CN108300725A

CN108300725A - 可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用

Info

Publication number: CN108300725A
Application number: CN201710024154.8A
Authority: CN
Inventors: 徐明恺; 宋宇博; 李永强; 李旭; 张惠文; 张成刚
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2037-01-13
Also published as: CN108300725B

Abstract

本发明涉及基因工程，具体的说是一种促溶分子伴侣SUMO引导下的靶向人类表皮生长因子受体HER‑2的单链抗体与一种超抗原SAg融合基因及其制备。该基因其具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列，并可编码序列表SEQ ID No:2中氨基酸序列。当使用原核表达载体对本发明中融合基因进行表达时，SUMO分子伴侣的引导可增强下游单链抗体和超抗原融合蛋白的正确折叠，从而获得较高量的可溶性融合蛋白。该融合蛋白以抗HER‑2单链抗体作为靶向分子，以SAg蛋白作为效应分子，可对HER‑2受体过表达的肿瘤细胞产生特异性的细胞抑制作用。

Description

可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种促溶分子伴侣SUMO引导下的靶向人类表皮生长因子受体HER-2的单链抗体与一种超抗原SAg融合基因及其制备。

背景技术

靶向融合蛋白是在现代医学生物学发展的基础上提出的一种新型的治疗策略，由靶向分子和细胞毒性分子结合而成。靶向分子常选用抗体或者基因工程抗体可变区片段，单链抗体片段(Single Chain Variable Fragment,scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。因其分子量小、肿瘤穿透力强、血液清除快、半衰期短和易于基因工程化改造等特点而被广泛的应用于药物靶向载体的研究。靶向分子的引入可显著提高细胞毒性分子抗肿瘤的特异性，提高效应分子的作用效率，且符合现代精准医疗的目标，现已广泛应用于肿瘤治疗。

人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER-2)是一种肿瘤特异性抗原，表达于肿瘤细胞表面，是肿瘤靶向治疗的合适靶点，在乳腺癌和卵巢癌患者中有25-30％的过表达，并且其过表达与患者的不良预后相关。以HER-2作为靶点对HER-2过表达的肿瘤进行靶向性治疗已经成为研究热点。于是将靶向Her-2单链抗体应用为融合蛋白的靶向分子。

超抗原(superantigen，SAg)是一组种在极低浓度下对T淋巴细胞产生极强免疫刺激活性的蛋白质分子，其可在抗原递呈细胞外侧的抗原结合区与MHC II(组织相容性复合物)分子和T细胞Vβ区结合形成复合物，从而激发大量的T淋巴细胞增殖，使体外或体内释放大量的细胞因子和其它效应分子。正因为超级抗原存在这种特殊的生物活性和作用机理，使其可以作为一种临床上的免疫调节剂和抗肿瘤药物。由于其作用的非特异性，所以设计引入单链抗体后，可提高其靶向性，增强其对肿瘤的杀伤效率。

小分子泛素样修饰蛋白SUMO(Small ubiquitin-like modifier),是一种分子伴侣,具有同泛素相似的结构，参与蛋白质翻译后修饰等多种生理进程。因为其具有一个高度疏水的核心，能为融合蛋白的折叠提供成核位点，从而作为分子伴侣和融合标签用于提高外源蛋白稳定性和可溶性，且SUMO蛋白三级结构能够被SUMO蛋白酶完整识别，经过特异性的酶切后的目的蛋白具有天然的N末端，保证了目的蛋白的活性。在表达水平和产物的可溶性方面SUMO表达系统明显优于传统表达系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg的基因及其制备，本发明以抗HER-2单链抗体作为靶向分子，以SAg作为效应分子，经短肽连接构建成靶向融合蛋白B-L-Sag，并在其N端设计SUMO，从而实现在原核表达载体中，以大肠杆菌为宿主菌，获得较大量可溶性表达的融合蛋白。该融合蛋白可特异性识别结合HER-2受体过表达的癌细胞，并对其产生特异性细胞抑制作用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-Sag的编码基因sumo-b-l-sag，具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列。编码可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg，具有序列表SEQ ID No:2中蛋白序列。

所述融合蛋白SUMO-B-L-Sag的编码基因sumo-b-l-sag的制备，是将人源性抗HER-2的单链抗体基因b和SAg编码基因sag通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接成b-l-sag基因，并将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白SUMO编码基因sumo使用Overlap PCR方法同b-l-sag的N端相连接，其特征在于：具有SEQ ID No:1中碱基序列。

