CN101298615A

CN101298615A - 一种新的抗恶性疟原虫表位以及含有它的疫苗

Info

Publication number: CN101298615A
Application number: CNA2004100809826A
Authority: CN
Inventors: 王恒; 蔡启良
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2004-10-26
Filing date: 2004-10-26
Publication date: 2008-11-05
Anticipated expiration: 2024-10-26
Also published as: CN101298615B

Abstract

本发明涉及生物医学高技术中的基因的开发与应用领域。具体而言，本发明涉及一种能被恶性疟疾患者血清识别的具有多个表位的人工抗原的氨基酸序列以及编码所述的氨基酸序列的多核苷酸序列。本发明还涉及含有所述的氨基酸序列或所述的多核苷酸序列的疫苗。本发明进一步涉及所述的人工抗原在用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫抑制剂中的应用。

Description

一种新的抗恶性疟原虫表位以及含有它的疫苗

技术领域

背景技术

疟疾是当今世界上最致命的流行病之一。全世界有近40亿人生活在疟疾流行区，每年大约有3-5亿新的感染者出现，并且造成每年约2-4百万人死亡。在感染人类的4种疟原虫中，恶性疟原虫是造成上述死亡的元凶，因此对恶性疟疾的防治无论对流行区人口健康还是对该地区经济发展都具有重大意义。

疟原虫的生活史可简单归纳为：在人体内进行无性增殖、早期有性增殖和在蚊体内的有性增殖与孢子增殖。从雌性按蚊(Anopheles sp.)叮咬入血，到在肝细胞内发育成熟，大量裂殖子(merozoite)从破裂的肝细胞内逸出，进入血流，这时期称红前期(exoerythrocyticstage)。从血流中裂殖子侵入红细胞在其内发育增殖，到下一代疟原虫经无性繁殖反复感染红细胞，称为红(细胞)内期(erythrocyticstage)。部分进入红细胞的裂殖子在红细胞内不再进行无性分裂，而逐渐发育成为雌或雄配子体。如被雌性按蚊吸入胃内，则在蚊体内进行有性增殖，发育成熟为子孢子逸出，统称为蚊期。

疟原虫在上述不同生活周期表达多种不同的抗原蛋白。尽管研究证实减毒子孢子能够引导产生免疫保护，由于疟原虫需通过宿主体内繁殖，因此没有利用天然虫体制备疫苗的条件。对已经筛选出的疟原虫抗原蛋白的研究已证实，它们的抗原性在宿主免疫系统的压力下会不断产生变异，因此目前没有任何一种抗原的单独使用能够达到预期的保护效果。

疟疾的临床症状只发生在红内期，可引起周期性寒战高热，贫血，脾肿大，昏迷以致死亡。因此，针对红内期研制的抗疟疫苗被认为是最有效的预防途径。恶性疟原虫生活周期的复杂性，以及恶性疟原虫抗原的高度多态性，使人们把研究重点放在对保守性多表位疫苗的研制上。因此，目前明显需要一种具有高免疫原性、抗原识别多样性、同时具有高抑制率的疫苗。

发明内容

根据上述需要，本发明人构建出一种人工重组的核酸分子ES312，包含编码SEQID No：2所示的323个氨基酸残基的全长多肽。

因此，本发明涉及一种具有SEQID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸。

本发明还涉及具有由SEQID NO：1所示的碱基序列编码的如SEQID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明进一步涉及含有所述的多核苷酸的载体。

本发明进一步涉及含有所述的载体的大肠杆菌。其是于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229的大肠杆菌。

本发明进一步涉及它含有所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽的疫苗。

本发明进一步涉及对所述的碱基序列特异的抗体。

本发明进一步涉及对所述的多肽特异的抗体。

本发明进一步涉及所述的多核苷酸用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。

本发明进一步涉及所述的多核苷酸免疫机体产生的抗体用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。

本发明进一步涉及所述的多肽用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。

本发明进一步涉及所述的多肽免疫机体产生的抗体用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。

根据本发明提供的含有抗恶性疟原虫的多表位人工抗原的ES312疫苗与现有技术的抗恶性疟原虫疫苗相比具有高免疫原性、抗原识别多样性。另外，由所述的SEQ ID NO：1所示的碱基序列的多核苷酸和所述的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽所产生抗体对恶性疟原虫的体外生长具有很高的抑制效率。

保藏信息

本发明所用的重组工程菌株已于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229和CGMCC1230。

附图说明

图1示出抗恶性疟原虫多表位人工抗原ES312疫苗的基因核苷酸序列的975个碱基(即SEQ ID NO：1)及其编码蛋白的323个氨基酸序列(即SEQ ID NO：2)。

