CN102690351A - 间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间日疟醛缩酶（aldolase）蛋白单克隆抗体的制备方法，该抗体是针对以aldolase蛋白为靶抗原，选择A、B、C三个优势抗原表位，通过柔性片段连接A、B、C三个优势抗原表位，形成重组子D，并在其上下游分别添加BamHI和XhoI限制性内切酶酶切位点，双酶切后插入载体PET-28a(+)载体中，构建重组蛋白D表达载体，利用大肠杆菌BL21表达重组蛋白D，免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到10株稳定分泌aldolase蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明所得单克隆抗体能特异性识别间日疟原虫aldolase蛋白，可用于间日疟感染的特异性检测，特异性高，反应灵敏，实验成本低，适合高通量快速检测。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和免疫学技术领域，特别是一种间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，所得单克隆抗体可应用于酶联免疫法检测间日疟原虫，也可作为间日疟原虫快速诊断试剂盒的一部分。
背景技术
疟疾广泛流行于热带和亚热带发展中国家，是一种由蚊媒传播的严重危害人类健康的寄生虫病。间日疟原虫对人类的危害仅次于恶性疟原虫，据估计全球收到间日疟原虫感染的人口高达26亿，每年约有0.8~3亿的人口因受到间日疟原虫感染而急性发作，在我国，2000年后疟疾疫情呈上升趋势，每年估计有70万左右疟疾患者，其主要是间日疟患者，尽管2007年后疫情得到遏制，但是其流行程度仍然处于上升趋势。
采用传统的厚血膜镜检费时费力，检测效率低下，近年来，核酸检测方法在疟疾诊断中得以应用，虽然该方法具有高度的特异性和敏感性，但是技术要求较高，需要技能熟练的操作员，阻碍了该方法的进一步普及。因此，寻求灵敏特异，简便快速的疟疾诊断方法在当前疟疾防治工作中显得尤为重要。开发具有高灵敏度、高特异性的间日疟抗体是建立间日疟体外诊断技术的首要任务。
间日疟原虫的宿主只有两个，人和按蚊。通过中间宿主按蚊传播疾病，被感染的人患疟疾。其生活史分为三个时期：红细胞外期、红细胞内期和红细胞期，只有红细胞内期发生在红细胞内，其余两个发生在肝细胞中。
疟疾特异性检测（RDTs）是一种可以检测疟疾寄生虫特异性抗原的横向层析方法。RDTs方法提高了疟疾诊断和实例诊断的准确性，尤其是当镜检不可用或者不可靠的情况下。市场上已经有很多种RDT产品可以购买，其中一些是只可以检测恶性疟原虫，而其他的一些可以检测恶性疟原虫同时检测出一种甚至三种以上的人源疟疾。RDTs检测中主要是以HRPⅡ和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原来检测恶性疟原虫，然而疟原虫pan-specific乳酸脱氢酶和醛缩酶通常被当作检测另外三种疟原虫的靶抗原。醛缩酶是疟原虫糖酵解过程中的关键酶。与高等脊椎动物拥有三种醛缩酶（同工酶）不同的是，间日疟原虫和恶性疟原虫拥有同一种醛缩酶，与锥体虫和贾第虫类似。间日疟原虫和恶性疟原虫的醛缩酶都含有390个氨基酸，他们的核苷酸和氨基酸序列的相对保守。因此，本申请选用醛缩酶作为靶抗原，分析其序列，选择其优势抗原表位，筛选反应灵敏度高，特异性强的单克隆抗体，以降低以HRPⅡ和疟原虫乳酸脱氢酶为靶抗原可能出现的漏检风险。
发明内容
本发明的目的在于提供一种间日疟原虫醛缩酶(aldolase)蛋白单克隆抗体的制备方法。由该方法所得的间日疟单克隆抗体反应灵敏度高，特异性强，成本低，可大规模制备作为商品化检测试剂盒的原料。
间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D；其中，
抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；
抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；
抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；
重组子D的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；
（2） 将重组子D和载体PET-28a（+）用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET-28a（+）上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株；
（3） 诱导表达重组蛋白D；重组蛋白D的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu；
（4）将获得的重组蛋白D超声破碎并低温离心，溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白D；
（5）用纯化后重组蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾静脉采血测定血清效价后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并用HAT筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；
（6）将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，50%饱和硫酸铵沉淀法和Protein G亲和纯化单抗，得到单克隆抗体。
