CN102108355A - 恶性疟原虫的多表位人工抗原及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及恶性疟原虫的多表位人工抗原及其用途。本发明设计出一种序列如SEQ ID No：1所示的多核苷酸以及序列如SEQ ID NO：2所示的多肽，所述多核苷酸和多肽作为人工抗原可用于制备疫苗，并可通过该抗原获得抗体，用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂和检测疟疾感染的试剂盒。本发明多表位人工抗原与现有技术的抗恶性疟原虫疫苗相比具有高免疫原性、抗原识别多样性，本发明的抗体对恶性疟原虫的体外生长具有很高的抑制效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。具体而言，本发明涉及一种能被恶性疟疾患者血清识别的具有多个表位的人工抗原的氨基酸序列以及编码所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明还涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本发明进一步涉及所述的人工抗原在用于制备恶性疟原虫感染的诊断试剂，以及抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。
背景技术
疟疾是当今世界上最致命的流行病之一。全世界有近40亿人生活在疟疾流行区，每年大约有2.47亿新的感染者出现，并且造成每年约1百万人死亡。在感染人类的5种疟原虫中，恶性疟原虫是造成上述死亡的元凶，因此对恶性疟疾的防治无论对流行区人口健康还是对该地区经济发展都具有重大意义。
疟原虫的生活史可简单归纳为：在人体内进行无性繁殖、早期有性增殖和在蚊体内的有性增殖与孢子增殖。从雌性按蚊(Anopheles sp.)叮咬入血，到在肝细胞内发育成熟，大量裂殖子(merozoite)从破裂的肝细胞内逸出，进入血流，这时期称红前期(exoerythrocytic stage)。从血流中裂殖子侵入红细胞在其内发育增殖，到下一代疟原虫经无性繁殖反复感染红细胞，称为红(细胞)内期(erythrocytic stage)。部分进入红细胞的裂殖子在红细胞内不再进行无性分裂，而逐渐发育成为雌或雄配子体。如被雌性按蚊吸入胃内，则在蚊体内进行有性增殖，发育成熟为子孢子逸出，统称为蚊期。
疟原虫在上述不同生活周期表达多种不同的抗原蛋白。尽管研究证实减毒子孢子能够引导产生免疫保护，由于疟原虫需通过宿主体内繁殖，因此没有利用天然虫体制备疫苗的条件。对已经筛选出的疟原虫抗原蛋白的研究已证实，它们的抗原性在宿主免疫系统的压力下会不断产生变异，因此目前没有任何一种抗原的单独使用能够达到预期的保护效果。
疟疾的临床症状只发生在红内期，可引起周期性寒战高热，贫血，脾肿大，昏迷以致死亡。因此，针对红内期研制的抗疟疾疫苗被认为是最有效的预防途径。恶性疟原虫生活周期的复杂性，以及恶性疟原虫抗原的高度多态性，使人们把研究重点放在对保守性多表位疫苗的研制上。
因此，目前明显需要一种具有高免疫原性、抗原识别多样性、同时具有高抑制率的疫苗。
发明内容
根据上述需要，本发明人构建出一种新的恶性疟原虫的多表位人工抗原，将所述的抗原命名为M.RCAg-3。通过选择表位序列，同时在各个表位基因序列两端掺入特定的间隔序列(在N端表位基因序列中引入起始密码子，在C端表位基因序列中引入终止密码子)，然后按照特定的排列顺序(如图2)，得到新的人工抗原的编码序列，如图1中的SEQ ID No：1所示。
因此，本发明涉及一种具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸。
本发明还涉及具有由SEQ ID NO：1所示的碱基序列编码的如SEQID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。由于密码子的简并性，本领域技术人员可知编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列并不仅限于SEQ ID NO：1，其他为适合在相应表达系统表达本发明的人工抗原而优化的多核苷酸序列也在本发明的范围之中。
本发明进一步涉及含有所述的多核苷酸的载体。
本发明进一步涉及含有所述的载体的大肠杆菌(即大肠埃希氏菌Escherichia coli)。其是于2009年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，保藏号为CGMCC3519的大肠埃希氏菌Escherichia coli。
本发明进一步涉及含有所述的多核苷酸或所述的多肽的疫苗。
本发明进一步涉及所述的多核苷酸用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。
