M、A94V、S109A、F113L、K117M、R118H、K124I、C128F、P134H、P136T、Q150H、A151T、A155T、V157I、E160K、A167V、A172T、D187G、K195N、R204S、L221M、A224E、N227E、N227S、N227D、Q231H、A250V、A256D、E257K、K263T、T264A、D277N、I282F、P291S、P291Q、A292T和A292E。
除了上述取代之外，鉴别了突变DhaA与下游C末端配偶体Renilla萤光素酶之间连接序列中的取代。所述亲本连接序列(残基294-320)是：QYSGGGGSGGGGSGGGGENLYFQAIEL(SEQ ID NO：79)。在该连接序列中鉴别的与改良的FP信号相关的取代是Y295N，G298C，G302D，G304D，G308D，G310D，L313P，L313Q和A317E。注意这9个取代中有5个是带负电荷的。
除了A172T和Y273F(在H272N情况中)之外，所有上述取代均提供了作为N末端融合体在大肠杆菌中的改良的功能性表达。然而，A172T和Y273F改良了内在动力学用于标记。
在具有一般改良性质的突变DhaA中举例的组合取代是：
DhaA 2.3(V3)：S58T、D78G、A155T、A172T、A224E、F272N、P291S和A292T。
DhaA 2.4(V4)：S58T、D78G、Y87F、A155T、A172T、A224E、N227D、F272N、Y273F、P291Q和A292E。
DhaA 2.5(V5)：G32S、S58T、D78G、Y87F、A155T、A172T、A224E、N227D、F272N、P291Q和A292E。
DhaA2.6(V6)：L47V、S58T、D78G、Y87F、L88M、C128F、A155T、E160K、A167V、A172T、K195N、A224E、N227D、E257K、T264A、F272N、P291S和A292T。
在DhaA 2.6中发现的取代除了A167V之外均改良在大肠杆菌中的功能性表达，所述A167V改良内在动力学。
图5提供了改良在大肠杆菌中功能性表达的额外的取代。
V6序列用作模板用于在C-末端诱变。在Id-V6融合情况中(V6是C-末端配偶体)，制备含有随机的两个残基(尾部)延伸的突变体文库，并且用FAM配体筛选。鉴别具有改良的蛋白质产生以及较低非特异性裂解(通过TMR配体标记和凝胶分析确定)的突变体。DhaA 2.6(V6)中两个C-末端残基由Glu-Ile-Ser-Gly置换，产生V7。作为与Id的N-末端和C-末端融合体，将V7的表达与V6进行对比。融合体在大肠杆菌中过表达，并用10μM TMR配体完成标记，然后通过SDS-PAGE+荧光成像(fluorimaging)分辨。数据示出从V7序列中产生更多的功能性融合蛋白。此外，用FAM配体对V7的标记动力学与V6相似，但是当检测纯化的非融合蛋白质时，V7比V6具有更快的动力学。
为了检测体内标记，在将HeLa细胞用HT2，V3，V7和V7F的载体转染24小时后(V7F相对于V7具有一个不同氨基酸差异；V7F在273位置是Phe而不是Leu)，将细胞在体内用0.2μM TMR配体标记5分钟、15分钟、30分钟或者2小时。通过SDS-PAGE/荧光成像分析样品以及通过ImageQuant量化。V7和V7F导致比HT2和V3更好的功能性表达，V7、V7F和V3在哺乳动物细胞中均具有相对于HT2改良的体内动力学。
此外，V7作为N-或C-买末端融合体具有改良的功能性表达，且在pulldown实验中比其它突变DhaA更有效。结果示出对于MyoD的数量V7＞V6＞V3，可以使用HaloLinkTM-固定的突变体DhaA-Id融合体pulleddown。V7和V7F具有改良的标记动力学。特别地，V7F具有比V7快大约1.5-3倍的标记。
此外，对于热稳定性，V7＞V6＞V7F＞V3＞HT2。例如，在一些条件下(暴露于48℃温度30分钟)，纯化的V7F丧失其50％活性，而V7仍保持80％活性。当V7和V7F在大肠杆菌中表达以及作为裂解产物分析时，V7和V7F之间热稳定性差异更显著。
注意这些突变体的末端可以适应各种序列，包括尾部和链接序列以及取代。例如，突变体DhaA的N末端可以是M/GA/SETG，C末端可包括取代和添加(尾部)，例如P/S/QA/T/ELQ/EY/I，以及任选SG。例如，所述C末端可以是EISG、EI、QY或者Q。对于N-载体，N-末端可以是MAE，而在C-载体中，N-末端序列或者突变体DhaA可以是GSE或者MAE。尾部包括但不限于QY和EISG。
实施例2
Renilla萤光素酶中耐受修饰的位点
制备Renilla萤光素酶构建体，其具有插入在耐受修饰的位点中的RIIβB，例如在残基91/92、223/224或者229/230之间。它们是：hRL(1-91)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-4氨基酸肽接头-hRL(92-311)，hRL(1-91)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-20氨基酸肽接头-hRL992-311)，hRL(1-91)-10氨基酸肽接头-RIIBetaB-4氨基酸接头-hRL(92-311)，hRL(1-91)-42氨基酸肽接头-hRL(92-311)，hRL(1-223)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-4氨基酸接头-hRL(224-311)，hRL(1-223)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-20氨基酸接头-hRL(224-311)，hRL(1-223)-10氨基酸肽接头-RIIBetaB-4氨基酸接头-hRL(224-311)，hRL(1-223)-10氨基酸肽接头-RIIBetaB-20氨基酸接头-hRL(224-311)，hRL(1-223)-42氨基酸肽接头-hRL(224-311)，hRL(1-229)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-4氨基酸接头-hRL(230-311)，hRL(1-229)-4氨基酸肽接头-RIIBetaB-20氨基酸接头-hRL(230-311)，hRL(1-229)-42氨基酸肽接头-hRL(230-311)。
使用TnT T7Coupled Wheat Germ Lysate系统从所述构建体中表达蛋白质，将17μL的TNT反应物与补加3.4μL的1mM cAMP原液或者dH2O的17μL的300mM HEPES/200mM Thiourea(pH为大约7.5)混合；使反应物在室温保温大约10分钟。将10μL每个样品一式三份加入96孔平板中，使用100μL Renilla萤光素酶分析试剂在Glomax光度计上测量发光。hRL(1-91)-接头-RIIBetaB-接头-hRL(92-311)蛋白被诱导12-23倍，hRL(1-223)-接头-RIIBetaB-接头-hRL(224-311)蛋白未被诱导，hRL(1-229)-接头-RIIBetaB-(230-311)蛋白被诱导大约2-9倍。42个氨基酸接头构建体无一被诱导，全长Renilla萤光素酶构建体或者“无DNA”对照物也未被诱导。
