JPS6237A - ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 久吸盆ば託 本発明は、哺乳動物をマラリアから防御するワクチンに
関する。

発明の背景 マラリアは、長年鋭意研究が重ねられてきたにもかかわ
らず、ワクチンが開発されていない、重く、かつ広範囲
にわたる病気である。例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、第２２６巻、６７９頁（１９８４年１１月９日
）参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射したス
ポロゾイトを接種することにより、マラリアの病原体、
プラスモジウム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）による感染
に対して防御される。

クライトら、アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカ
ル・メジシン・アンド・ハイジーン（Ｃ１ｙｄｅｅｔ　
　ａｌ、　、Ａｍ、　Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　ＭｅｄｌＨｙ
ｇ、　）、第２４巻、３９７頁（１９７５）およびリー
クマンら、ブリティン、ダブリュー・エイチ・オー（Ｒ
ｉｅｃｋｍａｎｅｔ　　ａｌ、　、Ｂｕｌｌ、　ＷＨＯ
）、第５７巻（補遺ｌ）、２６１頁（１９７９）参照。

ヨシダら、サイエンス（Ｙｏｓｈｉｄａ　　ｅｔ　　ａ
ｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ）、第２０７巻、７１頁（１９
８０）は、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの
表面上のタンパク質、サーカムスボロゾイト（Ｃ８）タ
ンパク質に対する抗体により部分的に媒介され、ＣＳタ
ンパク質に対して生じたモノクローナル抗体は、ｉｎ　
　ｖｉｔｒ。

で感染を中和し、ｉｎ　　ｖｉｖｏで動物を防御する。

ＣＳタンパク質は、種内で高度に進化的に保存されるが
、種間ではかなり異なる。

プラスモジウムの４つの種は、ヒトを感染させることが
公知である。これらは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ。

ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐ、　ｏｖａｌｅ）
および四日熱原虫（Ｐ　、　ｍａｌａｒｉａｅ）であっ
て、後の２つは頻度が少ない。科学的に興味深い他の種
は、唱歯類住血胞子虫（Ｐ　、ｂｅｒｇｈｅｉ）および
猿マラリア原虫（Ｐ。

ｋｎｏｗｌｅｓｉ）であり、これらの種の宿主は、各々
、唱歯傾動物およびサルである。

猿マラリア原虫のＣＳタンパク質は、１２のアミノ酸配
列の１２のタンデム重複からなる。ザバラら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｚａｖａｌ
ａ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　
）、第１５７巻、ｌ９４７頁（１９８３）は、該重複単
位に対するモノクローナル抗体が、抗スポロゾイト抗血
清の可溶化スポロゾイトタンパク質に対する接触をブロ
ラクするという実験に基づいて、該重複単位が、猿マラ
リア原虫ＣＳタンパク質の主な免疫原であることを報告
している。ジシンら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン（Ｇｙｓｉｎ　　ｅｔ　　ａｔ、　、
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、　第１６０巻、９３５
頁（１９８４）は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質のタ
ンデム重複単位を表す合成の２４のペプチド残基は、サ
ルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和すること
を報告している。

コルマンら（Ｃｏｌｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ）　、国際
特許公開ＷＯ３４−２９２２−Ａ号（１９８４年８月２
日公開）は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質重複単位ノ
コ−ディング領域のタンパク質のクローニング、および
イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるそのβ−ラクタ
マーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報告
している。ヌッセンッバイクら（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉ
ｇ　　ｅｔ　　ａｌ、　）、米国特許第４４６６９１７
号は、Ｐ４４タンパク質と称するスボロゾイトタンパク
質、およびイー・コリにおけるそのクローニングおよび
発現を開示している。

エネアら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニスーｃ、イ（
Ｅｎｅａ　ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、第８１巻、７５２０頁（１９８４）
は、シノモルギマラリア原虫（Ｐ、　ｃｙｎｏｍｏｌｏ
ｇｉ）のＣＳタンパク質質重類似した重複単位構造を報
告している。

ケンプら（Ｋｅｍｐ　　ｅｔ　　ａｌ）　、国際特許公
開ＷＯ３４−０２９１７−Ａ号は、イー・コリにおける
熱帯熱マラリア原虫ｃＤＮＡのクローニングおよび発現
を開示している。

デイムら、サイエンス（Ｄａｍｅ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃ
ｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（１９８４）は、
イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫のＣＳタンパク
質のクローニングおよび発現を報告している。該タンパ
ク質は、分子量約４４０００の約４１２のアミノ酸から
なると記載されている。これは、テトラペプチドの４１
タンデム重複からなる。モノクローナル抗体に結合した
重複領域由来の合成の７−１１１−および１５−ペプチ
ド残基は、ＣＳタンパク質に対して発生する。

発明の概要 一態様において、本発明は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ　　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　ＣＳタ
ンパク質の４つ以上のタンデム重複からなる熱帯熱マラ
リア原虫による感染に対して哺乳動物において免疫を付
与することができる免疫原性ポリペプチドに関する。