图2多表位人工抗原ES312的结构组成分析。A：多表位蛋白ES312的不同种类表位的串联方式；B：多表位蛋白ES312的氨基酸序列的二级结构预测。

图3多表位蛋白ES312对20种恶性疟病人血清的识别。A：原核表达蛋白ES312的纯化(1，镍柱亲合纯化前的His融合蛋白；2，纯化后的His融合蛋白；3，肠肽酶切割His融合蛋白；4，镍柱亲合纯化的蛋白ES312)；B：蛋白ES312能有效地识别疟疾病人血清的酶联免疫吸附实验ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)实验结果，其中系列1：蛋白ES312与病人血清识别的光吸收值；系列2：蛋白ES312与正常人血清识别的光吸收值。

图4兔抗ES312蛋白的IgG抗体对多种恶性疟原虫天然蛋白的识别。A：与天然虫体蛋白的免疫共沉淀(Preimmune表示免疫前兔IgG抗体，Anti-ES312D表示免疫后IgG抗体)；B：免疫透射电镜(RBC表示红细胞，Tr表示滋养体，小黑点表示Anti-ES312D的IgG抗体与天然蛋白结合位点)。

具体实施方式

本发明是在由相同申请人于2003年8月1日申请的申请号为PCT/CN03-00620中披露的方法，利用选用恶性疟原虫不同生活时期的抗原CPE，MSA-2，RESA，EBA-175，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1，AMA-1和MAg-1的14个表位，以人类密码子的偏爱性进行设计表位相应的基因序列ES312，从不同生活时期的恶性疟原虫保护性抗原中选出9种表位，它们是：MSA-2，RESA，EBA-175，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1，AMA-1，CPE和MAg-1，通过人工合成抗原蛋白ES312的相应基因，合成筛选出SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。另外，本发明SEQID NO：1所示的核苷酸序列还可以通过本领域任何常规的方法产生，所产生的本发明序列都包含在本发明的范围之内。

用本发明SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码具有323个氨基酸序列的蛋白质，如SEQ ID NO：2所示，其相对分子量约为65kDa。编码ES312蛋白的表位类型分析，发现在ES312蛋白的上游存在多个连续两个的B细胞表位与Th细胞表位连接的组装方式(图2A)。其氨基酸序列二级结构预测，亦发现序列上游存在有连续数个的转角-螺旋结构(即Coil-Helix，CH)，如图2B所示。真核表达载体质粒VR1012连接后(VR1012为vical公司的真核表达载体)，感受态转化大肠杆菌SKS383菌株，在终浓度为25μg/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得含重组质粒工程菌ES312-VR1012/SK383。该重组工程菌株已于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏保藏，保藏号为CGMCC1229和CGMCC1230。但上述方法产生的如SEQ ID NO：2的氨基酸序列并非限制本发明的目的，本领域技术人员可以理解的是，任何方法形成的SEQ ID NO：2的氨基酸序列应该在本发明的保护范围之内。

根据本发明人发明的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，可以使用任何合适的方法制备疫苗，例如，通过免疫动物的方式获得单克隆或多克隆抗体。

例如，可以通过以下的方法制备疫苗。

1.多克隆抗体的制备

(1)抗原

目前所知的载脂蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。载脂蛋白因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。抗原应该是纯化品，该纯品在12.5％的PAG电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。

(2)免疫

动物的选择：通常选择壮年、成熟且健壮的豚鼠、鸡、兔、山羊、绵羊、马等动物，优选大白兔。作为批量生产，以采用山羊或绵羊，若需量再多，可考虑用马作为免疫动物。因动物个体差异的关系，即使是用一种抗原去免疫多个白兔，所得抗血清特异性会有很大的差别。因此，为了得到比较一致的抗血清，常用能产生大量抗血清的羊或马为免疫动物。

佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund’adguvant)，具有明显的免疫剌激作用。福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯(arlacela)为乳剂。油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。在不完全佐剂内加入杀死的分枝杆菌(如结核杆菌或卡介苗)制备成完全佐剂。分枝杆菌能增加局部淋巴结的炎症反应，扩大免疫原性，从而促进最终高亲和力抗体的形成。佐剂有成品购买，也可自行制备。佐剂制备方法是，取石蜡油6份、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原缓冲液(含0.1％SDS)，混匀，灭菌，分装于小玻璃瓶中，0～8℃保存，此为不完全佐剂。在不完全佐剂中加入卡介苗(3～5mg/0.5ml)即为完全佐剂，均贮存于0～8℃。临用时，取完全佐剂3份加入含抗原的缓冲液1份，混匀，振摇或研磨，使其成为乳化状态，因为含SDS很易促使其乳化成油包水抗原乳化复合物，注射入动物体内时一定要保持乳化状态。抗原用量视抗原分子量不同及免疫原性及免疫动物不同而有一定差异，无统一标准和固定模式。一般是每兔(约2kg重)或每羊(约20kg重)第1次注射抗原1mg，以后逐次增加抗原量，最多每次不超过3mg。