所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为，

GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC；

采用引物：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3

反向引物:5’-AGCTGCACCTGGGCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3

通过PCR技术扩增出sumo基因片段

采用引物：

正向引物:5’-ACAGAGAACAGATTGGT GCCCAGGTGCAGC-3

反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3

通过PCR技术扩增出b-l-sag基因片段

采用引物：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3

反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3

通过Overlap PCR技术构建融合基因sumo-b-l-sag。

所述的融合蛋白编码基因sumo-b-l-sag通过原核表达载体，优选为pET-28a表达载体；以大肠杆菌为宿主菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)，实现异源表达有活性的融合蛋白SUMO-B-L-SAg蛋白。

本发明具有以下优点：

1.本发明采用在单链抗体超抗原融合基因上游引入sumo基因，使用原核表达载体在大肠杆菌宿主菌中进行蛋白表达，可有效促进融合蛋白的正确折叠,提高可溶性表达量，克服一般的单链抗体融合蛋白表达效果不理想的情况。且SUMO蛋白三级结构能够被SUMO蛋白酶完整识别并切割。相较于一般载体的肠激酶酶切位点等，SUMO酶切更准确，效率更高。并且由于融合标签和蛋白酶都具有组氨酸标签，在通过层析柱时两者均可被吸附,达到一次洗脱目的蛋白的效果，不仅得到的蛋白纯度较高，而且大大节约了纯化的时间和成本。

2.本发明中所述融合蛋白在超抗原的基础上引入了只有普通抗体分子量的1/6的单链抗体，不仅能够提高超抗原抗肿瘤的靶向性，而且克服了单克隆抗体不易渗透到肿瘤组织的不足，显著提高了超抗原的抗肿瘤效率。

3.引用本发明，可进一步提供直接用于生产B-L-SAg融合蛋白的工程菌株。

附图说明

图1为构建pET-28a-sumo-b-l-sag酶切验证以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析

结果，其中：1.DL10000marker；2.未经酶切的pET-28a-sumo-b-l-sag质粒；

3.4.分别经过Nco I和Xho I单酶切的pET-28a-sumo-b-l-sag质粒；5.DL2000 DNA分子量标准；5.经过Nco I和Xho I双酶切的pET-28a-sumo-b-l-sag质粒；

图2为pET-28a-sumo-b-l-sag诱导前后表达的10％SDS-PAGE电泳分析图，其中：

1.为蛋白Marker：；2.诱导前菌体全蛋白；3.30℃诱导4h后菌体全蛋白；4.30℃诱导4h后菌体的可溶性蛋白；5.16℃诱导16h后菌体全蛋白；6.16℃诱导16h后菌体的可溶性蛋白；

图3为经AKTA纯化后的可溶性表达的单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-Sag经10％的SDS-PAGE电泳分析图，其中：

1.为经Ni柱层析纯化后再透析除盐后的融合蛋白，纯度(265ng/μL)；

图4为融合蛋白B-L-SAg体外抗HER-2受体过表达的肿瘤细胞的实验结果。

图5为融合蛋白B-L-SAg体外抗HER-2受体非表达的肿瘤的实验结果。

图6为本发明所构建表达融合蛋白SUMO-B-L-SAg的三维结构示意图。

具体实施方式

实施例1

一种促可溶表达分子伴侣SUMO的编码基因sumo，其具有序列表

SEQ ID NO：3中所示的碱基序列：

(1)SEQ ID NO：3的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

*长度：354bp

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：Lifesensors公司pSUMO质粒DNA

(2)sumo基因的PCR扩增

(a)PCR引物设计及反应条件：

根据sumo基因序列设计一组引物：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3(由北京华大基因公司合成)

反向引物:5’-AGCTGCACCTGGGCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3(由北京华大基因公司合成)

PCR反应体系为：10xPyrobest buffer(购自大连宝生物公司)5μL、dNTP(购自大连宝生物公司)250μmol、上下游引物各25pmol、模板

pSUMO质粒DNA(购自Lifesensors公司)0.1μg/、pyrobest DNA聚合酶(购自大连宝生物公司)2U，无菌超纯水补齐体积至50μL。

PCR反应条件为：

第一阶段：95℃，5min；

第二阶段：94℃，55s；60℃，2min；72℃，1mins；共30个循环；

第三阶段：72℃，10min；

(b)PCR产物回收：PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收374bp的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。

实施例2

人源性抗HER-2的单链抗体基因b和超抗原SAg编码基因sag通过编码连接短肽的DNA Linker以限制性核酸内切酶连接技术连接得到b-l-sag，具有序列表SEQ ID No:4中碱基序列：