他の態様において、本発明は、免疫防御量の本発明のポ
リペプチドおよび界薬上許容される担体からなる熱帯熱
マラリア原虫による感染に対してヒトを保護するワクチ
ンに関する。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は、ＣＳタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ゲ
ノムＤＮＡの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図である。 第ｉｂ図は、ｐＡｓｌの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 発明の詳細 な説明のポリペプチドは、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ
）において産生される４つ以上のタンデムＣＳタンパク
質重復単位からなる。該ポリペプチドは、ＣＳタンパク
質ではないが、重複単位以外のＣＳタンパク質の部分を
含んでもよい。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉ
ｐａｒｕｍ）重複単位は、次に示す配列を有するテトラ
ペプチドである： アスパラギン（ａｓｎ）−アラニン（ａｌａ）　−ａｓ
ｎ−プロリン（ｐｒｏ）−本発明のポリペプチド内で、
種々のテトラペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱
帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質に関して、その抗体の
反応性に著しく悪い影響を及ぼさない。 例えば、デイムら、サイエンス（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　
ａｌ、。 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（１９８４
）に開示されている如く、天然に存在する熱帯熱マラリ
ア原虫における４１テトラペプチド重複の３７はａｓｎ
　−ａｌａ　−ａｓｎ　−ｐｒｏであり、４はａｓｎ−
バリン（ｖａｌ）−アスパラギン酸（ａｓｐ）　−ｐｒ
ｏである。好ましくは、本発明のポリペプチドにおける
テトラペプチド重複単位の半分以上は、いわゆる共通塩
基配列、ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏである。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、約８重複（即ち
３２アミノ酸）〜約１４８重複からなる。 さらに好ましくは、ポリペプチドは、約１６〜約１１２
の重複からなる。 本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、即ち、非ＣＳ
タンパク質重複単位配列を有する融合ポリペプチドであ
ってもよい。かかる非ＣＳタンパク質重複配列は、免疫
原性を高めるか、または組換微生物におけるクローニン
グおよび発現を促進する担体分子として機能し得る。あ
るいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト免疫原
、他のプラスモジウム免疫原および／または池の非プラ
スモジウム免疫原に対する１以上のエピトープを担うこ
とができる。特に、イー・コリにおいて実施可能な量で
安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化
に関して必要でないことが判明しているＣＳタンパク質
は、本発明から除外され本明細書において例示する本発
明のポリペプチドの種類の具体例は、次のとおりである
：重複のＣ末端と融合したｐＢＲ３２２におけるテトラ
サイクリン耐性（ｔｅｔ　Ｒ）遺伝子由来の約３２のＮ
−末端アミノ酸を有する少なくとも４つの重複からなる
Ｒｔｅｔ３２ポリペプチド：重複のＣ末端と融合したｔ
ｅｔＲ遺伝子を有する少なくとも４つの重複からなるＲ
　ｔｅｔａｅポリペプチド； 重複のＣ末端と融合したＮＳＩの２２７のアミノ酸を有
する少なくとも４つの重複からなるＲＮＳｔポリペプチ
ド： 重複のＮ末端と融合したＮＳＩの８１のＮ末端アミノ酸
を有する少なくとも４つの重複からなるＮ５ＩＲポリペ
プチド； 重複のＣ末端で−グリシン残基が続いている少なくとも
４つの重複からなるＲＧポリペプチド；重複のＣ末端で
一ロイシンーアルギニン残基につながっている少なくと
も４つの重複からなるＲＬＡポリペプチド；および 重複のＣ末端で−ａｓｎ−ｔｈｒ−ｖａｌ′−５ｅｔ−
ｓｃｚｒにつながっている少なくとも４つの重複からな
るＲＮポリペプチド。 ＣＳタンパク質重複単位に関する遺伝子コーディング配
列は、公知の技術により得ることができる。 ・該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリスら、
ネイチ＋−（Ｅｌｌｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｎａｔ
ｕｒｅ）、第３０２巻、５３６頁（１９８３）に開示さ
れている様なメツセンジャーＲＮＡの逆転写により、熱
帯熱マラリア原虫から得られるものによるか、または、
前記デイムら（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ）により開示
されている様な、熱帯熱マラリア原虫ゲノムＤＮＡから
得られる完全な遺伝子の直接的クローニングによるもの
が挙げられる。図面に、ＣＳタンパク質コープ４ング領
域を示す。熱帯熱マラリア原虫およびそのスポロゾイト
は、感染したヒトおよび蚊より得ることができる。 ＣＳタンパク質の全部または一部に対するコーディング
配列をクローンし、重複単位の全部または一部をコード
するそのサブフラグメントを、公知の技術により調製す
ることができる。第１ａ図に、ＣＳタンパク質遺伝子内
の選択された有用な制限サイトを示す。好ましいサイト
はＸｈｏＵサイトである。ＸｈｏＩｒで切断すると、次
に示すＩ６重複のコーディング配列が得られる： Ｎ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−
ｐｒｏ）＋　５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒｏ）＋
）ｎＣ 〔式中、ｎは！である〕 適当な配列の多重タンデムＸｈｏｌＩフラグメントを用
いることにより、さらに長い重複、即ち、ｎが１以上で
ある重複が得られる。 合成技術は公知であり、かつ、商業的に入手可能なりＮ
Ａ合成装置を用いて達成することができる。実質的に同
じアミノ酸に関するコドンを有し、同じＸｈｏＩＩ末端
または末端に異なる開裂サイトを有する合成オリゴヌク
レオチドを合成することができる。かかる合成オリゴヌ
クレオチドは、天然の６４コドンと異なってもよく、同
じアミノ酸、または少数の、好ましくは約８未満の異な
るアミノ酸をコードし得る。ただし、これらはポリペプ
チドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさないものとす
る。典型的な合成コーディング配列は、完全に、共通塩
基配列、（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）ｎ（式中
、ｎは少なくとも４である）をコードする。 ポリペプチドのコーディング配列は、いかなるイー・コ
リ発現ベクターにも挿入することができ、その多くは公
知であり、かつ入手可能である。イー・コリにおける本
発明のポリペプチドの高レベルの発現は、生成物の異常
なアミノ酸組成（アスパラギン（ａｓｎ）約５０％、ア
ラニン（ａｌａ）２５％、プロリン（ｐｒｏ）　２５％
）の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドｐＡＳｌに含まれる様な、λ−ＰＬプロ
モーターおよびλ−ｃＩＩ　　リポソーム結合サイトか
らなる調節エレメントを用いて、コーディング配列がよ
く発現されることが判明している〔ローゼンベルクら、
メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇｅｔ　　ａｌ、　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　）、
第１０１巻、１２３頁（１９８３）およびシャツラマン
ら、エクスペリメンタル・マニピュレイション・オブ・
ジーン・エクスプレッション、エム・イノウニ編、アカ
デミツクプレス、ニューヨーク（Ｓｈａｔｚｍａｎ　　
ｅｔ　ａｌ、。 ｉｎ　　Ｅ　ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　　Ｍａｎｉｐｕ
ｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｇｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、　ｅｄｉｌ　ｂｙ　　Ｍ、　Ｉ　ｎｏｕｙｅ、　Ａ
ｃａｒｅｍｉｃＰｒｅｓ３２Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）（１
９８２）参照）、ｐＡＳｌは、ｐＢＲ３２２複製開始点
、アンピシリン耐性マーカーおよびＰＬ、Ｎ抗停止機能
認識サイト（Ｎ　ｕｔ　ＬおよびＮｕｔＲ）、ρ−依存
性転写停止シグナル（ｔＲｌ）およびＧ残基が直接Ｂａ