进一步地，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIleLysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。
间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位B的氨基酸序列为：IleGlyPheLeuThrVal ArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThr。
间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位C的氨基酸序列为：AsnSerLeuAlaThrTyr GlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGly AlaAspAlaGlyAlaSerLeu。
本发明选择比较温和的培养和诱导条件，步骤3中的表达诱导温度优选为25℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
本发明通过选择间日疟原虫醛缩酶（aldolase）蛋白A、B、C三个优势抗原表位，利用基因工程技术，用柔性片段将三个抗原表位相连接，得到重组子D核苷酸序列。再通过BamHI和XhoI双酶切连接到表达载体PET-28a（+）中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选得到重组蛋白D表达菌株，诱导表达重组蛋白D。采用aldolase重组蛋白D作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，筛选出10株能够分泌针对重组蛋白D有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从注射杂交瘤细胞株后的动物腹水中获取单克隆抗体。
本发明的间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体可用于各种免疫测定法，例如免疫测定法为ELISA免疫测定法。在一个具体实施例中，建立了双抗体夹心ELISA检测系统。纯化单抗分别通过辣根过氧化物酶（HRP）标记，ELISA正交配对实验确定最佳组合单抗。本发明确定的最佳单抗组合由McAb623和McAb627的杂交瘤细胞株产生。所获得的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的抗体亚型均为IgG1。
本发明通过50%饱和硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析方法从动物腹水中获得高纯度抗体，并且实现了抗体的大量制备。
本发明的间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体还可用于快速诊断试剂盒或制备相应快速诊断试剂条。
具体实施方式
实施例1 间日疟原虫抗原的制备
1.1间日疟原虫优势抗原表位的选择
以间日疟原虫aldolase蛋白为靶抗原，分析其氨基酸序列亲水性及抗原性，选择A、B、C三个优势抗原表位。
抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；其氨基酸序列为:GluGlyIleIleProGlyIleLysValAsp
LysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。
抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；其氨基酸序列为：IleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArg ThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThr。
抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAG GGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；其氨基酸序列为： AsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu。
1.2优化并合成编码重组蛋白的核苷酸序列
间日疟原虫aldolase优势抗原表位的串联。
间日疟原虫醛缩酶蛋白的三个优势抗原表位A、B、C分别重复后通过柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC连接，得到重组蛋白D氨基酸序列。
柔性片段氨基酸序列为：GlySerGlySerGly。
重组蛋白D氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu。
1.3合成编码重组蛋白D的核苷酸序列
委托南京金思特公司化学合成编码重组蛋白D的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI（GGATCC）和XhoI（CTCGAG）对应的核苷酸序列。
1.4构建重组蛋白表达载体
