CN105441472A - 一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体 - Google Patents

一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体。所述表达载体克隆区的上游包含人类脂肪酸结合蛋白(hFABP6)，下游为金属硫蛋白MT4。本发明还揭示了应用所述表达载体的方法，包括表达菌株的构建、扩增、诱导表达、融合蛋白纯化的基本方法。本发明所揭示的hFABP6-MT4融合蛋白表达载体具有如下特点：①高效表达MT4蛋白；②可溶性表达。

Description

一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体，尤其是涉及一种具有伴侣样蛋白功能的人类游离脂肪酸结合蛋白与人类金属硫蛋白的融合表达。
背景技术
1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白(英文为Metallothionein，简称MT)。
关于金属硫蛋白,全球从1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美国共举行了四次国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987年我国将MT列入[863]计划，“八五”、“九五”重大攻关项目，1994年列入国家级[火炬计划]；2003年MT项目被国家科技部列为“国家科技成果重点推广计划项目,1995年联合国将MT列入向世界各国推荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对MT的研究、开发、推广、应用的高度重视。
金属硫蛋白(Metallothionein，MT),又称巯基金属结合蛋白。一类非酶蛋白质，除含有镉(Cd)、锌(Zn)的MT外，在自然界也存在含有铜(Cu)、汞(Hz)、金(Au)、铋(Bi)等元素的MT。MT的蛋白分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50％的金属离子发生解离的pH值分别为：Zn-MT:3.5～4.5；Cd-MT:2.5～3.5；Cu-MT<1.0。因MT缺乏芳香族氨基酸，故在280nm处无吸收峰，然而具有与金属相关的吸收峰。去金属的MT在190nm处有一个吸收峰。所有脊椎动物、多数植物和微生物体内都含有MT。无论是自然产生还是诱导产生的MT，其氨基酸组成基本相同、主要不同在所含金属及其含量。
人类MT按分子特征和分布分为四个亚群：MT1、MT2、MT3、MT4。MT1又分9个亚类，MT2又分MT2a和MT2b。MT1和MT2分布全身，MT3分布于脑，MT4主要分布于皮肤。
自由基是人体衰老的第一大元凶，自由基还与人类若干中老年疾病紧密相关，导致人体免疫力逐步下降，MT是目前已知的最好的自由基清除剂，减少自由基就能延缓人体衰老步伐。同时，MT也是目前唯一有效的重金属解毒和清除蛋白。人体重金属超标或中毒，损害肝、肾、骨、脑和记忆功能，引发多种疾病。
大量的科学实验和临床结果表明：MT在抗电离辐射、紫外线照射、解除金属毒素、治疗或缓解消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、各种癌症、保护皮肤、减轻吸烟及环境污染对人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。
目前MT产品主要从兔肝、马肾、猪肝和微生物(如粗脉孢菌)等中提取，成本高、产量低，抑制了她的广泛使用，比如食品、饮品、化妆品等。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体是将人类金属硫蛋白-4(MT4)的编码序列作为目标蛋白编码序列插入伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的多克隆区所得；所述的伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体上游含有人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列，人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白编码序列的多克隆区。
所述的人类游离脂肪酸结合蛋白与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等于或大于85％，所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列优选为经过密码子优化的编码序列。
所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列进一步优选如SEQIDNO.1所示。
所述的柔性接头区和多克隆区序列优选如SEQIDNO.3所示。
所述的人类金属硫蛋白-4其氨基酸序列优选与人类天然金属硫蛋白的氨基酸序列的同源性等于或大于75％。
人类金属硫蛋白-4(MT4)氨基酸序列如SEQIDNO.22所示，该蛋白经密码子优化后的核苷酸编码序列优选如SEQIDNO.21所示。
