CN103319595A - 抗人afp单链抗体以及融合抗原肽的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗人甲胎蛋白单链抗体。本发明还涉及一种与抗人甲胎蛋白单链抗体融合肝细胞癌抗原肽的制备方法。本发明另外还涉及抗人甲胎蛋白单链抗体和抗人甲胎蛋白单链抗体融合肝细胞癌抗原肽在治疗肿瘤疾病中的用途。

Description

抗人AFP单链抗体以及融合抗原肽的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可与肝癌标志抗原AFP特异结合的单链抗体，还涉及该单链抗体的制备方法和应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率仅次于胃癌，我国每年死于肝癌约为11万人，占世界肝癌死亡人数的45％，且肝癌的5年存活率也是所有肿瘤中最低的。过去30年中，尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段，但因缺乏特异性，病患的生存率提高不多，探索新的治疗方式势在必行^[1]。

甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)是肝癌细胞表达的高特异性蛋白，70-80％的肝癌病人在发病期间都有AFP高表达的特征，自上世纪七十年代至今，已对该蛋白进行了充分且深入的研究，目前学术界对该蛋白在肝癌细胞和免疫体系中的作用机制已达成高度一致：肿瘤细胞内的AFP不仅能抑制肿瘤凋亡信号的转导，而且也能促进肿瘤生长信号的传递，同时AFP具有下调机体免疫水平的作用，研究显示AFP可引起MHCII类在单核细胞的下调，有抑制TB淋巴细胞的效应，更重要的是AFP能明显诱导体内最主要的APC细胞——树突细胞(DCs)的凋亡^{[6，7，8，9，10]}。成熟的DC能持续高表达HLA-I，HLA-II等免疫应答相关分子，将限制性的肿瘤抗原递呈给CD4和CD8细胞，提供有效免疫的第二信号。体外实验业已证明了抗AFP抗体能有效阻断小鼠脾淋巴细胞增殖被AFP抑制的作用，同时抗AFP抗体还可以显著阻断AFP对肝癌细胞的促增殖作用。

用于肿瘤生物治疗的完整抗体由于分子量了较大，其血管通透性弱，扩散入肿瘤内能力差等一系列缺点限制了其靶向递呈及肿瘤拮抗应用效果。单链抗体是用基因工程方法制备的小分子抗体，是有弹性连接肽(一般为12-15个氨基酸)将抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接而成的重组抗体，其分子量只相当于原天然抗体的六分之一，但单链抗体含有全部的抗原结合位点，所以单链抗体最大程度的保留了抗体的抗原结合活性，是具有亲本抗体抗原结合活性的最小片段。单链抗体分子连接细胞毒素、药物或放射性同位素等形成的免疫毒素用于肿瘤治疗显示了良好的杀伤效果。

发明内容

本发明的目的之一是利用基因工程方法将抗甲胎蛋白的单克隆抗体改造成单链抗体，其氨基酸序列如SEQID No2所示；

本发明的目的之二在于提供所述抗人甲胎蛋白单链抗体的编码基因。

进一步，所述编码基因，具有如SEQ ID No1所示的核苷酸序列。

本发明的目的之三在于提供一种重组体，将所述重组载体导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)而得到。

本发明的目的之四在于提供所述抗人甲胎蛋白单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

A、抗人甲胎蛋白单链抗体的包涵体表达

取权利要求4所述的重组载体，加入大肠杆菌BL21(DE3)，菌种划线接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-16h，挑选单菌落，接种于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，240r/min培养10-12h成为活化种子。取活化的种子1mL加入100ml LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀0.6-0.8后，加入诱导物IPTG至终浓度为0.4mmol/L，在37℃继续诱导至5小时后离心收集菌体。菌体以10mL/g溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，置于冰浴中用超声探头进行超声波间歇破碎10min(超声5s，间隔5s)，弃上清收集包涵体。

B、抗人甲胎蛋白单链抗体包涵体的复性和纯化

上述包涵体中以10mL/g加入变性液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/Lβ-巯基乙醇，8mol/L尿素)，10000r/min离心30min，弃沉淀收集上清液。所得上清液以1∶4比例和3mL/h的速度滴加稀释到复性液中(20mmol/L Tris-HC，pH8.0，1mmol/L EDTA，2mol/L尿素，0.1mmol/L GSSG，1mmol/L GSH)，接着用pH7.4的PB缓冲液透析约20h，PEG-20000浓缩至1mL。采用抗E-tag亲和层析法纯化抗人甲胎蛋白单链抗体，再将抗人甲胎蛋白单链抗体的溶解试剂更换为中性pH的磷酸盐缓冲液，既制得纯化的抗人甲胎蛋白单链抗体。