耐受修饰的这些位点及其它位点在下表中示出。
  位点
  位点
  31
  42
  69
  111
  151
  169
  193
  208
  251
  259
  274
  91
  223
  229
对于除4个之外的所有构建体，选择位点，因为其在溶剂暴露的表面环中。Renilla萤光素酶在其它水解酶如脱卤素酶中可以用作耐受修饰的位点模型，例如使用1BN6(红球菌属(Rhodococcus sp.))和2DHD(自养的茁平胞菌(Xanthobacter autotrophicus))卤代烷脱卤素酶晶体结构作为模板。溶剂暴露的表面环与包埋于蛋白质核心中的位点或者包含于α或者β结构中的位点相比可以更适应修饰。因此，脱卤素酶中相应于Renilla萤光素酶中耐受修饰的那些位点的区域，例如相应于Renilla萤光素酶的残基86-97、96-116或者218-235的区域，可用于制备“分离(split)”脱卤素酶蛋白用于PCA或者PCL。
实施例3
雷帕霉素(Rapamycin)-介导的FRB/FKBP蛋白质-蛋白质相互作用和突变体DhaA用于PCL中。当雷帕霉素存在时，FRB和FKBP相互作用。因此，如果PCL成功，重建的报道蛋白仅当融合蛋白在存在雷帕霉素条件下保温时被标记。
产生两个pF9(Kan)载体，其含有FRB或者FKBP ORF加上接头序列(GlyGlyGlyGlySer)2，位于SgfI/PmeI位点上游。对应可用于制备Renilla萤光素酶片段用于PCS的位置的突变DhaA基因(HT2)(见实施例2和图7)具有FRB-N-末端和FKBP-C-末端融合。使用PCR引物扩增HT2N-和C-末端部分，并克隆进SgfI/PmeI位点。使用RiboMax及随后Wheat Germ Plus反应(HT2)，通过单独表达每个克隆在体外进行PCL。使用或者不用FluoroTectTM表达蛋白质。FluoroTectTM标记保证所有蛋白质以大约相等量表达(数据未示出)。未标记的蛋白质单独或者与合适的配对体在由或无1μM雷帕霉素条件下一起保温。然后将10μl这些产物与突变体脱卤素酶的0.1μM的TMR标记的配体在黑暗处保温2小时。然后将所有样品与1×SDS/50mM DTT加样缓冲液在70℃保温5分钟，随后进行变性
Figure GPA00001133133200671
凝胶电泳。图8B示出预期结果。
对于瞬时转染，将CHO细胞铺板于6孔平板中，使用
Figure GPA00001133133200672
-CHO一式两份转染。第二天，将细胞在有或无1μM雷帕霉素条件下保温2.5小时，随后与1.0μM
Figure GPA00001133133200673
TMR配体保温1小时。将细胞在PBS中洗涤、用胰蛋白酶消化、沉淀，以及在具有蛋白酶抑制剂和RQDNase I的200μlPBS中机械裂解。将标准化量的蛋白质在用微波高火处理30秒，并在变性
Figure GPA00001133133200674
凝胶上运行。
结果
FRB-N末端(1-78)+FKBP-C末端(79-294)的共保温仅当与雷帕霉素一起保温时才保持TMR标记。正如所期望的，全长HT2也被标记。FluoroTectTM标记示出所有蛋白质均等量表达(数据未示出)。此外，CHO细胞中PCL介导的蛋白质在存在雷帕霉素的条件下被标记(图8C)。也存在少量雷帕霉素非依赖性PCL。无论是否加入雷帕霉素，全长HT2均被标记。
因此，这个技术具有提供更高灵敏性的潜力，用以通过随时间积累标记而检测弱的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，这个技术通过使用相同载体构建体可易于在体外、体内以及原位显影研究之间转变。
实施例4
在FRB-N-末端报道蛋白片段+FKBP-C-末端报道蛋白片段方向与HTv7和 人源化Renilla萤光素酶(hRL)的蛋白质互补
许多细胞信号是沟通的，并且通过级联蛋白质-蛋白质相互作用的网络实现。最后，许多这些信号导致可以通过使用报告基因测定监测的遗传应答。需要测定与主要事件接近的细胞事件的能力，因为其可以更“实时”分析细胞应答以及降低由于在随后下游点混淆因素所致假象的可能性。
为了监测蛋白质-蛋白质相互作用，制备两个融合蛋白。一个融合蛋白含有一部分报道蛋白和一种感兴趣的蛋白质(第一个异源序列，相对于报道蛋白异源，与另一(第二个)异源序列相互作用)。另一融合蛋白含有与第一个融合蛋白中的报道蛋白部分功能不同但互补的蛋白质的一部分以及第二个异源氨基酸序列。在一个实施方案中，一个感兴趣的蛋白质融合在Renilla萤光素酶的N末端或C末端部分的N-末端或者C-末端，另一感兴趣的蛋白质融合在突变脱卤素酶例如称作HTv7的C-末端或者N-末端部分的N-或者C-末端。感兴趣的蛋白质的相互作用重建Renilla萤光素酶和/或HTv7蛋白的活性。哪种活性重建依赖于催化位点位于蛋白质的哪部分(或者在HTv7情况中是前面的催化位点)。
选择Renilla萤光素酶和HTv7作为基于结构相似性的杂合互补系统模型。对卤代烷脱卤素酶(红球菌；Swiss Prot#P59336)和Renilla萤光素酶同源模型，使用1BN6(红球菌)和2DHD(自养的茁平胞菌)卤代烷脱卤素酶晶体结构作为模板的基于结构分析获得大约30％相同性。
材料和方法
这两个蛋白质由HTv7和Renilla萤光素酶分别在两个位置被分离：残基78/79或者98/99以及91/92或者111/112。Renilla萤光素酶“分离”位置先前已经在Renilla萤光素酶蛋白质互补分析(PCA)(Kaihara，et al.，2003，和Remy et al.，2005)中成功示出(也见实施例2所述)。此外，成功的蛋白质互补标记(PCL)通过使用HT2(相对于HTv7的突变脱卤素酶，见实施例1)在位置78/79证实(实施例3)。另外，被cAMP成功诱导通过使用循环改变顺序的Renilla萤光素酶-RIIBetaB生物传感器证实，其中Renilla萤光素酶基因在相应于氨基酸位置91/92和111/112的位置被循环改变顺序(见美国专利申请系列No.11/732,105)。
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统进行PCA。以如下方向制备融合蛋白：FRB-N-末端报道蛋白片段和FKBP-C-末端报道蛋白片段。定向诱变(Stratagene QuickChange)用于将核苷酸“TA”导入pF3A载体(Promega)，产生就在SgfI限制位点上游的NheI限制位点(在下表1中称作pF3A(TA))。然后将如下两个表达盒插入NheI与SgfI限制位点之间：[FRB-AscI限制位点-GGGGSGGGGS接头]和[FKBP-AscI限制位点-GGGGSGGGGS接头]。在FRB构建体的SgfI与PmeI限制位点之间，插入如下报道蛋白片段：HTv7(氨基酸1-78)、HTv7(氨基酸1-98)、hRL(氨基酸1-91)和hRL(氨基酸1-111)。在FKBP构建体的SgfI与PmeI限制位点之间，插入如下报道蛋白片段：HTv7(氨基酸79-297)、HTv7(氨基酸99-297)、hRL(氨基酸92-311)和hRL(氨基酸112-311)。此外，将HTv7(氨基酸1-297)和hRL(氨基酸1-311)的全部编码区插入pF3A载体的SgfI与PmeI限制位点之间。表1列出了所述构建体。