本发明进一步涉及所述的多核苷酸免疫机体产生的抗体用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。
本发明进一步涉及所述的多肽用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。
本发明进一步涉及对所述的多核苷酸序列特异的抗体。
本发明进一步涉及对所述的多肽特异的抗体。
本发明还涉及所述特异性抗体在制备检测疟疾的制剂中的用途。由于对本发明人工抗原特异性的抗体可有效识别疟原虫，因此可用于制备各种检测疟原虫的制剂。所述的抗体可以是IgG抗体，通过使用本发明的人工抗原免疫动物获得。本发明的抗体也包括本领域所知的其他类型的抗体，如IgY抗体。
本发明还涉及含本发明特异性抗体的试剂盒。优选地，该试剂盒使用ELISA法。该试剂盒可包括本发明特异性抗体包被的酶联反应板、辣根过氧化物酶标记的抗体和显色系统。所述试剂盒可通过本领域公知的方法制备，也可包括现有技术中其他可有效提高ELISA试剂盒灵敏度和特异性的辅助成分。所述的试剂盒中还包含说明书。
根据本发明提供的含有抗恶性疟原虫的多表位人工抗原与现有技术的抗恶性疟原虫疫苗相比具有高免疫原性、抗原识别多样性。另外，由所述的SEQ ID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸和所述的SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的多肽所产生抗体对恶性疟原虫的体外生长具有很高的抑制效率。
术语说明：除非另有说明，本发明中使用的术语具有本领域公知的含义。
抗原：是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。最常见的抗原分子是大分子蛋白质。
表位：免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而仅识别抗原大分子上的一个特定的部分。称为表位(epitope)或抗原决定簇(antigenicdeterminant)。因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与免疫细胞表面的抗原受体或游离的抗体分子相结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子。
抗体：抗体是免疫系统用来鉴别和抑制外源物质(例如细菌和病毒)的一种蛋白质复合体。每种抗体只识别特定的目标抗原。
保藏信息
本发明所用的重组工程菌株(大肠埃希氏菌Escherichia coli)已于2009年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC3519。
附图说明
图1示出抗恶性疟原虫多表位人工抗原M.RCAg-3疫苗的基因核苷酸序列的978个碱基(即SEQ ID No：1)及其编码蛋白的324个氨基酸序列(即SEQ ID No：2)。
图2示出多表位人工抗原M.RCAg-3的不同种类表位的串联方式。
图3示出多表位人工抗原M.RCAg-3对72例恶性疟疾病人血清的识别。A：多表位人工抗原M.RCAg-3的纯化：1，纯化前细菌裂解液；2，经纯化后的M.RCAg-3蛋白；M为蛋白低分子量marker；B：蛋白M.RCAg-3能有效地识别恶性疟疾患者血清的酶联免疫吸附实验ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)实验结果，包括M.RCAg-3与患者血清识别的光吸收值和t-检验结果：
t-检验：双样本等方差假设
。
图4示出兔抗多表位人工抗原M.RCAg-3的IgG抗体对恶性疟原虫3D7株天然蛋白的识别。A为在光镜下视野；B为在荧光下的相同视野；C为A与B重合后的视野。
图5示出本发明使用的购自Novagen公司的原始载体pET-30a-c(+)的图谱。
具体实施方式
材料、方法和结果：
一、表位基因合成
通过查阅文献，经分析后确定选取表1中的表位序列，同时在各个表位基因序列两端掺入特定的间隔序列(在N端表位基因序列中引入起始密码子，在C端表位基因序列中引入终止密码子)，按照特定的排列顺序(如图2)，由上海生工公司以通用密码子合成M.RCAg-3的全长基因序列，如图1中的SEQ ID No：1。
表1.表位信息表(序列分别对应于SEQ ID No：5-14)
| 表位 | 抗原来源 | 表位序列 | 表位类型 | 氨基酸数目 | 参考文献 |
| E1 | RESA | MQTLWDEIMDINKRK | B | 15 | [1] |
| E2 | MSP6 | LNNNILGWEFGGGAPQNGAAEDKKTEY | B | 27 | [2] |