本发明的目的之五在于提供所述的抗人甲胎蛋白单链抗体与肝癌抗原肽双功能分子融合表达。进一步所述肝癌抗原肽具有如SEQ ID No5所示的核苷酸序列

本发明的目的之六在于所述的抗人甲胎蛋白单链抗体在制备肿瘤诊断试剂和肿瘤治疗药物中的应用。

附图说明

图1小鼠腹水单抗纯化后的电泳鉴定

图2为VH基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图3为VL基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图4为全套单链基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图5为重组载体pET32a-scFv的双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；

图6为抗人甲胎蛋白单链抗体融合表达的SDS-PAGE鉴定图；

图7为酶切镍柱纯化后的抗人甲胎蛋白单链抗体的SDS-PAGE鉴定图；

图8为抗人甲胎蛋白单链抗体竞争性抑制抗人甲胎蛋白单克隆抗体的结合反应柱状图。

图9为抗人甲胎蛋白单链抗体与肝癌抗原肽融合蛋白PCR电泳图

图10为抗人甲胎蛋白单链抗体抗甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异性抑制作用的柱状图；

图11为给药24h后不同浓度抗人甲胎蛋白单链抗体协同40μmol/L和80μmol/L ATRA对hepG2细胞增殖影响的柱状图；

图12为给药24h后不同浓度scFv协同40μmol/L和80μmol/L ATRA对hepG2细胞抑制率柱状图

具体实施方式

实施例1：动物免疫

将人甲胎蛋白溶于生理盐水，与弗氏完全佐剂等体积混合，经充分乳化后，接种于BALB/c小鼠(扬州大学比较医学中心提供，SCXK(苏)2007-0001)腹腔，10μgAFP蛋白/200μL/只；于基础免疫后，间隔两周采用相同的抗原剂量与等体积弗氏不完全佐剂混合，进行加强免疫；于第二次加强免疫后一周，以间接ELISA法测定免疫小鼠抗血清效价。以正常鼠血清为阴性对照，以(测定孔A值-空白值)/(阴性对照孔A值-空白值)≥2.1为判定标准，进行测定。小鼠抗血清终点效价均为1∶12,8000以上。

选择血清hAFP特异性抗体效价最高的小鼠用于细胞融合，并于融合前3天，腹腔接种20μg hAFP蛋白进行冲击免疫。

实施例2：单克隆抗体的制备

1.细胞融合

细胞融合采用聚乙二醇法：无菌操作取如实施例1所述免疫的小鼠脾脏，制成细胞悬液，离心，细胞计数；将1×10⁸脾细胞与2×10⁷SP2/0细胞混合，1000rpm离心10min，弃上清液，将离心管置于37℃水浴中；取1ml预热至40℃的50％PEG缓慢滴加到细胞沉淀上，以基础培养基悬浮细胞；1000rpm离心10min，弃上清液，加HAT培养基重悬细胞，分装于96孔细胞培养板，将培养板置于37℃、5％的CO₂湿润细胞培养箱中培养，5天后用新鲜HAT换出培养板孔中1/2培养基，10天后用HT培养基换出HAT。

2.融合细胞的筛选及克隆化培养

采用有限稀释法克隆化杂交瘤细胞：以hAFP蛋白作为筛选包被抗原，山羊抗小鼠IgM-HRP/IgG-HRP作为检测抗体。阳性孔杂交瘤细胞经亚克隆-筛选-亚克隆-筛选-亚克隆-扩大培养。

具体的，用小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，接种于96孔细胞板HAT选择性培养基上。经三次亚克隆，建立了稳定分泌的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为9H3，所分泌的单克隆抗体命名为9H₃。

实施例3：抗人甲胎蛋白单链抗体的构建

1.细胞培养及鉴定：将分泌抗人甲胎蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞培养与含10％小牛血清的完全RPMI1640培养基中。培养箱中含5％CO2的混合气体，用ELISA方法鉴定培养上清中单抗的特异度和亲和性。

2.抗人甲胎蛋白单克隆抗体轻链、重链可变区基因的克隆：取生长良好的杂交瘤细胞株，用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，用PCR技术，在反应体系中加入cDNA和一套抗体抗体轻链或重链可变区引物，10×PCR反应缓冲液，终浓度为2.5nM的dNTP，0.5μL primeStar聚合酶，总反应体系为50uL.进行30个循环反应，循环条件为94℃，30S；60℃，30S；72℃，30S，最后一个循环结束后72℃，10min；胶回收轻链和重链可变区基因扩增产物后连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌保存阳性克隆。