(1)SEQ ID No:4的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1533碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

(2)融合基因b-l-sag的PCR扩增：

融合基因b-l-sag全序列由北京华大基因公司合成

(a)PCR引物设计及反应条件：

根据b-l-sag基因序列设计一组引物：

正向引物:5’-ACAGAGAACAGATTGGT GCCCAGGTGCAGC-3(由北京华大基因公司合成)反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3(由北京华大基因公司合成)

PCR反应体系为：10xPyrobest buffer 5μL、dNTP 250μmol、上下游引物各25pmol、模板为含b-l-sag基因的质粒DNA(由北京华大基因公司合成)0.1μg、pyrobest DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μL。

PCR反应条件为：

第一阶段：95℃，5min；

第二阶段：94℃，55s；55℃，2min；72℃，2min；共30个循环；

第三阶段：72℃，10min；

(b)PCR产物回收：PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收1533bp的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。

实施例3

将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白SUMO编码基因sumo使用Overlap PCR方法同b-l-sag的5’端相连接成融合基因sumo-b-l-sag，具有序列表SEQ ID No:1的碱基序列。

(1)SEQ ID No:1的信息(参见序列表)

(a)序列特征

*长度：1887碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

由SEQ ID No:1中核苷酸所编码的融合蛋白，具有SEQ ID No:2中的氨基酸序列。

(2)SEQ ID No:2的信息(参见序列表)

(A)序列特征

*长度：630残基

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(C)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人工序列

(3)sumo-b-l-sag融合基因的制备

(a)PCR引物设计及反应条件：

根据设计使用sumo基因的正向引物和b-l-sag基因的反向引物进行Overlap PCR：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3(由北京华大基因公司合成)

反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3(由北京华大基因公司合成)

第一轮：

PCR反应体系为：10xPyrobest buffer 2.5μL、dNTP 250μmol、模板sumo和b-l-sag基因各0.1μg、pyrobest DNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至25μL。

PCR反应条件为：

第一阶段：95℃，5min；

第二阶段：94℃，55s；63℃，1min；72℃，2min；共5个循环；

第三阶段：72℃，2min；

第二轮：

Overlap补充体系为：10xPyrobest buffer 10μL、dNTP 250μmol、上下游引物各25pmol、pyrobest DNA聚合酶1U，无菌超纯水补齐体积至25μL。

第一阶段：95℃，5min；

第二阶段：94℃，50s；56℃，1min；72℃，2min；共30个循环；

第三阶段：72℃，10min；

(b)PCR产物回收：PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收1911bp大片段的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。

实施例4

可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag利用原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌中表达可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg

将融合基因sumo-b-l-sag连接入表达载体pET-28a(购自Novagen公司)中：将表达载体pET-28a的质粒DNA和sumo-b-l-sag的基因DNA片段分别使用Nco I(购自大连宝生物公司)和Xho I(购自大连宝生物公司)双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收sumo-b-l-sag片段和质粒pET-28a的DNA大片段，以T4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)16℃连接过夜，构建单链抗体超抗原融合蛋白表达载体pET28a-sumo-b-l-sag。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自大连宝生物公司)。以卡那青霉素(购自Sigma公司)抗性筛选转化子，挑选重组单克隆扩培，提取质粒DNA，经Nco I和Xho I双酶切鉴定正确重组克隆(图1)。并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往上海生工进行测序。将测序正确的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中(购自北京天根生化科技公司)

(1)融合蛋白SUMO-B-L-SAg的表达：接种转化重组质粒pET28a-sumo-b-l-sag的BL21(DE3)单菌落于60μg/ml卡那青霉素的液体LB中37℃过夜，次日按1：100转接到下一代，37℃培养至OD600 0.8，加入终浓度为10mM IPTG(购自Sigma公司)16℃诱导12h。

(2)利用AKTA工作站(美国GE公司产品)纯化外源融合蛋白：离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml平衡缓冲液(20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，50mM咪唑，pH＝7.9)，于0℃超声破碎至菌液变得清亮，100000rpm 10min超高速离心，收集上清。