用BamHI和XhoI限制性内切酶(本发明所采用的各种分子生物学用酶均购自NEB公司)进行双酶切重组蛋白D核苷酸序列和PET-28a（+）载体12小时之后，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒（公司）回收重组蛋白D核苷酸片段和PET-28a（+）载体。用T4连接酶于4℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含100ug/ml硫酸卡那霉素(上海生工生物工程服务有限公司，货号：KB0286)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有100ug/mL的硫酸卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600nm达0.6左右，用终浓度为0.1mM的IPTG(生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速250rpm，5小时。诱导之后，将培养液4℃ 5000rpm离心20分钟收集菌体。
1.5重组蛋白的纯化
将菌体用50mL抽提液(50mM Tris，8M Urea，0.5M NaCl，PH8.5)重悬，然后超声破碎，条件为功率600W，超声3s，间隔6s，共180次，12000rpm，4℃离心保留上清，上清用镍琼脂糖亲和层析纯化，用抽提液平衡柱子，然后用洗脱缓冲液(50mM Tris，8M Urea，0.5M Nacl，300mM咪唑 pH8.5)洗脱目的蛋白。将洗脱后的重组蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.85% NaCl，1mM EDTA，pH8.5)透析，每隔12小时换一次透析液，换液3次后，取出透析后的蛋白液，经聚乙二醇PEG-20000进行浓缩，于-20℃保存备用。
实施例2 筛选针对间日疟原虫重组蛋白的杂交瘤细胞株
2.1用间日疟重组蛋白免疫小鼠
取6~8周雌性BALB/C小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限公司），首次免疫皮下多点注射福氏完全佐剂乳化的重组蛋白，100ug/只，后续免疫每两周对小鼠进行腹腔注射不完全福氏佐剂充分乳化的重组蛋白，100ug/只，第五次免疫后尾静脉采血，测定血清效价。择血清效价较好的小鼠加强免疫，脾脏内注射重组蛋白，50ug/只。
2.2细胞融合
2.2.1饲养细胞的制备
小鼠摘眼球处死，浸泡于75%酒精中消毒5min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入5~10mL 37℃预热的IMDM无血清培养基（该过程切记不能刺破肠管，否则细胞可能被肠管中滴虫等污染），轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液。1500rpm离心3min，用15%胎牛血清IMDM的培养液重悬。
2.2.2脾细胞的制备
摘眼球处死经加强免疫的小鼠，无菌分离出脾脏，75%酒精洗涤，再用无血清IMDM培养液淋洗，置于筛网上研碎，将脾脏细胞冲洗入无菌离心管，1500rpm离心3min，用无血清IMDM培养液重悬，计数，调整细胞浓度至2×108。
2.2.3细胞融合
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1：4比例混合，在无菌的50mL离心管中用无血清IMDM培养基洗一次，1500rpm离心3min，弃上清，尽量不要有残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动。置于37℃水浴，在90s内缓缓加入37℃预温的1mL PEG1500，边加边轻微摇动。加入一定量37℃预温的无血清IMDM培养基终止PEG作用。离心，1500rpm离心3min，弃上清。
2.3阳性克隆的筛选
2.3.1细胞培养
用15%胎牛血清HAT选择培养基重悬细胞沉淀，加入饲养细胞。将该细胞加到96孔板内，每孔200uL，将培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养。在15%胎牛血清HAT选择培养基中维持3天左右，镜检，观察到瘤细胞基本死亡，杂交瘤细胞形成小集落，此时换用15%胎牛血清HT培养基，每孔100uL。
2.3.2阳性克隆的筛选和亚克隆
采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测各孔抗体效价。抗原包被与封闭：重组蛋白D抗原用包被液（0.05M碳酸缓冲液 pH9.6）稀释成1ug/mL，50uL/孔，37℃3小时；配制BSA（1%M/V）封闭液，甩去孔中包被液，拍干后，加入封闭液，300uL/孔，4℃过夜封闭，此后甩去封闭液，包被完成。对于检测阳性的杂交瘤细胞株，再使用有限稀释法进行亚克隆，经过三次克隆后，共筛选得到10株杂交瘤细胞株，细胞上清效价ELISA结果如下：
| 细胞株 | F184-8B3.9.1 | F183-2B12.4.2 | F183-3G9.10.3 | F183-9F9.4.1 | F183-11F7.2.1.3 |
| 保藏号 | McAb612 | McAb619 | McAb620 | McAb621 | McAb622 |
| 细胞株 | F184-1B1.4.5 | F207-1A9.2.9 | F207-1A12.12.1 | F207-4G3.4.11.3 | F207-9G4.5.7.2. |
| 保藏号 | McAb623 | McAb626 | McAb627 | McAb628 | McAb630 |
| row | 612 | 619 | 620 | 621 | 622 | 623 | 626 | 627 | 628 | 630 |
| A,1ug/mL | 0.443 | 2.318 | 1.197 | 0.983 | 1.412 | 0.947 | 1.016 | 0.818 | 1.349 | 1.346 |
| B,1：3 | 0.519 | 1.916 | 0.819 | 1.240 | 1.256 | 0.967 | 0.336 | 0.720 | 1.359 | 1.043 |
| C,1：9 | 0.394 | 1.931 | 0.448 | 0.904 | 0.838 | 0.743 | 0.424 | 0.642 | 0.794 | 0.451 |
| D,1：27 | 0.223 | 1.067 | 0.295 | 0.469 | 0.449 | 0.422 | 0.249 | 0.488 | 0.284 | 0.150 |
| E,1：81 | 0.105 | 0.575 | 0.094 | 0.363 | 0.152 | 0.123 | 0.127 | 0.206 | 0.146 | 0.112 |
| F,1：243 | 0.059 | 0.213 | 0.082 | 0.148 | 0.096 | 0.066 | 0.052 | 0.096 | 0.080 | 0.104 |
| G,1：729 | 0.057 | 0.085 | 0.093 | 0.073 | 0.058 | 0.055 | 0.049 | 0.074 | 0.092 | 0.082 |
| H,PBS | 0.042 | 0.045 | 0.074 | 0.044 | 0.047 | 0.043 | 0.047 | 0.054 | 0.072 | 0.109 |
实施例3 单克隆抗体的大量制备及纯化
3.1单克隆抗体的大量制备
选择健康8~10周的F1小鼠，在接种杂交瘤细胞前约一星期向每只小鼠体内注入0.5mL液体石蜡。每个细胞株注射5只小鼠，每只小鼠腹腔注射约1×106杂交瘤细胞，接种后7~10天小鼠开始产腹水，在此期间严密观察小鼠健康状态和腹水征象，用注射器将小鼠腹水引入试管中，如此反复几次，在小鼠频临死亡之前，取尽腹水，处死小鼠。
3.2单克隆抗体的纯化
3.2.1 50%硫酸铵沉淀
用4倍腹水体积的PB溶液稀释，往烧杯中贴壁缓缓加入5倍腹水体积的饱和硫酸铵（pH7.0），控制硫酸铵滴加速度为3~4mL/min，边加边搅拌，加完后让溶液静置2小时，然后将悬浊液于12000rpm离心30min。弃上清，用0.7倍原腹水体积的PB透析液溶解沉淀。
3.2.2透析离心
将溶解后的抗体溶液装入透析袋中，用PB缓冲液（pH7.4）透析，其间换液三次，两次换液时间间隔不得少于5小时，然后将透析完的溶液于12000rpm离心10min。弃沉淀，将上清用0.22um的滤器过滤，所得溶液即为所需单克隆抗体溶液。
3.2.3 Protein G亲和纯化
将透析后的单克隆抗体用Protein G亲和纯化，洗脱后收集洗脱峰，即得到纯化后单抗。
实施例4 单克隆抗体的鉴定
4.1 抗体亚类的鉴定
通过单克隆抗体亚类试剂盒（购自Pierce公司，货号37503），具体操作为：将TMB溶液和板条恢复至室温，8孔条每孔加入50ul稀释好的抗体（1ug/mL），8孔条每孔加入50ul HRP标记羊抗鼠IgG+IgM+IgA，轻轻敲击板子使其混匀，板子遮盖好室温放置1小时，板子拍干，用1×Wash Buffer加满各孔，再拍干，可用纸巾吸干剩余液体，同上步骤，洗涤三次。每孔加75ulTMB显色底物，5分钟后加入终止液，吸光度450nm读数，吸光度>0.2就可以视为是阳性。
经鉴定，本实验所得10株杂交瘤细胞株分泌的单抗均为IgG1型。
4.2单克隆抗体抗原表位的鉴定
将筛选得到的McAb612、McAb620等10个单克隆抗体分别稀释至1ug/mL，50uL/孔包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗板三次，用1%BSA封闭，4℃过夜，用PBST洗板三次，待用。将筛选得到的McAb612、McAb620等10个单克隆抗体稀释至5ug/mL，稀释重组蛋白D抗原稀释至1ug/mL ，取各稀释好单抗500 uL ，稀释抗原50 uL ，加入EP管中，混合至于37℃1小时，混合液50uL/孔加入酶标板中，同时设PBS对照，37℃反应30min，洗涤三次，稀释羊抗醛缩酶aldolase-PcAb至1ug/mL，加入酶标板中，50uL/孔，37℃反应30min，洗板三次，加入1:5000稀释的兔抗羊抗体，50uL/孔，37℃反应30min，洗板三次，K-Blue TMB 50uL/孔显色5min，加入2M H2SO4 50uL/孔，于酶标仪检测各孔OD450值，检测结果如下：
| row | 612 | 619 | 620 | 621 | 622 | 623 | 626 | 627 | 628 | 630 |
| Ag-McAb612 | 0.040 | 0.589 | 0.575 | 0.436 | 0.353 | 0.634 | 0.513 | 0.427 | 0.388 | 0.342 |
| Ag-McAb619 | 0.513 | 0.112 | 0.680 | 1.735 | 0.575 | 0.297 | 0.424 | 0.261 | 0.577 | 0.297 |
| Ag-McAb620 | 0.436 | 0.718 | 0.027 | 0.695 | 0.533 | 0.261 | 0.216 | 0.291 | 0.602 | 0.446 |
| Ag-McAb621 | 0.533 | 2.011 | 0.715 | 0.061 | 0.662 | 0.332 | 0.335 | 0.286 | 0.385 | 0.502 |
| Ag-McAb622 | 0.387 | 0.604 | 0.643 | 0.708 | 0.039 | .0.423 | 0.521 | 0.275 | 0.229 | 0.477 |
| Ag-McAb623 | 0.427 | 0.680 | 0.664 | 0.533 | 0.415 | 0.096 | 0.294 | 1.303 | 1.446 | 0.356 |
| Ag-McAb626 | 0.342 | 0.601 | 0.643 | 0.575 | 0.382 | 0.295 | 0.075 | 0.302 | 0.496 | 0.391 |
| Ag-McAb627 | 0.291 | 0.711 | 0.695 | 0.513 | 0.445 | 1.116 | 0.434 | 0.054 | 0.523 | 0.375 |
| Ag-McAb628 | 0.424 | 0.577 | 0.747 | 0.436 | 0.303 | 1.561 | 0.436 | 0.289 | 0.026 | 0.424 |
| Ag-McAb630 | 0.388 | 0.297 | 0.313 | 0.328 | 0.311 | 0.345 | 0.261 | 0.384 | 0.275 | 0.058 |
| PBS | 1.155 | 1.017 | 1.303 | 1.116 | 1.250 | 1.074 | 1.352 | 1.228 | 1.068 | 1.226 |
由上表可知，McAb619和McAb621抗原表位不同，McAb623与McAb627、McAb628抗原表位不同。
4.3 HPR标记单抗的制备
取4mg的HRP溶于0.5ml的双馏水中，加入新配0.06 mol/L 的过碘酸钠溶液0.5 mL（10 mL+128mg过碘酸钠），混匀置4℃冰箱30min，取出后加入0.16 mol/L(10 mL水+0.1 mL乙二醇)乙二醇水溶液0.5mL，于室温放置30min。分别加入7.50mg/ml的McAb619、McAb621、McAb623、McAb627、McAb628抗体溶液1ml混匀，装入透析袋中，对0.05mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液透析6h(或者过夜)，使之结合。加5 mg/mL NaBH4 溶液0.2mL，混匀置冰箱2h。将上述溶液放于0.01 mol/L pH7.4的PBS缓冲液中，置4℃冰箱4h。在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，，混匀，4℃ 30min，离心，去上清，沉淀以少许0.01 mol/L pH7.4的PBS缓冲液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜。次日取出离心，取沉淀，用0.01 mol/L pH7.4的PBS缓冲液溶解，即得酶-抗体结合物。
4.4 单克隆抗体配对
将用杂交瘤单抗McAb619、McAb621、McAb623、McAb627、McAb628稀释至1ug/mL，50uL/孔包被酶标板，4℃过夜。用PBST洗板三次，用1%BSA封闭，4℃过夜。用PBST洗板三次，取间日疟阳性临床血清标本以及间日疟临床阴性标本，50uL/孔， 37℃反应1h，同上洗涤三次，加入5株单抗的HRP标记物，37℃反应30min，洗板三次，K-Blue TMB 50uL/孔显色5min，加入2M H2SO4 50uL/孔，于酶标仪检测各孔OD450和OD630值，根据酶标结果求P/N值（阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值），结果如下：
| row | McAb619 | McAb621 | McAb623 | McAb627 | McAb628 |
| HRP-McAb619 | 3.5 | 15.6 | 4.6 | 8.6 | 5.7 |
| HRP-McAb621 | 21.3 | 6.8 | 7.0 | 3.9 | 5.7 |
| HRP-McAb623 | 13.2 | 9.6 | 10.6 | 25.6 | 17.5 |
| HRP-McAb627 | 11.5 | 8.9 | 29.3 | 9.5 | 16.4 |
| HRP-McAb628 | 7.5 | 3.2 | 25.7 | 7.2 | 9.8 |
通过上表可知，McAb623与HRP- McAb627配对检测间日疟为最佳组合。
实施例5 利用间日疟重组蛋白单克隆抗体检测人血清样本
5.1特异性
用McAb623与HRP- McAb627配对，检测人1000份阴性血清，结果是特异性为99.9%，假阳性为0.1%。
5.2灵敏度
用McAb623与HRP- McAb627配对，检测阳性血清，特异性为100%。
因此用这两个抗体，可以制备成间日疟检测试剂盒。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州傲锐生物医药科技有限公司
<120> 间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213> aldolase
<400> 1
gagggaatca ttccaggaat taaagttgac aaaggattgg ttaccatccc atgcactgat 60
gatgagaagt ccacccaggg attagatggt ctagctgaga ggtgtaaaga atattacaaa 120
gctggtgcaa ggtttgcaaa atggagagct 150
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> aldolase
<400> 2
Glu Gly Ile Ile Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Leu Val Thr Ile
1 5 10 15
Pro Cys Thr Asp Asp Glu Lys Ser Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Ala
20 25 30
Glu Arg Cys Lys Glu Tyr Tyr Lys Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp
35 40 45
Arg Ala
50
<210> 3
<211> 150
<212> DNA
<213> aldolase
<400> 3
attggttttc tcacagtgag aactttaagt aggacagtgc caccatcctt accaggagtt 60
gtattcttat ctggaggtca atctgaagaa gaagcatctg tcaatttgaa ttccatcaat 120
gcgttaggcc cacacccatg ggcgttgacc 150
<210> 4
<211> 50
<212> PRT
<213> aldolase
<400> 4
Glu Gly Ile Ile Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Leu Val Thr Ile
1 5 10 15
Pro Cys Thr Asp Asp Glu Lys Ser Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Ala
20 25 30
Glu Arg Cys Lys Glu Tyr Tyr Lys Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp
35 40 45
Arg Ala
50
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> aldolase
<400> 5
aactccttgg cgacttatgg aaagtacaag ggaggtgcag gcggagccga tgcaggagca 60
tccctt 66
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> aldolase
<400> 6
Asn Ser Leu Ala Thr Tyr Gly Lys Tyr Lys Gly Gly Ala Gly Gly Ala
1 5 10 15
Asp Ala Gly Ala Ser Leu
20
<210> 7
<211> 396
<212> DNA
<213> 重组序列
<400> 7
gagggaatca ttccaggaat taaagttgac aaaggattgg ttaccatccc atgcactgat 60
gatgagaagt ccacccaggg attagatggt ctagctgaga ggtgtaaaga atattacaaa 120
gctggtgcaa ggtttgcaaa atggagagct ggcagcggca gcggcattgg ttttctcaca 180
gtgagaactt taagtaggac agtgccacca tccttaccag gagttgtatt cttatctgga 240
ggtcaatctg aagaagaagc atctgtcaat ttgaattcca tcaatgcgtt aggcccacac 300
ccatgggcgt tgaccggcag cggcagcggc aactccttgg cgacttatgg aaagtacaag 360
ggaggtgcag gcggagccga tgcaggagca tccctt 396
<210> 8
<211> 132
<212> PRT
<213> 重组序列
<400> 8
Glu Gly Ile Ile Pro Gly Ile Lys Val Asp Lys Gly Leu Val Thr Ile
1 5 10 15
Pro Cys Thr Asp Asp Glu Lys Ser Thr Gln Gly Leu Asp Gly Leu Ala
20 25 30
Glu Arg Cys Lys Glu Tyr Tyr Lys Ala Gly Ala Arg Phe Ala Lys Trp
35 40 45
Arg Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ile Gly Phe Leu Thr Val Arg Thr Leu
50 55 60
Ser Arg Thr Val Pro Pro Ser Leu Pro Gly Val Val Phe Leu Ser Gly
65 70 75 80
Gly Gln Ser Glu Glu Glu Ala Ser Val Asn Leu Asn Ser Ile Asn Ala
85 90 95
Leu Gly Pro His Pro Trp Ala Leu Thr Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser
100 105 110
Leu Ala Thr Tyr Gly Lys Tyr Lys Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp Ala
115 120 125
Gly Ala Ser Leu
130
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggcagcggca gcggc 15
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
Claims (5)
1.间日疟原虫醛缩酶蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用柔性片段GGCAGCGGCAGCGGC将间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A、B、C相连接，得到重组子D；其中，
抗原表位A的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCT；
抗原表位B的核酸序列为：ATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTA GGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACC；
抗原表位C的核酸序列为：AACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGG GAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；
重组子D的核酸序列为：GAGGGAATCATTCCAGGAATTAAAGTTGAC AAAGGATTGGTTACCATCCCATGCACTGATGATGAGAAGTCCACCCAGGGATTAGATGGTCTAGCTGAGAGGTGTAAAGAATATTACAAAGCTGGTGCAAGGTTTGCAAAATGGAGAGCTGGCAGCGGCAGCGGCATTGGTTTTCTCACAGTGAGAACTTTAAGTAGGACAGTGCCACCATCCTTACCAGGAGTTGTATTCTTATCTGGAGGTCAATCTGAAGAAGAAGCATCTGTCAATTTGAATTCCATCAATGCGTTAGGCCCACACCCATGGGCGTTGACCGGCAGCGGCAGCGGCAACTCCTTGGCGACTTATGGAAAGTACAAGGGAGGTGCAGGCGGAGCCGATGCAGGAGCATCCCTT；
（2） 将重组子D和载体PET-28a（+）用BamHI和XhoI进行双酶切，将重组子D连接到载体PET-28a（+）上，转化大肠杆菌BL21，筛选得到重组蛋白D表达菌株；
（3） 诱导表达重组蛋白D：重组蛋白D的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIle LysValAspLysGlyLeuValThrIleProCysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAlaGlySerGlySerGlyIleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSerLeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThrGlySerGlySerGlyAsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGlyAlaAspAlaGlyAlaSerLeu；
（4）将获得的重组蛋白D超声破碎并低温离心，溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，洗脱得到纯化重组蛋白D；
（5）用纯化后重组蛋白D免疫Balb/c小鼠，多次免疫尾静脉采血测定血清效价后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并用HAT筛选得到稳定的杂交瘤细胞株；
（6）将杂交瘤细胞株注射到液体石蜡预处理的F1小鼠腹腔，隔周取腹水，50%饱和硫酸铵沉淀法和Protein G亲和纯化单抗，得到单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位A的氨基酸序列为：GluGlyIleIleProGlyIleLysValAspLysGlyLeuValThrIlePro CysThrAspAspGluLysSerThrGlnGlyLeuAspGlyLeuAlaGluArgCysLysGluTyrTyrLysAlaGlyAlaArgPheAlaLysTrpArgAla。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位B的氨基酸序列为：IleGlyPheLeuThrValArgThrLeuSerArgThrValProProSer LeuProGlyValValPheLeuSerGlyGlyGlnSerGluGluGluAlaSerValAsnLeuAsnSerIleAsnAlaLeuGlyProHisProTrpAlaLeuThr。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，间日疟原虫醛缩酶蛋白的抗原表位C的氨基酸序列为：AsnSerLeuAlaThrTyrGlyLysTyrLysGlyGlyAlaGlyGly AlaAspAlaGlyAlaSerLeu。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的表达诱导温度为25℃，诱导转速为250rpm，诱导的IPTG浓度为0.1mM。
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