免疫途径及方法：免疫部位可分别选用皮内、皮下或淋巴结。第1次免疫采用皮内结合皮下多点注射，常注射在背部或腿部。许多作者介绍在后足蹠皮下或皮内注射，因为四足落地的关系很易造成感染，使第1次免疫失效，并使动物行走不便，造成伤害。整个免疫过程以2～3个月为宜。一般是第1次免疫后的3～4周再进行第2次免疫，不完全佐剂为乳化剂。2周后加强1次(不完全佐剂)，2周后又加强1次(不完全佐剂或完全佐剂)，1周后再免疫1次。待最后一次免疫后的7～10天，取静脉血测试抗体效价(试血)，效价达到要求后即可一次性放血，采用颈动脉放血，得抗血清。笔者采用此法先后免疫成功ApoA I、A II、B100和E的抗血清。

(3)抗血清的保存

免疫成功的动物放血过程，所有用具均严格消毒，并按无菌操作方式进行放血。抗血清的防腐剂以0.05％叠氮钠为宜；也可采用加入20％～30％无菌甘油保存的方法。若时间较长，不用可采用-20℃低温保存。一般在0～8℃保存1年，抗体效价几乎无改变，保存2年，其效价稍有降低。抗体切忌反复冻融，否则抗体效价很快降低，以颈动脉一次性放血为宜。

2.单克降抗体的制备

单克隆抗体是一种高度特异性的抗体。单克隆抗体与多克隆抗体有一定的差别。抗体含量比较，单克隆抗体浓度高，腹水中可达0.5～10mg/ml，而多克隆仅0.1～1.0mg/ml；结合特性，单克隆抗体仅与单个抗原决定簇结合，特异性和亲和力高，多克隆抗体可与所有抗原决定簇结合，特异性和亲和力比较差；含免疫球蛋白类型，单克隆抗体仅一种亚类，多克隆抗体为所有种类和亚类。单克隆抗体在腹水中含量较高，可以人工培养，专一性强等特性是多克隆抗体无法比拟的优点。

(1)单克隆抗体产生机理

单克隆抗体制备过程中需要两种细胞和即骨髓瘤细胞和脾细胞。骨髓瘤细胞是一种恶变细胞，在体外有无限的增殖能力，并能分泌很多化学结构均一的免疫球蛋白，但特异性很差，当它与不同性质的动物脾细胞融合时，可形成杂交瘤细胞株。该细胞株在HAT培养基(内含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)中生长良好，而骨髓瘤细胞则在HAT培养基中不能生长。因为①缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，不能利用次黄嘌呤合成嘌呤；②氨基喋呤可阻止细胞内嘌噙和胸腺嘧啶的合成。经免疫的动力脾细胞，不能在体外增殖，但是能产生相应的特异抗体，可以与骨髓瘤细胞融合，并形成可分泌单克隆抗体的细胞株。

操作过程，一般是先把骨髓瘤细胞和经免疫的脾细胞置在聚乙二醇(PEG)中进行融合，然后在HAT培养液中选择培养，由此得到杂交瘤细胞，采用有限稀释法，即能把产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株筛选出来。该细胞再经人工培养，或注射到小鼠体内等亚克隆方法，即可得到单克隆抗体。

在实验中所证明的，本发明的全长ES312蛋白能被恶性疟疾患者血清识别(P＜0.01)，也能被间日疟患者血清识别。此外，本发明蛋白在免疫动物后获得的多克隆抗血清也能够有效识别多个天然虫体蛋白，并可在体外有效地抑制恶性疟原虫的生长。因此，本发明还涉及ES312基因或其ES312蛋白在制备用于预防和治疗疟疾的免疫制剂中的应用。