表1
  构建体   载体   类型   描述   名称
  201518.54.02   pF3A   全长   HTv7(1-297)   FLHTv7
  201518.45.A2   pF3A(TA)   FRB-N末端   FRB-HTv7(1-78)   FRB-H78
  201518.45.B9   pF3A(TA)   FRB-N末端   FRB-HTv7(1-98)   FRB-H98
201518.45.C6 pF3A(TA)   FKBP-C末端   FKBP-HTv7(79-297) FKBP-H79
201518.45.E1 pF3A(TA)   FKBP-C末端   FKBP-HTv7(99-297) FKBP-H99
  201518.45.01   pF3A   全长   hRL(1-311)   FLhRL
  201518.45.E9   pF3A(TA)   FRB-N末端   FRB-hRL(1-91)   FRB-R91
  201518.73.D1   pF3A(TA)   FRB-N末端   FRB-hRL(1-111)   FRB-R111
201518.61.B1 pF3A(TA)   FKBP-C末端   FKBP-hRL(92-311) FKBP-R92
201518.45.03 pF3A(TA)   FKBP-C末端   FKBP-hRL(112-311) FKBP-R112
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HT和Renilla萤光素酶蛋白以及FRB-N-末端或FKBP-C-末端片段对照)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTect GreenLys in vitroTranslation labeling System(Promega)以及有或无1μM雷帕霉素(BioMol)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将5μL所得非-FluoroTect标记的裂解物与1μM
Figure GPA00001133133200691
TMR配体(Promega)在室温在黑暗处保温2.5小时。然后将5μL所有裂解物(有和无FluoroTect，有和无雷帕霉素)与5-10U的RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。将裂解物与1×LDS加样染料(Invitrogen)、60μM DTT和水混合至总体积为20μL。然后将样品在4-12％Bis-Tris SDS PAGE凝胶(Invitrogen)上进行大小分级分离。
对于Renilla萤光素酶活性测定，将10μL裂解物(有和无雷帕霉素)在2×HEPES/硫脲中1∶1稀释，一式三份将5μL置于96孔平板孔中。通过用注射器加入100μL Renilla萤光素酶分析试剂(Promega；R-LAR)测量发光。
结果
图9A和9B示出HTv7的N-末端和C-末端报道部分在存在雷帕霉素条件下在分离位点H78/H79和H98/H99可重建标记活性。也存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图9A，泳道2和3；图9B，泳道3)。此外，N-末端hRL片段+C-末端HTv7片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点R91/H79和R111/H99可以重建标记活性(图9A，泳道7以及图9B，泳道7)。
Renilla萤光素酶分析结果适于图10A和10B。除了FRB-R111+FKBP-R112组合之外，PCA构建体+雷帕霉素无一导致明显的Renilla萤光素酶活性。有雷帕霉素的这个组合与无雷帕霉素相比产生高5.3倍Renilla萤光素酶活性。
实施例5
在N-末端报道蛋白片段-FRB+FKBP-C-末端报道蛋白片段方向与HTv7和 人源化Renilla萤光素酶(hRL)的蛋白质互补
材料和方法
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统进行PCA。为了检测“插入样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备另一系列融合蛋白：N-末端报道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[C-末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FRB]。插入如下N-末端报道蛋白片段：HTv7(氨基酸1-78)、HTv7(氨基酸1-98)、hRL(氨基酸1-91)和hRL(氨基酸1-111)。表2列出所述构建体。
表2
  构建体   载体   类型   描述   名称
201518.172.H7 pF3A N末端-FRB   HTv7(1-78)-FRB   FRB-H78
201518.172.G10 pF3A N末端-FRB   HTv7(1-98)-FRB   FRB-H98
  201518.176.01   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-91)-FRB   FRB-R91
  201518.158.A4   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-111)-FRB   FRB-R111
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HaloTag和Renilla萤光素酶蛋白)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTect GreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将20μL所得裂解物(有或无FluoroTect)在有和无1μM雷帕霉素(BioMol)条件下在室温保温15分钟。然后将5μL非-FluoroTect标记的裂解物与1μMTMR配体(Promega)在冰上在黑暗处保温大约45分钟。将5μL FluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5-10U的RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与1×LDS加样染料(Invitrogen)和水混合至总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis--HCl SDS PAGE凝胶(Bio-Rad)上进行大小分级分离。
对于Renilla萤光素酶活性测定，将10μL裂解物(有和无雷帕霉素)在2×HEPES/硫脲中1∶1稀释，一式三份将5μL置于96孔平板孔中。通过用注射器加入100μL Renilla萤光素酶分析试剂(Promega；R-LAR)测量发光。
结果
