DK167817B1 - Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria - Google Patents
Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria Download PDFInfo
- Publication number
- DK167817B1 DK167817B1 DK062386A DK62386A DK167817B1 DK 167817 B1 DK167817 B1 DK 167817B1 DK 062386 A DK062386 A DK 062386A DK 62386 A DK62386 A DK 62386A DK 167817 B1 DK167817 B1 DK 167817B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- asn
- pro
- asp
- arg
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 75
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 71
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 title claims description 8
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 77
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 claims description 32
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 3
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010029660 Intrinsically Disordered Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 claims description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 72
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 101100245267 Caenorhabditis elegans pas-1 gene Proteins 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 12
- 102100031675 DnaJ homolog subfamily C member 5 Human genes 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 102200030043 rs10012 Human genes 0.000 description 4
- 102220006123 rs1042713 Human genes 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- 241000223810 Plasmodium vivax Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102220045637 rs587782266 Human genes 0.000 description 2
- 102220090143 rs758476299 Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 102100031633 Chorionic somatomammotropin hormone-like 1 Human genes 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 101000940558 Homo sapiens Chorionic somatomammotropin hormone-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000667595 Homo sapiens Ribonuclease pancreatic Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000223992 Plasmodium gallinaceum Species 0.000 description 1
- 241000223821 Plasmodium malariae Species 0.000 description 1
- 206010035501 Plasmodium malariae infection Diseases 0.000 description 1
- 241001505293 Plasmodium ovale Species 0.000 description 1
- 206010035502 Plasmodium ovale infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000004799 bromophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011997 immunoflourescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 244000000056 intracellular parasite Species 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000008191 permeabilizing agent Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 102220226324 rs1064794702 Human genes 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
DK 167817 B1
Den foreliggende opfindelse angår et fusionspolypeptid og en vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et præparat mod malaria.
Malaria er en alvorlig, meget udbredt sygdom, som der trods 5 mange års store anstrengelser endnu ikke er udviklet nogen vaccine imod. Se f.eks. Science, bind 226, side 679 (9. november 1984). Pattedyr, herunder mennesker, er forsøgsvis blevet beskyttet mod infektion med maleriafremkalderen, Plasmodium, ved vaccination med bestrålede sporozoiter. Clyde et al., 10 Am. J. Trop. Med. Hyg., bind 24, side 397 (1975) og Rieckman et al., Bull. WHO, bind 57 (tillæg 1), side 261 (1979). Yoshida et al., Science, bind 207, side 71 (1980) angiver, at en sådan beskyttelse i det mindste delvis formidles af antistof rettet mod et protein på sporozoitoverfladen, circumsporozoit(CS)-15 proteinet. Monoklone antistoffet dannet mod CS-proteiner neutraliserer infektionsvirkningen in vitro og beskytter dyr in vivo. CS-proteinet synes at være kraftigt evolutionært bevaret inden for arter, men varierer eivdel fra' art til art.
Man kender fire Plasmodiumarter, der inficerer mennesker.
20 Disse et'P. falciparum, P. vivax, P. ovale og P. malariae.
De to sidstnævnte optræder meget sjældnere. Andre arter af videnskabelig interesse er P. berghei og P. knowlesi. Værterne for disse arter er henholdsvis gnavere og aber. · · CS-proteinet fra P. knowlesi omfatter tolv tandemgentagelser 25 af en sekvens på tolv aminosyrer. Zavala et al., J. Exp. Med., bind 157, side 1947 (1983) anfører, at gentagelsesenheden er det vigtigste immunogen på P. knowlesi-CS-proteinet, hvilket baseres på forsøg, der viser, at monoklone antistoffer mod gentagelsesenheden blokerede anti-sporozoitantiseras adgang 30 til opløseliggjort sporozoitprotein. Gysin et al-, J. Exp.
Med., bind 160, side 935 (1984), anfører, at et syntetisk peptid med 24 led, og som repræsenterer tandemgentagelsesenheder fra P. knowlesi-CS-proteinet, neutraliserede virulente sporozoiters infektionsvirkning i aber.
DK Ί to/οΊ / d I
2
Colman et al., WO 84-2922-A, publiceret 2. august 1984, beskriver kloning af en del af den region, der koder for P. know-lesi-CS-protein-gentagelsesenheden og ekspression af β-lacta-mase- og β-galactosidasefusioner deraf i E. coli. Nussenzweig 5 et al., US 4.466.917 beskriver et sporozoitprotein, der benævnes som P44-proteinet, og dets kloning og ekspression i E. coli.
Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 81, side 7520 (1984) beskriver en analog gentagelsesenhedsstruktur i CS-pro-10 teinet fra P. cynomologi.
Kemp et al., WO. 84-02917-A, beskriver kloning og ekspression af P. falciparum cDNA i E. coli. I fig. 2a-b beskrives syntetiske peptider med sekvensen Glu-Glu-Asn-Val 19 gange.
Dame et al., Science, bind 225, side 593-599 (1984), beskriver kloning 15 og ekspression af CS-proteinet fra P. falciparum i E. coli. Proteinet beskrives som omfattende ca. 412 aminosyrer med en omtrentlig molekylvægt på '44.000. Det indeholder 41 tandemgentagelser af et tetrapeptid, hvoraf de 37 er Asn-Ala-Asn-Pro, og de sidste 4 er Asn-Val-Asp-Pro. Syntetiske peptider med 2, 3 og 4 gentagelser af Asn-Val-Asp-Pro er 20 også beskrevet. Syntetiske peptider med 7, 11 og 15 led, og som er afledt af gentagelsesregionen, bandt til monoklone antistoffer, der er dannet mod CS-proteinet.
Endelig beskrives i Science, bind 225 (1984), side 628-629, en aminosy-resekvens med Pro-Asn-Asn-Asn gentaget 23 gange, og det omhandlede 25 polypeptid anvendes i en malariavaccine.
Den foreliggende opfindelse angår specifikke fusionspolypeptider, hvis fremstilling er illustreret i de efterfølgende eksempler, og som ikke kendes fra den ovenfor omtalte kendte teknik. De omhandlede specifikke fusionspolypeptider udmærker sig ved deres høje ekspressionshastighed, 30 der ikke kunne forudses på baggrund af kendskab til den hidtil kendte DK 167817 B1 3 teknik.
Fusionspolypeptidet ifølge opfindelsen omfatter tandemgentagelsesenheder af et P. falciparum-circumsporozoitprotein (-CS-protein) og en ikke-CS-protein-gentagelsessekvens og er kendetegnet ved, at ikke-CS-5 protein-gentagelsessekvenserne er valgt blandt:
Gly,* Leu-Arg; influenzavirus-ustruktureret protein 1 (NSI) ; 81 N-terminale aminosyrer af NSI; Asn-Thr-Val-Ser-Ser; 86 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tetg6) ; og 32 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet32) , samt yderligere 10 kendetegnet ved, at tandemgentagelsesenhederne omfatter: [ (Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro)-j_] n, hvori n a l.
Polypeptidet ifølge opfindelsen kan bibringe pattedyr immunitet mod infektion forårsaget af Plasmodium falciparum.
Opfindelsen angår endvidere en vaccine til beskyttelse af mennesker mod 15 infektion med Plasmodium falciparum-sporozoit, hvilken vaccine er ejendommelig ved, at den omfatter en immunbeskyttende mængde polypeptid ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer.
Endelige angår opfindelsen det omhandlede polypeptids anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat mod malaria, herunder en 20 vaccine mod malaria.
På tegningen viser fig. la en del af et restriktionsendonukleasekløvningskort for en region i det genome DNA fra P. falciparum, som indeholder den sekvens, der koder for CS-proteinet, og 4 UK 1b/S1 / b l fig. lb en del af restriktionsendonukleasekløvningskortet for pASl.
Polypeptidet ifølge opfindelsen omfatter fire eller flere tandem-CS-proteingentagelsesenheder dannet i E. coli. Det er ikke CS-proteinet, selvom det kan omfatte andre dele af 5 CS-proteinet end gentagelsesenheden. P. falciparumgentagelses-enheden er et tetrapeptid med følgende sekvens: asparagin(asn)-alanin(ala)-asn-prolin(pro)-.
I polypeptidet ifølge opfindelsen kan der forekomme variation af tetrapeptidet, forudsat at dette ikke på uhensigts-10 mæssig måde signifikant påvirker reaktiviteten af antistoffer derimod med P. falciparum-CS-proteinet. Som beskrevet af Dame et al., Science, bind 225, side 593 (1984), som skal anses for inkorporeret i den foreliggende tekst ved henvisningen hertil, er f.eks. 37 af de 41 tetrapeptidgentagelser i det 15 naturligt forekommende P. falciparum-CS-protein asn-ala-asn-pro, og 4 af dem er asn-valin (vaD-asparaginsyre(asp)-pro. Det foretrækkes, at mere end halvdelen af tetrapeptidgentagelsesenhederne i polypeptidet ifølge opfindelsen er den såkaldte consensussekvens, asn-ala-asn-pro.