实施例1：抗恶性疟原虫多表位人工抗原蛋白ES312的基因合成与序列分析

1、多表位人工抗原基因ES312的合成及其真核表达工程菌的构建选用恶性疟原虫不同生活时期的抗原CPE，MSA-2，RESA，EBA-175，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1，AMA-1和MAg-1的14个表位，以人类密码子的偏爱性进行设计表位相应的基因序列ES312，设计基因序列图送至生物公司(上海生工)合成后(如图1 SEQ ID NO：1所示)，经Bcl I和BamHI限制性内切酶双酶切后，与真核表达载体质粒VR1012连接后(VR1012为vical公司的真核表达载体)，感受态转化大肠杆菌SKS383菌株，在终浓度为25μg/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得含重组质粒工程菌ES312-VR1012/SK383。该重组工程菌株已于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1230。

2、多表位人工抗原基因ES312的序列分析

针对ES312基因的基因序列进行分析，其具有975个碱基，其编码的蛋白质含323个氨基酸(SEQ ID NO：2)，其相对分子量约为65kDa。编码ES312蛋白的表位类型分析，发现在ES312蛋白的上游存在多个连续两个的B细胞表位与Th细胞表位连接的组装方式(图2A)。其氨基酸序列二级结构预测，亦发现序列上游存在有连续数个的转角-螺旋结构(即Coil-Helix，CH)，如图2B所示。

实施例2：多表位人工抗原ES312蛋白与病人血清的识别实验1、ES312-DS/BL21基因工程菌的构建与其编码蛋白的表达纯化

将重组质粒VR1012-ES312的ES312基因片段经NcoI和Bgl II酶切后，连接到大肠杆菌表达载体pDS-ex(即由以下引物进行改造pET-30a载体获得，N端与含有His位点序列融合：p30aF1：5’-CGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGA-3’，p30aR1：3’TCGGGTCTGGACATGCTGCTGCTGCTGTTCCGGTACCG5’，p30aF2：5’CAAGGCCATGGCGGTACCCGGATCCGAATTCGAGCTC3’，p30aR2：3’CTTAAGCTCGAGTGATCAGCTGTTCGAACTCTAGAGTGAGCTCGTGGT5’)，感受态转化大肠杆菌BL21株，在终浓度为25μg/ml卡那霉素抗性的培养基筛选后，获得含重组质粒ES312-DS的原核表达工程菌ES312-DS/BL21。该重组工程菌株已于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229。该重组工程菌株经37℃ IPTG诱导3小时，得到ES312的融合重组蛋白(与His蛋白融合)，经特异吸附的镍柱亲和纯化融合蛋白后，再由肠肽酶溶液过柱切割，最终获得纯化的ES312蛋白(图3A)。

具体步骤如下：

1)重组蛋白样品准备：

a)在5ml LB培养基中接种含有表达目的蛋白的大肠杆菌工程菌，37℃活化过夜。

b)1/100接种量转接到新鲜LB 37℃培养到接近对数生长期，加终浓度为1mM IPTG诱导3小时。

c)收集菌液4℃，5000rpm×5min。

d)预冷的1×PBS重悬菌液，4℃，5000rpm×5min，去上清。

e)加一定体积的预冷的1×PBS重悬菌液(每ml培养物加入50μl预冷的1×PBS)。

f)冰上进行超声波(电压300V，10秒，间隔15秒，50次)。

g)4℃，5000rpm×10min，上清转入一新50ml离心管，重复一次。

h)0.45μm滤膜注射器过滤，上清可放-20℃保存备用。

2)过柱前试剂准备：

储存液(Stock Solution)A(10×)

200mM NaH₂PO₄，5M NaCl.

(13.8g NaH₂PO₄，146.5g NaCl在500ml去离子水)

储存液(Stock Solution)B(10×)

200mM Na₂HPO₄，5M NaCl.

(14.2g NaH₂PO₄，146.5g NaCl在500ml去离子水)

Native结合缓冲液(50ml)

2.9ml stock sol A(1×)；47.1ml stock sol B(1×)

调pH7.2-7.6 Sol A(1×)↑，Sol B(1×)↓

Native冲洗缓冲液(50ml)

37ml stock sol A(1×)；13ml stock sol B(1×)

调pH6.0 Sol A(1×)↑，Sol B(1×)↓

Native冲洗缓冲液(50ml)

43.5ml stock sol A(1×)；6.5ml stock sol B(1×)

调pH5.5 Sol A(1×)↑，Sol B(1×)↓

Native pH洗脱缓冲液(50ml)

50ml stock sol A(1×)