图12示出HTv7的N-末端和C-末端片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点H78/H79和H98/H99在“插入样”方向可重建标记活性。也存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图12，泳道2和3)。此外，N-末端hRL报道蛋白片段+C-末端HTv7报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点R91/H79和R111/H99在“插入样”方向可以重建标记活性(图12，泳道9和10)。R91/H79组合存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图12，泳道9)。
除了R91-FRB+FKBP-R92和R111-FRB+FKBP-R112组合之外，PCA构建体+雷帕霉素无一导致明显的Renilla萤光素酶活性。有雷帕霉素的这些组合与无雷帕霉素相比分别产生高8.6和81倍Renilla萤光素酶活性(图13)。
实施例6
在C-末端片段-FKBP+FRB-N-末端片段方向与HTv7和人源化Renilla萤 光素酶(hRL)的蛋白质互补
材料和方法
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统进行PCA。为了检测“CP样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备另一系列融合蛋白：C-末端报道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[Met-C-末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FKBP]。插入如下C-末端报道蛋白片段：HTv7(Met-氨基酸79-297)、HTv7(Met-氨基酸99-297)、hRL(Met-氨基酸92-311)和hRL(Met-氨基酸112-311)。表3列出所述构建体。
表3
  构建体   载体   类型   描述   名称
201591.13.09 pF3A C末端-KBP   HTv7(79-297)-FKBP   H79-FKBP
201591.13.14 pF3A C末端-FKBP   HTv7(99-297)-FKBP   H99-FKBP
201591.13.03 pF3A C末端-FKBP   hRL(92-311)-FKBP   R92-FKBP
201591.13.06 pF3A C末端-FKBP   hRL(112-311)-FKBP   R112-FKBP
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HaloTag和Renilla蛋白)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTect GreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将20μL所得裂解物(有或无FluoroTect)在有和无1μM雷帕霉素(BioMol)条件下在室温保温15分钟。然后将5μL非-FluoroTect标记的裂解物与1μM
Figure GPA00001133133200721
TMR配体(Promega)在冰上在黑暗处保温大约45分钟。将5μL FluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5-10U的RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与1×LDS加样染料(Invitrogen)和水混合至总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis-HCl SDS PAGE凝胶(Bio-Rad)上进行大小分级分离。
对于Renilla萤光素酶活性测定，将10μL裂解物(有和无雷帕霉素)在2×HEPES/硫脲中1∶1稀释，一式三份将5μL置于96孔平板孔中。通过用注射器加入100μL Renilla萤光素酶分析试剂(Promega；R-LAR)测量发光。
结果
图14示出HTv7的N-末端和C-末端报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点H79/H78和H99/H98在“CP样”方向可重建标记活性。也存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图14，泳道2和3)。此外，N-末端hRL报道蛋白片段+C-末端HTv7报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点H 79/R91和H99/R111在“CP样”方向可以重建标记活性(图14，泳道7和8)。H79/R91组合存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图14，泳道7)。
Renilla萤光素酶活性结果示于图15。除了R92-FKBP+FRB-R91和R111-FKBP+FRB-R112组合之外，PCA构建体+雷帕霉素无一导致明显的Renilla萤光素酶活性。有雷帕霉素的这些组合与无雷帕霉素相比分别产生高134和46倍Renilla萤光素酶活性(图15)。
实施例7
在N末端报道蛋白片段-FRB+FKBP-C末端报道蛋白片段和C末端报道蛋 白片 段-FKBP+FRB-N末端报道蛋白片段两个方向与HTv7和稳定的 Renilla萤光素酶(Rluc8)的蛋白质互补
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统进行PCA。对于这个实施例，使用稳定的Renilla萤光素酶(Rluc8，A55T，C124A，S130A，K136R，A143M，M185V，M253L，和S287L；Loening et al.，2006)。为了检测“插入样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备两个融合蛋白：N-末端报道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[C末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FRB]。插入如下N-末端报道蛋白片段：Rluc8(氨基酸1-91)和Rluc8(氨基酸1-111)。为了检测“CP样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备两个融合蛋白：C末端报道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[Met-C末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FKBP]。插入如下C-末端报道蛋白片段：Rluc8(Met-氨基酸92-311)和Rluc8(Met-氨基酸112-311)。将Rluc8的全长氨基酸序列也插入在pF3K载体(Promega)的SgfI与PmeI限制位点之间。表4列出所述构建体。
表4
  构建体   载体   类型   描述   图例
  201647.120.C7   pF3A   全长   FLRluc8   FLRluc8