3.轻链和重链可变区基因的筛选：轻链和重链可变区基因连入pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，PCR验证转化子。DNA测序分析抗人甲胎蛋白单链抗体重链可变区是由342个核苷酸组成，其基因序列为SEQ.ID.No3。轻链可变区是由318个核苷酸组成，其基因序列为SEQ.ID.No4。

4.抗人甲胎蛋白单链抗体的构建：PCR分别在重链、轻链可变区片段两端引入限制性内切酶位点EcoR I、Xho I和编码(Gly₄Ser)₃的连接DNA序列。回收纯化后，在OVERLAP PCR将重链和轻链可变区连接成抗人甲胎蛋白单链抗体基因片段，割胶回收，用EcoR I和Xho I双酶切消化，割胶回收，连入事先切好的pET32a表达载体，转化大肠杆菌DH5α扩增，PCR和限制性内切酶验证转化子。序列分析证明构建的单链抗体具有抗人甲胎蛋白抗体的轻、重链可变区以及(Gly₄Ser)₃的连接肽，由705个核苷酸组成其基因序列为SEQ.ID.No1。

实施例4：抗人甲胎蛋白单链抗体的表达、复性、纯化和活性鉴定

1.单链抗体基因的表达：从平板随机挑取阳性菌落在LB液体培养基进行培养，待其OD₆₀₀增长到0.6后加入终浓度为0.2mM IPTG进行诱导表达。诱导表达5h后取样进行15％SDS-PAGE电泳以筛选高表达菌株。挑取高表达菌株的单菌落在LB培养基进行大量表达。

2.包涵体复性：以最佳条件诱导表达重组蛋白，10000r/min离心30min，4℃离心收集表达菌体，以10mL/g溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，用超声探头进行超声波间歇破碎10min10000r/min离心30min，弃上清收集包涵体。在包涵体中加入变性液，4℃磁力搅拌12h使沉淀缓慢溶解，10000r/min离心30min，弃沉淀收集上清液。所得上清液以1∶4比例和3mL/h的速度滴加稀释到复性液中，然后用pH7.4的磷酸盐缓冲液透析约20h，PEG-20000浓缩至1mL。复性液中目的蛋白纯度约为75％，复性率达到37.38％。。

3.单链抗体蛋白的纯化：将复性液过Ni亲和色谱柱，用含咪唑缓冲液梯度洗脱杂蛋白，取样品进行SDS-PAGE电泳。将含有目的蛋白的洗脱峰用SephadexG-25柱进行脱盐，收集洗脱峰。在洗脱液中加入肠激酶，并置于25℃酶切1h离心收集上清，再次使用Ni亲和色谱柱，磷酸缓冲液洗脱，SDS-PAGE电泳鉴定。

4.竞争抑制性ELISA测定目的蛋白活性：将AFP亲本单抗和不同比例的scFv蛋白共50μL(scFv：AFP亲本单抗＝1，2，4，8，16，32)，加入包被AFP抗原的96孔酶标板，37℃孵育2h，PBST洗涤3次后加入HRP标记的抗小鼠IgG抗体50μL，37℃孵育2h，加底物显色15min后终止反应，测定A₄₉₂值。结果表明当AFP亲本单抗的浓度固定时，其与AFP抗原混合反应的抑制率随scFv蛋白浓度的增加而逐步增大，当scFv与亲本单抗浓度为16∶1时，竞争抑制率达到54.13％。

实施例5：抗人甲胎蛋白单链抗体与肝癌抗原肽融合蛋白的构建表达

扩增抗人AFP-ScFv，利用多次延伸PCR制备融合蛋白，将连接肽HSA-D3(Interlinker：5′-FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS-3′)区和抗原肽(SLIVHLNEV)连接到抗AFP单链抗体ScFv的C端，构建双功能分子基因；选择PET32a⁺为载体，转化大肠杆菌DH5α扩增，PCR和限制性内切酶验证转化子。序列分析证明构建的融合蛋白具有单链抗体全部序列、连接肽HSA-D3和抗原肽，由807个核苷酸组成其基因序列为SEQ.ID.No5。

实施例6：抗人甲胎蛋白单链抗体抗甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异性抑制作用测定

选用AFP阳性的肝癌细胞株HepG2和Bel7402以及AFP阴性的肝癌细胞SK-Hep-1，在37℃和5％CO2的条件下培养至对数期；将细胞培养悬液，按照4.0×10⁴个/ml接种于96孔板，100μl/孔，每组设3个重复平行孔，平行铺板3块。培养24h后，给药处理，加入浓度为10μg/ml，5μg/ml，1μg/ml的单链抗体，每孔100μl；分别在给药后24h和48h时，加入20μl的MTT(5mg/ml)，继续培养4h；培养4h后，每孔加入150μl的DMSO溶解细胞形成的甲臜，放置在摇床上低速振荡10～15min使甲臜充分溶解，用酶标仪在OD570nm处检测各孔的吸光值；用以下公式计算药物对细胞的抑制率。抑制率＝(1-OD_给药组/OD_对照组)。以上实验重复两次。