| E3 | Pf332 | SVTEEIAEEDKSVTEEIAEEDK | B | 22 | [3，4] |
| E4 | ABRA-1 | NIISCNKNDKNQ | Th/B | 12 | [5] |
| E5 | MSP1 | VTHESYQELVKKLEALEDAV | Th/B | 20 | [6] |
| E6 | Mag1 | QTDEIKNDNI | Th/B | 10 | [12] |
| E7 | RAP1 | SPSSTKSSSPSSTKSSS | Th | 17 | [7] |
| E8 | Pf332 | LVSEEIVTEEGSVAQE | 泛Th | 16 | [8，9] |
| EN | Pf332 | DMNNRKTMLNEIEKGIKDETFSRENGLDVCKSQCEERSRDDTEDQFLRFFAEWEEEF | B | 57 | [10] |
| EC | RESA | KNVIKCTGESQTGNTGGGQAGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEP | B | 57 | [11] |
二、载体改造
原始载体：pET-30a-c(+)购自Novagen公司，见图5；
原始载体的改造引物：
上游引物(SEQ ID No：3)：
5’CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCACCATC3’
下游引物(SEQ ID No：4)：
5’TGCTCGAGTGAGATCTCAAGCTTGTCGACTAG3’
经PCR分子重组改造，结果得到人工多表位抗原M.RCAg-3的表达载体：pMV-ex(Malaria Vaccine-expression)。
三、M.RCAg-3蛋白的表达和纯化
将M.RCAg-3的全长基因克隆入pMV-ex(经Pst I和BglII酶切后)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Merck公司)。在终浓度为50μg/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得含重组质粒M.RCAg-3-MV的原核表达工程菌M.RCAg-3-MV/BL21(DE3)。该重组工程菌株已于2009年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC3519。将该重组工程菌株经37℃IPTG诱导3小时，使得融合重组获得表达，经过色谱纯化后，获得较高纯度的M.RCAg-3蛋白(图3A)。
具体步骤如下：
1、重组蛋白样品准备：
1)在5mlLB培养基中接种含有表达目的蛋白的大肠杆菌工程菌，37℃活化过夜。
2)以1∶100的接种量转接到新鲜LB培养基中，37℃培养到接近对数生长期，加终浓度为1mM的IPTG诱导3小时。
3)收集菌液：4℃，5000rpm×5min。
4)预冷的1×PBS重悬菌液，4℃，5000rpm×5min，去上清。
5)加一定体积的预冷的1×PBS重悬菌液(每ml培养物加入50μl预冷的1×PBS)。
6)冰上进行超声破碎(功率400W，超声5秒，间隔10秒，15个循环)。
7)4℃，12000rpm×30min，收集上清至一新50ml离心管。
8)放入55℃水浴中30min(其间每10min颠倒一次)。
9)重复操作7)。
l0)0.22μm滤膜注射器过滤，上清可放-40℃保存备用。
2、过柱前试剂准备：
储存液(Stock Solution)A
1M Tris·Cl，pH＝8.0
储存液(Stock Solution)B(10×)
磷酸盐缓冲液
800ml去离子水中加入80g NaCl，2g KCl，36.25g Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，然后补足1L。
BufferA
25mM Tris·Cl，50mM NaCl，pH＝8.0
Buffer B
25mM Tris·Cl，1M NaCl，pH＝8.0
Buffer C：(PBS)
100ml Stock sol B，加入去离子水补足1L。
3、样品过柱纯化步骤
1)打开
FPLC(GE Healthcare公司)，同时打开控制软件Unicorn5.10，待仪器完成自检后，设置限压和流速；
2)将色谱柱安装上，过程要排除气泡；
3)首先用去离子水清洗柱子5-10个柱体积；
4)运行柱子清洗程序；
5)运行柱子平衡程序；
6)运行柱子纯化程序；
7)经过多步纯化后，得到较高纯度的M.RCAg-3蛋白。
四、酶联免疫吸附实验ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测M.RCAg-3蛋白与恶性疟疾患者血清的识别实验