(3)分别取离心前和离心后的上清液，作为诱导后全细胞蛋白和诱导后全细胞可溶性蛋白的样品，以12％的SDS-PAGE分析可溶性表达量，结果如图2所示。

(4)离心后的上清液上样于AKTA Ni亲和层析柱(美国GE公司产品)，使用平衡缓冲液(20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，50mM咪唑，pH＝7.9)漂洗十个柱体积，至UV检测数值稳定。最后使用洗脱缓冲液(20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，250mM咪唑，pH＝7.9)洗脱目的蛋白，在UV检测数值开始拉升后进行收集，直至UV平稳。将收集的蛋白洗脱液使用Millipore超滤管(美国Merck Millipore公司产品，截留分子量30000)，以4000g离心20min进行超滤并使用PBS稀释后再次超滤除盐，最终收集得到较纯的SUMO-B-L-SAg蛋白液，并经过SDS-PAGE分析纯度(图3)。

实施例5

可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg的生物学活性研究。

将通过转染使Her-2过表达的鼠源性黑色素瘤细胞B16和相同状态的未表达Her-2的B16细胞(购自上海生化细胞所)，以5×10⁴cells/well加入96孔板，分别将融合蛋白SUMO-B-L-SAg及单独表达的SAg蛋白(制备过程见参考文献：王洪波等.2011肠毒素C2中Met24对其超抗原活性无重要作用.生物技术.21(4)：67-70)分别以不同浓度加入各孔，同时设空白对照孔(仅加培养基RPMI-1640，美国Gibco公司产品)、肿瘤细胞对照孔(仅加肿瘤细胞)，每样3个复孔。同样方法以牛血清白蛋白BSA(购自Sigma公司)为阴性对照设各孔。按常规条件(37℃、5％CO2浓度)培养72h，加入50ul/well的MTS液(购自Sigma公司)。继续培养3h后，震荡10min，酶标仪上以490nm测定各孔的吸光值。

抑瘤率(Tumor growth inhibition,％)＝100-[(实验孔－空白对照孔)/(肿瘤细胞对照孔－空白对照孔)]×100。

实验结果显示(图4，图5)，表达的可溶性融合蛋白SUMO-B-L-SAg可以对HER-2受体过表达的肿瘤细胞产生特异性的靶向杀伤作用，其作用效果明显强于单独SAg蛋白。

实施例6

融合蛋白SUMO-B-L-SAg的分子三维结构分析

经过Ni亲和层析纯化、分子排阻、离子交换法并超滤浓缩的SUMO-B-L-SAg融合蛋白纯品(方法参考分子克隆实验指南第三版.萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)。在室温下通过悬滴法获得融合蛋白的晶体。以稀疏矩阵采样法确定结晶条件。最终的结晶条件如下：B-L-SAg蛋白溶液(20mg/ml)和等体积的母液(0.1M Tris-HCl(pH 7.4),0.08M醋酸镁,26％(w/v)聚乙二醇6000)混合，约15-18天时出现晶体。用多波长反常散射法(MAD)确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4R CCD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView 4.0软件在SiliconGraphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。融合蛋白B-L-SAg的三维结构参见图6。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所

<120> 可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1887)

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcgct 60

agcatgtcgg actcagaagt caatcaagaa gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag 120

cctgagactc acatcaattt aaaggtgtcc gatggatctt cagagatctt cttcaagatc 180

aaaaagacca ctcctttaag aaggctgatg gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa 240

atggactcct taagattctt gtacgacggt attaggatac aagctgatca gacccctgaa 300

gatttggaca tggaggataa cgatattatt gaggctcaca gagaacagat tggtatggcc 360

caggtgcagc tggtgcagtc tggggcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 420

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 480

cccgggaaag gcctggagta catggggctc atctatcctg gtgactctga caccaaatac 540

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagtcgaca agtccgtcag cactgcctac 600

ttgcaatgga gcagtctgaa gccctcggac agcgccgtgt atttttgtgc gagacatgac 660

gtgggatatt gcaccgaccg gacttgcgca aagtggcctg aatacttcca gcattggggc 720

cagggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc 780

ggtggcggat cgcagtctgt gttgacgcag ccgccctcag tgtctgcggc cccaggacag 840

aaggtcacca tctcctgctc tggaagcagc tccaacattg ggaataatta tgtatcctgg 900

taccagcagc tcccaggaac agcccccaaa ctcctcatct atgatcacac caatcggccc 960

gcaggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc aagtctggca cctcagcctc cctggccatc 1020

agtgggttcc ggtccgagga tgaggctgat tattactgtg cctcctggga ctacaccctc 1080

tcgggctggg tgttcggcgg agggaccaag gtcaccgtcc taggtgcggc cgcaggttcc 1140

ggatctggca gcggttccgg atctgaattc gagagtcaac cagaccctac gccagatgag 1200

ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg atgggtaata tgaaagtatt atatgatgat 1260