调pH74.0 Sol A(1×)↑，H₃PO₄↓

回收柱床的处理：自来水冲洗柱子，再蒸馏水洗净，无水乙醇冲洗不挂壁，双蒸水洗净(一定去除乙醇干净)，晾干。

3)样品过柱纯化步骤

a)0.5-1ml重悬树脂装柱，垂直放置柱体静置5-10分钟；

b)7ml无菌去离子水过柱，轻柔避免气泡，垂直放置柱体静置5-10分钟，放水，重复洗涤一次；

c)7ml Native结合缓冲液洗涤柱子3次，并平衡柱子；

d)加样5ml细菌裂解液上柱；

e)上下轻柔混匀Resin 10分钟，打开柱子阀门放掉液体；

f)再加5ml细菌裂解液上柱，10分钟吸附，打开柱子阀门放掉液体；

g)加4ml native结合缓冲液轻柔混匀Resin 2分钟，打开柱子阀门放掉液体，重复一次。

h)加4ml native冲洗缓冲液(pH6.0)轻柔混匀Resin 2分钟，打开柱子阀门放掉液体，重复3次。

i)加4ml native冲洗缓冲液(Ph5.5)轻柔混匀Resin 2分钟，打开柱子阀门放掉液体，重复1次。

j)加5ml native pH洗脱缓冲液洗脱，1ml分一管，待SDS-PAGE或浓度检测。

4)肠肽酶(Enterkinase)切割His融合蛋白：

按此酶的最适反应体系调整不同融合蛋白与肠肽酶的量，和改变25℃的不同作用时间。

2、酶联免疫吸附实验ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)检测ES312蛋白与病人血清的识别实验

1)包被：根据所应用的抗原，用pH9.6的0.1M碳酸盐包被缓冲液稀释至所需的蛋白质浓度(200ng/100ul/孔)用加样器每孔加入100ul，然后将平板置湿盒中，4℃过夜，或37℃4h，将平板小孔中液体倾尽，用PBST洗板5次。

2)封闭：每孔200ul 1％BSA，37℃ 1h。

3)用PBST洗板5次。

4)加入一抗即病人和正常人血清：将待检血清用PBS溶液作以1∶200稀释，每孔100ul稀释血清，4℃过夜

5)PBST洗板5次。

6)加入辣根过氧化物酶标记抗体即羊抗兔IgG-HRP：每孔中加入100ul经PBST稀释过的(1∶1000)酶标抗体，置湿盒中37℃温育2h。

7)PBST洗板5次。

8)显色。每孔加入底物显色缓冲液100ul，放入湿盒中，摇动，37℃温育10min。

9)利用Labsystems GenesisV3.03系统(Wellsacn MK3，Labsystems Dragon，USA)，读取450nm吸光度值。

10)利用生物统计学工具分析实验结果，确定病人和正常人血清对重组蛋白的识别程度。

(底物用显色缓冲液(pH5.0)

A液：柠檬酸(无水)1.92g加DDW到100ml。

B液：Na₂HPO₄(含12个结晶水)7.16g加DDW到100ml。

将A液2.43ml，B液2.57ml及水5ml混合即成pH5.0的磷酸一柠檬酸缓冲液10ml。

显色反应前新鲜配制：

30％过氧化氢 0.015ml

TMB 0.004g

加入到10ml磷酸-柠檬酸缓冲液中，既可用于显色反应。)

(双样本方差分析结果表明：病人和正常人血清对ES312蛋白的识别差异极其显著，如图3B)

实施例3：多表位人工抗原ES312蛋白的多克隆抗血清对合成肽和天然虫体蛋白的识别

1.鼠抗血清的制备

用实施例1中所得的重组质粒ES312-VR1012进行大提质粒DNA(详细方法见Promega公司质粒大提试剂盒)。以生理盐水将重组质粒稀释成浓度为100μg/100μl的溶液进行肌肉注射的方法免疫Balb/c小鼠，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。

用实施例2中所得的表达蛋白ES312结合弗氏佐剂(Gibco公司)皮下免疫Balb/c小鼠，以磷酸盐缓冲液稀释，每次50μg/100μl的剂量进行免疫，第一次为完全弗氏佐剂，接下来为不完全弗氏佐剂，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。

2.兔抗血清的制备及其IgG抗体纯化

用实施例1中所得的重组质粒VR1012-ES312免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清。以生理盐水将重组质粒稀释成浓度为500μg/2ml的溶液进行肌肉注射的方法免疫大白兔，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。

用实施例2中所得的表达蛋白ES312结合弗氏佐剂(Gibco公司)皮下免疫大白兔，以磷酸盐缓冲液稀释，每次100μg/1ml的剂量进行免疫，第一次为完全弗氏佐剂，接下来为不完全弗氏佐剂，每两周加强一次，共加强2次。取血并收集免疫后多克隆抗血清。兔抗血清IgG用蛋白A亲合层析纯化(实验步骤详见pierce公司ImmunoPureImmobilized Protein A试剂盒产品说明)。