1)包被：用pH9.6的0.1M碳酸盐包被缓冲液稀释至所需的蛋白质浓度(1μg/100μl/孔)用加样器每孔加入100μl，然后将平板置于湿盒中，4℃过夜，或37℃，4小时，将平板小孔中液体倾尽，用PBST洗板5次。
2)封闭：每孔200μl含1％BSA的PBST，37℃，1小时。
3)用PBST洗板5次，每次2分钟。
4)加入I抗(即患者和正常人血清)：将待检血清用PBS溶液作以1∶200稀释，每孔100μl稀释血清，4℃过夜。
5)PBST洗板5次，每次2分钟。
6)加入辣根过氧化物酶标记的II抗(山羊抗人IgG-HRP)：每孔中加入100μl经PBST稀释过的II抗(1∶1000)，置于湿盒中37℃湿育1小时。
7)PBST洗板5次，每次2分钟。
8)显色。每孔加入底物显色缓冲液100μl，室温反应10分钟。
9)利用Labsystems GenesisV3.03系统(Wellscan MK3，LabsystemsDragon，USA)，读取450nm吸光度值。
10)利用生物统计学工具分析实验结果，确定患者和正常人血清对重组蛋白的识别程度。
底物用显色缓冲液pH5.0
A液：柠檬酸(无水)1.92g加入去离子水到100ml。
B液：Na2HPO4·12H2O7.16g加入去离子水到100ml。
将A液2.43ml，B液2.57ml及去离子水5ml混合即成pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液10ml。
显色反应前新鲜配制：
30％过氧化氢0.015ml
TMB 0.004g
加入到10ml磷酸-柠檬酸缓冲液中，即可用于显色反应。)
双样本方差分析结果表明：患者和正常人血清对M.RCAg-3蛋白的识别具有显著性差异(如图3B)。
五、抗人工多表位抗原M.RCAg-3的兔抗血清的制备及其IgG抗体纯化
用“方法三”纯化所得的M.RCAg-3蛋白结合福氏佐剂(Sigma公司)皮下免疫大白兔，以磷酸盐缓冲液稀释，每次100μg/ml的剂量进行免疫，第一次为完全福氏佐剂，接下来为不完全福氏佐剂，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。兔抗血清IgG用蛋白A亲和层析纯化。
1、抗M.RCAg-3抗原的兔多克隆抗体IgG的分离纯化
溶液配制
【饱和硫酸铵，(SAS)】
在900ml水中加入1.21gTris碱，调校pH7.0，并定容终体积至1L，配制成0.01MTris·Cl溶液。称量767g(NH4)2SO4，通过搅拌和稍微加热将其溶于1L0.01MTris·Cl，调校至pH7.0，并置于4℃贮存。在4℃贮存时应可见瓶底出现(NH4)2SO4晶体。
【33％SAS溶液】
33mlSAS加67mlPBS，pH7.0
【0.1M PBS】
A液：3.02gNaH2PO4·2H2O溶于去离子水中配制成0.2M NaH2PO4溶液。
B液：35.85gNa2HPO4·12H2O溶于500ml去离子水中。
取A液92ml，B液305ml添加去离子水配制成400ml 0.1M pH7.3的PBS贮存液。
【0.01M PBS】
将0.1MPBS稀释10倍既成0.01MPBS，pH7.3
【0.05M PBS】
将0.1MPBS稀释2倍既成0.05MPBS，pH7.3
用硫酸铵沉淀IgG：
1)1份血清+1份生理盐水+1份饱和硫酸铵，4℃搅拌过夜，以形成沉淀；
2)4℃，5000rpm离心10分钟，用33％SAS溶液洗两遍；
3)用0.01M的PBS补足原体积后，装入透析袋(MWCO：12,000)，4℃PBS中透析2-3天，每天换3-4次透析液；
4)4℃，离心10,000rpm 10分钟，留取上清备用。
2、用蛋白A亲和层析纯化兔血清的IgG：
材料：HiTrap rProteinAFF层析柱(GE Healthcare公司)；
结合缓冲液：20mM磷酸盐，150mMNaCl，pH＝7.0
洗脱缓冲液：0.1M柠檬酸钠pH3.0
中和液：1.0M Tris pH＝9
样品：步骤“四-1”中的透析后上清(必须用结合缓冲液1∶1稀释，以保证结合时离子强度和pH值)。
1)打开蛋白A柱子(注意，去顶帽时避免进气泡)，灌入贮存液。
2)平衡蛋白A柱子(用5-10个住体积的结合缓冲液或合时的缓冲液)。
3)泵上样。
4)上样结束后，用10-15倍柱体积的结合缓冲液洗涤柱子，至洗涤液的紫外吸光值低至20mAU以下。
5)用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱。
6)立即用中和液，将蛋白洗脱液的pH值调至7左右(1ml样品加150μl缓冲液)。
7)用6倍柱体积洗脱缓冲液再生柱子。
8)免疫球蛋白洗脱液透析、脱盐或浓缩。
六、兔抗多表位人工抗原M.RCAg-3的IgG抗体对M.RCAg-3蛋白，以及各个表位合成肽(由北京奥维亚生物技术有限公司合成)的识别滴度