  201647.136.02   pF3A   N末端-FRB   Rluc8(1-91)-FRB   Rluc8(91)-FRB
201647.136.09 pF3A N末端-FRB   Rluc8(1-111)-FRB   Rluc8(111)-FRB
201647.136.13 pF3A C末端-FKBP   Rluc8(92-311)-FKBP   Rluc8(92)-FKBP
201647.147.25 pF3A C末端-FKBP   Rluc8(112-311)-FKBP   Rluc8(112)-FKBP
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HaloTag和Renilla蛋白)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTect GreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将20μL所得裂解物(有或无FluoroTect)在有和无1μM雷帕霉素(BioMol)条件下在室温保温15分钟。然后将5μL非-FluoroTect标记的裂解物与1μM
Figure GPA00001133133200741
TMR配体(Promega)在冰上在黑暗处保温大约45分钟。将5μL FluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5-10U的RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与1×LDS加样染料(Invitrogen)和水混合至总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis-HCl SDS PAGE凝胶(Bio-Rad，图16)上进行大小分级分离。
对于Renilla萤光素酶活性测定，将10μL裂解物(有和无雷帕霉素)在2×HEPES/硫脲中1∶1稀释，一式三份将5μL置于96孔平板孔中。通过用注射器加入100μL Renilla萤光素酶分析试剂(Promega；R-LAR)测量发光。
结果
图16示出HTv7的N-末端和C-末端报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点H78/H79和H98/H99可重建标记活性。也存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图16，泳道2和3)。此外，N-末端Rluc8报道蛋白片段+C-末端HTv7报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下在分离位点Rluc8(91)/H79和Rluc8(111)/H99在“插入样”方向可以重建标记活性(图16，泳道6和7)。Rluc8(91)/H79组合存在少量雷帕霉素非依赖性标记活性(图16，泳道6)。
除了Rluc8(91)-FRB+Rluc8(92)-FKBP和Rluc8(111)-FRB+Rluc8(112)-FKBP组合之外，PCA构建体+雷帕霉素无一导致明显的Renilla萤光素酶活性。有雷帕霉素的这些组合与无雷帕霉素相比分别产生高4.0和17.0倍Renilla萤光素酶活性(图17)。
实施例8
在N末端报道蛋白片段-FRB+FKBP-C末端报道蛋白片段和C目的报道蛋 白片段-FKBP+FRB-N末端报道蛋白片段两个方向与Renilla萤光素酶 /HTv7杂合及人源化Renilla萤光素酶的蛋白质互补
材料和方法
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统进行PCA。对于这个实施例，将Renilla萤光素酶的前13个氨基酸添加于HTv7N-末端片段，然后将该杂合的蛋白质与FRB或者FKBP融合，再用于具有C末端融合于FRB或者FKBP的人源化Renilla萤光素酶的FRB/FKBP模型系统中，测量Renilla萤光素酶活性。为了检测“插入样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备两个融合蛋白：N-末端报道蛋白片段-FRB。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[C末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FRB]。插入如下N-末端报道蛋白片段：Rluc8(氨基酸1-91)和Rluc8(氨基酸1-111)。为了检测“CP样”方向，在pF3A载体(Promega)中以如下方向制备两个融合蛋白：C末端报道蛋白片段-FKBP。在SgfI和PmeI限制位点之间插入如下表达盒：[Met-C末端报道蛋白片段-GGSSGGGSGG接头(包括SacI限制位点)-FKBP]。插入如下C-末端报道蛋白片段：Rluc8(Met-氨基酸92-311)和Rluc8(Met-氨基酸112-311)。将Rluc8的全长氨基酸序列也插入在pF3K载体(Promega)的SgfI与PmeI限制位点之间。表5列出所述构建体。
表5
  构建体   载体   类型   描述   图例
  201518.45.01   pF3A   全长   FL-hRL   FL-hRL
  201518.176.01   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-91)-FRB   R91-FRB
  构建体   载体   类型   描述   图例
  构建体   载体   类型   描述   图例
  201518.158.A4   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-111)-FRB   R111-FRB
  201518.61.B1   pF3A   FKBP-C末端   FKBP-hRL(92-311)   FKBP-R92
  201518.45.03   pF3A   FKBP-C末端   FKBP-hRL(112-311)   FKBP-R112
  201518.45.E9   pF3A   FRB-N末端   FRB-hRL(1-91)   FRB-R91
  201518.73.D1   pF3A   FRB-N末端   FRB-hRL(1-111)   FRB-R111
  201591.13.03   pF3A   C末端-FKBP   hRL(92-311)-FKBP   R92-FKBP
  201591.13.06   pF3A   C末端-FKBP   hRL(112-311)-FKBP   R112-FKBP
  201591.45.01   pF3A   杂合N末端-FRB   hRL(1-13)-HTv7(1-78)-FRB   R13-H78-FRB
  201591.45.07   pF3A   杂合N末端-FRB   hRL(1-13)-HTv7(1-98)-FRB   R13-H98-FRB
  201591.47.A4   pF3A   FRB-杂合N末端   FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-78)   FRB-R13-H78