cattatgtat cagcaactaa agttatgtct gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt 1320

tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat 1380

gaagatttag caaagaagta caaagatgaa gtagttgatg tgtatggatc aaattactat 1440

gtaaactgct atttttcatc caaagataat gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt 1500

atgtatggag gaataacaaa acatgaagga aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat 1560

gtacttataa gagtttatga aaataaaaga aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat 1620

aagaaaagtg taacagctca agaactagac ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa 1680

aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca tatgaaacag gatatataaa atttattgaa 1740

aataacggca atactttttg gtatgatatg atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa 1800

tctaaatatt taatgatgta caacgacaat aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata 1860

gaagtccacc ttacaacaaa gaatgga 1887

<210> 2

<211> 630

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(630)

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser Ala Ser Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys

20 25 30

Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys

35 40 45

Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr

50 55 60

Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu

65 70 75 80

Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp

85 90 95

Gln Thr Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala

100 105 110

His Arg Glu Gln Ile Gly Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly

115 120 125

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly

130 135 140

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser

165 170 175

Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val

180 185 190

Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro

195 200 205

Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys

210 215 220

Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro

260 265 270

Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly

275 280 285

Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu

290 295 300

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro

305 310 315 320

Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala

325 330 335

Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr

340 345 350

Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly

355 360 365

Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ser

370 375 380

Gly Ser Gly Ser Glu Phe Met Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp

385 390 395 400

Glu Leu His Lys Ser Ser Glu Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys

405 410 415

Val Leu Tyr Asp Asp His Tyr Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val

420 425 430

Asp Lys Phe Leu Ala His Asp Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys

435 440 445

Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu

450 455 460

Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr

465 470 475 480

Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr

485 490 495

Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn

500 505 510

His Phe Asp Asn Gly Asn Leu Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu

515 520 525

Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser

530 535 540

Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn

545 550 555 560

Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr

565 570 575

Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met

580 585 590

Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr

595 600 605

Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His

610 615 620

Leu Thr Thr Lys Asn Gly

625 630

<210> 3

<211> 354

<212> DNA

<213> Lifesensors公司pSUMO质粒DNA

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(354)

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcgct 60

agcatgtcgg actcagaagt caatcaagaa gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag 120

cctgagactc acatcaattt aaaggtgtcc gatggatctt cagagatctt cttcaagatc 180

aaaaagacca ctcctttaag aaggctgatg gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa 240

atggactcct taagattctt gtacgacggt attaggatac aagctgatca gacccctgaa 300

gatttggaca tggaggataa cgatattatt gaggctcaca gagaacagat tggt 354

<210> 4

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1533)

<400> 4

atggcccagg tgcagctggt gcagtctggg gcagaggtga aaaagcccgg ggagtctctg 60

aagatctcct gtaagggttc tggatacagc tttaccagct actggatcgc ctgggtgcgc 120

cagatgcccg ggaaaggcct ggagtacatg gggctcatct atcctggtga ctctgacacc 180

aaatacagcc cgtccttcca aggccaggtc accatctcag tcgacaagtc cgtcagcact 240

gcctacttgc aatggagcag tctgaagccc tcggacagcg ccgtgtattt ttgtgcgaga 300

catgacgtgg gatattgcac cgaccggact tgcgcaaagt ggcctgaata cttccagcat 360

tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 420

tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg acgcagccgc cctcagtgtc tgcggcccca 480

ggacagaagg tcaccatctc ctgctctgga agcagctcca acattgggaa taattatgta 540

tcctggtacc agcagctccc aggaacagcc cccaaactcc tcatctatga tcacaccaat 600

cggcccgcag gggtccctga ccgattctct ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg 660