3.酶联免疫吸附实验ELISA检测多克隆抗血清与不同表位合成肽的识别

具体实验步骤同实施例2，其中包被抗原改为200ng/100ul/孔的合成肽。一抗分别为DNA免疫(或蛋白免疫)的鼠抗血清或兔抗血清，所得的抗体滴度为OD值大于3倍SD+对照OD值相应的抗体稀释度。结果发现，无论是DNA免疫，还是蛋白免疫的鼠抗血清或兔抗血清，对包括的11个表位合成肽均有较高的识别滴度，但同时我们亦发现，对于不包括的表位E8、E12和E13同样也存在较高的识别滴度(如表1)。

表1

注意事项：^*在多表位抗原中没有表位。E1，E2至E14表位分别来自Plasmodium falciparum的抗原NKND，MSA-2，RESA，EBA-175，MSA-1，LSA-1，CST3/CSP，MSP-1，MSP-1，AMA-1，AMA-1AMA-1，MSP-1和MAg-1。

4.免疫共沉淀检测ES312蛋白的特异兔抗IgG抗体对天然虫体蛋白的识别

恶性疟原虫天然蛋白的提取：

1)10％恶性疟感染红细胞，用PBS洗涤后2％皂素处理，1800rpm离心。

2)沉淀中加入100μl NETT(150mMNaCl，5mMEDTA，1％TritonX-100，50mMTris-HCl)和10μl protease inhibitorcocktail。

3)用25G针头重悬沉淀并反复抽吸20次，直至沉淀溶解。

4)12000g，4℃离心7分钟。

5)上清转入一个新管中，-20℃贮存备用.

免疫共沉淀实验步骤：

1)用稀释缓冲液调节每管抗原的体积至1ml，加入50μl的蛋白A悬液，4℃缓慢滚动1-3小时；

2)12,000g离心20秒，转移上清至一新管；

3)在上清中加入鼠抗血清(1μg/μl)1μl，4℃缓慢滚动1小时；

4)在以上混合物中加入蛋白A 50μl，4℃缓慢滚动过夜；

5)12,000g离心20秒，轻轻移走上清，收集蛋白A；

6)加入1ml洗液1，重悬蛋白珠，4℃缓慢滚动20分钟；

7)重复上述三步一次；

8)如前收集蛋白珠，加入1ml洗液2，重悬蛋白珠，4℃缓慢滚动20分钟；

9)重复上述操作一次；

10)加入1ml洗液3，重悬蛋白珠，4℃缓慢滚动20分钟；

11)收集蛋白珠，尽量移走痕迹量的洗液；

12)加入25-75μl的上样缓冲液；100℃变性3分钟，

13)12,000g离心20秒，转移上清至一新管；

14)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(结果如图4A所示)。

5.免疫透射电镜检测ES312蛋白的特异兔抗IgG抗体对天然虫体蛋白的识别

试剂准备：

1％多聚甲醛，0.2％戊二醛的PBS固定液

[0.2M PBS(NaH₂PO₄.H₂O 2.6g，Na2HPO₄.12H₂O 29g 500ml去离子水，pH7.4)；1g多聚甲醛溶于50ml双蒸水中，60℃水浴，加入0.1N NaOH直至溶液澄清；0.8ml 25％戊二醛]

封闭液[1×PBS中含1％白蛋白和0.01％Tween-20]

注：应越干净越好(超纯水抽滤级)。

样品的固定：

较高疟原虫感染率(＞8％)，多为大滋养体，2000rpm×10min离心，1×PBS洗几遍，最后一次去上清，加1ml固定液室温30分钟，送去切片。

实验步骤：

1)切好的片子用封闭液室温孵育30分钟；

2)加一抗室温孵育2小时(用封闭液稀释不同浓度)；

3)用PBS洗5次(每次5分钟)；

4)加金颗粒标记的二抗，室温孵育1小时(用封闭液稀释)；

5)PBS洗5次(每次5分钟)；

6)送电镜下观察。

(结果如图4B所示)。

实施例4多表位人工抗原疫苗效果的验证

1、抗ES312抗原的兔多克隆抗体IgG的分离纯化

溶液配制

【饱和硫酸铵，(SAS)】

在900ml水中加入1.21gTris碱，调校pH7.0，并定容终体积至11L，配制成0.01MTris·Cl溶液。称量767g(NH₄)₂SO₄，通过搅拌和稍微加热将其溶于1L 0.01MTris·Cl中，调校至pH7.0，并于4℃贮存。在4℃贮存时应可见瓶底出现(NH₄)₂SO₄晶体。

【33％SAS溶液】

33mlSAS加67mlPBS，pH7.0

【0.1MPB】

A液：3.02g NaH₂PO₄·2H₂O溶于去离子水中配制成0.2M NaH₂PO₄溶液。

B液：35.85g Na₂HPO₄·12H₂O溶于500ml去离子水中。

取A液92ml，B液305ml添加去离子水配制成400ml 0.1MpH7.3的PB贮存液。

【0.01MPB】

将0.1MPB稀释10倍既成0.01MPB，pH7.3

【0.05MPB】

将0.1MPB稀释2倍既成0.01MPB，pH7.3

用硫酸铵沉淀IgG：

a)1份血清+1份生理盐水+1份饱和硫酸铵，4℃搅拌过夜，以形成沉淀；

b)5000rpm离心10分钟，用33％SAS溶液洗两遍；

c)用0.01M的PB补足原体积后，装入透析袋(MWCO 12000)，4℃PB中透析2-3天，每天换3-4次透析液；

d)离心10000rpm 10分钟，留取上清备用。

用镍柱亲合层析纯化兔血清的IgG：

材料：预热蛋白A，柱子，缓冲液至室温。

准备样品

(抗血清，腹水，组织培养上清。必须用结合缓冲液1∶1稀释，以保证结合时离子强度和pH值)。

a)打开蛋白A柱子(注意，去顶盖时避免应气泡)，灌入贮存液。

b)平衡蛋白A柱子

(用5倍体积的结合缓冲液或合适的缓冲液，如10mM Tris.pH7.5)

c)加2ml稀释抗血清样品每毫升胶(gel)至柱子，并让液体流入gel至液面与top disc相平为止。

d)用10-15倍柱体积的结合缓冲液洗涤柱子。收集1或2ml洗涤液，检测未结合部分的OD280值。

e)用3-5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱。

(ImmunoPure洗脱缓冲液或0.1M氨基乙酸缓冲液pH2-3x洗脱结合蛋白可用OD280检测洗脱结果。)

注意：应立即用合适的高浓度缓冲液，如1.0M Tris.pH7.5.调蛋白洗脱液的物理pH值(1ml样品加100ul缓冲液)。

f)洗脱免疫球蛋白部分可去盐或浓缩。

g)再生柱子

用6倍柱体积洗脱缓冲液或0.1M柠檬酸pH3.0(用NaOH调)。

2、对恶性疟原虫的体外抑制

1)以两次山梨醇同步化的恶性疟原虫3D7(保藏号MRA-102)和Dd2虫株(保藏号MRA-150)(本实验室保存的来自美国ATCC(theAmerican Type Culture Collection)的标准菌株)环状体期细胞作为实验细胞；

2)用正常人血细胞和1640培养液配制10％悬液，分装于96孔板内，0.1ml/孔(每孔血细胞含量最终为5％，Thiazole Orange染色流式细胞仪检测起始感染率为3％)；

3)分别加入含不同浓度纯化兔抗IgG抗体：包括抗ES312基因免疫-IgG；抗ES312蛋白免疫-IgG；抗ES312基因免疫免疫前-IgG；

抗ES312蛋白免疫免疫前-IgG；空白PBS对照。(终浓度为50μ1/ml，100μl/ml，200μl/ml等)，每个浓度3个复孔，每孔100μl；

4)过滤无菌纯化兔抗IgG抗体；

5)37℃正常蜡烛缸中培养48小时后，流式细胞仪计数10⁴个细胞。

生长抑制率按下列公式计算：生长抑制率＝(对照IgG组感染率-待测IgG组感染率)/(对照IgG组感染率-起始背景感染率)×100％。数据由SPSS软件计算平均值及标准差，并进行统计学分析。

经数次实验重复结果显示了，抗ES312基因免疫或蛋白免疫的IgG在200μl/ml终浓度时对恶性疟原虫3D7或Dd2虫株的生长抑制率可达90％以上(表2)。

表2

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>一种新的抗恶性疟原虫表位以及含有它的疫苗

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>975

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

atggaattcg gatcaaacaa gaacgacaac aagaacgacg gatcaggcaa cgccgagaag 60

tacgacaaga tggacgagcc gcagcactac ggcaagagcg gatcagagca gcagagcgac 120

ctggagcagg agcgcctggc caaggagaag ctgcagggcc ccggccccgg atcaggcaac 180

gccgagaagt acgacaagat ggacgagccg cagcactacg gcaagagcgg atcaaagaac 240

gagagcaagt acagcaacac cttcatcaac aacgcctaca acatgagcat ccgccgcagc 300

atgggccccg gccccggatc acagaccgac gagatcaaga acgaccacat ccagaccgat 360

gaaattaaaa atgataatat tggatcagag gagaacgtgg agcacgacgc cggatcagag 420

cgcgaggacg agcgcaccct gaccaaggag tacgaggaca tcgtgctgaa gggccccggc 480

cccggatcag acggcaactg cgaggacatc ccgcacgtga acgagttcag cgccatcgac 540

ctgggatcaa agaagatcgc caagatggag aaggccagca gcgtgttcaa cgtgggcccc 600

ggccccggat caggcaacgc cgagaagtac gacaagatgg acgagccgca gcactacggc 660

aagagcggat cacagaccga cgagatcaag aacgaccaca tccagaccga tgaaattaaa 720

aatgataata ttgaggacag cggcagcaac ggcaagaaga tcacctgcga gtgcaccaag 780

ccggacagcg gatcaaacaa gaacgacaac aagaacgacg gatcagacgg caactgcgag 840

gacatcccgc acgtgaacga gttcagcgcc atcgacctgg gatcactgga caacatcaag 900

gacaacgtgg gcaagatgga ggactacatc aagaagaaca agaagggccc cggccccgga 960

tccgctagct aataa 975

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Glu Phe Gly Ser Asn Lys Asn Asp Asn Lys Asn Asp Gly Ser Gly

1 5 10 15

Asn Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys

20 25 30

Ser Gly Ser Glu Gln Gln Ser Asp Leu Glu Gln Glu Arg Leu Ala Lys

35 40 45

Glu Lys Leu Gln Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Asn Ala Glu Lys Tyr

50 55 60

Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser Lys Asn

65 70 75 80

Glu Ser Lys Tyr Ser Asn Thr Phe Ile Asn Asn Ala Tyr Asn Met Ser

85 90 95

Ile Arg Arg Ser Met Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gln Thr Asp Glu Ile

100 105 110

Lys Asn Asp His Ile Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Ile Gly

115 120 125

Ser Glu Glu Asn Val Glu His Asp Ala Gly Ser Glu Arg Glu Asp Glu

130 135 140

Arg Thr Leu Thr Lys Glu Tyr Glu Asp Ile Val Leu Lys Gly Pro Gly

145 150 155 160

Pro Gly Ser Asp Gly Asn Cys Glu Asp Ile Pro His Val Asn Glu Phe

165 170 175

Ser Ala Ile Asp Leu Gly Ser Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala

180 185 190

Ser Ser Val Phe Asn Val Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Asn Ala Glu

195 200 205

Lys Tyr Asp Lys Met Asp Glu Pro Gln His Tyr Gly Lys Ser Gly Ser

210 215 220

Gln Thr Asp Glu Ile Lys Asn Asp His Ile Gln Thr Asp Glu Ile Lys

225 230 235 240

Asn Asp Asn Ile Glu Asp Ser Gly Ser Asn Gly Lys Lys Ile Thr Cys

245 250 255

Glu Cys Thr Lys Pro Asp Ser Gly Ser Asn Lys Asn Asp Asn Lys Asn

260 265 270

Asp Gly Ser Asp Gly Asn Cys Glu Asp Ile Pro His Val Asn Glu Phe

275 280 285

Ser Ala Ile Asp Leu Gly Ser Leu Asp Asn Ile Lys Asp Asn Val Gly

290 295 300

Lys Met Glu Asp Tyr Ile Lys Lys Asn Lys Lys Gly Pro Gly Pro Gly

305 310 315 320

Ser Ala Ser

Claims

1、一种多核苷酸，它具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

2、一种多肽，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3、含有权利要求1所述的多核苷酸的载体。

4、含有权利要求3所述的载体的大肠杆菌。

5、如权利要求4所述的大肠杆菌，其是于2004年10月9日在中国科学院微生物保藏中心保藏，保藏号为CGMCC1229的大肠杆菌。

6、一种疫苗，其特征在于它含有权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的多肽。

7、对权利要求1所述的碱基序列特异的抗体。

8、对权利要求2所述的多肽特异的抗体。

9、如权利要求1所述的多核苷酸用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。

10、如权利要求1所述的多核苷酸免疫机体产生的抗体用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。

11、如权利要求2所述的多肽用于制备抗恶性疟原虫感染的疫苗中的用途。

12、如权利要求2所述的多肽免疫机体产生的抗体用于制备抗恶性疟原虫感染的免疫制剂中的用途。