  201591.47.A8   pF3A   FRB-杂合N末端   FRB-hRL(1-13)-HTv7(1-98)   FRB-R13-H98
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HaloTag和Renilla蛋白)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTect GreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将20μL所得裂解物在有和无1μM雷帕霉素(BioMol)条件下在室温保温15分钟。将5μLFluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5-10U的RNase ONERibonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与1×LDS加样染料(Invitrogen)和水混合至总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis-HClSDS PAGE凝胶(Bio-Rad，图18)上进行大小分级分离。
对于Renilla萤光素酶活性测定，将10μL裂解物(有和无雷帕霉素)在2×HEPES/硫脲中1∶1稀释，一式三份将5μL置于96孔平板孔中。通过用注射器加入100μL Renilla萤光素酶分析试剂(Promega；R-LAR)测量发光。
结果
图18示出N和C末端报道蛋白片段被表达。除了R91-FRB+FKBP-R92、R111-FRB+FKBP-R112、R92-FKBP+FRB-R91和R112-FKBP+FRB-R111组合之外，PCA构建体+雷帕霉素无一导致明显的Renilla萤光素酶活性。有雷帕霉素的这些组合与无雷帕霉素相比分别产生高13.5、114、10.4和51倍Renilla萤光素酶活性(图19)。
实施例9
确定在N末端报道蛋白片段-FRB+FKBP-C末端报道蛋白片段和C末端报 道蛋白片 段-FKBP+FRB-N末端报道蛋白片段两个方向HaloTag(version 7)和人源化Renilla萤光素酶或者稳定的Renilla萤光素酶(Rluc8)蛋白质 互补百分比
材料和方法
使用雷帕霉素依赖性FRB/FKBP模型系统以及前述构建体进行PCA。表6列出这个实施例中使用的构建体。
表6
  构建体   载体   类型   描述   图例
  201518.54.02   pF3A   全长   FL-HTv7   FLHTv7
201518.45.A2 pF3A FRB-N末端   FRB-HTv7(1-78)   FRB-H78
201518.45.B9 pF3A FRB-N末端   FRB-HTv7(1-98)   FRB-H98
  201518.45.C6   pF3A FKBP-C末端   FKBP-HTv7(79-297)   FKBP-H79
  201518.45.E1   pF3A FKBP-C末端   FKBP-HTv7(99-297)   FKBP-H99
201518.172.H7   pF3A   N末端-FRB   HTv7(1-78)-FRB   H78-FRB
201518.172.G10   pF3A   N末端-FRB   HTv7(1-98)-FRB   H98-FRB
  201591.13.09   pF3A   FKBP-C末端   HTv7(79-297)-FKBP   H79-FKBP
  201591.13.14   pF3A   FKBP-C末端   HTv7(99-297)-FKBP   H99-FKBP
  201518.45.E9   pF3A   FRB-N末端   FRB-hRL(1-91)   FRB-hRL91
201518.73.D1   pF3A   FRB-N末端   FRB-hRL(1-111)   FRB-hRL111
  构建体   载体   类型   描述   图例
  201518.176.01   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-91)-FRB   hRL91-FRB
201518.158.A4   pF3A   N末端-FRB   hRL(1-111)-FRB   hRL111-FRB
201647.136.02   pF3A   N末端-FRB   Rluc8(1-91)-FRB   Rluc8(91)-FRB
201647.136.09   pF3A   N末端-FRB   Rluc8(1-111)-FRB   Rluc8(111)-FRB
使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)共表达蛋白质(或者单独表达全长HaloTag蛋白)。根据厂商方案使用或不使用2μL的FluoroTectGreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将10μL所得裂解物(有和无FluoroTect)在有和无5μL(1μM)雷帕霉素(BioMol)条件下在室温保温15分钟。将11μL非-FluoroTect标记的裂解物与5μL(1μM)
Figure GPA00001133133200781
TMR配体(Promega)在室温在黑暗处保温15分钟。将11μL FluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5μL的1∶5稀释的(5-10U)RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与5μL的4×(最后1×)LDS加样染料(Invitrogen)混合至总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis-HClSDS PAGE凝胶(Bio-Rad，图20)上进行大小分级分离。
结果
图20示出所有N和C末端报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下均可以重建标记活性。大多数还具有少量雷帕霉素非依赖性标记活性。使用ImageQuant(Molecular Dynamics)量化SDS-PAGE图像上TMR标记的产物的量，体积减去背景(无DNA样品)并根据FL HTv7标准化(见图21)。
实施例10
基于图21所示结果，选择最佳的四个Renilla萤光素酶N-末端+HTv7C-末端对以及FL HTv7和两个HTv7N-末端+HTv7C-末端对照物。使用如下偏差重复实验。使用TnT Sp6高产量蛋白质表达系统(Promega)单独表达蛋白质，以降低雷帕霉素非依赖性标记。根据厂商方案使用或不使用2μLFluoroTect GreenLys in vitro Translation labeling System(Promega)，将2μg总DNA与50μL主混合物(master mix)在25℃保温2小时。将10μL所得裂解物(有和无FluoroTect)在有或无5μL(1μM)雷帕霉素(BioMol)的条件下在室温保温15分钟。然后将11μL非-FluoroTect标记的裂解物与5μL(1μM)