所述的表达载体中人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列的上游还包含编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列，优选编码组氨酸标签的序列。
有益效果：
1.本发明构建的重组表达载体能够促进或诱导被融合的下游人类金属硫蛋白融合蛋白的折叠,具有蛋白伴侣样蛋白的特性。
2.该FABP蛋白为人源性,理论上不存在对人体的免疫原性,适于制药工业中解决目标蛋白包涵体问题,并且可以保留融合蛋白一同制药。
附图说明
图1、hFABP融合蛋白示意图
图2、pET28a-hFABP6表达载体物理图
图3、pET28-hFABP6-MT4环状质粒物理图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的应用进行说明，所举的实施例仅是对本发明的应用作概括性例示，有助于更好地理解本发明的用途，但并不会限制本发明应用范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
一种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的构建方法，包括以下步骤：
步骤一、hFABP的编码DNA的人工合成和优化，本实施例以hFABP6为例：
(1)取hFBP6氨基酸序列(SEQIDNO.2)逆向翻译成DNA编码序列，经过密码子优先性、核糖体结合区序列优化获得序列(SEQIDNO.1),但不限于此序列，以翻译后的蛋白质氨基酸序列同源性等于或大于85％为限。
(2)将该编码序列分段合成寡核苷酸单链DNA(SEQIDNO.5～18)。
(3)多聚酶链式反应(PCR)法合成全长编码DNA序列，包含5’-6xHisTag(SEQIDNO.4)、hFBP6氨基酸编码序列、3’-柔性接头序列(Linker)和多克隆区(SEQIDNO.3)。
(4)经测序反应验证全长DNA序列(SEQIDNO.19所示)。
步骤二、载体制备：
(1)将步骤一合成得到的hFABP6编码序列(SEQIDNO.19)，包含5’-6xHisTag、3’-柔性接头序列(Linker)和多克隆区，经限制性内切酶酶切消化、琼脂糖凝胶纯化，获得两端分别是NcoI和XhoI的粘性接头的插入片段。
(2)制备表达载体pET28a，但不限于该表达载体：
①取pET28a载体1μg，用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切。
②琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性化后的pET28a载体。
③用T4DNA连接酶将包含hFABP6序列的插入片段和步骤②制备好的pET28a表达载体连接。
④转化大肠杆菌感受态菌株DH5α，含卡那霉素(Kan)抗生素的培养皿培养过夜，然后挑取单菌落，PCR法鉴定阳性克隆，常规制备DNA质粒。
⑤将阳性克隆质粒送交DNA序列分析，选取和保留正确序列的克隆供表达测试。
⑥载体命名为pET28a-hFABP6(SEQIDNO.20)
步骤三、载体的表达测试：
(1)将步骤二得到的pET28a-hFABP6载体DNA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得Kan抗性的菌落。
(2)挑取单菌落数个，LB培养基培养，IPTG诱导4-12小时，收集菌液1mL，离心收集菌体，1×PBS洗涤一次，再悬浮于0.5mL1×PBS，超声破碎菌体，离心去沉淀。
(3)取适量20μL上清与上样缓冲液混合，95℃加热变性10分钟，离心收集至管底，至于冰上。
(4)取10μL上样15％聚丙烯酰胺电泳，考马斯亮蓝染色、脱色，观察蛋白质条带和hFABP6蛋白的表达情况。
(5)重组hFABP6，包括N-HisTag、柔性接头、多克隆区，共158aa,分子量17.2kDa。hFABP6占菌体总蛋白的20％，可溶性表达。
实施例2
1、MT4的全基因合成：
合成的方法为通用的两步PCR法(PCR，多聚酶链式反应)，获得MT4编码DNA:1)重叠延伸PCR(OverlapPCR)以引物互为模板合成全长DNA序列，所用引物4条(SEQIDNO：23～26)；2)并以此产物为模板，PCR扩增全长DNA，所用引物2条(SEQIDNO.27～28)。
(1)搭头延伸PCR参数：94℃/30秒，56℃/30秒，72℃/30秒，15个循环，补齐延伸72℃/2分钟。
(2)全长合成PCR参数：94℃/30秒，58℃/30秒，72℃/45秒，30个循环，补齐延伸72℃/5分钟。
2、hFABP6-MT4融合蛋白表达载体构建：
(1)将人工合成所获得的MT4DNA序列,分别经过KpnI/XhoI双酶切处理、电泳、切胶纯化；
(2)同时将pET28-hFABP6载体用KpnI/XhoI双酶切处理、纯化；
(3)用T4DNA连接酶将经过(1)和(2)处理的DNA片段分别连接，形成连接产物：pET28-hFABP6-MT4(SEQIDNO.29)。
(4)将连接产物转化感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)，挑取单菌落，PCR法鉴定阳性克隆，送交DNA序列分析，保留序列正确的pET28-hFABP6-MT4/BL21(DE3)克隆，保存菌种。
实施例3
(一)对照载体pET28-MT4的构建
MT4的PCR引物，上游引物：5’-TTTTGGTACCATGGATCCGCGCGAATGTGTCTGCATGTCTG-3’(SEQIDNO.27),下游引物：5’–TTTTCTCGAGTTATGGACAGCAGGAGCATTTATC–3’(SEQIDNO.28)。