1)包被：用pH9.6的0.1M碳酸盐包被缓冲液将M.RCAg-3蛋白(或表位合成肽)稀释至所需的浓度(1μg/100μl/孔)用加样器每孔加入100μl，然后将平板置于湿盒中，4℃过夜，或37℃，4小时，将平板小孔中液体倾尽，用PBST洗板5次。
2)封闭：每孔200μl含1％BSA的PBST，37℃，1小时。
3)用PBST洗板5次，每次2分钟。
4)加入经PBS稀释后的不同稀释度的I抗(兔抗IgG)，每孔100μl，4℃过夜。
5)用PBST洗板5次，每次2分钟。
6)加入辣根过氧化物酶标记的II抗(山羊抗兔IgG-HRP)：每孔中加入100μl经PBST稀释过的II抗(1∶1000)，置于湿盒中37℃湿育1小时。
7)PBST洗板5次，每次2分钟。
8)显色。每孔加入底物显色缓冲液100μl，室温反应10分钟。
9)利用Labsystems GenesisV3.03系统(Wellscan MK3，LabsystemsDragon，USA)，读取450nm吸光度值。
10)最高抗体稀释度选取原则：免疫组OD值≥2倍对照(免疫前)OD值相应的抗体稀释度。
结果(如表2)表明，M.RCAg-3蛋白免疫得到的兔抗血清(兔抗IgG)，对M.RCAg-3蛋白的最高识别滴度为＞1∶204800。
结果(如表3)表明，M.RCAg-3蛋白免疫得到的兔抗血清(兔抗IgG)，对M.RCAg-3蛋白所包含的10个表位并不是全部都有高的识别滴度，针对不同表位的识别特异性不同。
表2
| 血清稀释倍数 | 1∶200 | 1∶400 | 1∶800 | 1∶1600 | 1∶3200 | 1∶6400 |
| 免疫组 | 2.889 | 2.911 | 2.773 | 2.577 | 2.445 | 2.379 |
| 免疫前 | 0.246 | 0.216 | 0.264 | 0.234 | 0.166 | 0.115 |
| 血清稀释倍数 | 1∶12800 | 1∶25600 | 1∶51200 | 1∶102400 | 1∶204800 | |
| 免疫组 | 2.456 | 2.162 | 1.649 | 1.081 | 0.709 | |
| 免疫前 | 0.134 | 0.146 | 0.136 | 0.182 | 0.177 |
表3
| 表位 | 表位特异的抗体反应(兔IgG) |
| E1 | 1∶200-1∶400 |
| E2 | 1∶25600-1∶51200 |
| E3 | 1∶3200-1∶6400 |
| E4 | 1∶3200-1∶6400 |
| E5 | ＜1∶200 |
| E6 | ＜1∶200 |
| E7 | ＜1∶200 |
| E8 | 1∶1600-1∶3200 |
| EN+EC | 1∶102400-1∶204800 |
七、兔抗多表位人工抗原M.RCAg-3的抗血清(或IgG抗体)对恶性疟原虫3D7株天然蛋白的识别：间接免疫荧光分析(indirectimmunofluorescence assay，IFA)
1)取恶性疟原虫3D7株红内期混合期细胞(感染率2％左右)于EP管中，用PBS漂洗两次，每次2000rpm离心5分钟。弃去上清，用1/3细胞压积的PBS稀释后，均匀涂于载玻片上，室温风扇吹干，约3-4小时。
2)将涂好的片子浸入冰预冷的固定液(丙酮∶甲醇＝4∶1)中，冰上固定5分钟，室温风干。
3)用HB铅笔画圈标记，在圈中加入不同稀释度(1∶80，1∶160，1∶320，1∶640等)的I抗血清(兔抗多表位人工抗原M.RCAg-3的抗血清或IgG抗体)，37℃，湿盒内温育1小时。
4)用PBS洗5次，每次2分钟，室温风干。
5)加入II抗，即1∶150稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，37℃，湿盒内温育30分钟。
6)用PBS洗5次，每次2分钟，室温风干。
7)用50％的甘油将盖玻片封在载玻片上，立刻用荧光显微镜观察或共聚焦荧光显微镜扫图。
结果(如图5)表明，M.RCAg-3蛋白免疫的兔抗IgG，对恶性疟原虫3D7株天然蛋白的最高识别滴度为1∶2560。
八、兔抗多表位人工抗原M.RCAg-3的IgG抗体对恶性疟原虫3D7株的体外抑制
1)以两次山梨醇同步化的恶性疟原虫3D7株(保藏号MRA-102)(本实验室保存的来自美国ATCC(the American TypeCulture Collection)的标准虫株)环状体期细胞作为实验细胞；
2)用正常人血细胞和1640培养液配制10％悬液，分装于96孔板内，0.1ml/孔(每孔血细胞最终含量为5％，Giemsa染色后镜检起始感染率为0.5％)；
3)分别加入含不同浓度的纯化兔抗IgG抗体：包括抗M.RCAg-3蛋白免疫-IgG；抗M.RCAg-3蛋白免疫免疫前-IgG；空白1640培养基对照。(终浓度为0.5mg/ml，1mg/ml和2mg/ml)，每个浓度3个复孔，每孔100μl；