Figure GPA00001133133200782
TMR配体(Promega)在室温在黑暗处保温15分钟。将11μLFluoroTect标记的裂解物(有和无雷帕霉素)与5μL的1∶5稀释的(5-10U)RNase ONE Ribonuclease(Promega)在室温保温15分钟。然后将裂解物与5μL的4×(最后1×)LDS加样染料(Invitrogen)混合，总体积为20μL。然后将样品在4-20％Bis-HCl SDS PAGE凝胶上进行大小分级分离(Bio-Rad；图22)。
结果
图22示出所有N和C末端报道蛋白片段在存在雷帕霉素条件下均可以重建标记活性。大多数未示出雷帕霉素非依赖性标记活性。使用ImageQuant(Molecular Dynamics)量化SDS-PAGE图像上TMR标记的产物的量，体积减去背景(无DNA样品)并根据FL HTv7标准化。数据示于图23。对于Renilla萤光素酶N-末端+HTv7C-末端对，在加入雷帕霉素的样品中标记的产物的量为FL HTv7的大约20-30％。HTv7N-末端+HTv7C-末端对在加入雷帕霉素的样品中具有明显更多的标记的产物，是FL HTv7的大约75-85％。然而，雷帕霉素非依赖性背景也明显较高(大约16％，FLHTv7为大约1-8％)。背景增加在Renilla萤光素酶N末端+HTv7 C-末端与HTv7N-末端+HTv7 C-末端对之间在有或无雷帕霉素的条件下导致相似的倍数差异，只有一个例外。
因此，在非特异性蛋白质-蛋白质相互作用是检测或者动态范围的限制因素的情况中，分离Renilla萤光素酶/HaloTag对可能能检测N-末端(same)报道蛋白与C-末端(same)报道蛋白对可能不能检测的蛋白质-蛋白质相互作用。
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所有出版物、专利和专利申请书均并入本文作参考。在前面的说明书中，已经关于某些优选的实施方案描述了本发明，且举例说明了本发明，本领域技术人员显然意识到在不偏离本发明基本原理的前提下可以对本发明加以改变。

Claims (38)

1.多个表达载体，包括：
第一个表达载体，其包含第一个多核苷酸，该多核苷酸包含与第一个融合蛋白的开放读框可操纵连接的启动子，所述第一个融合蛋白包含i)报道蛋白的片段，所述片段具有相应全长报道蛋白的至少50个连续氨基酸残基但是比其少至少50个氨基酸残基；以及ii)第一个异源氨基酸序列；
第二个表达载体，其包含第二个多核苷酸，该多核苷酸包含与第二个融合蛋白的开放读框可操纵连接的启动子，所述第二个融合蛋白包含iii)相对于报道蛋白功能不同的蛋白质的片段，所述片段具有相应全长功能不同的蛋白质的至少50个连续氨基酸残基但是比其少至少50个氨基酸残基，以及iv)第二个异源氨基酸序列，
其中报道蛋白片段的报道活性在功能不同的蛋白质片段的存在下增加，并且依赖于第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用。
2.权利要求1的多个载体，其中报道蛋白是突变卤代烷脱卤素酶，其稳定结合相应非突变卤代烷脱卤素酶的底物，其中突变卤代烷脱卤素酶在相应于红球菌卤代烷脱卤素酶的第106或者272位残基的氨基酸残基包含至少一个氨基酸取代。
3.权利要求2的多个载体，其中所述功能不同的蛋白质是珊瑚虫萤光素酶或者单加氧酶。
4.权利要求2的多个载体，其中突变卤代烷脱卤素酶的片段包含相应全长突变卤代烷脱卤素酶的C末端部分的至少50个直至250个连续氨基酸。
5.权利要求2的多个载体，其中所述突变卤代烷脱卤素酶片段的N末端相应于红球菌脱卤素酶中第73-103位残基区域中的残基。
6.权利要求1的多个载体，其中所述报道蛋白是生物发光酶或者水解酶。
7.权利要求1的多个载体，其中所述报道蛋白是甲虫萤光素酶，所述功能不同的蛋白质不是生物发光蛋白。
8.权利要求7的多个载体，其中所述功能不同的蛋白质是酰基-CoA连接酶，酰基-硫醇连接酶或者脂酰基-CoA合成酶。
9.权利要求1的多个载体，其中所述报道蛋白质是Oplophorus萤光素酶，所述功能不同的蛋白质不是生物发光蛋白质。
10.测试分子相互作用的测定或者可以改变分子相互作用的物质或条件，包括单独融合于分子结构域的功能不同的蛋白质的片段，其中分子结构域的相互作用通过重建至少一个所述独立的蛋白质的活性而检测。
11.权利要求10的测定，其中所述功能不同的蛋白质是珊瑚虫萤光素酶和突变卤代烷脱卤素酶，或者甲虫萤光素酶和酰基-CoA连接酶、酰基-硫醇连接酶，或者脂酰基-CoA-合成酶，或者Oplophorus萤光素酶和亲脂转运蛋白质、视黄醇结合蛋白、脂肪酸结合蛋白，或者FABP-样蛋白质家族中非生物发光蛋白质。
12.测试分子相互作用的方法，包括：
a)提供第一个融合蛋白，其包含第一个蛋白质的片段与第一个异源氨基酸序列；
b)提供第二个融合蛋白，其包含相对于第一个蛋白质功能不同的蛋白质的片段及选择的第二个异源氨基酸序列，所述第二个异源氨基酸序列与第一个异源氨基酸序列相互作用或可疑与其相互作用；
c)使第一个和第二个异源氨基酸序列互相接触；
d)检测得自第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用的第一个蛋白质或第二个蛋白质的活性。
13.权利要求12的方法，其中第一个蛋白质是突变卤代烷脱卤素酶，其稳定结合相应非突变脱卤素酶的底物或者是生物发光酶。
14.组合物，其包含第一个多核苷酸，该多核苷酸包含编码第一个融合蛋白的开放读框，所述第一个融合蛋白具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用，其中所述脱卤素酶片段在相对于脱卤素酶功能不同蛋白质的片段的存在下能稳定结合相应全长野生型脱卤素酶的脱卤素酶底物，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应全长功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基，其中所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基包含至少一个氨基酸取代，所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定。
15.权利要求14的组合物，其进一步包含第二个多核苷酸，该多核苷酸包含编码第二个融合蛋白的开放读框，所述第二个融合蛋白包含功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段的结合增加，其中功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的残基或区域中。
16.组合物，其包含第一个融合蛋白，所述第一个融合蛋白包含具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用，其中所述脱卤素酶片段在相对于脱卤素酶的功能不同蛋白质的片段的存在下能稳定结合相应全长野生型脱卤素酶的脱卤素酶底物，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应全长功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基，其中所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基的至少一个氨基酸取代，所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定。