gccatcagtg ggttccggtc cgaggatgag gctgattatt actgtgcctc ctgggactac 720

accctctcgg gctgggtgtt cggcggaggg accaaggtca ccgtcctagg tgcggccgca 780

ggttccggat ctggcagcgg ttccggatct gaattcgaga gtcaaccaga ccctacgcca 840

gatgagttgc acaaatcaag tgagtttact ggtacgatgg gtaatatgaa agtattatat 900

gatgatcatt atgtatcagc aactaaagtt atgtctgtag ataaattttt ggcacatgat 960

ttaatttata acattagtga taaaaaacta aaaaattatg acaaagtgaa aacagagtta 1020

ttaaatgaag atttagcaaa gaagtacaaa gatgaagtag ttgatgtgta tggatcaaat 1080

tactatgtaa actgctattt ttcatccaaa gataatgtag gtaaagttac aggtggtaaa 1140

acttgtatgt atggaggaat aacaaaacat gaaggaaacc actttgataa tgggaactta 1200

caaaatgtac ttataagagt ttatgaaaat aaaagaaaca caatttcttt tgaagtgcaa 1260

actgataaga aaagtgtaac agctcaagaa ctagacataa aagctaggaa ttttttaatt 1320

aataaaaaaa atttgtatga gtttaacagt tcaccatatg aaacaggata tataaaattt 1380

attgaaaata acggcaatac tttttggtat gatatgatgc ctgcaccagg cgataagttt 1440

gaccaatcta aatatttaat gatgtacaac gacaataaaa cggttgattc taaaagtgtg 1500

aagatagaag tccaccttac aacaaagaat gga 1533

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(43)

<400> 5

ggccgcaggt tccggatctg gcagcggttc cggatctgaa ttc 43

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(22)

<400> 6

tataccatgg gcagcagcca tc 22

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(35)

<400> 7

agctgcacct gggcaccaat ctgttctctg tgagc 35

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(30)

<400> 8

acagagaaca gattggtgcc caggtgcagc 30

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(26)

<400> 9

gtgctcgagt tatccattct ttgttg 26

Claims

1.可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo:1中的碱基序列。

2.一种权利要求1所述基因编码的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg，其特征在于：具有序列表SEQ ID No:2中的氨基酸序列。

3.一种权利要求1所述的可溶性单链抗体超抗原融合基因sumo-b-l-sag的制备，其特征在于：

人源性抗HER-2的单链抗体基因b(具有序列表SEQ ID No:1中从第355位到1128位的碱基序列)和SAg编码基因sag(具有序列表SEQ ID No:1中从第1171位到1887位的碱基序列)通过编码连接短肽的DNA Linker(具有序列表SEQ ID No:1中从第1129位到1170位的碱基序列)连接成b-l-sag基因(具有序列表SEQ ID No:1中从第355位到1887位的碱基序列)，并将带有组氨酸标签的小泛素化修饰促融蛋白SUMO编码基因sumo(具有序列表SEQ ID No:1中从第1位到354位的碱基序列)使用Overlap PCR方法同b-l-sag的5‘端相连接，具有SEQID No:1中碱基序列；

(1)所述连接短肽DNA Linker的碱基序列为，

GGCCGCAGGTTCCGGATCTGGCAGCGGTTCCGGATCTGAATTC；

(2)采用引物：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3

反向引物:5’-AGCTGCACCTGGGCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3

通过PCR技术扩增出sumo基因片段

(3)采用引物：

正向引物:5’-ACAGAGAACAGATTGGT GCCCAGGTGCAGC-3

反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3

通过PCR技术扩增出b-l-sag基因片段

(4)采用引物：

正向引物:5’-TATACCATGGGCAGCAGCCATC-3

反向引物:5’-GTGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3

通过Overlap PCR技术构建融合基因sumo-b-l-sag。

4.一种权利要求2所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白SUMO-B-L-SAg的异源表达方法，其特征在于：利用原核表达载体(优选为pET-28a表达载体)；以大肠杆菌为宿主菌(优选为大肠杆菌BL21(DE3))，异源表达融合蛋白SUMO-B-L-SAg，经过菌体超声波破碎，离心收集上清液，Ni亲合层析纯化、超滤脱盐后得到具有生物学活性的可溶性融合蛋白B-L-SAg。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：采用Ni亲合层析柱对目的产物进行纯化，纯化时以0.2-0.8ml/min速度上样于预先平衡好的Ni亲合层析柱；以含20-80mM咪唑的平衡缓冲液洗涤8-12个柱体积，洗去非特异性结合的杂蛋白；以250-300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，洗脱产物经超滤浓缩除盐。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的平衡缓冲液的组成为：20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，20-80mM咪唑，溶液的pH值范围为：7.2～8.0；所述的洗脱缓冲液的组成为：20mM Tirs-HCl，500mM NaCl，250-300mM咪唑，溶液的pH值范围为：7.2～8.0。

7.一种权利要求2所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白的应用，其特征在于：所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白可用于肿瘤治疗药物的开发。

8.根据权利要求7所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白的应用，其特征在于：所述的可溶性单链抗体超抗原融合蛋白可特异性靶向HER-2阳性肿瘤细胞，并对其进行杀伤。