PCR参数是：94℃/30秒，56℃/30秒，72℃/30秒，30个循环。
(2)MT4PCR产物的限制性内切酶酶切
PCR产物用NcoI/XhoI双酶切，电泳切胶纯化。
3.用NcoI/XhoI双酶切处理pET28载体，电泳切胶纯化。
4.T4DNA连接酶连接线性化pET28载体与插入片段MT4。
5.将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单菌落扩增鉴定重组子，测序分析获得正确的pET28-MT4克隆。
6.取上述正确克隆，LB培养基过夜培养增菌。
7.取过夜培养物1:10接种于新鲜LB培养基，4小时后，或OD＝0.6，加IPTG至0.1mM，继续诱导12小时。
8.取1mL培养物，离心收集菌体，PBS洗涤1次，加0.5mLPBS重悬浮，超声破碎，分别保留上清和沉淀，沉淀物用0.5mLPBS再悬浮，分别取上清20μL，2x蛋白电泳缓冲液20μL，95℃加热10分钟，冰上放置2分钟，离心12000RPM，5分钟，收集上清，留作聚丙烯酰胺凝胶电泳。
9.分别取10μL样品上样聚丙烯酰胺凝胶，电泳至染料前端到达凝胶的下1/3，收胶，考马斯亮蓝染色、脱色。
10.观察有无6.4kDa的表达条带及条带浓度(占总蛋白的比例)。
(二)pET28-hFABP6-MT4的表达测试
(1)将pET28-hFABP6-MT4/BL21(DE3)的正确克隆过夜培养增菌；
(2)取过夜培养物1:10接种于新鲜LB培养基，4小时后，或OD＝0.6，加IPTG至0.1mM，继续诱导12小时。
(3)取1mL培养物，离心收集菌体，PBS洗涤1次，加0.5mLPBS重悬浮，超声破碎，分别保留上清和沉淀，沉淀物用0.5mLPBS再悬浮，分别取上清20μL，2x蛋白电泳缓冲液20μL，95℃加热10分钟，冰上放置2分钟，离心12000RPM，5分钟，收集上清，留作聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(4)分别取10μL样品上样聚丙烯酰胺凝胶，电泳至染料前端到达凝胶的下1/3，收胶，考马斯亮蓝染色、脱色。
(5)观察有无约22.6kDa的表达条带及条带浓度，结果见下表。
表1.MT4在两种不同表达载体中的表达状况
样品种类 pET28-MT4 pET28-hFABP6-MT4
上清溶液(占总蛋白比列) 不明显 ≈22％
沉淀物中 不明显 不明显

Claims (9)

1.一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体是将人类金属硫蛋白-4的编码序列作为目标蛋白插入伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的多克隆区所得；所述的伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体上游含有人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列，人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头区和用于插入目标蛋白的多克隆区。
2.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等于或大于85％，人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列为经过密码子优化的编码序列。
3.根据权利要求2所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列如SEQIDNO.1所示。
4.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的柔性接头区和多克隆区编码序列如SEQIDNO.3所示。
5.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的人类金属硫蛋白-4其氨基酸序列与人类天然金属硫蛋白的氨基酸序列的同源性等于或大于75％。
6.根据权利要求5所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：人类金属硫蛋白-4氨基酸序列如SEQIDNO.22所示。
7.根据权利要求6所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：人类金属硫蛋白-4编码序列如SEQIDNO.21所示。
8.根据权利要求1所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的表达载体中人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列的上游还包含编码用于分离纯化融合蛋白的标签的序列。
9.根据权利要求8所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，其特征在于：所述的表达载体中人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列的上游还包含编码组氨酸标签的序列。
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