17.权利要求16的组合物，其进一步包含第二个融合蛋白，所述第二个融合蛋白包含功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段的结合增加，其中功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的残基或区域中。
18.权利要求15或17的组合物，其中功能不同的蛋白质中耐受修饰的区域相应于Renilla萤光素酶的第64-74、86-116或者146-156位残基。
19.权利要求14或16的组合物，其中脱卤素酶中耐受修饰的区域相应于Rhodococcus脱卤素酶的第73-83、93-103或者204-214位残基。
20.载体，其包含权利要求14的组合物中的第一个多核苷酸。
21.载体，其包含权利要求15的组合物中的第二个多核苷酸。
22.宿主细胞，其包含权利要求14-16的组合物。
23.多个表达载体，包含
第一个表达载体，其包含与第一个融合蛋白的开放读框可操纵连接的第一个启动子，所述第一个融合蛋白包含具有来自相应全长脱卤素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的第一个片段和第一个异源氨基酸序列，所述第一个异源氨基酸序列与第二个异源氨基酸序列直接或间接相互作用，其中所述脱卤素酶片段的N末端是在耐受修饰的全长野生型脱卤素酶序列的残基或区域中，所述脱卤素酶片段在序列上相应于全长突变的脱卤素酶的片段，其包含在相应于玫瑰色红球菌脱卤素酶的氨基酸残基106或272的氨基酸残基的至少一个氨基酸取代，所述取代允许全长突变的脱卤素酶与脱卤素酶底物形成键，该键比相应全长野生型脱卤素酶与脱卤素酶底物之间形成的键更稳定；
第二个表达载体，其包含与第二个融合蛋白的开放读框可操纵连接的第二个启动子，所述第二个融合蛋白包含相对于脱卤素酶的功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，所述功能不同蛋白质的片段包含来自相应全长功能不同蛋白质的N末端部分的至少50个及直至150个连续氨基酸残基，其中所述功能不同蛋白质片段的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的残基或区域中；
其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能够检测并且导致脱卤素酶底物被脱卤素酶片段的结合增加。
24.权利要求23的多个载体，其中突变脱卤素酶包含相对于相应全长野生型脱卤素酶的至少两个氨基酸取代，其中第二个取代在全长野生型脱卤素酶活性位点腔内的氨基酸残基。
25.检测样品中两个蛋白质之间相互作用的方法，包括：
a)在有效允许第一个和第二个异源氨基酸序列缔合的条件下提供样品，该样品具有表达由权利要求23的多个载体编码的融合蛋白的细胞，该细胞裂解物，或者表达由权利要求23的多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，以及具有至少一个官能团的脱卤素酶底物；
b)检测样品中与所述脱卤素酶片段结合的至少一个官能团的存在、量或者位置，从而检测这两个异源序列是否相互作用。
26.检测改变两个蛋白质的相互作用的物质的方法，包括：
a)在有效允许第一个和第二个异源序列缔合的条件下提供样品，该样品具有表达由权利要求23的多个载体编码的融合蛋白的细胞，该细胞裂解物，或者表达由权利要求23的多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应，以及提供具有至少一个官能团的脱卤素酶底物和可疑改变第一个和第二个异源氨基酸序列的相互作用的物质；
b)检测样品中相对于无该物质的样品时结合所述脱卤素酶片段的至少一个官能团的存在或者量。
27.检测改变两个蛋白质的相互作用的条件的方法，包括：
a)提供样品置于一种条件，其中所述样品包含表达由权利要求23的多个载体编码的的融合蛋白的细胞、该细胞裂解物，或者表达由权利要求23的多个载体编码的融合蛋白的体外转录/翻译反应；
b)将具有至少一个官能团的脱卤素酶的底物加入样品；
c)相对于不在该条件下的样品，检测样品中结合脱卤素酶片段的至少一个官能团的存在或量。
28.权利要求25的方法，进一步包括将样品与改变第一个和/或第二个异源氨基酸序列构象的物质接触，或者将样品置于该条件下。
29.组合物，其包含第一个多核苷酸，该第一个多核苷酸包含编码第一个融合蛋白的开放读框，所述第一个融合蛋白包含i)包含来自相应全长珊瑚虫萤光素酶的C末端部分的至少50个及直至250个连续氨基酸残基的珊瑚虫萤光素酶的第一个片段，包含来自相应全长甲虫萤光素酶的C末端部分的至少50个及直至450个连续氨基酸残基的甲虫萤光素酶的第一个片段，或者包含来自相应全长十足类萤光素酶的C末端部分的至少40个及直至150个连续氨基酸残基的十足类萤光素酶的第一个片段，其中珊瑚虫萤光素酶、甲虫萤光素酶或者十足类萤光素酶片段的N末端在耐受修饰的全长野生型珊瑚虫萤光素酶、甲虫萤光素酶或者十足类萤光素酶序列的残基或区域中，以及ii)第一个异源氨基酸序列，其与第二个异源氨基酸序列直接或者间接相互作用；
第二个多核苷酸，其包含编码第二个融合蛋白的开放读框，所述第二个融合蛋白包含相对于萤光素酶的功能不同蛋白质的片段及第二个异源氨基酸序列，所述功能不同的蛋白质片段包含相应全长功能不同的蛋白质的N末端部分的至少40个及直至250个连续氨基酸残基，其中功能不同蛋白质的C末端是在耐受修饰的全长功能不同蛋白质的残基或区域中；
其中第一个和第二个异源氨基酸序列之间的相互作用能被检测且导致萤光素酶活性增加。
30.权利要求29的组合物，其中甲虫萤光素酶中耐受修饰的区域是在相应于萤火虫萤光素酶的残基102-126、残基139-165、残基203-193、残基220-247、残基262-273、残基303-313、残基353-408或者残基485-495的区域。
31.权利要求30的组合物，其中第一个片段是萤火虫萤光素酶片段。
32.权利要求31的组合物，其中所述功能不同蛋白质不是生物发光蛋白质。
33.权利要求32的组合物，其中功能不同蛋白质是脂酰基-CoA合成酶。
34.权利要求29的组合物，其中珊瑚虫萤光素酶中耐受修饰的区域相应于Renilla萤光素酶的残基64-74、残基86-116或者残基146-156，或者十足类萤光素酶中耐受修饰的区域相应于Oplophorus萤光素酶的残基45-55或者残基79-89。
35.权利要求34的组合物，其中所述第一个片段是Renilla萤光素酶片段或者Oplophorus萤光素酶片段。
36.权利要求35的组合物，其中功能不同蛋白质不是生物发光蛋白质。
37.权利要求36的组合物，其中所述功能不同蛋白质是脱卤素酶。
38.权利要求36的组合物，其中所述功能不同蛋白质是亲脂性转运蛋白、视黄醇结合蛋白或者脂肪酸结合蛋白。
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