结果见图10，结果说明该单链抗体可以对AFP阳性的HepG2和Bel7402细胞产生明显的生长抑制作用，而对AFP阴性的肝癌细胞SK-Hep1无抑制作用；表明其抑制作用具有特异性。

实施例7：抗人甲胎蛋白单链抗体提高肝癌细胞株HepG2对全反式维甲酸的敏感性的测定

11.52mg ATRA溶于1ml DMSO中(将适量ATRA溶于DMSO中)，再用无血清培养基RPMI-1640稀释为终浓度分别为160μM，80μM，40μM，20μM，10μM的溶液，控制DMSO的含量小于2％。按照上述MTT法中所述进行细胞铺板，设置160μM，80μM，40μM，20μM，10μM，0μM六个浓度梯度，每组设置4个平行孔，以此作为第一组。第二组设置160μM，80μM，40μM，20μM，10μM，0μM六个浓度梯度后，在每个浓度中加入1μg/ml的单链抗体，第三组及第四组按照第二组的设置方法，分别加入5μg/ml，10μg/ml的单链抗体，每个浓度设置4个平行孔。检测给药后24h，48h，72h后的OD₅₇₀值。进行t检验，用公式抑制率＝(1-OD_给药组/OD_对照组)计算药物对细胞的抑制率，以上实验重复两次。

在进行anti-AFP scFv协同ARTA作用实验之前，我们首先研究了ATRA对hepG2细胞生长的影响，结果显示小剂量的ATRA(40μmol/L)处理hepG2细胞，对细胞生长没有影响，当ATRA的剂量大于80μmol/L时能显著性抑制细胞的增殖，而将不同浓度的anti-AFP scFv(0.5、2.5和5μg/ml)和40μmol/L和80μmol/L ATRA联合处理细胞24h后，细胞增殖被极显著性抑制，见图11，12，(n＝8)。结果说明该单链抗体可以明显增加AFP阳性的HepG2细胞对全反式维甲酸的敏感性。

Claims (10)

1.人甲胎蛋白单链抗体，其氨基酸序列如SequenceNO.2所述。 

2.权利要求1所述的人甲胎蛋白单链抗体的编码基因。 

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：具有SequenceNO.1所示的核苷酸序列。 

4.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。 

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：载体为大肠杆菌BL21(DE3)。 

6.权利要求1所述的人甲胎蛋白单链抗体的放射性标记物。 

7.根据权利要求6所述的放射性标记物，其特征在于：所述放射性标记物为I^[3]。 

8.权利要求1所述的抗人甲胎蛋白单链抗体的制备方法，包括以下步骤： 

a、抗人甲胎蛋白单链抗体的包涵体表达 

取权利要求4所述的重组载体，加入大肠杆菌BL21(DE3)，菌种划线接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12-16h，挑选单菌落，接种于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，240r/min培养10-12h成为活化种子。取活化的种子1mL加入100ml LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀0.6-0.8后，加入诱导物IPTG至终浓度为0.4mmol/L，在37℃继续诱导至5小时后离心收集菌体。菌体以10mL/g溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，置于冰浴中用超声探头进行超声波间歇破碎10min(超声5s，间隔5s)，弃上清收集包涵体。 

b、抗人甲胎蛋白单链抗体包涵体的复性和纯化 

上述包涵体中以10mL/g加入变性液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/Lβ-巯基乙醇，8mol/L尿素)，10000r/min离心30min，弃沉淀收集上清液。所得上清液以1∶4比例和3mL/h的速度滴加稀释到复性液中(20mmol/L Tris-HC，pH8.0，1mmol/L EDTA，2mol/L尿素，0.1mmol/L GSSG，1mmol/L GSH)，接着用pH7.4的PB缓冲液透析约20h，PEG-20000浓缩至1mL。采用抗E-tag亲和层析法纯化抗人甲胎蛋白单链抗体，再将抗人甲胎蛋白单链抗体的溶解试剂更换为中性pH的磷酸盐缓冲液，既制得纯化的抗人甲胎蛋白单链抗体。 

9.权利要求1所述的抗人甲胎蛋白单链抗体与肝癌细胞抗原肽的融合表达，其氨基酸序列如Seque nce NO.3所述。 

10.权利要求1所述的抗人甲胎蛋白单链抗体和权利要求9所述的抗人甲胎蛋白单链抗体与肝癌细胞抗原肽的融合蛋白在制备肿瘤诊断试剂和肿瘤治疗药物中的应用。 

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