4)过滤无菌纯化兔抗IgG抗体；
5)37℃正常蜡烛缸中培养48小时，Giemsa染色后经显微镜观察血涂片，计数3000个细胞。
生长抑制率按下列公式计算：生长抑制率＝(对照IgG组感染率-待测IgG组感染率)/(对照IgG组感染率-起始背景感染率)×100％。
经数次实验重复结果显示了，抗M.RCAg-3蛋白免疫的IgG在2mg/ml终浓度时对恶性疟原虫3D7虫株的生长抑制率可以达到46％(表4)。
表4
结论：
多表位人工抗原M.RCAg-3与现有技术的抗恶性疟原虫疫苗相比具有高免疫原性、抗原识别多样性。另外，由M.RCAg-3所产生抗体对恶性疟原虫的体外生长具有很高的抑制效率。
参考文献：
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序列表
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<120>恶性疟原虫的多表位人工抗原及其用途
<130>890298CG
<160>14
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atggatatga acaatcgtaa gacaatgctg aatgaaattg agaaaggtat caaagacgag 60
acgttttctc gtgagaacgg cttagacgtg tgcaaaagcc aatgtgaaga gcgcagtcgg 120
gatgataccg aagatcagtt ccttcgcttt ttcgcggaat gggaagaaga atttggatca 180
cagaccgacg aaatcaaaaa cgataatatt ggcggatcat taaataacaa tattctgggg 240
tgggaatttg gtggcggagc cccgcagaac ggcgcagcgg aagataagaa aaccgagtat 300
ggcggatcaa gcgtgaccga agagattgcg gaagaagata aaagcgtgac cgaagagatt 360
gcggaagaag ataaaggcgg atcaggcccg ggcccgagcc catcttccac caagtcgtca 420
agcccgtcct caacgaaaag ttctagtggc ccgggcccgg gatcaaatat cattagctgc 480
aacaaaaatg ataagaacca gggcggatca gtgacccatg aaagctatca ggaacttgtc 540
aaaaagttag aggccctgga agatgcggtt ggcggatcag gcccgggccc gctggtcagc 600
gaagagattg ttaccgagga aggctctgtg gcgcaggaag gcccgggccc gggatcatta 660
aataacaata ttctggggtg ggaatttggt ggcggagccc cgcagaacgg cgcagcggaa 720
gataagaaaa ccgagtatgg cggatcaatg cagaccctgt gggacgaaat catggatatt 780
aataaacgta agggcggatc caaaaacgtg attaagtgca ccggggaaag ccagaccgga 840
aatacgggtg gagggcaagc gggcaacact ggtggcggtc aggctggcaa tacggttggc 900
gatcaggcag ggtcaaccgg tggcagccca cagggctcca caggtgccag tcaaccgggt 960
tcttcggagc cttaataa 978
<210>2
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Asp Met Asn Asn Arg Lys Thr Met Leu Asn Glu Ile Glu Lys Gly
1 5 10 15
Ile Lys Asp Glu Thr Phe Ser Arg Glu Asn Gly Leu Asp Val Cys Lys
20 25 30
Ser Gln Cys Glu Glu Arg Ser Arg Asp Asp Thr Glu Asp Gln Phe Leu
35 40 45
Arg Phe Phe Ala Glu Trp Glu Glu Glu Phe Gly Ser Gln Thr Asp Glu
50 55 60
Ile Lys Asn Asp Asn Ile Gly Gly Ser Leu Asn Asn Asn Ile Leu Gly