20 Polypeptidet ifølge opfindelsen omfatter fortrinsvis ca. 8 gentagelser, dvs. 32 aminosyrer, op til ca. 148 gentagelser. Polypeptidet indeholder særligt fordelagtigt fra ca. 16 til ca. 112 gentagelser.
Polypeptidet ifølge opfindelsen kan være et hybrid, dvs. et 25 fusionspolypeptid med ikke-CS-proteingentagelsesenhedssekvenser. En sådan ikke-CS-proteingentagelsessekvens kan tjene som bæremolekyle til forøgelse af immunogeniciteten eller til lettelse af kloning og ekspression i rekombinante mikroorganismer. En sådan yderligere sekvens kan alternativt bære en 30 eller flere epitoper for andre sporozoitimmunogener, andre DK 167817 B1 5
Plasmodium-immunogener og/eller andre ikke-Plasmodium-immuno-gener. Opfindelsen omfatter specielt ikke-CS-proteinet, som har vist sig ikke at blive stabilt udtrykt i anvendelige mængder i E. coli og ikke at være nødvendig til immunisering mod P.
5 falciparum.
Specifikke udførelsesformer for typer af polypeptider ifølge opfindelsen, der er eksemplificeret heri, er: 1Q Rtet22-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med ca. 32 N-terminale aminosyrer fra tetracyklinresistens(tetR)-genet i pBR322, sammensluttet til gentagelsernes C-ende,
Rtetgg-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med 15 et tetR-genprodukt, sammensluttet til gentagelsernes C-ende, RNSl-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med de 227 aminosyrer fra NSI, sammensluttet til gentagelsernes C-ende, 20 NSlR-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser med 81 N-terminale aminosyrer fra NSI, sammensluttet til gentagelsernes N-ende, RG-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser efterfulgt 25 af en -glycinrest ved gentagelsernes C-ende, RLA-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser efterfulgt af -leucin-argininrester ved gentagelsernes C-ende, og 30 RN-polypeptider, som omfatter mindst 4 gentagelser efterfulgt af -asn-thr-val-ser-ser ved gentagelsernes C-ende.
En genetisk kodningssekvens for CS-proteingentagelsesenhederne kan opnås ved hjælp af kendte teknikker. Disse omfatter 35 syntese og fortrinsvis opnåelse ud fra P. falciparum ved omvendt transskription af mRNA, som beskrevet f.eks. af Ellis et al.,
DK Ί678Ί7 BT
6
Nature, bind 302, side 536 (1983), eller ved direkte kloning af det intakte gen fra genomt P. falciparum-DNA, som beskrevet f.eks. af Dame et al., der tidligere er omtalt. Figurerne illustrerer CS-proteinkodningsregionen. P. falciparum og sporo- zoiter deraf kan opnås fra inficerede mennesker og myg.
5
Efter at have klonet kodningssekvensen for hele eller en del af CS-proteinet, kan et underfragment deraf, der koder for hele eller en del af gentagelsesenheden, fremstilles ved hjælp 1Q af kendte teknikker. Fig. la viser valgte tilgængelige restriktionsteder i CS-proteingenet. Foretrukne steder er XholI-stederne. Skæring med XhoII frigør en kodningssekvens for 16 gentagelser som følger: 1S N-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^^(asn-val-asp-pro)^]nC, hvori n er 1. Anvendelsen af flere tandem-Xholl-fragmenter, orienteret rigtigt, resulterer i længere gentagelser, dvs. n er større end en.
20
Synteseteknikker er velkendte og kan gennemføres ved anvendelse af kommercielt tilgængelige DNA-syntetiseringsmidier.
Et syntetisk oligonukleotid med codoner for i alt væsentligt de samme aminosyrer og med de samme XhoII-ender ellér forskel-25 lige kløvningssteder ved enderne kan syntetiseres. Sådanne syntetiske oligonukleotider kan afvige fra de naturlige 64 codoner og kan kode for de samme aminosyrer eller for et poly-peptid med et ringere antal, fortrinsvis færre end ca. 8 forskellige aminosyrer, forudsat at disse ikke på uhensigtsmæssig 30 måde signifikant påvirker polypeptidets immunobeskyttelsesevne. Et eksempel på en syntetisk kodende sekvens koder fuldstændigt for consensussekvensen (asn-ala-asn-pro)n, hvori n er mindst 4.
Kodningssekvensen for polypeptidet kan indføres i en hvilken 35 som helst E. coli-ekspressionsvektor, hvoraf mange kendes DK 167817 B1 7 og er tilgængelige. Det høje ekspressionsniveau af polypepti- derne ifølge opfindelsen i E. coli er overraskende, når henses til den usædvanlige aminosyresammensætning i produktet - ca.
50% asparagin (asn), 25% alanin (ala) og 25% prolin (pro).
Som beskrevet nærmere nedenfor har det vist sig, at kodnings-5 sekvensen udtrykkes godt under anvendelse af et regulerende element, som omfatter PL-promotoren fra lambda og cll-ribo-sombindingsstedet fra lambda, som omfattet af plasmid pASl beskrevet af Rosenberg et al., Meth. Enzym., bind .101, side 10 123 (1983) og Shatzman et al., i Experimental Manipulation of Gene Expression, udgivet af M. Inouye, Academic Press,
New York, 1982. pASl bærer pBR322-replikationsoriginet, en ampicillinresistensmarkør og en række fragmenter fra lambda, inklusive PL, N-antitermineringsfunktionsgenkendelsessteder 15 (NutL og NutR), det rho-afhængige transskriptionsterminerings-signal (tRl) og clI-ribosombindingsstedet, inklusive cll-trans-lationsinitieringsstedet, hvis G-rest efterfølges umiddelbart af et BamHI-kløvningssted. pASl kan afledes af pKC30cII ved at fjerne nukleotider mellem BamHI-stedet ved cII-pBR322-sam-20 menføjningsstedet af pKC30cII og cII-ATG og'-genligering af molekylet til gendannelse af BamHI-stedet umiddelbart nedstrøms for ATG. pKC30cII opbygges ved at indføje et 1,3 kb Haelll-fragment fra lambda, som bærer cll-genet i pKC30's Hpal-sted.
Se Shatzman et al., der er nævnt ovenfor, og Rosenberg et 25 al., der er nævnt ovenfor. pKC30 er beskrevet af Shimitake et al., Nature, bind 292, side 128 (1981). Det er et pBR322-derivat med et 2,4 kb HindIII-BamHI-fragment af lambda indsat mellem Hindlll- og BamHI-stedet i pBR322's tetR-gen. En konstruktion svarende til pASl er beskrevet af Courtney et al., 30 Nature, bind 313, side 149 (1985). pASl blev deponeret i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland under asses-sionsnummer ATCC 53021 i overensstemmelse med Budapest-trak-tatens bestemmelser. Den kodende sekvens bindes operativt, dvs. i korrekt orientering og i korrekt læseramme, til et 35 regulerende element af en E. coli-ekspressionsvektor ved hjælp af standardteknikker for at opbygge en ekspressionsvektor ifølge opfindelsen.
8
Ulv ΙΌ/b I / bl
Det således udtrykte polypeptid isoleres og oprenses fra den producerende kultur ved hjælp af standardproteinisolerings-teknikker, hvoraf mange er velkendte i teknikken. Eksempelvis omfatter et anvendeligt oprensningsskema 1) sprængning af 5 celler, 2) klaring af cellerester, 3) adskillelse af poly-peptiderne ifølge opfindelsen fra andre polypeptider, som findes i den klarede celleekstrakt og 4) endelig rensning til fjernelse af resterende forureninger, herunder rester af polypeptider, carbohydrater, nukleinsyrer og/eller lipo-10 polysaccharider.
Det første trin kan udføres f.eks. ved tilsætning af lysozym eller et andet lyserende eller permeabiliserende middel eller ved mekanisk eller ultralydssprængning. Før centrifugering 15 eller filtrering for at klare ekstrakten tilsættes et overfladeaktivt middel for at holde polypeptidet ifølge opfindelsen opløst. 1 2 3 forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist 20 sig, ..at nogle af polypeptiderne ifølge opfindelsen meget effek 2 tivt kan skilles fra andre polypeptider ved opvarmning af den klarede ekstrakt til ca. 80°C efter tilsætning af et overfladeaktivt middel til bevarelse af proteinets opløselighed. Opvarmning til 80°C i mindst ca. 4 minutter viste sig at be-25 virke udfældning af næsten alle bakterielle polypeptider uden denaturering af polypeptider, som overvejende omfattede gentagelserne, eller gentagelserne knyttet sammen med andre ikke-varmedenaturerbare sekvenser. De denaturerede bakterielle polypeptider kan bundfældes ved centrifugering og fjernes.
3 0 Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at rense Rtet^-#· RG-, RLA- og Rtetgg-polypeptider. Denne fremgangsmåde blev især anvendt til med held at rense Rietet^* R32tetg2r R48tetg2, R64tet32, R48G, R32LA og R16tetgg, som beskrevet i de efterfølgende eksempler, men opvarmning af R16NS1 og R32NS1 resul-35 terede i udfældning af disse polypeptider.
DK 167817 B1 9
Polypeptidet ifølge opfindelsen kan renses yderligere, f.eks. ved tilsætning af et selektivt fældningsmiddel efterfulgt af_ et afsluttende kromatografitrin, såsom ionbytningskromatografi eller højtryksvæskekromatografi med omvendt fase.
5 I vaccinen ifølge opfindelsen kan en vandig opløsning af polypeptidet ifølge opfindelsen, fortrinsvis pufret til fysiologisk pH-værdi, anvendes direkte. Alternativt kan polypeptidet med eller uden forudgående frysetørring iblandes eller adsorberes 10 med et hvilket som helst af de forskellige kendte hjælpestoffer. Sådanne hjælpestoffer omfatter blandt andet aluminiumhydroxid, muramyldipeptid og saponiner, såsom Quil A. Som endnu et alternativt eksempel kan polypeptidet indkapsles'til mikropartikler, såsom liposomer. Som endnu et alternativt eksempel kan poly-15 peptidet konjugeres til et immunostimulerende makromolekyle, såsom dræbt Bordetella eller tetanus toxoid.
Vaccinefremstilling er beskrevet generelt i New Trends and Developments i Vaccines, udgivet af Voller et al.. University 20 Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. -Indkapsling i liposomer er beskrevet f.eks. af Fullerton, US-patent 4.235.877. Konjugering af proteiner til makromolekyler er f.eks. beskrevet af Likhite, US-patent 4.372.945 og af Armor et al., US-patent 4.474.757. Anvendelse af Quil A er beskrevet af Dalsgaard 25 et al., Acta. Vet. Scand., bind 18, side 349 (1977).
Den i hver vaccinedosis indgående polypeptidmængde vælges som en mængde, der fremkalder en immunobeskyttende reaktion uden signifikante uhensigtsmæssige bivirkninger i typiske 30 vaccinerede individer. En sådan mængde vil variere i afhængighed af det specielt anvendte polypeptid, og af hvorvidt vaccinen er tilsat hjælpestof eller ej. Almindeligvis forventes det, at hver dosis vil omfatte 1-1000 yg polypeptid, fortrinsvis 10-200 yg. En optimal mængde til en bestemt vaccine kan be-35 stemmes ved hjælp af standardundersøgelser, der omfatter observation af antistoftitre og andre reaktioner i patienter.
DK 167817 Bl 10
Efter en indledende vaccination vil patienter fortrinsvis få en ny vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået immunitet efter ca. 4 ugers forløb efterfulgt af en ny vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået g immunitet hver sjette måned, så længe der eksisterer risiko for infektion.
De følgende eksempler tjener til belysning af opfindelsen. Den CS-proteinkodende sekvens blev leveret af James Weber, Walter 10 Reed Army Institute for Research som et 2337 bp EcoRI-fragment (se fig. la) af XmPFl (Dame et al., som nævnt ovenfor) på EcoRI-stedet i pUC8, en standard E. coli-kloningsvektor (der kan fås f.eks. fra Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) . Det resulterende pUC8-derivat kaldes pUC8-klon 1.
15
EKSEMPLER
Eksempel 1 20 CS-proteinderivat
Renset plasmid-DNA fra pUC8-klon 1 plasmid-DNA (40 ug) blev fordøjet med restriktionsendonukleaser Stul og Rsål’ (100 enheder 25 af hvert enzym) i 400 yl mediumpuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 10 mM MgC^) i 1 1/2 time ved 37°C. Det resulterende fragment på 1216 basepar, der koder for hele CS-proteinet, bortset fra de første 18 aminosyrer, blev isoleret ved elektroforese på en 5% poly-30 acrylamidgel (PAGE). Ekspressionsvektor pASl (10 yg) blev fordøjet med restriktionsendonuklease BamHI (25 enheder) i 200 yl mediumpuffer i 1 1/2 time ved 37°C. Det kløvede plasmid blev derpå behandlet med et stort DNA-polymerasefragment (Kle-now, 5 enheder; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgC^, 60 mM 35 NaCl, 6 mM 2-mercaptoethanol og 0,25 mM af hvert af de fire deoxynukleotidtriphosphater, 25°C, 15 minutter) for at endeopfylde BamHI-stedet. CSgenfragmentet (1 yg) blev derpå ligeret DK 167817 B1 11 i denne vektor (100 ng) i 30 μΐ ligasepuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM DTT, 10 mM MgC^f 100 μΜ rATP) med en enhed T4-DNA-ligase i 16 timer ved 4°C. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. colistamme MM294CI+, og der blev opnået 5 ampicillin-resistente kolonier, der blev undersøgt for indfø jelse af CS-genfragmentet i pASl. Et plasmid med den korrekte opbygning (pCSP) blev identificeret og blev transformeret ind i E. coli-stamme N5151 (clts857) og undersøgt for ekspression af CS-protein i fuld længde. (Udeladelsen af de 18 10 aminosyrer ved proteinets aminoende ville svare til et kløvet signalpeptid af det autentiske CS-protein). Celler blev dyrket i Luria-Bertani-suppe (LB) ved 32°C til en absorbans ved 650 nm (Α^,-φ) på 0,6, og temperaturinduceret ved 42°C i 2 timer for at starte transskription af ekspressionsplasmidets PL-pro-15 motor og efterfølgende translation af CS-proteinderivatet.
Cellerne blev udtaget i 1 ml prøver, bundfældet ved centrifugering,· suspenderet igen i lyseringspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 25% (volumen/volumen) glycerol, 2% 2-mercaptoethanol, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% bromphenylblåt) og inkuberet 20 i en ,105°C varmeblok i 5 minutter. Proteiner blev adskilt ved hjælp af SDS-PAGE (13% acrylamid, 30:0,8 acrylamid:bis-acryl-amid). Proteiner blev overført til nitrocellulose, og det i E. coli dannede CS-protein blev påvist ved hjælp af western-aftryks-analyse under anvendelse af en blanding af £em monoklone 25 antistoffer, som reagerer med P. falciparum CS-proteinets tetrapeptidgentagelsesområde. (Dame et al., der tidligere er nævnt).
Eksempel 2 30 R16tetoc.
OD
Renset plasmid-DNA fra pUC8-klon 1 (100 ng) blev fordøjet med restriktionsendonuklease XhoII (40 enheder) i 400 μΐ medium-35 puffer ved 37°C i 16 timer. Et fragment på 192 basepar, der koder for 16 tetrapeptidgentagelser af CS-proteinet, blev derpå isoleret ved hjælp af PAGE. Ekspressionsvektor pASl 12 UK Tb/bl / b l blev kløvet med restriktionsendonuklease BamHI, som beskrevet i eksempel 1. XhoII-fragmentet på 192 basepar (1 ug) blev ligeret på BamHI-stedet af pASl (100 ng)f som beskrevet i eksempel 1. Ligeringsbiandingen blev transformeret ind i E.
5 colistamme MM294CI+. Der blev identificeret en klon, som indeholdt et enkelt XhoII-fragment med 192 basepar med korrekt orientering i pASl's BamHI-sted ved hjælp af polyacrylamid-gelelektroforeseanalyse af et BamHI-Hindll-fragment af plas-midet, idet Hindll-stedet er nedstrøms for tetR-genet, og 10 idet BamHIstedet er ved sammenføjningen af cII-ATG og det indsatte stykke i korrekt orienterede plasmider. Dette plasmid pR16tetgg kan belyses på følgende måde: pBR322 PL gentagelse tetR S pBR322 15 *__:_
BH B B
hvori BH angiver et BamHI-sted, B angiver et Banll-sted og 2o S en termineringscodon. pR16tetgg blev anvendt til at transformere E. coli-stamme N5151 (clts857) og undersøgt for dannelsen af CS-proteintetrapeptidgentagelsen ved hjælp af western-af-trykningsanalyse. Det således dannede protein havde følgende sekvens: · .
25 N-met-asp-pro(asn-ala-asn-pro)^(asn-val-asp-pro)^ T86-C
hvori T86 var 86 aminosyrer afledt af tetracyklinresistens-genet, der findes på pASl. Den N-terminale methionin(met)rest stammede også fra vektoren, nærmere betegnet fra cll-protein-initieringscodonen.
30
Eksempel 2a R32tetgg og R48tetgg 35 Renset pR16tetgg-plasmid-DNA (10 yg) blev fordøjet med 25 enheder BamHI i 200 yl mediumpuffer i 2 timer ved 37°C. 100 ng DK 167817 B1 13 af dette DNA blev derpå ligeret med 1 yg af det ovenfor beskrevne XholI-fragment med 192 basepar. Plasmidekspressions-yektorer, pR32tetgg og pR48tetgg, der koder for de følgende polypeptider, blev fremstillet og udtrykt i E. coli.
5
N-met-asp-pro[ (asn-ala-asn-pro)15~(asn-val-asp-pro)1]n~T86-C
hvori n er 2 (R32tetgg), eller n er 3 (R48tetgg). pASl-kloner, hvori n var 2 eller 3, blev valgt blandt kloner, hvori n var jo forskellig fra henholdvis 2 eller 3, som beskrevet ovenfor.
Alle de undersøgte kloner havde det indsatte stykke i korrekt orientering. Både R32tetgg og R48tetgg blev udtrykt til omtrent den samme grad som R16tetgg, hvilket blev bestemt ved hjælp a f immunoa ft ryk.
15
Immunoaftryksanalyse af adskillige af Rtetgg-proteinerne afslørede et heterogent sæt af produkter, som ikke kunne ses med Coomassie Brilliant Blue R-25O-farvning. Disse proteiner viste sig at have akkumuleret til ca. halvdelen af de nedenfor 20 beskrevne mængder af Rtetg2~P°lyPePtiderne.r Det viste sig, at størrelserne af de mindste nedbrydningsprodukter var proportionale med antallet af tetrapeptidgentagelser i klonerne.
Disse proteiners manglende stabilitet kan skyldes nedbrydning af den heterologe COOH-endehale.
25
Eksempel 3 Rl6tetg2* 30 Renset pR16tetgg-DNA (10 yg) blev skåret med 25 enheder restrik-tionsendonuklease Banll i 200 yl mediumpuffer i 2 timer ved 37°C. 100 ng af det skårne DNA blev derpå sammenføjet ved ligering. Denne manipulation resulterede i fjernelse af et BanII-fragment med 14 basepar og dannede en afslutningscodon 35 umiddelbart nedstrøms for det tilbageblevne Banll-kløvnings-punkt. Det resulterende plasmid, pRlStet^/ blev anvendt til 14
Ulv Ib/8 I / d I
at udtrykke Ristet^ i E. coli-stamme N5151, og Rlétet^ blev renset derfra. 30 g {våd vægt) E. coli, der indeholder Ristet^/ blev suspenderet igen i 200 ml puffer A (50 mM Tris-HCl, pH
8,0, 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,1 mM dithio- 5 threitol, 5% (vol/vol) glycerol). Lysozym blev tilsat til en slutkoncentration på 0,2 mg/ml, og blandingen inkuberet på is i 30 minutter til lysering af celler. Blandingen blev derpå behandlet i en Waring-blender i 30 minutter ved den høje hastighed efterfulgt af lydbehandling i 1 minut med et 10 Branson 350 lydbehandlingsapparat til skæring af bakterielt DNA. Natriumdeoxycholat blev tilsat til en slutkoncentration på 0,1% (vægt/volumen), og denne blanding blev omrørt i 30 minutter ved 4°C. Suspensionen blev derpå centrifugeret ved 12.000 x g i 30 minutter til fjernelse af celleaffald. Super-15 natanten blev opsamlet i en kolbe, inkuberet i et kogende vandbad i 10 minutter og centrifugeret ved 12.000 x g i 30 minutter. Det viste sig, at næsten alle E. coli-proteinerne udfældedes under opvarmningstrinnet og bundfældedes under centrifugeringen, hvorimod Ri6tet.^“Proteinet var opløseligt 20 og v$r indeholdt i supernatanten. Supernatanten blev opsamlet og ammoniumsulfat derpå langsomt tilsat til en slutkoncentration på 20% mætning. Dette resulterede i selektiv udfældning af R16tet22~Pr°teinet, som derpå blev opsamlet ved centrifugering (12.000 x g i 30 minutter). På dette tidspunkt var 25 Rl6tet^2-proteinet mere end ca. 95% rent med hensyn til andre forurenende bakterielle proteiner.
Et sidste kromatografisk trin (f.eks. ionbytning, højtryksvæskekromatografi med omvendt fase, phenylsepharosekromatografi, 30 størrelsesseparering etc.) kan derpå gennemføres til fjernelse af resterende forurening med andre stoffer, såsom proteiner, carbohydrater, nukleinsyrer eller lipopolysaccharider. Rl6tet^2 blev udtrykt og renset ved koncentrationer omtrent svarende til 5% af det samlede E. coli-protein, dvs. ca. 30-60 mg/L, 35 påvist ved hjælp af Coomassie Blue-farvning.
15 DK 167817 B1 R16tet33 havde følgende sekvens:
N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)(asn-val-asp-pro)^]nT32-C
5 hvori n er en, og T32 er 32 aminosyrer, afledt af tetracyklin-resistentsgenet. T32 har nærmere bestemt følgende sekvens:
-leu-arg-arg-thr-his-arg-gly-arg-his-his-arg-arg-his-arg-cys -gly-cys-trp-arg-leu-tyr-arg-arg-his-his-arg-trp-gly-arg-ser 10 -gly-ser-C
idet det resterende Banll-kløvningspunkt er mellem resterne 30 og 31.
15 Eksempel 3AS
R32tet32; R48tet32· I alt væsentligt som beskrevet ovenfor i eksempel 3 blev 20 R32tet32 og R48tet32 (Rl6tet32, hvori n er henholdsvis 2 og 3) udtrykt i E. coli og isoleret til samme niveau og renhedsgrad som R16tet32· Udgangsvektorerne var henholdsvis pR32tetgg og pR48tetgg.
25 Eksempel 3B
R64tet32, R80tet32·
Renset pR48tet32-plasmid-DNA (10 yg) blev fordøjet med 25 30 enheder BamHI i 200 yl mediumpuffer i 2 timer ved 37°C. 100 ng af dette DNA blev derpå ligeret med 1 yg af XhoII-fragmentet med 192 basepar, som beskrevet ovenfor. Plasmidekspressions-vektorer, der koder for de følgende polypeptider, blev fremstillet og udtrykt i E. coli.
35 16
UK ΙΟ/ΰ I / D I
N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)(asn-val-asp-pro)^]n~T32-C
hypri n er 4 (RGitet.^)/ eller n er 5 (ReOtet.^)· pASl-kloner, hvori n var 4 eller 5, blev valgt blandt kloner, hvori n er 5 forskellig fra henholdsvis 4 eller 5, som beskrevet ovenfor.
Både R64tet^2 og RSOtet^ udtryktes ved omtrent de samme niveauer som R48tet22* R64tet^2 blev renset i alt væsentligt på samme måde som RlStet^r I^tet^ og R48tet^2r som beskrevet ovenfor.
10
Eksempel 3C R96tet22 og Rl^tet^· 15 I alt væsentligt som beskrevet i eksempel 3B ovenfor blev R96tet^2 og Rl^tet^ (hvori n er henholdsvis 6 og 7) udtrykt i E. coli ved omtrent de samme niveauer som R48tet22* Udgangsvektoren var pReOtet^· 2o Selvom der sås nogen heterogenitet i rensede Rtet^-polypep- tider ved immunoaftryksanalyse, korrelerede de reaktive hovedformer med båndet, som sås ved proteinfarvning. De ved SDS-PAGE observerede molekylvægte var omtrent dobbelt så store som forventet, selvom hvert af proteinernes vandring var propor-25 tional med antallet af tetrapeptidgentage1sesenheder i hver af konstruktionerne. Bestemmelser af aminosyresammensætning foretaget på adskillige Rtet^-polypeptider stemte overens med de forventede værdier.
30 Eksempel 4 R16G.
pTerm blev fremstillet ved at indføje en syntetisk kobler 35 med følgende sekvens: 17 DK 167817 B1 5'-GATCCCGGGTGACTGACTGA -3' 3'- GGCCCACTGACTGACTCTAG -5' i pASl's BamHI-sted. pASl (10 yg) blev fordøjet med 25 enheder 5 BamHI. 100 ng af det BamHI-skårne pASl blev ligeret med 20 ng af den syntetiske kobler, og plasmid pTerm blev identificeret med en kobler indføjet i pASl's BamHI-sted. Denne vektor bibeholder BamHI-stedet og resulterer i indføjelse af TGA-termineringscodoner nedstrøms for ATG-initieringscodonen jq i cll-proteinet i alle tre læserammer.
pR16G blev fremstillet ved at indføje det 192 basepar XhoII-fragment fra pUC8-klon 1 i pTerm's BamHI-punkt, og en klon med et enkelt indsat XhoII-fragment indføjet i den korrekte 15 orientering blev valgt i alt væsentligt som beskrevet tidligere.
pRl6G blev klonet og udtrykt i E. coli-stamme N5151 i alt væsentligt som beskrevet ovenfor.
20 Rl6G..har følgende sekvens:
N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^-(asn-val-asp-pro) ^3n-gly-C
hvori n er en.
25
Da dette protein ikke indeholder nogen aromatiske rester, kan det ikke gøres synligt ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue R-250-farvning for at bestemme ekspressionsniveauer kvantitativt. Ved immunoaftrykanalyser med 5 monoklone antistoffer, 30 der er specifikke for CS-proteinet (Dame et al., tidligere citeret) blev niveauerne bestemt til at være ca. 1% af samlet celleprotein i sammenligning med RlGtet^ nied hvilket synlig-gørelse ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue R-250-farvning er mulig.
35 DK 167817 81 18
Eksempel 4A
R32G, R48G, R64G, R80G og R112G.
g R32G, R48G, R64Gf R80G og R112G (R16G, hvori n er henholdsvis 2, 3, 4, 5 eller 7) blev udtrykt i E. coli-stamme N5151, som beskrevet i eksempel 4 ovenfor. Disse polypeptider blev udtrykt ved omtrent det samme niveau som R16G. R48G blev renset i alt væsentligt som beskrevet i eksempel 3.
1°
Eksempel 5 R16LA og R32LA.
15 pTerm2 blev fremstillet ved at indføje en syntetisk kobler med følgende sekvens: 5'-GATCCGCTGCGTT -3' 3'- GCGACGCAACTAG-5' 20 i pASl's BamHI-sted i alt væsentligt som beskrevet i eksempel 4. pTerm2 bibeholder BamHI-stedet. Det 192 store basepar XhoII-fragment fra pUC8-klon 1 blev indføjet som beskrevet ovenfor. pRl6LA og pR32LA, kloner med henholdsvis et eller to indføjede 25 XhoII-stykker i rigtig orientering, blev valgt i alt væsentligt som beskrevet tidligere. R32LA blev renset i alt væsentligt som beskrevet i eksempel 3.
pRlSLA og pR32LA blev klonet og udtrykt i E. coli-stamme N5151 30 i alt væsentligt som beskrevet tidligere.
R16LA og R32LA har følgende sekvens: N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^ (asn-val-asp-pro)^ 3^-leu-arg-C 35 hvori n er henholdsvis 1 og 2. Det C-terminale leucin og argi-nin stammer fra den syntetiske kobler i pTerm2. R16LA'et blev 19 DK 167817 B1 udtrykt med ca. 1% af totalt E. coli-protein, hvorimod R32LA blev udtrykt med ca. 5% af totalt celleprotein.
Eksempel 6 5 R16NS1.
pASlAEH blev fremstillet ved at fjerne en ikke-essentiel EcoRI-Hindlll-region fra pASl's pBR322-origin. 10 mikrogram pASl blev skåret med EcoRI og Hindlll (20 enheder hver) i 200 μΐ 10 mediumpuffer, behandlet med DNA-polymerase (Klenow), lukket ved ligering og transformeret ind i E. coli i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Der blev identificeret en klon uden det 29 basepar EcoRI-HindlIl-fragment. Et 1236 basepar BamHI-fragment af pAPR801 (Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
15 USA, bind 80, side 6105 (1983)), som indeholder den influenzavirus (A/PR/8/34)-NSl-kodende region inde i 881 basepar af virusoprindelse, og 375 basepar af pBR322-oprindelse blev indføjet i BamHI-stedet af pASlAEH. Det resulterende plasmid, ρΑ81ΔΕΗ/801, udtrykker autentisk NSI (230 aminosyrer). Dette 20 plasmid bevarer BamHI-stedet mellem cll-trånslationsstartstedet og den NSl-kodende sekvens.
pASlAEH/801 (10 yg) blev skåret med EcoRI (20 enheder) og
Sall (20 enheder) i 200 yl høj puffer (50 mM Tris-HCl, pH
25 7,5, ImM DDT, 10 mM MgC^/ 100 mM NaCl) i 2 timer ved 37°C, behandlet med stort DNA-polymerasefragment (Klenow) og lukket ved ligering i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Der blev isoleret en klon, hvori EcoRI-Sall-regionen på 650 basepar var fjernet. Dette plasmid, pNSlAES, udtrykker autentisk NSI.
30 pRlfiNSl blev fremstillet ved indføjelse af et 192 basepar XhoII-fragment fra pUC8-klon 1 i BamHI-stedet i pNSlAES, og kloner med et enkelt XhoII-fragment indsat i passende orientering blev valgt i alt væsentligt som tidligere beskrevet.
35 20 UK lb/ΒΊ / b l pRl6NSl blev klonet og udtrykt i E. coli, og R16NS1 blev renset i alt væsentligt som beskrevet ovenfor, idet kogningstrinnet blev udeladt.
5 R16NS1 har følgende sekvens: N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^(asn-val-asp-pro)^3nN227 hvor n er en, og N227 er 227 aminosyrer af NSl-oprindelse.
10 R16NS1 i Rl6NSl-præparatet blev bestemt til at indeholde mere end 80% proteiniuden kognings- eller ionbytningstrinnet. R16NS1 repræsenterede en særligt overraskende høj andel af totalt cellulært protein, nemlig ca. 25%.
15
Eksempel 6Å R32NS1, R48NS1 og R64NS1.
20 R32NS1 (R16NS1, hvori n er 2) blev udtrykt i og renset fra E. coli i alt væsentligt som beskrevet i det ovennævnte eksempel 3, idet kogningstrinnet udelades. R32NS1 blev udtrykt ved omtrent det samme niveau som R16NS1 og renset til omtrent den samme grad.
25 R48NS1 (R16NS1, hvori n er 3) og R64NS1 (R16NS1, hvori n er 4) blev udtrykt i E. coli i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. R48NS1 og R64NS1 udtryktes ved henholdsvis ca. 10% og 5% af totalt E. coli-protein.
30
Eksempel 7 NS1R48 35 pR48tetor blev kløvet med BamHI og suppleret i enden med DNA-
O O
polymerase (Klenow) i alt væsentligt som beskrevet ovenfor.
DK 167817 B1 21
Plasmidet blev derpå kløvet med Banll, som beskrevet ovenfor til frigørelse af et 672 basepar stort fragment, som har 3 XhoII-fragmenter og 96 basepar fra tetracyklinresistensgenet.
5 10 mikrogram pASlAEH/801 blev skåret med Ncol (20 enheder) i 200 yl puffer med høj saltkoncentration i 2 timer ved 37°C og suppleret i enden med et stort DNA-polymerasefragment (Kle-now) i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Ncol-stedet findes i codonen for rest 81 i NSI. Plasmidet blev dernæst skåret 10 med BanII som beskrevet ovenfor for at fjerne de restende NSl-codoner og en del af tetracyklinresistensgenet til dannelse af pASlAEH/801-l.
Det 672 basepar store BamHI (ende-suppleret)-BanII-fragment 15 blev indføjet i pASlAEH/801-l til fremstilling af pNSlR48.
Dette plasmid blev udtrykt i E. coli i alt væsentligt som beskrevet' ovenfor.
NS1R48 har følgende sekvens: 20
N-81N-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^(asn-val-asp-pro^]nT32-C
hvori 81 N er 81N-terminale aminosyrer fra NSI, n er 3, og T32 har den ovenfor beskrevne betydning. NS1R48 blev udtrykt 25 som ca. 5% af totalt cellulært protein.
Eksempel 8
R32N
30 10 mikrogram pR32NSl blev skåret med Hindlll (25 enheder) i 200 yl mediumpuffer i 2 timer ved 37°C og suppleret i enden med DNA-polymerase i alt væsentligt som beskrevet ovenfor til fremstilling af pR32NSl-l. Hindlll-stedet findes i codonen 35 for rest 5 i den NSl-kodende region. pR32NSl-l (100 ng) blev derpå lukket ved ligering i alt væsentligt som beskrevet ovenfor. Det resulterende plasmid, pR32N, indeholdt nu en TAA- DK ι67ο17 ΒΊ 22 termineringscodon efter den femte codon i den NSl-kodende sekvens. pR32N blev anvendt til at udtrykke R32N i E. coli i ..alt væsentligt som tidligere beskrevet.
5 R32N har følgende sekvens:
N-met-asp-pro[(asn-ala-asn-pro)^ -(asn-va1-asp-pro)^]n~N5-C
hvori n er 2, og N5 er 5 aminosyrer, der er afledt af NSl-genet. 10 N5 har nærmere bestemt følgende sekvens: -asn-thr-val-ser-ser-C.
R32N blev udtrykt som ca. 5% af totalt E. coli-protein.
15
Eksempel 9
Antistofreaktion - ELISA
20 Rekombinante proteiner Rl6tet32, R32tet32 og R48tet32 blev renset i alt væsentligt som beskrevet ovenfor, dialyseret mod 0,01 M phosphatpufret saltvand, pH 7,0 (PBS), udtaget i afmålte mængder og lagret ved -80°C. Konstruktioner blev blandet med enten PBS, aluminiumhydroxid (alun) eller Complete 25 Freund's Adjuvant (CFA) til dannelse af en 0,5 ml dosis, der indeholder 50 ug protein. CFA (GIBCO, Grand Island, New York) plus antigen i PBS blev emulgeret i l:l-forhold ved hvirvling i 30 minutter ved hjælp af et mekanisk vortex-apparat. Alun blev fremstillet af aluminiumhydroxidgel, USP, fortyndet i 50 PBS. Antigen blev absorberet til alun ved 4°C i 12 timer på et roterende blandingsapparat. Suspensionen blev henstillet til bundfældning i yderligere 12 timer, og der blev fjernet tilstrækkeligt supernatant til opnåelse af 0,80 mg Al og 50 yg rekombinant protein per dosis. 6-8 uger gamle C57Bl/6-mus 35 blev subkutant og intraperitonealt immuniseret med ialt 50 yg protein (5 dyr per gruppe). Dyrene fik en forstærkerdosis 4 uger efter den primære immunisering under anvendelse af DK 167817 B1 23 den samme fremgangsmåde som ved de første injektioner, bortset fra at gruppen, som havde fået immunogenerne i CFA, fik forstærkerdosen med proteiner, der var emulgeret i Incomplete Freund's adjuvant (IFA). En uge senere blev komplet blod, 5 opnået ved blødning fra halerne sammenblandet, størknet natten over ved 4°C og centrifugeret til adskillelse af serumet.
Disse sera blev lagret ved -80°C, indtil der var brug for dem.
10 En enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) blev anvendt til afprøvning af alle serumernes evne til at reagere med et syntetisk peptid med 16 aminosyrer og bestående af 4 gentagelser fra P. falciparum CS-proteinet (asn-ala-asn-pro)4 Dame et al., (Science, bind 225, side 593 (1984)). Syntetisk peptid-25 antigen blev koblet til bovint serumalbumin (BSA) og anvendt til at beklæde mikrotiterpladernes brønde. 50 yl (0,1 yg) af screeningsantigenet, fortyndet med 0,01 M phosphatpufret saltvand, pH 7,4 (PBS), blev pipetteret i brønde i polystyren-mikrotitreringsplader (Immunion 2 Dynatech Laboratories, Alex-20 andria, VA) og holdt natten over ved stuetemperatur (ca. 22°C) (RT). Indholdet i brøndene blev dernæst luftet, fyldt med blokeringspuffer (BB=1,0% BSA, 0,5% casein, 0,005% thimersol og 0,0005% phenolrødt i PBS) og holdt i en time ved RT. Musesera blev fortyndet i serier i BB, og 50 yl blev sat til hver brønd. 25 Efter 2 timers inkubation ved RT blev brøndene luftet, vasket 3 gange med PBS-0,05% Tween 20 (PBS-TW20), og 50 yg peber-rodsperoxidase konjugeret til gedeanti-muse-IgG (H+L) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) fortyndet 1/500 med 10% varme-inaktiveret humant serum i PBS blev sat til hver brønd. Efter 30 i times forløb blev brøndenes indhold luftet, vasket 3 gange med PBS-TW20, og 150 yl substrat (1 mg 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolinsulfonsyre-6) per ml 0,1 M citrat-phosphatpuffer, pH 4,0 med 0,005% hydrogenperoxid tilsat umiddelbart før brug) blev derpå sat til hver brønd. Absorbansen ved 414 nm blev 35 bestemt 1 time senere med en ELISA-pladelæser (Titertek Multi- skan, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA). RlStet^-r R32tet^2- DK Ί67817 ΒΊ 24 og R48tet^2“konstruktionerne resulterede alle i dannelse af antistof, som reagerede i ELISA. R16tet32 var, givet alene, dårligt immunogent i sammenligning med R32tet22 0<3 R48tet22* Både alun og CFA forøgede immunogeniteten af alle tre proteiner, 5 og antistof blev bestemt ved titere op til 102.000 i mindst et system.
Eksempel 10
10 Antistofreaktion - IFA
Antiserumerne fra eksempel 9 viste sig at reagere kraftigt med autentisk P. falciparum CS-protein, hvilket blev afprøvet i en indirekte immunofluorescent antistofanalyse (IFA). Reak-15 tivitet mod P. knowlesi, P. cynomologi, P. viva og P. galli- naceum blev ikke påvist. Der sås en ringe reaktivitet af antiserumerne over for R32tet^2 med P. berghei. Denne observation stemmer overens med tidligere data fra Hockmeyer et al. i Proc. 3d Int'l. Symp. Immunobiol. Proteins Peptides, udgivet 20 af Atassi, Μ.Z., Plenum New York (in press)/ som viste, at nogle Mabs over for P. falciparum reagerer med P. berghei-spo-rozoiter ved IFA.
Sporozoiter blev dissekeret fra inficerede mygs spytkirtler 25 i alt væsentligt som beskrevet af Bosworth, J. Parasitol., bind 61, side 769 (1975), fortyndet i saltvand eller medium 199 (GIBCO) indeholdende 0,5% BSA, talt under anvendelse af et hæmacytometer og fortyndet til 2000-5000 sporozoiter per 10 μΐ. Prøver på 10 μΐ blev fordelt på hver brønd i multi-30 brøndtrykte IFA-slæder, lufttørret ved stuetemperatur og lagret ved -80°C.
IFA'erne blev igangsat ved fordeling af 20 μΐ volumener serumer, fortyndet 1/100 med BB, på en IFA-slædes brønd indeholdende 35 tørrede sporozoiter. Efter 20 minutters inkubation i et fugtigt kammer ved RT blev serumopløsningerne luftet, og pletterne blev vasket med 2 dråber PBS. 20 μΐ prøver indeholdende gede- DK 167817 B1 25 anti-museantistof konjugeret med fluoresceinisothiocyanat (Kirkegård og Perry, Gaithersburg, MD), fortyndet 1:40 med BB_, blev derpå sat til hver plet. Efter endnu 20 minutters inkubation ved RT blev pletterne vasket igen med 2 dråber 5 PBS, monteret i glycerol og undersøgt for fluorescens under ultraviolet lys under ved en forstørrelse på 500 gange.
Eksempel 11 1Q CSP-reaktion
Sera fra mus, der var immuniseret med R16tet32, R32tet32 og R48tet^2/ gav kraftige CSP-positive reaktioner (tabel 1).
Det var kun R16tet32, som, når det anvendtes uden hjælpestof, 15 ikke dannede antistof, som gav positive CPS-reaktioner, hvor imod alle tre konstruktioner, r.år de blev anvendt sammen med CFA eller alun, fremkaldte antistoffer, som bevirkede kraftige CSP-reaktioner.
20 TABEL 1 CSP-reaktivitet af antisera over for Rl6tet32, R32tet32 °9 R48tet32· 25 __Antisera_ HJÆLPESTOF R16tet32 R32tet32 R48tet32 INTET 0/25(-) 17/25(2+) 21/25(4+) 30 CFA 23/25(4+) 21/25(4+) 21/25(4+) ALUN 25/25(4+) 25/25(4+) 16/27(2+-4+) 1 CSP-reaktioner blev gennemført i alt væsentligt som beskrevet af Vanderberg et al. Mil. Med. bind 134 (Supp. 1), side 1183 DK 167© i / Bi 26 (1969). 5 mikroliter, der indeholder 500-1000 P. falciparum-myggespytkirtelsporozoiter, resuspenderet i medium 199, blev blandet med 5 yl serum på et mikroskopobjektglas, forseglet under et dækglas, indrammet med vaseline og inkuberet ved 5 37°C i 1 time. Reaktionerne blev vurderet ved hjælp af fase- kontrastmikroskopi ved en forstørrelse på 400 gange. 25 tilfældige sporozoiter blev undersøgt for hver serumprøve, og antallet af CSP-positive organismer er angivet. CSP-reaktivi-tetsgraden, som beskrevet af Vanderberg et al., som er nævnt 10 ovenfor, er vist i parenteser. (-) viser, at der ikke kunne påvises nogen CSP-reaktivitet. (2+) viser forekomsten af et granulært bundfald på sporozoiternes overflade. (4+) viser forekomsten af et langt trådlignende filament i sporozoiternes ene ende. Normalt museserum og serum fra mus, der er immuni-15 seret med CFA alene, gav ikke nogen påviselig CSP-reaktivitet i parallelle forsøg.
Eksempel 12 20 Hepatocytblokering.
Serumerne fra det ovennævnte eksempel 9 blev undersøgt ved en in vitro-hæmning af invasionsprøve (tabel 2). Disse data viser, at R32tet22~ og R48tet22~proteinerne fremkalder anti-25 stoffer med kraftig blokeringsvirkning selv uden nærværelse af hjælpestof. Rietet^ var mindre effektivt med hensyn til at udvikle kraftigt blokerende antistoffer, bortset fra når de blev givet adsorberet til alun. Dette resultat stemmer overens med den ringe CSP-reaktivitet og de lave ELISA-titere, 30 som blev konstateret med de antistoffer, som blev dannet imod Pietets-proteinet.
35 DK 167817 B1 27 TABEL 2 Hæmning af P. falciparum-sporozoit-invasion HepG2-Al6 Hepatomaceller in vitro.
5 _Antisera_ HJÆLPESTOF RI 6 R32 R48 INGEN 46 95 92 CFA 76 92 94 10 ALUN 100 100 96
Inhibering af sporozoit-invasion af dyrkede celler blev udført 15 i alt væsentligt som tidligere beskrevet af Hollingdale et al. J. Immunol, bind 32, side 909 (1984). De sera, som blev opnået fra mus, der er immuniseret med Rietet^-/ R32tet^2 og R48tet22-konstruktionerne, blev undersøgt for deres evne til at hæmme invasion P. falciparum-sporozoiter i dyrkede 20 celler. Serumerne blev fortyndet i dyrkningsmedium og sat til HepG2-Al6-cellekulturer til dannelse af en siutfortynding på 1:20 (volumen/volumen). Kulturer fik derpå 12.00040.000 myggespytkirtel-P. falciparum-sporozoiter og blev inkuberet ved 37°C i en 5% CO«-atmosfære i 3 timer, skyllet med Dulbecco's 25 ^ phosphat-pufret saltvand (PBS), fikseret i methanol og skyllet 2 gange med PBS.
Sporozoiterne, som var trængt ind i cellerne, blev gjort synlige ved hjælp af en immunoperoxidase-antistof-analyse (IPA) 30 (Hollingdale et al., beskrevet ovenfor). Immunoperoxidase- antistofreaktionen blev gennemført ved først at behandle de fikserede kulturer med en Mab til P. falciparum (2F1.1, se
Dame et al., nævnt ovenfor) efterfulgt af inkubation med kanin- antimuseimmunoglobulin konjugeret med peberrodperoxidase og 3 5 farvning med 3,3-diaminobenzidin. Antallet af sporozoiter, som invaderede dyrkede celler blev bestemt ved at tælle de 28
UK lb/o I / b I
intracellulære parasitter, som findes i hele præparatet, på et Leitz-mikroskop ved en forstørrelse på 250 gange med et mørkeblåt filter. Forsøgene blev gennemført enten in duplo eller triplo, og hver cellekultur i et forsøg fik det samme antal sporozoiter. Hæmning var den procentiske' reduktion af
O
sporozoitinvasion med anti-konstruktionsimmunsera i sammenligning med normale museserumkontroller, hvor CS-reaktivt Mab 2F1.1 gav 100% hæmning af sporozoitinvasion ved fortyndinger på 1/20.
10
Rekombinante proteiner RLA, R16NS1 og R32NS1, i alt væsentligt fremstillet som beskrevet ovenfor, blev på lignende måde undersøgt ved hjælp af ELISA- og IFA-analyserne og viste sig ligeledes at fremkalde antistof, som reagerede med det 16-led 25 store syntetiske peptid og at give positive CSP-reaktioner.
R32tet22 °9 R32LA foretrækkes på grund af deres relative homogenitet, ekspressionsniveauer og lette fremstilling.
For en hvilken som helst syntetisk fremstillet vaccine er 20 det af største interesse, hvorvidt antistof.dannet mod det syntetiske immunogen vil genkende det autentiske molekyle, og hvorvidt antistoffet vil besidde de nødvendige biologiske egenskaber til kunne fremkalde beskyttelse. Eksemplerne, som viser både en immunofluorescensanalyse og CPS-reak'tionen, 25 viser, at antistof dannet mod E. coli-konstruktionerne reagerer med sporozoitoverfladen og-således genkender autentisk CS-pro-tein. Det er blevet påvist, at tilstedeværelsen af CSP-anti-stof i dyr og mennesker har nøje sammenhæng med immunitetsbeskyttelse. Den kendsgerning, at antikonstruktionsantistoffer 30 hæmmer sporozoitinvasion af humane hepatomaceller in vitro, er signifikant. Hollingdale et al., nævnt ovenfor, viste, at både Mabs mod P. falciparum og P. vivax såvel som polyklont serum fra mennesker, der er immune over for disse malariaformer, blokerede sporozoitinvasion. Blokering af sporozoitinvasion 35 in vitro antages således at være en analyse for beskyttende antistof. Dataene viser således sammen, at invasionsvaccinen DK 167817 B1 29 kan anvendes til at beskytte mennesker mod invasion af P. falciparum-sporozoiter.
Immunreaktionen over for disse rekombinante proteiner, som 5 er analyseret ved hjælp af ELISA-titer, overfladereaktivitet (som vist ved hjælp af IFA og CPS) og blokering af sporozoit-invasion forøges ved anvendelse af enten Complete Freunds Adjuvant eller Alum. Complete Freunds Adjuvant kan ikke anvendes hos mennesker, da det forårsager feber, fremkalder 10 granulomer og resulterer i tuberkulinhypersensitivitet. Alun anvendes for tiden som et hjælpestof i etablerede vacciner, såsom mod difteritis og tetanustoksoid såvel som i en af de nyeste vacciner, vaccinen mod Hepatitis B. Lang tids brug har vist, at det er effektivt og sikkert til brug hos menne-15 sker.
Eksempel 13
Vaccinefremstilling 2 0
Et vaccineeksempel fremstilles på følgende måde.
Til en pufret vandig opløsning af 3% aluminiumhydroxid (10 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 6,8; steriliseret ved filtrering) sættes polypeptidet ifølge opfindelsen i en lig- 25 nende puffer under omrøring til en slutkoncentration på 100 3 + pg/ml polypeptid og 1,0 mg/ml aluminium (Al ). pH-værdien holdes på 6,6. Blandingen henstår natten over ved ca. 0°C.
Der tilsættes thimersol til en slutkoncentration på 0,005%.
pH-værdien kontrolleres og justeres om nødvendigt til 6,8.
30
Selvom ovenstående fuldstændigt beskriver opfindelsen og alle foretrukne udførelsesformer deraf må det forstås, at opfindelsen ikke er begrænset til de heri specielt anførte udførelsesformer, men derimod omfatter alle modifikationer deraf, 3 5 .
som falder inden for de efterfølgende patentkravs definition.
Claims (12)
1. Fusionspolypeptid omfattende tandemgentagelsesenheder af et P. falciparum-circumsporozoitprotein (-CS-protein) og en ikke-
2. Fusionspolypeptid ifølge krav l, kendetegnet 15 ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro[ (Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn- Val-Asp-Pro)1]n-tetg6-C/ hvori n a 1.
3. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har f ormlen N-Met-Asp-Pro [Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro)1]n-tet32-C, hvori n a 1.
4. Polypeptid ifølge krav 3, kendetegnet ved, at tet32 består af aminosyresekvensen: Leu-Arg-Arg-Thr-His-Arg-Gly-Arg-His-His-Arg-Arg-His-Arg-Cys- Gly-Cys-Trp-Arg-Leu-Tyr-Arg-Arg-His-His-Arg-Trp-Gly-Arg-Ser- Gly-Ser-C.
5. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro [ (Asn-Ala-Asn-Pro) lg- (Asn-Val-Asp-Pro) -^] n-Gly-C, hvori n a 1. DK 167817 B1
5 CS-protein-gentagelsessekvens, kendetegnet ved, at ikke-CS-protein-gentagelsessekvenserne er valgt blandt: Gly; Leu-Arg; influenzavirus-ustruktureret protein 1 (NSI) ; 81 N-terminale aminosyrer af NSI; Asn-Thr-Val-Ser-Ser; 86 N-ter-minale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tetg_ 10 g) ; og 32 N-terminale aminosyrer af et tetracyklinresistent genprodukt (tet32)/ samt yderligere kendetegnet ved, at tandemgentagelsesenhederne omfatter: [ (Asn-Ala-Asn-Pro) 25 (Asn-Val-Asp-Pro) 1]n, hvori n s 1.
6. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro [ (Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro)2]n-Leu-Arg-C, hvori n s 1.
7. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, atdetharformlenN-Met-Asp-Pro[(Asn-Ala-Asn-Pro)15(Asn- Val-Asp-Pro)-l] n-NSl-C, hvori n a 1.
8. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen N-NSl81-Asp-Pro [ (Asn-Ala-Asn-Pro) 15-(Asn-Val-Asp-Pro)-l] n-tet32-C, hvori η & 1.
9. Fusionspolypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har formlen N-Met-Asp-Pro [ (Asn-Ala-Asn-Pro) 15 (Asn-Val-Asp-Pro)j^ijj-Asn-Thr-Val-Ser-Ser-C, hvori n s l.
10. Vaccine til beskyttelse af mennesker mod infektion med Plasmodium falciparum- sporozoit, kendetegnet ved, 15 at den omfatter en immunbeskyttende mængde polypeptid ifølge ethvert af kravene 1 - 9 og en farmaceutisk acceptabel bærer.
11. Anvendelse af polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-9 til fremstilling af et farmaceutisk præparat mod malaria.