ｍＨＴ開裂サイトにつながっているｃＩＩ翻訳開始サイ
トを含むｃ■リポソーム結合サイトを含むλ由来の一連
のフラグメントを担う。Ｉ）ＡＳＩは、ｐＫｃ３０ｃＵ
から、ｐＫｃ３０ｃＩＩのｃｌｌ−ｐＢＲ３２２結合の
ＢａｍＨＩサイトおよびｃＩＩＡＴＧ　間のヌクレオチ
ドを切除し、該分子を再結紮して、ＡＴＧのすぐ下流に
ＢａｍＨＩサイトを再生することにより得ることができ
る。ｐＫｃ３０ｃＩ［は、ｐＫｃ３０のＨｐａＩ　　サ
イトに、ｃ■遺伝子を担うλ由来の１゜３ｋｂ　　Ｈａ
ｅＩ［フラグメントを挿入することにより組立てること
ができる（前記シャツラマンら（Ｓｈａｔｚｍａｎ　ｅ
ｔ　ａｔ、）および前記ローゼンベルクら（Ｒｏｓｅｎ
ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）参照）。Ｉ）ＫＣ３０は、シ
ミタケら、ネイチャー（Ｓｈｉｍｉｔａｋｅ　　ｅｔ　
　ａｌ、　、Ｎａｔｕｒｅ）、第２９２巻、１２８頁（
１９８１）により記載されている。これは、ｐＢＲ３２
２のＬｅｔ　Ｒ遺伝子のＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｍＨ
Ｉサイト間に挿入されたλの２゜４ｋｂ　　ＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｌＨ４フラグメントを有するｐＢｒ（３２２
誘導体である。ｐＡＳＩ　　に類似した構造は、コート
ニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔａｌ、、
Ｎａｔｕｒｅ）、第３１３巻、１４９頁（１９８５）に
記載されている。ｐＡｓｌは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に、ブダペスト条約に従っ
て寄託されている。コーディング配列は、有効に、即ち
、適当な配列で、適当な解読フレーム中で、イー・コリ
発現ベクターの調節エレメントに、標準的技術により結
合され、本発明の発現ベクターを形成する。 この様に発現されたポリペプチドを、公知の標単的タン
パク質単離技術により、増殖培養株から単離精製する。 典型的な、有用な一連の精製反応は、ｌ）細胞の破壊、
２）細胞片の清澄化、３）本発明のポリペプチドの、清
澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチドからの分
離、４）残存ポリペプチド、炭水化物、核酸および／ま
たはりポボリサッカライドを含む残存する汚染物質を除
去するための最終精製からなる。 第１工程は、例えば、リソシームまたは他の溶解または
浸透化剤を添加するか、あるいは機械的または超音波破
壊により達成することができる。 抽出物を清澄化するための遠心操作または濾過の前に、
界面活性剤を添加して、本発明のポリペプチドを溶液状
態に保つ。 本発明の一態様としては、本発明のある種のポリペプチ
ドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の溶解性を維持
するために界面活性剤を添加した後、約８０℃に加熱す
ることにより、他のポリペプチドから非常に効率よく分
離できることが判明した。少なくとも約４分間８０℃に
加熱することにより、実質的に重複または他の非熱変性
配列と融合した重複からなるポリペプチドを変性させる
ことなく殆んど全ての細菌性ポリペプチドを沈殿させら
れることが判明した。変性した細菌性ポリペプチドは、
遠心操作によりペレット化し、除去することができる。 この操作は、Ｒｔｅｔ３２、ＲＧ、ＲＬＡおよびＲｔｅ
ｔｓｅポリペプチドを精製するのに用いられる。特に、
この操作は、以下の実施例に記載の如く、ＲＩ　６　ｔ
ｅｔＨｌＲ３２ｔｅｔ３２、　Ｒ４８ｔｅｔ＋ｔ、Ｒ６
４ｔｅｔ３２、Ｒ４８Ｇ、Ｒ３２ＬＡおよびＲＩ　６　
ｔｅｔｅｅをうまく精製するのに用いられるが、Ｒ１６
ＮＳ１およびＲ３２ＮＳ　＋を加熱すると、これらのポ
リペプチドは沈殿する。 例えば、選択的沈殿剤を添加し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーまたは逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ等の仕上クロマ
トグラフィ一工程により、本発明のポリペプチドをさら
に精製することができる。 本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理的ｐＨに緩
衝された本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いる
ことができる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したかま
たはしていないポリペプチドを、いかなる各種公知のア
ジュバントと混合あるいは吸着させることができる。か
かるアジュバントとしては、とりわけ水酸化アルミニウ
ム、ムラミルジペプチドおよびＱｕｉｔ　Ａ等のサポニ
ンが挙げられる。別の変法例として、ポリペプチドをリ
ポソーム等の微粒子中に封入することができる。 さらに別法例として、死菌百日咳（Ｂ　ｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａ）または破傷風トキソイド等の免疫刺激性高分子に
接合することができる。 ワクチンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾
向および発展」ポーラ−ら編、ユニバシティー・パーク
・プレス（Ｎｅｗ　　Ｔｒｅｎｄｓ　　ａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｅｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　　Ｖａｃｃｉｎｅ３２　
　ｅｄｉｔｅｄ　　ｂｙＶｏｌｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ
、　、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　Ｐａｒｋ　　Ｐｒｅｓ
ｓ。 Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｕ、　Ｓ、　
Ａ）、（１９７８）に記載されている。リポソーム中へ
の封入は、例えば、７ユラートン（Ｆ　ｕｌｌｅｒｔｏ
ｎ）、米国特許第４２３５８７７号に記載されている。 タンパク質の高分子への接合は、例えば、リクハイトＣ
Ｌ　１ｋｈｉｔｅ）、米国特許第４３７２９４５号およ
びアーモーら（ａｒｍｏｒ　　ｅｔ　　ａｌ、　）、米
国特許第４４７４７５７号により開示されている。Ｑｕ
ｉｌ　Ａの使用は、例えばプレスガードら、アクタ・ベ
テリナリア・スカンジナビカ（Ｄａｌｓｇａａｒｄ　　
ｅｔ　　ａｌ、　、Ａｃｔａ、　Ｖｅｔ。 ５ｃａｎｄ、　）、第１８巻、３４９頁、（１９７７）
に開示されている。 各ワクチン投与量中に存在するポリペプチドの撒は、典
型的なワクチンにおける著しく有害な副作用なしに免疫
防御応答を惹起する量として選択される。かかる量は、
どのポリペプチドを用いるか、およびワクチン（４アジ
ユバントが添加されているか否かによって異なる。一般
に、各投与量はポリペプチドを１−１０．００μ９、好
ましくは、ｌＯ〜２００μ９含有する。特定のワクチン
に対する最適量は、抗体力価および患者における他の応
答の観察を含めた標準的考察により確かめることができ
る。第１回接種の後、患者は好ましくは約４週間後に追
加抗原投与を受け、その後、感染の危険性が存在するか
ぎり、６力月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。 以下の実施例で本発明を説明するが、これに限定される
ものではない。ＣＳタンパク質コーディング配列は、ジ
ェームズ・ウェーバ−、ウォルター・リード・アーミー
・インスティチュート・フォア・リサーチ（Ｊ　ａｍｅ
ｓ　　Ｗｅｂｅｒ、Ｗａｌｔｅｒ　　ＲｅｅｄＡｒｍｙ
　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　　ｆｏｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ）により、ｐＵＣ８（標準的なイー・コリクローニン
グベクター（例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ・インコーホレイテッド（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ３２　Ｉ　ｎｃ
、　、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）より入手可
能）のＥｃｏＲＩサイトにおけるλｍＰＦ１（前記デイ
ムら（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、　）参照）の２３３
７ｂｐ　　ＥｃｏＲＩフラグメント（第１ａ図参照）と
して得た。得られたｐｕｃｓ誘導体は、ｐＵＣ８クロー
ンｌと称する。 Ｘ車数 実施例Ｉ ＣＳタンパク質誘導体 精製したｐＵＣ８クローンｌプラスミドＤＮＡ４０μ９
を培地緩衝液（５０ｍＭ）リス、ｐＨ７、５５０ｍＭ　
　ＮａＣＱ、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１
０ｍＭ　　ＭｇＣ（２ｔ）　４００　ｔｔ（ｌ中制限エ