65 70 75 80
Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro Gln Asn Gly Ala Ala Glu Asp Lys
85 90 95
Lys Thr Glu Tyr Gly Gly Ser Ser Val Thr Glu Glu Ile Ala Glu Glu
100 105 110
Asp Lys Ser Val Thr Glu Glu Ile Ala Glu Glu Asp Lys Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Pro Ser Pro Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Thr Lys Ser Ser Ser Gly Pro Gly Pro Gly Ser Asn Ile Ile Ser Cys
145 150 155 160
Asn Lys Asn Asp Lys Asn Gln Gly Gly Ser Val Thr His Glu Ser Tyr
165 170 175
Gln Glu Leu Val Lys Lys Leu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Val Gly Gly
180 185 190
Ser Gly Pro Gly Pro Leu Val Ser Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Gly
195 200 205
Ser Val Ala Gln Glu Gly Pro Gly Pro Gly Ser Leu Asn Asn Asn Ile
210 215 220
Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro Gln Asn Gly Ala Ala Glu
225 230 235 240
Asp Lys Lys Thr Glu Tyr Gly Gly Ser Met Gln Thr Leu Trp Asp Glu
245 250 255
Ile Met Asp Ile Asn Lys Arg Lys Gly Gly Ser Lys Asn Val Ile Lys
260 265 270
Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr Gly Gly Gly Gln Ala Gly
275 280 285
Asn Thr Gly Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val Gly Asp Gln Ala Gly
290 295 300
Ser Thr Gly Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly Ala Ser Gln Pro Gly
305 310 315 320
Ser Ser Glu Pro
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca ccatc 55
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
tgctcgagtg agatctcaag cttgtcgact ag 32
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>5
Met Gln Thr Leu Trp Asp Glu Ile Met Asp Ile Asn Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210>6
<211>27
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>6
Leu Asn Asn Asn Ile Leu Gly Trp Glu Phe Gly Gly Gly Ala Pro Gln
1 5 10 15
Asn Gly Ala Ala Glu Asp Lys Lys Thr Glu Tyr
20 25
<210>7
<211>22
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>7
Ser Val Thr Glu Glu Ile Ala Glu Glu Asp Lys Ser Val Thr Glu Glu
1 5 10 15
Ile Ala Glu Glu Asp Lys
20
<210>8
<21l>12