12. Anvendelse af polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-9 20 til fremstilling af en vaccine mod malaria. 25
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69911685A | 1985-02-07 | 1985-02-07 | |
| US69911685 | 1985-02-07 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK62386D0 DK62386D0 (da) | 1986-02-07 |
| DK62386A DK62386A (da) | 1986-08-08 |
| DK167817B1 true DK167817B1 (da) | 1993-12-20 |
Family
ID=24808007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK062386A DK167817B1 (da) | 1985-02-07 | 1986-02-07 | Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0192626B1 (da) |
| JP (1) | JPH0689032B2 (da) |
| CN (1) | CN86100428A (da) |
| AP (1) | AP18A (da) |
| AT (1) | ATE78869T1 (da) |
| AU (2) | AU5293486A (da) |
| DE (1) | DE3686178T2 (da) |
| DK (1) | DK167817B1 (da) |
| ES (1) | ES8801126A1 (da) |
| GR (1) | GR860352B (da) |
| HU (1) | HU201682B (da) |
| IE (1) | IE58829B1 (da) |
| IL (1) | IL77787A0 (da) |
| NZ (1) | NZ215023A (da) |
| OA (1) | OA08200A (da) |
| PT (1) | PT81974B (da) |
| YU (1) | YU46814B (da) |
| ZA (1) | ZA86874B (da) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| ZA855232B (en) * | 1984-07-23 | 1986-02-26 | Univ New York | Protective peptide antigen corresponding to plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| IT1187710B (it) * | 1985-07-25 | 1987-12-23 | Eniricerche Spa | Composizione peptidica utile per la preparazione di vaccini per la malaria e di kit diagnostici per la determinazione di affezioni malariche |
| EP0252588A3 (en) * | 1986-05-12 | 1989-07-12 | Smithkline Beecham Corporation | Process for the isolation and purification of p. falciparum cs protein expressed in recombinant e. coli, and its use as a vaccine |
| EP0254862A1 (en) * | 1986-06-26 | 1988-02-03 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Vaccines against protozoan parasites |
| WO1988002757A1 (en) * | 1986-10-17 | 1988-04-21 | Saramane Pty. Ltd.; | Hybrid proteins or polypeptides |
| WO1988005817A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-11 | Smith Kline - Rit S.A. | Expression of the p. falciparum circumsporozoite protein by yeast |
| US6093406A (en) * | 1988-06-02 | 2000-07-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Vaccine for induction of immunity to malaria |
| NZ233255A (en) * | 1989-04-11 | 1993-02-25 | Chiron Corp | Plasmodium cs protein analogues lacking one or more of the repeat epitopes, and containing at least one nonrepeat flanking epitope |
| JP2513316B2 (ja) * | 1989-06-09 | 1996-07-03 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像読取装置 |
| CA2037151A1 (en) * | 1990-03-23 | 1991-09-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Plasmodium sporozoite antigen |
| AU6158700A (en) * | 1999-07-13 | 2001-01-30 | Corixa Corporation | Vaccine |
| JP2002371098A (ja) * | 2001-06-11 | 2002-12-26 | Japan Atom Energy Res Inst | マラリア感染診断材及びマラリア原虫の増殖を抑える免疫用抗原 |
| BRPI0905729A2 (pt) * | 2008-01-18 | 2015-07-14 | Aeras Global Tb Vaccine Found | "polipeptídeo antigênico recombinante, peptídeo antigênico recombinante, ácido nucléico e método para imunizar um indivíduo contra malária" |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2145092B (en) * | 1983-01-28 | 1988-04-07 | Univ New York | Protective peptide antigen |
| US4466917A (en) * | 1981-02-12 | 1984-08-21 | New York University | Malaria vaccine |
| DE3280028D1 (en) * | 1981-05-21 | 1989-12-28 | Wellcome Found | Protozoal antigen |
| AU569722B2 (en) * | 1983-01-28 | 1988-02-18 | Saramane Pty Ltd | Expression of plasmodium falciparum polypeptides from cloned cdna |
| WO1985003724A1 (en) * | 1984-02-21 | 1985-08-29 | National Research Development Corporation | Improvements in or relating to the production of malaria vaccines |
| US4707357A (en) * | 1984-06-26 | 1987-11-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Immunologically active peptides capable of inducing immunization against malaria and genes encoding therefor |
| ZA855232B (en) * | 1984-07-23 | 1986-02-26 | Univ New York | Protective peptide antigen corresponding to plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| CN86100979A (zh) * | 1985-02-07 | 1986-12-17 | 史密丝克莱恩贝克曼公司 | 疟疾疫苗的制备方法 |
| CA1297983C (en) * | 1986-11-12 | 1992-03-24 | Shigenobu Kasuya | Binary signal producing apparatus for optical character recognition |
-
1986
- 1986-02-03 NZ NZ215023A patent/NZ215023A/xx unknown
- 1986-02-03 DE DE8686870014T patent/DE3686178T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-03 AU AU52934/86A patent/AU5293486A/en not_active Abandoned
- 1986-02-03 EP EP86870014A patent/EP0192626B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-03 AT AT86870014T patent/ATE78869T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-02-04 IL IL77787A patent/IL77787A0/xx unknown
- 1986-02-05 GR GR860352A patent/GR860352B/el unknown
- 1986-02-05 ES ES551657A patent/ES8801126A1/es not_active Expired
- 1986-02-05 PT PT81974A patent/PT81974B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-02-06 OA OA58780A patent/OA08200A/xx unknown
- 1986-02-06 IE IE33686A patent/IE58829B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-02-06 ZA ZA86874A patent/ZA86874B/xx unknown
- 1986-02-06 HU HU86506A patent/HU201682B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-02-06 JP JP61025661A patent/JPH0689032B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-07 AP APAP/P/1986/000021A patent/AP18A/en active
- 1986-02-07 CN CN198686100428A patent/CN86100428A/zh active Pending
- 1986-02-07 YU YU18286A patent/YU46814B/sh unknown
- 1986-02-07 DK DK062386A patent/DK167817B1/da not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-08-21 AU AU82609/91A patent/AU639588B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0192626B1 (en) | 1992-07-29 |
| DK62386D0 (da) | 1986-02-07 |
| PT81974A (en) | 1986-03-01 |
| IE860336L (en) | 1986-08-07 |
| AU5293486A (en) | 1986-08-14 |
| YU18286A (en) | 1989-12-31 |
| IE58829B1 (en) | 1993-11-17 |
| CN86100428A (zh) | 1987-01-21 |
| OA08200A (en) | 1987-10-30 |
| IL77787A0 (en) | 1986-07-31 |
| PT81974B (pt) | 1988-07-01 |
| DE3686178T2 (de) | 1993-03-11 |
| ATE78869T1 (de) | 1992-08-15 |
| ES8801126A1 (es) | 1987-12-16 |
| GR860352B (en) | 1986-06-05 |
| HU201682B (en) | 1990-12-28 |
| JPS6237A (ja) | 1987-01-06 |
| ZA86874B (en) | 1986-12-30 |
| DE3686178D1 (de) | 1992-09-03 |
| NZ215023A (en) | 1989-07-27 |
| YU46814B (sh) | 1994-06-10 |
| EP0192626A1 (en) | 1986-08-27 |
| AP8600021A0 (en) | 1986-02-01 |
| AP18A (en) | 1988-04-02 |
| AU639588B2 (en) | 1993-07-29 |
| AU8260991A (en) | 1991-11-28 |
| DK62386A (da) | 1986-08-08 |
| HUT41844A (en) | 1987-05-28 |
| ES551657A0 (es) | 1987-12-16 |
| JPH0689032B2 (ja) | 1994-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK167817B1 (da) | Fusionspolypeptid og vaccine indeholdende polypeptidet samt anvendelse af polypeptidet til fremstilling af et farmaceutisk praeparat mod malaria | |
| JP4145348B1 (ja) | マラリア・プラスモジウム抗原ポリペプチドｓｅ３６変異体、その精製方法、並びにこれより得られる抗原を用いるワクチン及び診断剤 | |
| EP0191748B1 (en) | Malaria vaccine | |
| JP4573773B2 (ja) | マラリア・ワクチン | |
| Knapp et al. | Protection of Aotus monkeys from malaria infection by immunization with recombinant hybrid proteins | |
| EP0885012A1 (en) | Malaria vaccine based upon the addition of a msa1 peptide | |
| EP0544781B1 (en) | New peptides and their use | |
| AU634837B2 (en) | Malaria vaccine | |
| AU635737B2 (en) | Malaria vaccine | |
| IE910966A1 (en) | Plasmodium Sporozoite Antigen | |
| Uthaipibull | Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1: Antigenicity, immunogenicity and structure | |
| Toebe | Recombinant Plasmodium berghei merozoite surface protein-1 expressed in Salmonella: evaluation of immunogenicity in a rodent model | |
| Malaria | Immunization of Mice with DNA-Based | |
| Debus et al. | Malaria Vaccine | |
| PT100757A (pt) | Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PBP | Patent lapsed |