ンドヌクレアーゼ５ｔｕｌおよびＲｓａＩ　　（各酵素
、それぞれ１００単位）で３７℃にて１．５時間消化す
る。ＣＳタンパク質のはじめの１８アミノ酸以外をコー
ドする得られた１２１６塩基対フラグメントを、５％ポ
リアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上での電気泳動によ
り単離する。発現ベクターｐ、ＡＳ１　１０μ９を、培
地緩衝液２００μσ中制限エンドヌクレアーゼＴ３ａｔ
ａＨＴ　２５単位で、３７℃にて１．５時間消化する。 切断されたプラスミドを、次いでＤＮＡポリメラーゼ大
フラグメントで処理しくフレノウ５単位；２０ｍＭ）リ
ス−ＨＣＩ２．ｐＨ７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣ１２ｔ、
６０ｍＭ　　ＮａＣｌ２．　　６ｍＭ２−メルカプトエ
タノールおよび各０．２５１１ＩＭの４種のデオキシヌ
クレ才チドトリホスフェ−ト；２５℃、１５分）、Ｂａ
ｍＨＩサイトの末端をうめる。Ｃ８遺伝子フラグメント
１μ９を次いで３０μＱリガーゼバツフアー（５０ｍＭ
）リス、ｐＨ７，５、ｌ　ｍＭ　　Ｄ　Ｔ　Ｔ、　　１
０　ｍＭ　　ＭｇＣ（ｂ、■００μＭ　　ｒＡＴＰ）中
、１単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼで４℃にて１６時間、
このベクター１０００９に結紮する。該結紮混合物をイ
ー・コリＭＭ２９４ＣＩ＋株に形質転換し、アンピシリ
ン耐性コロニーを得、Ｃ８遺伝子フラグメントのｐＡｓ
Ｉ　　中への挿入に関してスクリーンする。適正な構造
を有するプラスミド（ｐＣＳＰ）を同定し、イー・コリ
Ｎ５１５１株（ｃＩ　ｔｓ８５７）に形質転換し、完全
なＣＳタンパク質の発現に関してテストする。 （タンパク質のアミノ末端での１８アミノ酸の欠失は、
真正ＣＳタンパク質の開裂シグナルペプチドに対応する
。）細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス（ＬＢ）中で３
２℃にて６５０ｎｍでの吸収（Ａａ、。）が０．６とな
る様に増殖させ、２時間４２°Ｃで発現プラスミドのＰ
Ｌプロモーターの転写およびその結果ＣＳタンパク質誘
導体の翻訳が起こる。 細胞のＩＩＩＩＱをサンプルにとり、ペレット化し、溶
解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ２．ｐＨ７，８，２
５％（Ｖ／　Ｖ）グリセロール、２％２−メルカプトエ
タノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０
．１％ブロモフェニルブルー）中に再懸濁し、１０５℃
加熱ブロック中で５分間インキュベートする。タンパク
質を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１３％アクリルアミド３０：
０．８　　アクリルアミド：ビスアクリルアミド比）に
より分離する。タンパク質をニトロセルロースに移し、
イー・コリにおいて産生されたＣＳタンパク質を、熱帯
熱マラリア原虫ＣＳタンパク質のテトラペプチド重複領
域と反応性の５つのモノクローナル抗体のプールを用い
て、ウェスタンプロット分析により検出する（前記デイ
ムら（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、　）参照）。 実施例２ Ｒ１６ｔｅｔｓｓ 精製したＰＵＣ８クローン１プラスミド１００μ９を培
地緩衝液４００μｇ中制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ
ｒ４０単位で３７℃にて、１６時間消化する。ＣＳタン
パク質の１６テトラベプチド重複をコードづける１９２
塩基対フラグメントを次いでＰＡＧＥにより単離する。 発現ベクターｐＡｓｌを実施例１に記載したのと同様に
して制限エンドヌクレアーゼＢａＩＩＩＨＩで開裂させ
る。実施例１に記載したのと同様にして、１９２塩基対
のＸｈｏＩ［フラグメント１μ９をｐＡｓｌ　　１００
ｎｙのＢａｍＨｒサイトに結紮する。結紮ミックスをイ
ー・コリＭＭ２９４ＣＩ十株に形質転換する。クローン
は、該プラスミドのＢａｍＨＩ　−ＨｌｎｄＩＩ　　フ
ラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
りｐＡｓｌのＢａｍＨＩサイトで適正な配列である１９
２塩基対のＸｈｏｌｌフラグメントを含有し、Ｈｉｎｄ
■サイトがｔｅｔ　Ｒ遺伝子の下流であり、ＢａｍＨＩ
サイトがｃｕＡＴＧ　および適正な配列のプラスミドの
挿入部の結合点にあるものと同定される。このプラスミ
ドｐＲｌ　６　ｔｅｔｅｓは、次の様に表されるＢＨＢ
Ｂ （図中、ＢＨはＢａｍＨ［サイトを意味し、ＢはＢａｎ
■サイト、Ｓは終止コドンを意味する）。ｐＲＬ６ｔｅ
ｔｓｓは、イー・コリＮ５１５１株（ｃｌｔｓ８５７）
を形質転換するのに用いられ、ウェスタン・プロット分
析によりＣＳタンパク質のテトラペプチド重複の産生に
関して調べる。この様にして産生されたタンパク質は、
次の様な配列を有する：Ｎ−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ（
ａｓｎ−ａｌａ−ａｓｎ−ｐｒｏ）＋ｓ　（ａｓｎ−ｖ
ａｌａｓｐ−ｐｒｏ）＋Ｔ　８６−Ｃ （式中、Ｔａ２はｐＡｓｌ上に存在するテトラサイクリ
ン耐性遺伝子由来の８６アミノ酸である）。 Ｎ−末端メチオニン（ｍｅＬ）残基も、ベクター、より
詳しくは、ｃｌＩタンパク質開姶コドン由来である。 実施例２Ａ Ｒ３２ｔｅｔｅｅおよびＲ４８ｔｅｔ＋＋ａ精製したｐ
ＲＩ　６　ｔｅｔｓｓプラスミドＤＮＡｌ０Ｉを培地緩
衝液２００μＱ中ＢａｍＨＩ　２５単位で３７℃にて２
時間、消化する。このＤＮＡ１００１１９を次いで前記
と同様にして、１９２塩基対のＸｈｏＩＩフラグメント
ｌμ９と結紮する。次のポリペプチドをコードするプラ
スミド発現ベクター、ｐＲ３２ｔｅｔａｅおよびｐＲ４
８ｔｅｔａａを調製し、イー・コリにおいて発現させる
： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　５−（ａｓｎ−ｖａｌ　−ａｓ
ｐ−ｐｒｏ）＋　）　ｎ−Ｔ　８６−Ｃ（式中、ｎは２
　（Ｒ３２ｔｅｔｓａ）またはｎは３（Ｒ４８ｔｅｔｓ
ｇ）である。）ｎが２または３であるｐＡｓ１クローン
は、前記と同様にして、各々ｎが２または３以外である
クローンから選択される。調べた全てのクローンは、適
正な配列の挿入部を有していた。Ｒ３２ｔｅｔｓｅおよ
びＲ４８ｔｅｔｓｅは両方とも、イムノブロッティング
により評価される如く、Ｒ１６ｔｅｔａａとほぼ同じレ
ベルで発現される。 数種のＲｔｅｔｓｅタンパク質のイムノプロット分析に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染
色により見られない不均一な生成物があることが示され
る。これらのタンパク質は、以下に記載の如（Ｒｔｅｔ
、、ポリペプチドのおよそ半量まで蓄積されると考えら
れる。最小の分解生成物の大きさは、クローン中のテト
ラペプチド重複の数に比例する。これらのタンパク質の
不安定性は、不均質Ｃ０ＯＨ末端の低下による。 実施例３ Ｒ１６ｔｅｔ３を 精製したｌ）Ｒ１６ｔｅｔｓｓ　ＤＮＡ　Ｉ　Ｏμ９を
培地緩衝液２００μＱ中制限エンドヌクレアーゼＢａｎ
Ｉ［２５単位で、３７℃にて２時間で切断する。切断し
たＤＮＡ１００ｎ９を次いで結紮する。この操作により
１４塩基対のＢａｎＩＩフラグメントが欠失し、残存す
るＢａｎＩ［サイトのすぐ下流に終止コドンが生じる。 得られたプラスミドＰＲ１６ｔｅｔｓｔを用いてイー・
コ゛すＮ５１５１株においてＲ１６ｔｅｔａｔを発現さ
せ、Ｒ１６ｔｅｔｓｔをこれから精製する。 Ｒｌ　６　ｔｅｔ３２を含有するイー・コリ３０９（湿
潤重量）を緩衝液Ａ（５０ｍＭトリスＨＣｌ２．ｐＨ８
，０，２ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）、０
．１ｍＭジチオトレイトール、５％（Ｖ／Ｖ）グリセロ
ール）２００１１２中に再懸濁させる。リソザイムを添
加して最終濃度を０　、２　ｍｇ／ｘＱにし、該混合物
を水上で３０分間インキュベートし、細胞を溶解させる
。該混合物を次いでワーリングブレングー中、最高値に
セットして３分間処理し、次いでブランラン３５０超音
波装置で１分間超音波処理することにより、微生物性Ｄ
ＮＡを除去する。デオキシコール酸ナトリウムを添加し
て最終濃度を０．１％（ｗ／　ｖ）にし、この混合物を
４℃にて３０分間撹拌する。該懸濁液を次いで１２００
０ｘｙで３０分間遠心操作に付し、細胞片を除去する。 上清をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で１０分間インキ
ュベートし、１２０００Ｘ９で３０分間遠心分離する。 殆ど全てのイー・コリタンパク質が、加熱工程中に沈殿
し、遠心操作中にペレット化され、一方、Ｒ１６ｔｅｔ
３．タンパク質は溶解性で、上清中に含まれる。上清を
集め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添加して、最
終濃度を飽和状態の２０％とする。これにより、Ｒ１６
ｔｅｔ３２タンパク質が選択的に沈殿し、これを遠心操
作（１２０００×９で３０分間）により集める。この時
点で、Ｒ１６ｔｅｔ３２は、他の汚染バクテリアタンパ
ク質に関して約９５％純粋である。 最終クロマトグラフィ一工程（例えば、イオン交換、逆
相高速液体クロマトグラフィー、フェニルセファロース
クロマトグラフィー、サイズ・セパレーション等）を行
い、タンパク質、炭水化物、核酸またはりポポリザッカ
ライド等の他の物質による残存する汚染物質を除去する
。Ｒｌ　６　ｔｅＥ３２を発現させ、イー・コリタンパ
ク質全体の５％にほぼ等しいレベル、即ち、フーマシー
ブルー染色により示される様な、約３０〜６０Ｒ９／Ｌ
で精製する。 Ｒｌ　６　ｔｅｔ３２は次に示す配列を有する：Ｎ　−
ｍｅｔ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−ａｓ
ｎ−ｐｒｏ）　Ｒ５（ａｓｎ−ｖａドａｓｐ−ｐｒｏ）
＋）　ｎＴ　３２−Ｃ（式中、ｎは１ＳＴ３２はテトラ
サイクリン耐性遺伝子由来の３２アミノ酸である。）さ
らに詳しくは、Ｔａ２は、次の様に配列ニ ー　Ｉｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ　−ｔｈｒ−ｈｉｓ−ａｒ
ｇ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ｈｉｓ　−ｈｉｓ−ａｒｇ　−ａ
ｒｇ−ｈ　ｉｓ−ａｒｇ−ａｙｓ−ｇａｙ−ａｙｓ　−
ｔｒｐ−ａｒｇ　−１ｅｕ　−ｔｙｒ−ａｒｇ−ａｒｇ
−ｈｉｓ−ｈｉｓ−ａｒｇ−ｔｒｐ−ｇｌｙ−ａｒｇ−
ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｓｅｒ−Ｃを有し、残存するＢａｎＩ
Ｉサイトは、３０および３１残基の間にある。 実施例３Ａ Ｒ３２ｔｅｔ＋ｔ、Ｒ４８ｔｅｔ３を 前記実施例３と実質的に同様にして、Ｒ３２ｔｅｔ＋ｔ
およびＲ４８ｔｅｔ３２（各々、Ｒ１６ｔｅｔ＋ｔにお
いてｎが２および３である）をイー・つりにおいて発現
させ、Ｒ１６ｔｅｔｓ！と同じレベルおよび程度の純度
に単離する。出発ベクターは、各々、ｐＲ３２ｔｅｔｇ
ｇおよびｐＲ４８ｔｅｔ＋＋ｇである。 実施例３Ｂ Ｒ６４ｔｅｔｔｔｑ　Ｒ８０ｔｅｔ＋を精製したｐＲ４
れｅｔ、、プラスミドＤＮＡｌ０゜Ｒ９を培地緩衝液２
００μ（２中ＢａｍＨＩ２５単位で、３７℃にて２時間
消化する。このＤＮＡ１００ｎ９を次いで前記と同様に
して、１９２塩基対のＸｈｏ・■フラグメントｌμ９と
結紮する。次に示すポリペプチドをコードするプラスミ
ド発現ベクターを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る。 Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　Ｒ５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐ
ｒｏ）＋）　ｎ−Ｔ　３２−Ｇ（式中、ｎは４　（Ｒ６
４ｔｅＬａｔ）またはｎは５（Ｒ８０ｔｅｔａ＊）であ
る）。ｎが４または５であるｐＡｓ１クローンを、前記
と同様にして、各々、ｎが４または５以外であるクロー
ンから選択する。　ｒ（６４ｔｅｔｓｔお上びＲ８０ｔ
ｅｔｔｔは両方ともＲ４８ｔｅｔ３２とほぼ同じレベル
で発現する。Ｒ６４ｔｅｔ、、を、前記ＲＩ　６　ｔｅ
ｔｓｔ、Ｒ３２ｔｅｔ＋ｚおよびＲ４８ｔｅｔ３２と実
質的に同じ方法で精製する。 実施例３Ｃ Ｒ９６ｔｅｔｓｔおよびＲＩ　ｌ　２　ｔｅｔ３を前記
実施例３Ｂに記載したのと実質的に同様にして、Ｒ９６
ｔｅｔ＋ｔおよびＲｌ　１２　ｔｅｔ＋ｔ（各々、ｎは
６および７である）をＲ４８ｔｅｔ３２とほぼ同じレベ
ルでイー・コリにおいて発現させる。出発ベクターはｐ
Ｒ−８０ｔｅｔａｔである。 イムノプロット分析により、精製したＲｔｅｔｓｔポリ
ペプチドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、バ
ンドに対応する主要な反応性種がタンパク質染色により
見られる。５ＤＳ−ＰＡＧＥによって得られる分子量は
、予想値の約２倍であるが、各タンパク質の移動は、各
構造中のテトラペプチドの数に比例する。数種のＲｔｅ
ｔｓｔポリペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予想
通りの値を示す。 実施例４ １６Ｇ ｐＴｅｒｍは、配列： ５°−ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡ　　
　−３’３″−ＧＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴ
ＡＧ　−５’を有する合成リンカ−を、ｐＡＳＩのＢａ
ｍＨＩ　　サイトに挿入することにより調製される。ｐ
Ａｓｔ１０１ｔ９を２５単位のＢａｍＨＩで消化する。 １００ｎ９のＢａｍＨ１切断ｐＡＳ１を２Ｏｎ９の合成
リンカ−と結紮し、プラスミドｐＴｅｒｍをｐＡｓｌの
Ｂａｎ１−１１サイトに挿入されたリンカ−で同定する
。このベクターはＢａｍＨＩサイトを有し、全ての３種
の解読フレーム中にｃＵ　タンパク質のＡＴＧ開始コド
ンの下流にＴＧＡ終止コドンが挿入される。 ｐＲ１６Ｇは、ｐＵＣ８クローン１由来の１９２塩基対
のＸｈｏＩＩフラグメントをｐＴｅｒｍのＢａｍＨＩサ
イトに挿入することにより調製し、適正な配列の１つの
ＸｈｏＩ［挿入部を有するクローンを、実質的に前記と
同様にして選択する。 実質的に前記と同様にして、ｐＲ１６Ｇをクローン化し
、イー・コリＮ５１５１株において発現させる。 Ｒ１６Ｇは、次に示す配列を有する： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　ｒ　ｓ　−（ａｓｎ−ｖａｌ　−ａ
ｓｐ−ｐｒｏ）＋）　　ｎ−ｇ！ｙ−Ｃ（式中、ｎはｌ
である）。 このタンパク質は芳香族残基を含有していないので、発
現レベルを定量化するクーマシーブリリアントブルーＲ
−２５０染色法によって視覚化することができない。Ｃ
Ｓタンパク質に関して特異的な５種のモノクローナル抗
体を用いたイムノプロット分析（前記デイムら（Ｄ　ａ
ｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、）参照）により、クーマン−ブ
リリアントブルーＲ−２５０染色が可能なＲ１６ｔｅｔ
ａｔと比較して評価したレベルは、全細胞タンパク質の
約１％である。 実施例４Ａ Ｒ３２Ｇ、Ｒ４８Ｇ、Ｒ６４ＧＳＲ８０ＧおよびＲ１１
２Ｇ 前記実施例４と同様にして、Ｒ３２Ｇ、Ｒ４８ＧＳＲ６
４Ｇ、Ｒ８０ＧおよびＲ１１２Ｇ（Ｒｔ６Ｇにおいて各
々、ｎが２．３．４．５または７である）をイー・コリ
Ｎ５１５１株において発現させる。これらのポリペプチ
ドは、Ｒ１６Ｇとほぼ゛同じレベルで発現される。実質
的に実施例３に記載したのと同様にして、Ｒ４８Ｇを精
製する。 実施例５ Ｒ１６ＬＡおよびＲ３２ＬＡ 実質的に実施例４に記載したのと同様にして、配列： ５°−ＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴ　　　−３゜３°−
ＧＣＧＡＣＧＣＡＡＣＴＡｉ５゜を有する合成リンカ−
をｐＡｓｌのＢａｍＨＩ　　サイトに挿入することによ
りｐＴ　ｅｒｍ　２を調製する。 ｐＴ　ｅｒｍ　２はＩ３ａｍＨＩ３Ｉトを有する。ｐＵ
Ｃ８クローン１由来の１９２塩基対のＸｈｏＩＩフラグ
メントを前記と同様にして挿入する。各々、適正な配列
の１種または２種のＸｈｏＩ［挿入部を有するクローン
であるｐＲ１６ＬＡおよびｐＲ３２ＬＡを、実質的に前
記と同様にして選択する。実質的に実施例３に記載した
のと同様にして、Ｒ３２ＬＡをイ製する。 実質的に前記と同様にして、ｐＲＩ６ＬＡおよびｐＲ３
２ＬＡをクローン化し、イー・コリＮ５１５１株におい
て発現させる。 Ｒ１６ＬＡおよびＲ３２ＬＡはっぎの配列を有する： Ｎ−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−ａ
ｓｎ−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒｏ
）＋）　ｎ−１ｅｎ−１ｅｕ−０４式中、ｎは、各々、
ｌおよび２である）。Ｃ末端のロイシンおよびアルギニ
ンは、ｐＴ　ｅｒｍ　２の合成リンカ−由来のものであ
る。Ｒ１６ＬＡは全イー・コリタンパク質の約１％で発
現され、一方、Ｒ３２ＬＡは、全細胞タンパク質の約５
％で発現される。 実施例６ １６ＮＳ１ ｐＡｓ１デルタＥＨは、ｐＡｓＩ　　起源のｐＢＲ３２
２の必須でないＥｃｏＲ［−Ｈ１ｎｄＩ［ｒ領域の切除
により調製される。実質的に前記と同様にして、ｌＯμ
９のｐＡｓｌを、培地緩衝液２００μσ中ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩ（各々、２０単位）で切断し、ＤＮ
Ａポリメラーゼ（フレノウ）で処理し、結紮し、イー・
コリ中に形質転換する。２９塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ｈ
ｌｎｄｌｌｌ　フラグメントが欠失したクローンを同定
する。８６１塩基対のビールス原および３７５塩基対の
ｐＢＲ３２２原中にインフルエンザビールス（Ａ／ＰＲ
／８／３４）ＮＳ　Ｉコーディング領域を含有するｐＡ
ＰＲ８０１の１２３６塩基対のＢａｍＨＩフラグメント
（ヤングら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（
Ｙｏｕｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、　　、Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ。 Ｓ　、Ａ）、第８０巻、６１０５頁（１９８３）参照）
を、ｐＡｓｌデルタＥＨのＢａｍＨＩサイトに挿入する
。得られたプラスミド、ｐＡｓｌデルタＥＨ／８０１は
真正のＮ５Ｉ（２３０アミノ酸）を発現する。このプラ
スミドは、Ｃｍ翻訳開始サイトおよびＮＳＩコーディン
グ配列間にＢａｍＨＩサイトを有する。 実質的に前記と同様にして、ＰＡＳＩデルタＥＨ／８０
１　１０μ９を、ハイ・バッファー（５０ＩＩＭトリス
ーＨＣＩ２、ｐＨ７，５，１ｍＭ　　ＤＴＴ。 １０ｍＭ　　ＭｇＣＱ＊、１００ｍＭ　　ＮａＣ１２）
２００μσ中ＥｃｏＲＩ　２０単位および５ａｌ１２Ｑ
単位で、３７℃にて２時間で切断し、ＤＮＡポリメラー
ゼ大フラグメント（フレノウ）で処理し、結紮する。 ６５０塩基対のＥｃｏＲＩ　−Ｓａｌ　Ｉ領域が欠失し
たクローンを単離する。このプラスミド、ｐＮｓｌデル
タＥＳは真正のＮＳＩを発現する。 ｐＵＣ８クローン１由来の１９２塩基対のＸｈ。 ■フラグメントをｐＮｓ１デルタＥＳ中のＢａｍＨ■サ
イト中に挿入することによりｐＲ１６Ｎｓｌを調製し、
実質的に前記と同様にして、適正な配列の１つのＸｈｏ
ＩＩ挿入部を有するクローンを選択する。 煮沸工程を除いて、実質的に前記と同様にして、ｐＲ１
６Ｎｓ１をクローンし、イー・コリにおいて発現し、Ｒ
１６ＮＳ１を精製する。 Ｒ１６ＮＳ１は、次の配列を有する： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−ｐｒ
ｏ）＋　）　ｎ−Ｎ　２２７（式中、ｎは１、Ｎ２２７
は、ＮＳＩ起源の２２７アミノ酸である）。 Ｒ１６ＮＳｌ調製におけるＲ１６ＮＳ１は、煮沸または
イオン交換工程なしで、タンパク質の８０％以上と評価
された。特に著しく高い比率を示すＲ１６ＮＳ１は、総
細胞タンパク質の約２５％である。 実施例６Ａ Ｒ３２ＮＳ　ｌ５Ｒ４８ＮＳＬおよびＲ６４ＮＳＬ煮沸
工程を除いて、実質的に実施例３に記載したのと同様に
して、Ｒ３２ＮＳｌ　　（Ｒ１６ＮＳ１においてｎが２
である）をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから
精製する。Ｒ３２ＮＳ　１はＲ１６ＮＳ１とほぼ同じレ
ベルで発現され、同じ程度まで精製する。 実質的に前記と同様にして、Ｒ４８ＮＳ１（Ｒ１６ＮＳ
ｌにおいてｎが３である）およびＲ６４ＮＳＩ（Ｒ１６
ＮＳ１においてｎが４である）をイー・コリにおいて発
現させる。Ｒ４８ＮＳ１およびＲ６４ＮＳ１は、各々、
総イー・コリタンパク質の約１０％および約５％で発現
する。 実施例７ ５ＩＲ４Ｂ 実質的に前記と同様にして、ｐＲ４８ｔｅｔｓｓをＢａ
ｍＨＩで開裂させ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ）で
末端をうめる。プラスミドを次いで前記の如（ＢａｎＩ
［で開裂させ、３つのＸｈｏＩ［フラグメントを担う６
７２塩基対のフラグメントおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子由来の９６塩基対を得る。 実質的に前記と同様にして、ｌＯμ９の１）ＡＳＩデル
タＥＨ／８０１をハイバッファ−２００μσ中Ｎｃｏ１
２０単位で３７℃にて２時間で切断し、ＤＮＡポリメラ
ーゼ大フラグメント（フレノウ）で末端をうめる。Ｎｃ
ｏＩサイトは、ＮＳＩ中の８１残基に関するコドン中に
ある。プラスミドを次いで前記の如＜Ｂａｎｎ切断して
残存するＮｓｌコドンおよびテトラサイクリン耐性遺伝
子の一部を切除し、ｐＡｓ１デルタＥＨ／８０１−１を
得る。 ６７２塩基対のＢａＩＩＩＨＩ（末端をうめたもの）−
ＢａｎＩＩフラグメントを１）ＡＳＩデルタＥＨ／８０
１−１に挿入してｐＮｓＩＲ４Ｂ　を調製する。このプ
ラスミドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにお
いて発現させる。ＮＳ　Ｉｎ２８は、次の配列を有する
： Ｎ　−８１Ｎ　−ａｓｐ−ｐｒｏ　Ｃ（ａｓｎ−ａｌａ
−ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋５（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ−
ｐｒｏ）＋　）　ｎ−Ｔ　３２−Ｃ（式中、８１ＮはＮ
ＳＩの８１Ｎ末端アミノ酸、ｎは３、Ｔａ２は前記のと
おりである）。　Ｎ５ＩＲ４８は総細胞タンパク質の約
５％で発現される。 実施例８ ３２Ｎ 実質的に前記と同様にして、ｌＯμ９のｐＲ３２ＮＳＩ
を培地緩衝液２００μＱ中Ｈｉｎｄｌｌ１２５単位で３
７℃にて２時間で切断し、ｐＲ３２Ｎｓ１−１を得る。 ＨｉｎｄＩＩｌ　サイトはＮＳＩコーディング領域中の
残基５に関するコドン中にある。ｐＲ３２ＮＳＩ−１１
００ｎ９を次いで実質的に前記と同様にして結紮する。 得られたプラスミド、ｐＲ３２Ｎは、ＮＳＩコーディン
グ配列において、５番目のコドンの後にＴＡＡ終止コド
ンを含有する。 ｐＲ３２Ｎは、実質的に前記と同様にしてイー・コリに
おいてＲ３２Ｎを発現するのに用いる。 Ｒ３２Ｎは、次の配列を有する： Ｎ　−ｍｅｔ−ａｓｐ−ｐｒｏ　（（ａｓｎ−ａｌａ−
ａｓｎ−ｐｒｏ）　＋　５−（ａｓｎ−ｖａｌ−ａｓｐ
−ｐｒｏ）＋−）　ｎ−Ｎ　５−Ｃ（式中、ｎは２、Ｎ
ＳはＮＳＩ　遺伝子由来の５つのアミノ酸である）。さ
らに詳しくは、ＮＳは、次の配列を有するニ ーａｓｎ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ｓｅｒ−ｓｅｒ−ＣＲ３２
Ｎは総イー・コリタンパク質の約５％で発現される。 実施例９ 抗体応答−ＥＬＩＳＡ 組換タンパク質Ｒ１６ｔｅｔ３ｚ、Ｒ３２ｔｅｔ３．お
よびＲ４８ｔｅｔｓｔを実質的に前記と同様にして精製
し、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７、０（ＰＢ
Ｓ）に対して透析し、アリコートをとり、−８０℃にて
貯蔵する。構築物を、ＰＢＳ、水酸化アルミニウム（明
パン）または完全フロインドアジュバント（ＣＦ　Ａ）
のいずれかと混合して、５０μ９のタンパク質を含有す
る０、５蛙の投与量を得る。 ＰＢＳ中ＣＦＡ（Ｇ　Ｔ　ＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ
ａｎｄ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）十抗原をｌ：ｌの比で、機
械的撹拌機で３０分間撹拌することにより乳濁化させる
。明パンをＰＢＳ中に希釈した水酸化アルミニウムゲル
（ＵＳＰ）から調製する。 ４℃にて１２時間回転式混合機で、抗原は明パンに吸着
される。該懸濁液をさらに１２時間静置し、上清を廃棄
して、ｌ投与量につきＡｌ２Ｏ，８０屑９および組換タ
ンパク質５０μ９を得る。６〜８週令のＣ５７Ｂ１／６
マウスを総量５０μ９のタンパク質を皮下投与および腹
腔内投与により免疫化する（１群につき５匹）。被験動
物に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の４
週間後に追加抗原投与をする。ただし、ＣＦＡ中免疫原
を受けた群には、不完全フロインドアジュバント（ＩＦ
Ａ）中孔濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。１
週間後、尾から採取した血を全部ため、−夜４°Ｃにて
凝固させ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清
を必要になるまで一８０℃にて保存する。 固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、熱帯熱マ
ラリア原虫ＣＳタンパク質（ａｓｎ−ａ（２ａ−ａｓｎ
−ｐｒｏ）＊の４つの重複からな、る１６アミノ酸合成
ペプチドとの反応性に関して、全ての血清をテストする
（デイムら、サイエンス（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｌ、
。 Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、第２２５巻、５９３頁（１９８４
）参照）。合成ペプチド抗原を牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）と結合させ、これをマイクロタイタープレートの孔
に塗布する。０．０１Ｍ　リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７
，４（’ＰＢＳ）で希釈したスクリーニング抗原５０μ
ＱＣ０，１μ９）をポリスチレンマイクロタイタープレ
ート（イムンロン２　ダイナチク・ラボラトリーズ（Ｉ
　ｍｍｕｎｌｏｎ　２　　Ｄ　ｙｎａｔｅｃｈ　　Ｌ　
ａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅ３２Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　
　ＶＡ）のくぼみにピペットで添加し、−夜室温（約２
２℃ＸＲＴ）に保つ。 孔内容物を次いで、吸引し、ブロッキングバッファー（
ＢＢ＝ＰＢＳ中１．０％ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０
．００５％チメルソールおよびｏ、ｏ　ｏ　。 ５％フェノールレッド）を充填し、１時間室温に保つ。 マウスの血清を連続してＢＢ中に希釈し、５０μｅを番
孔に添加する。室温にて２時間インキュベートした後、
孔を吸引し、ＰＢＳ−０，０５％ツイーン２０（ＰＢＳ
−ＴＷ２０）で３回洗浄し、１０％ＰＢＳ中熱不活化ヒ
ト血清で１１５００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ
＋ＬＸバイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ　）と接合したホースラディ
ツシュパーオキシダーゼ５０μＱを番孔に添加する。１
時間後、孔内容物を吸引し、ＰＢＳ−ＴＷ２０で３回洗
浄し、次いで基質（１ｍｇ２．２°−アジノージ−（３
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−６）１０．１Ｍ
クエン酸リン酸緩衝液、ｐＨ４，０＋＆、使用直前に０
．００５％過酸化水素を添加）を番孔に添加する。４１
４ｎｍにおける吸収を１時間後にＥＬ　Ｉ　ＳＡプレー
トリーダー（ティターチク・マルチスキャン、フロー・
ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｔ　１ｔｅｒ
ｔｅｋ　　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ、　　Ｆ　ｌｏｗｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅ３２　Ｉ　ｎｃ、　、ＭｃＬ　ｅａｎ
、　Ｖ　Ａ））で測定する。 Ｒ１６ｔｅｔＨｌＲ３２ｔｅｔｓｔおよびＲ４８ｔｅｔ
３を構築物は、全てＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて反応する抗
体を産生する。Ｒ１６ｔｅｔＨは、単独で投与した場合
、Ｒ３２ｔｅｔｓｔおよびＲ４８ｔｅｔｓｔに比べて免
疫原性が劣る。明パンおよびＣＦＡは両方とも３種のタ
ンパク質全部の免疫原性を高め、抗体は、少なくともｌ
領域で滴定により１０２０００検出される。 実施例１Ｏ 抗体応答−ＩＦＡ 実施例９で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分折（ＩＦ
Ａ）でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク
質と強く反応することが示された。 猿マラリア原虫、シノモルギマラリア原虫（Ｐ。 ｃｙｎｏｍｏｌｇｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ　、　
ｖｉｖａ）、およびガリナケウムマラリア原虫（Ｐ　、
ｇａｌｌｉｎａｃｅｕｍ）に対する反応性は検出されな
かった。Ｒ３２ｔｅｔ３ｚに対する抗血清の反応性は、
若干、嘔歯類住血胞子虫（Ｐ　、ｂｅｒｇｈｅｉ）に関
してみられた。この結果は、ホックマイヤーら、プロシ
ーデンクズ・サード・インターナショナル・シンポジウ
ム・オブ・イムノバイオロジー、プロテインズペブタイ
ズ、アタッン、エム・ゼット編、プレナム（Ｈｏｃｋｍ
ｅｙｅｒ　　ｅｔａｌ、、　　ｉｎ　　Ｐｒｏｃ、　３
ｄ　　Ｉｎｔ’１．　Ｓｙｍｐ、　　ｒｍｍｕｎｏ−ｂ
ｉｏｌ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　Ｐｅｐｔｉｄｅ３２　
　ｅｄ、　ｂｙ　Ａｔａｓｓｉ。 Ｍ、２’、、、　　Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒ
ｋ（ｉｎｐｒｅｓｓ）による、熱帯熱マラリア原虫に対
するある種のＭａｂは、ＩＦＡにより、唱歯類住血胞子
虫スポロゾイトと反応することを示すデータと一致する
。 実質的にボスワース、ジャーナル・オプ・バラシトロシ
イ（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ、　Ｊ　、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、
）、第６１巻、７６９頁（１９７５）に記載されている
のと同様にして、スポロゾイトを感染した蚊の唾液腺か
ら摘出し、食塩水または０．５％ＢＳＡを含有するＭｅ
ｄｉｕｍ　Ｉ　９９　（Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ）中に希釈し
、血球計算盤で計測し、２０００〜５０００スポロゾイ
ト／１０μｇに希釈する。１０μρのアリコートを、マ
ルチウェルプリンテッドＩＦＡスライドの番孔に入れ、
室温で乾燥し、−８０℃にて保存する。 ＩＦＡは、まず、ＢＢで１／１００に希釈した血清２０
μｇ容を、乾燥したスポロゾイトを入れたＩＦＡスライ
ドの孔に入れることにより開始する。湿潤室内で室温に
て２０分間インキュベートした後、該血清溶液を吸引し
、スポットを２滴のＰＢＳで洗浄する。ＢＢでｌ　：４
０に希釈したフルオレセインイソチオシアネート（キル
ケガード・アンド・ぺり−（Ｋｉｒｋｅｇｏｒｄ　　ａ
ｎｄ　　Ｐｅｒｙ。 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　　ＭＤ）と接合したヤ゛
ギ抗マウス抗体２０μｇを次いで各スポットに添加する
。再び室温にて２０分間インキュベートした後、該スポ
ットを再び２滴のＰＢＳで洗浄し、グリセロールに添加
し、５００倍のＵＶ光の下で蛍光に関して調べる。 実施例１１ Ｃ１２反応 ＲＩ　６　Ｌｅｔ、！、Ｒ３２Ｌｅｔ、、およびＲ４８
Ｌｅｔ３゜で免疫化したマウス由来の血清は、強いｃｓ
Ｐ陽性反応を示す（第１表参照）。アジュバントなしで
投与した場合、ＲＩ　６　Ｌｅｔ３．だけが、陽性のＣ
１２反応を示す抗体を産生せず、一方、ＣＦＡまたは明
パンとともに投与した場合、３つの構築物は全て強いＣ
１２反応を示す抗体を産生じた。 第１表 Ｒ１６Ｌｅｔ、２、Ｒ３２ｔｅｔＨおよびＲ４８Ｌｅｔ
Ｈに対する血清のＣＳＰ反応性 抗血清 アジュバント　Ｒ１６ｔｅｔ３２　　Ｒ３２ｔｅｔ３２
　　Ｒ４８ｔｅｔ３２なし　　　　　Ｏ／２５（−）　
１７／２５（２＋）　２１／２５（４＋）ＣＦＡ　　２
３／２５（４＋）２１／２５（４＋）２１／２５（４＋
）明パン　　　２５／２５（４＋）　２５／２５／（４
＋）　　１６／２７（２＋−４＋） Ｃ１２反応は、基本的にファンデルベルクら、（Ｖａｎ
ｄｅｒｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｉｌ、　Ｍｅｄ、）
、第１３４巻（補遺ｌ）、１１８３頁（１９６９）によ
り記載されているのと同様にして行う。Ｍｅｄｉｕｍ　
１９９　中に再懸濁させた熱帯熱マラリア原虫５００〜
１゜００を含有する蚊唾液腺スポロゾイトを、顕微鏡ス
ライド上で血清５μｇと混合し、カバーガラスをかけ、
ベトロリウムゼリーをふちにつけて密封し、３７℃にて
１時間インキュベートする。位相差顕微鏡で４００倍で
反応を評価する。２５のランダムスポロゾイトを、各血
清サンプルに関して調べ、Ｃ８Ｐ陽性生体の数を表に示
す。前記ファンデルベルクら（Ｖａｎｄｅｒｂｅｒｇ　
　ｅｔ　　ａｌ、）により記載されているＣＳＰ反応度
を書き加えである。 （−）は、ＣＳＰ反応性が検出されないことを示す；（
２＋）は、スポロゾイトの表面上に粒状の沈殿が見られ
ることを示す；（４＋）は、スポロゾイトの一端に、長
い糸状フィラメントが見られることを示す。正常マウス
血清、およびＣＦＡのみで免疫化したマウスから得た血
清は、同様の分析で検出可能なＣ８Ｐ活性を示さなかっ
た。 実施例■２ 肝臓細胞ブロッキング 前記実施例９で得た血清を、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでの侵
入阻害分析で調べた（第２表）。これらのデータにより
、Ｒ３２ｔｅｔｓｔおよびＲ４８ｔｅｔｓｚタンパク質
はアジュバントの非存在下でも抗体に強いブロッキング
活性を惹起することがわかる。Ｒ１６ｔｅｔ＋ｔは、適
用され明パンに吸収される場合は、強いブロッキング抗
体の惹起にあまり有効でない。これは、Ｒｌ　６　ｔｅ
ｔ、、タンパク質に生じる抗血清にっいて見られる弱い
ＣＳＰ反応性および低いＥＬＩＳＡ滴定値と一致する。 第２表 ｉｎ　　ｖｉＬｒｏの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト
侵入ＨｅｐＧ２−Ａｌ１へパトーム細胞の阻害な　　し
　　　　　　　　　　　　４６　　　　　　９５　　　
　　　９２ＣＦＡ　　　　　　　７６　　　９２　　　
９４明パン　　　　　１００　　１００　　　９６培養
細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ポリングデイルら、
ジャーナル・オブ・イムノロシイ（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａ
ｌｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕ、　
ｎｏｌ、）第３２巻、９０９頁（１９８４）により記載
されているのと実質的に同様にして行なわれる。Ｒ１６
ｔｅｔ３２、Ｒ３２ｔｅｔｓｔおよびＲ４８ｔｅｔａｔ
構築物で免疫化されたマウスから得た血清を、熱帯熱マ
ラリア原虫スポロゾイトによる培養細胞の侵入の阻害性
に関してテストした。血清を培養液中に希釈し、Ｈｅｐ
Ｇ２−Ａ１６細胞培養物に添加して、最終希釈度を１　
：　２０　（ｖ／ｖ）にする。次いで１２０００〜４０
０００の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適
用した培養物を、３７℃にて５％ＣＯ４雰囲気下で３時
間インキュベートし、Ｄ　ｕｌｂｅｃｃ。 のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、メタノー
ル中で凝固させて、ＰＢＳで２回洗浄する。 細胞中にはいったスポロゾイトは、免疫パーオキシダー
ゼ分析（ＩＰＡ）により視覚化できる（前記ホリングデ
イルら（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ　　ｅｔ　　ａｔ、参
照）。ＩＰＡは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア
原虫に対するＭａｂ（２Ｆ　１　、１　、前記デイムら
（Ｄａｍｅ　　ｅｔ　　ａｔ、参照）で処理し、次いで
、ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したウサ
ギ抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベートし
、３．３−ジアミノベンジジンで染色することにより行
う。培養細胞中に侵入したスポロゾイトの数を、ライフ
（Ｌ　ｅｉｔｚ）の顕微鏡で、２５０倍で、暗青色フィ
ルターを用いて、全調製物中に存在する細胞内寄生体の
計測により測定する。 実験は、２回または３回ずつ行い、同一の実験において
は、各細胞培養物に同数のスポロゾイトを添加する。阻
害は、正常マウス血清対照例と比較した杭構築免疫血清
によるスポロゾイト侵入の減少率（％）であり、ＣＳ反
応性Ｍａｂ２Ｆ　　１．１により、希釈［１／２０で１
００％のスポロゾイト侵入阻害が得られた。 実質的に前記と同様にして調製した組換タンパク質、Ｒ
ＬＡ、Ｒ１６ＮＳ　＋およびＲ３２ＮＳ　１を、同様に
ＥＬＩＳＡおよびＩＦＡ分析でテストし、同様に、１６
合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、陽性のＣ２
Ｆ反応を示すことが判明した。Ｒ３２ｔｅｔ３２および
Ｒ３２ＬＡは、その反応の均一性、発現レベルおよび調
製の容易性のために好ましい。 合成的に製造したワクチンの第一の問題は、合成免疫原
性に対して産生された抗体が真正分子を認識するかどう
か、および該抗体が防御を付与するのに十分な生物学的
性質を有するかどうかである。免疫蛍光分析およびＣＳ
Ｐ反応の両方を示す実施例により、イー・コリ構築物に
対して産生された抗体は、スポロゾイトの表面と反応し
、従って、真正ＣＳタンパク質を認識することがわかる
。 ＣＳＰ抗体は動物およびヒトにおいて存在し、防御免疫
と重要な関連があることが判明している。 杭構築抗体がｉｎ　　ｖｉｔｒｏでヒトへプトーマのス
ポロゾイト侵入を阻害することは明らかである。前記ホ
リングデイルら（Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ　　ｅｔ　　
ａｌ、）は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア
原虫に対するＭａｂは両方とも、これらの７９９７７種
に対するヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、
スポロゾイト侵入をブロックすることを示している。ｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏでのスポロゾイト侵入のブロッキング
は、従って防御抗体に関する評価として考慮される。従
って、該データは全体として、侵入のワクチンは、熱帯
熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染からヒトを防御
するのに用いることができることがわかる。 ＥＬＩ　ＳＡ滴定により評価されるこれらの組換タンパ
ク質、表面反応性（ＩＦＡおよびＣＳＰにより示される
）およびスポロゾイト侵入のブロッキングに対する免疫
応答は、完全フロインドアジュバントまたは明パンのい
ずれかを用いることにより高められる。完全フロインド
アジュバントは、発熱させ、肉芽腫を生じさせ、その結
果、ツベルクリン過感作となるので、ヒトにおいて用い
ることができない。明パンは、現在、ジフテリアおよび
破傷風トキソイド等の確立されたワクチン、ならびに最
新ワクチンの一種、Ｂ型肝炎において、アジュバントと
して用いられている。これは、有効で、ヒトにおいて長
期間安全に使用できることが実証されている。 実施例１３ ワクチン調製物 一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。３％
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液（１０ｍＭリン酸ナ
トリウム、１５０　ｍＭＮａｃ１２．　ｐＨ６。 ８：濾過により滅菌化）に、同様の緩衝液中本発明のポ
リペプチド溶液を撹拌しながら添加し、ポリペプチドの
最終濃度を１００μｇ／ｌｔｒσ、アルミニウム（Ａ　
Ｑ”　＋　）の最終濃度を１．０１／！１２にする。ｐ
Ｈを６．６　に保つ。該混合物を約０℃にて一夜静置す
る。チメルソールを添加し、最終濃度を０．００５％に
する。Ｉ）Ｈをチェックし、要すれば、６゜８に調節す
る。 以上の様に本発明およびその好ましい具体例を記載した
が、本発明は、記載した具体例に限定されるわけではな
く、むしろ特許請求の範囲に含まれるあらゆる修飾が含
まれる。 ４、簡単な図面の説明 第１ａ図は、ＣＳタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｕｉｍｆａｌｃ
ｉｐａｒｕｍ）ゲノムＤＮＡの領域の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。 第１ｂ図は、ｐＡｓｌの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）４つ以上の熱帯熱マラリア原虫 （Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳ
   タンパク質のタンデム重複単位からなることを特徴とす
   るポリペプチド。
2. （２）少なくとも４重複からなる前記第（１）項のポリ
   ペプチド。
3. （３）少なくとも約１６重複単位〜約１４８重複単位か
   らなる前記第（１）項のポリペプチド。
4. （４）Ｒｔｅｔ＿３＿２ポリペプチド、ＲＮＳ１ポリペ
   プチド、ＮＳ１Ｒポリペプチド、Ｒｔｅｔ＿８＿６ポリ
   ペプチド、ＲＧポリペプチド、ＲＬＡポリペプチドおよ
   びＲＮポリペプチドからなる群より選ばれる前記第（１
   ）項のポリペプチド。
5. （５）Ｒ１６ｔｅｔ＿８＿６　Ｒ３２Ｇ Ｒ３２ｔｅｔ＿８＿６　　　　Ｒ４８Ｇ Ｒ４８ｔｅｔ＿８＿６　　　　Ｒ６４Ｇ Ｒ１６ｔｅｔ＿３＿２　　　　Ｒ８０Ｇ Ｒ３２ｔｅｔ＿３＿２　　　　Ｒ１１２Ｇ Ｒ４８ｔｅｔ＿３＿２　　　　Ｒ１６ＬＡ Ｒ６４ｔｅｔ＿３＿２　　　　Ｒ３２ＬＡ Ｒ８０ｔｅｔ＿３＿２　　　　Ｒ１６ＮＳ１Ｒ９６ｔｅ
   ｔ＿３＿２　　　　Ｒ３２ＮＳ１Ｒ１１２ｔｅｔ＿３＿
   ２　　　Ｒ４８ＮＳ１Ｒ１６Ｇ　　　　　　　　　　Ｒ
   ６４ＮＳ１ＮＳ１Ｒ４８　　　　　　　　Ｒ３２Ｎ である前記第（４）項のポリペプチド。
6. （６）Ｒ３２ｔｅｔ＿３＿２またはＲ３２ＬＡである前
   記第（４）項のポリペプチド。
7. （７）免疫防御量の前記第（１）項のポリペプチドおよ
   び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
   帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
   を防御するためのワクチン。
8. （８）免疫防御量の前記第（２）項のポリペプチドおよ
   び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
   帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
   を防御するためのワクチン。
9. （９）免疫防御量の前記第（３）項のポリペプチドおよ
   び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
   帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
   を防御するためのワクチン。
10. （１０）免疫防御量の前記第（４）項のポリペプチドお
    よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
    熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
    トを防御するためのワクチン。
11. （１１）免疫防御量の前記第（５）項のポリペプチドお
    よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
    熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
    トを防御するためのワクチン。
12. （１２）免疫防御量の前記第（６）項のポリペプチドお
    よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
    熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
    トを防御するためのワクチン。