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>8
Asn Ile Ile Ser Cys Asn Lys Asn Asp Lys Asn Gln
1 5 10
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>9
Val Thr His Glu Ser Tyr Gln Glu Leu Val Lys Lys Leu Glu Ala Leu
1 5 10 15
Glu Asp Ala Val
20
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>10
Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Ile
1 5 10
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>11
Ser Pro Ser Ser Thr Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Thr Lys Ser Ser
1 5 10 15
Ser
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>12
Leu Val Ser Glu Glu Ile Val Thr Glu Glu Gly Ser Val Ala Gln Glu
1 5 10 15
<210>13
<211>57
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>13
Asp Met Asn Asn Arg Lys Thr Met Leu Asn Glu Ile Glu Lys Gly Ile
1 5 10 15
Lys Asp Glu Thr Phe Ser Arg Glu Asn Gly Leu Asp Val Cys Lys Ser
20 25 30
Gln Cys Glu Glu Arg Ser Arg Asp Asp Thr Glu Asp Gln Phe Leu Arg
35 40 45
Phe Phe Ala Glu Trp Glu Glu Glu Phe
50 55
<210>14
<211>57
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(plasmodium falciparum)
<400>14
Lys Asn Val Ile Lys Cys Thr Gly Glu Ser Gln Thr Gly Asn Thr Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Gly Gly Gly Gln Ala Gly Asn Thr Val
20 25 30
Gly Asp Gln Ala Gly Ser Thr Gly Gly Ser Pro Gln Gly Ser Thr Gly
35 40 45
Ala Ser Gln Pro Gly Ser Ser Glu Pro
50 55
Claims (10)
1.一种多核苷酸，它具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
2.一种多肽，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的多核苷酸的载体。
4.含有权利要求3所述的载体的大肠埃希氏菌Escherichia coli。
5.如权利要求4所述的大肠埃希氏菌Escherichia coli，其是于2009年12月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的，保藏号为CGMCC3519的大肠埃希氏菌Escherichia coli。
6.一种疫苗，其特征在于它含有权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽。
7.如权利要求1所述的多核苷酸或如权利要求2所述的多肽在制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。
8.对权利要求1所述的碱基序列或对权利要求2所述的多肽特异的特异的抗体。
9.如权利要求8所述的抗体在制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。
10.一种检测恶性疟原虫感染的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有如权利要求8所述的抗体。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |