JPS6237A - ワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
久吸盆ば託
本発明は、哺乳動物をマラリアから防御するワクチンに
関する。
関する。
発明の背景
マラリアは、長年鋭意研究が重ねられてきたにもかかわ
らず、ワクチンが開発されていない、重く、かつ広範囲
にわたる病気である。例えば、サイエンス(Scien
ce)、第226巻、679頁(1984年11月9日
)参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射したス
ポロゾイトを接種することにより、マラリアの病原体、
プラスモジウム(P lasmodium)による感染
に対して防御される。
らず、ワクチンが開発されていない、重く、かつ広範囲
にわたる病気である。例えば、サイエンス(Scien
ce)、第226巻、679頁(1984年11月9日
)参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射したス
ポロゾイトを接種することにより、マラリアの病原体、
プラスモジウム(P lasmodium)による感染
に対して防御される。
クライトら、アメリカン・ジャーナル・オブ・トロピカ
ル・メジシン・アンド・ハイジーン(C1ydeet
al、 、Am、 J、 Trop、 MedlHy
g、 )、第24巻、397頁(1975)およびリー
クマンら、ブリティン、ダブリュー・エイチ・オー(R
ieckmanet al、 、Bull、 WHO
)、第57巻(補遺l)、261頁(1979)参照。
ル・メジシン・アンド・ハイジーン(C1ydeet
al、 、Am、 J、 Trop、 MedlHy
g、 )、第24巻、397頁(1975)およびリー
クマンら、ブリティン、ダブリュー・エイチ・オー(R
ieckmanet al、 、Bull、 WHO
)、第57巻(補遺l)、261頁(1979)参照。
ヨシダら、サイエンス(Yoshida et a
l、 、5cience)、第207巻、71頁(19
80)は、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの
表面上のタンパク質、サーカムスボロゾイト(C8)タ
ンパク質に対する抗体により部分的に媒介され、CSタ
ンパク質に対して生じたモノクローナル抗体は、in
vitr。
l、 、5cience)、第207巻、71頁(19
80)は、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの
表面上のタンパク質、サーカムスボロゾイト(C8)タ
ンパク質に対する抗体により部分的に媒介され、CSタ
ンパク質に対して生じたモノクローナル抗体は、in
vitr。
で感染を中和し、in vivoで動物を防御する。
CSタンパク質は、種内で高度に進化的に保存されるが
、種間ではかなり異なる。
、種間ではかなり異なる。
プラスモジウムの4つの種は、ヒトを感染させることが
公知である。これらは、熱帯熱マラリア原虫(P、 f
alciparum)、三日熱マラリア原虫(P。
公知である。これらは、熱帯熱マラリア原虫(P、 f
alciparum)、三日熱マラリア原虫(P。
vivax)、卵形マラリア原虫(P、 ovale)
および四日熱原虫(P 、 malariae)であっ
て、後の2つは頻度が少ない。科学的に興味深い他の種
は、唱歯類住血胞子虫(P 、berghei)および
猿マラリア原虫(P。
および四日熱原虫(P 、 malariae)であっ
て、後の2つは頻度が少ない。科学的に興味深い他の種
は、唱歯類住血胞子虫(P 、berghei)および
猿マラリア原虫(P。
knowlesi)であり、これらの種の宿主は、各々
、唱歯傾動物およびサルである。
、唱歯傾動物およびサルである。
猿マラリア原虫のCSタンパク質は、12のアミノ酸配
列の12のタンデム重複からなる。ザバラら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン(Zaval
a et al、 、J、 Exp、 Med、
)、第157巻、l947頁(1983)は、該重複単
位に対するモノクローナル抗体が、抗スポロゾイト抗血
清の可溶化スポロゾイトタンパク質に対する接触をブロ
ラクするという実験に基づいて、該重複単位が、猿マラ
リア原虫CSタンパク質の主な免疫原であることを報告
している。ジシンら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン(Gysin et at、 、
J、 Exp、 Med、 )、 第160巻、935
頁(1984)は、猿マラリア原虫CSタンパク質のタ
ンデム重複単位を表す合成の24のペプチド残基は、サ
ルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和すること
を報告している。
列の12のタンデム重複からなる。ザバラら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン(Zaval
a et al、 、J、 Exp、 Med、
)、第157巻、l947頁(1983)は、該重複単
位に対するモノクローナル抗体が、抗スポロゾイト抗血
清の可溶化スポロゾイトタンパク質に対する接触をブロ
ラクするという実験に基づいて、該重複単位が、猿マラ
リア原虫CSタンパク質の主な免疫原であることを報告
している。ジシンら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン(Gysin et at、 、
J、 Exp、 Med、 )、 第160巻、935
頁(1984)は、猿マラリア原虫CSタンパク質のタ
ンデム重複単位を表す合成の24のペプチド残基は、サ
ルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和すること
を報告している。
コルマンら(Colman et al) 、国際
特許公開WO34−2922−A号(1984年8月2
日公開)は、猿マラリア原虫CSタンパク質重複単位ノ
コ−ディング領域のタンパク質のクローニング、および
イー・コリ(E、 coli)におけるそのβ−ラクタ
マーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報告
している。ヌッセンッバイクら(Nussenzwei
g et al、 )、米国特許第4466917
号は、P44タンパク質と称するスボロゾイトタンパク
質、およびイー・コリにおけるそのクローニングおよび
発現を開示している。
特許公開WO34−2922−A号(1984年8月2
日公開)は、猿マラリア原虫CSタンパク質重複単位ノ
コ−ディング領域のタンパク質のクローニング、および
イー・コリ(E、 coli)におけるそのβ−ラクタ
マーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報告
している。ヌッセンッバイクら(Nussenzwei
g et al、 )、米国特許第4466917
号は、P44タンパク質と称するスボロゾイトタンパク
質、およびイー・コリにおけるそのクローニングおよび
発現を開示している。
エネアら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニスーc、イ(
Enea et al、 、Proc、 Natl、
Acad。
カデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニスーc、イ(
Enea et al、 、Proc、 Natl、
Acad。
Sci、USA)、第81巻、7520頁(1984)
は、シノモルギマラリア原虫(P、 cynomolo
gi)のCSタンパク質質重類似した重複単位構造を報
告している。
は、シノモルギマラリア原虫(P、 cynomolo
gi)のCSタンパク質質重類似した重複単位構造を報
告している。
ケンプら(Kemp et al) 、国際特許公
開WO34−02917−A号は、イー・コリにおける
熱帯熱マラリア原虫cDNAのクローニングおよび発現
を開示している。
開WO34−02917−A号は、イー・コリにおける
熱帯熱マラリア原虫cDNAのクローニングおよび発現
を開示している。
デイムら、サイエンス(Dame et al、、5c
ience)、第225巻、593頁(1984)は、
イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク
質のクローニングおよび発現を報告している。該タンパ
ク質は、分子量約44000の約412のアミノ酸から
なると記載されている。これは、テトラペプチドの41
タンデム重複からなる。モノクローナル抗体に結合した
重複領域由来の合成の7−111−および15−ペプチ
ド残基は、CSタンパク質に対して発生する。
ience)、第225巻、593頁(1984)は、
イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク
質のクローニングおよび発現を報告している。該タンパ
ク質は、分子量約44000の約412のアミノ酸から
なると記載されている。これは、テトラペプチドの41
タンデム重複からなる。モノクローナル抗体に結合した
重複領域由来の合成の7−111−および15−ペプチ
ド残基は、CSタンパク質に対して発生する。
発明の概要
一態様において、本発明は、熱帯熱マラリア原虫(Pl
asmodium falciparum) CSタ
ンパク質の4つ以上のタンデム重複からなる熱帯熱マラ
リア原虫による感染に対して哺乳動物において免疫を付
与することができる免疫原性ポリペプチドに関する。
asmodium falciparum) CSタ
ンパク質の4つ以上のタンデム重複からなる熱帯熱マラ
リア原虫による感染に対して哺乳動物において免疫を付
与することができる免疫原性ポリペプチドに関する。
他の態様において、本発明は、免疫防御量の本発明のポ
リペプチドおよび界薬上許容される担体からなる熱帯熱
マラリア原虫による感染に対してヒトを保護するワクチ
ンに関する。
リペプチドおよび界薬上許容される担体からなる熱帯熱
マラリア原虫による感染に対してヒトを保護するワクチ
ンに関する。
第1a図は、CSタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫(P、 falciparum)ゲ
ノムDNAの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図である。 第ib図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 発明の詳細 な説明のポリペプチドは、イー・コリ(E、 coli
)において産生される4つ以上のタンデムCSタンパク
質重復単位からなる。該ポリペプチドは、CSタンパク
質ではないが、重複単位以外のCSタンパク質の部分を
含んでもよい。熱帯熱マラリア原虫(P、 falci
parum)重複単位は、次に示す配列を有するテトラ
ペプチドである: アスパラギン(asn)−アラニン(ala) −as
n−プロリン(pro)−本発明のポリペプチド内で、
種々のテトラペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱
帯熱マラリア原虫CSタンパク質に関して、その抗体の
反応性に著しく悪い影響を及ぼさない。 例えば、デイムら、サイエンス(Dame et
al、。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)に開示されている如く、天然に存在する熱帯熱マラリ
ア原虫における41テトラペプチド重複の37はasn
−ala −asn −proであり、4はasn−
バリン(val)−アスパラギン酸(asp) −pr
oである。好ましくは、本発明のポリペプチドにおける
テトラペプチド重複単位の半分以上は、いわゆる共通塩
基配列、asn−ala−asn−proである。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、約8重複(即ち
32アミノ酸)〜約148重複からなる。 さらに好ましくは、ポリペプチドは、約16〜約112
の重複からなる。 本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、即ち、非CS
タンパク質重複単位配列を有する融合ポリペプチドであ
ってもよい。かかる非CSタンパク質重複配列は、免疫
原性を高めるか、または組換微生物におけるクローニン
グおよび発現を促進する担体分子として機能し得る。あ
るいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト免疫原
、他のプラスモジウム免疫原および/または池の非プラ
スモジウム免疫原に対する1以上のエピトープを担うこ
とができる。特に、イー・コリにおいて実施可能な量で
安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化
に関して必要でないことが判明しているCSタンパク質
は、本発明から除外され本明細書において例示する本発
明のポリペプチドの種類の具体例は、次のとおりである
:重複のC末端と融合したpBR322におけるテトラ
サイクリン耐性(tet R)遺伝子由来の約32のN
−末端アミノ酸を有する少なくとも4つの重複からなる
Rtet32ポリペプチド:重複のC末端と融合したt
etR遺伝子を有する少なくとも4つの重複からなるR
tetaeポリペプチド; 重複のC末端と融合したNSIの227のアミノ酸を有
する少なくとも4つの重複からなるRNStポリペプチ
ド: 重複のN末端と融合したNSIの81のN末端アミノ酸
を有する少なくとも4つの重複からなるN5IRポリペ
プチド; 重複のC末端で−グリシン残基が続いている少なくとも
4つの重複からなるRGポリペプチド;重複のC末端で
一ロイシンーアルギニン残基につながっている少なくと
も4つの重複からなるRLAポリペプチド;および 重複のC末端で−asn−thr−val′−5et−
sczrにつながっている少なくとも4つの重複からな
るRNポリペプチド。 CSタンパク質重複単位に関する遺伝子コーディング配
列は、公知の技術により得ることができる。 ・該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリスら、
ネイチ+−(Ellis et al、 、Nat
ure)、第302巻、536頁(1983)に開示さ
れている様なメツセンジャーRNAの逆転写により、熱
帯熱マラリア原虫から得られるものによるか、または、
前記デイムら(Dame et al)により開示
されている様な、熱帯熱マラリア原虫ゲノムDNAから
得られる完全な遺伝子の直接的クローニングによるもの
が挙げられる。図面に、CSタンパク質コープ4ング領
域を示す。熱帯熱マラリア原虫およびそのスポロゾイト
は、感染したヒトおよび蚊より得ることができる。 CSタンパク質の全部または一部に対するコーディング
配列をクローンし、重複単位の全部または一部をコード
するそのサブフラグメントを、公知の技術により調製す
ることができる。第1a図に、CSタンパク質遺伝子内
の選択された有用な制限サイトを示す。好ましいサイト
はXhoUサイトである。XhoIrで切断すると、次
に示すI6重複のコーディング配列が得られる: N −asp−pro ((asn−ala−asn−
pro)+ 5(asn−val−asp−pro)+
)nC 〔式中、nは!である〕 適当な配列の多重タンデムXholIフラグメントを用
いることにより、さらに長い重複、即ち、nが1以上で
ある重複が得られる。 合成技術は公知であり、かつ、商業的に入手可能なりN
A合成装置を用いて達成することができる。実質的に同
じアミノ酸に関するコドンを有し、同じXhoII末端
または末端に異なる開裂サイトを有する合成オリゴヌク
レオチドを合成することができる。かかる合成オリゴヌ
クレオチドは、天然の64コドンと異なってもよく、同
じアミノ酸、または少数の、好ましくは約8未満の異な
るアミノ酸をコードし得る。ただし、これらはポリペプ
チドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさないものとす
る。典型的な合成コーディング配列は、完全に、共通塩
基配列、(asn−ala−asn−pro)n(式中
、nは少なくとも4である)をコードする。 ポリペプチドのコーディング配列は、いかなるイー・コ
リ発現ベクターにも挿入することができ、その多くは公
知であり、かつ入手可能である。イー・コリにおける本
発明のポリペプチドの高レベルの発現は、生成物の異常
なアミノ酸組成(アスパラギン(asn)約50%、ア
ラニン(ala)25%、プロリン(pro) 25%
)の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドpASlに含まれる様な、λ−PLプロ
モーターおよびλ−cII リポソーム結合サイトか
らなる調節エレメントを用いて、コーディング配列がよ
く発現されることが判明している〔ローゼンベルクら、
メソッズ・オブ・エンザイモロジー(Rosenber
get al、 、Meth、 Enzym、 )、
第101巻、123頁(1983)およびシャツラマン
ら、エクスペリメンタル・マニピュレイション・オブ・
ジーン・エクスプレッション、エム・イノウニ編、アカ
デミツクプレス、ニューヨーク(Shatzman
et al、。 in E xperimental Manipu
lation of geneExpressio
n、 edil by M、 I nouye、 A
caremicPres32New York)(1
982)参照)、pASlは、pBR322複製開始点
、アンピシリン耐性マーカーおよびPL、N抗停止機能
認識サイト(N ut LおよびNutR)、ρ−依存
性転写停止シグナル(tRl)およびG残基が直接Ba
mHT開裂サイトにつながっているcII翻訳開始サイ
トを含むc■リポソーム結合サイトを含むλ由来の一連
のフラグメントを担う。I)ASIは、pKc30cU
から、pKc30cIIのcll−pBR322結合の
BamHIサイトおよびcIIATG 間のヌクレオチ
ドを切除し、該分子を再結紮して、ATGのすぐ下流に
BamHIサイトを再生することにより得ることができ
る。pKc30cI[は、pKc30のHpaI サ
イトに、c■遺伝子を担うλ由来の1゜3kb Ha
eI[フラグメントを挿入することにより組立てること
ができる(前記シャツラマンら(Shatzman e
t at、)および前記ローゼンベルクら(Rosen
berg et al、)参照)。I)KC30は、シ
ミタケら、ネイチャー(Shimitake et
al、 、Nature)、第292巻、128頁(
1981)により記載されている。これは、pBR32
2のLet R遺伝子のHindlllおよびBamH
Iサイト間に挿入されたλの2゜4kb HindI
II−BalH4フラグメントを有するpBr(322
誘導体である。pASI に類似した構造は、コート
ニーら、ネイチャー(Courtney etal、、
Nature)、第313巻、149頁(1985)に
記載されている。pAslは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(AmericanType
Cu1tureCo11ection、Rockvi
lle、Maryland)に、ブダペスト条約に従っ
て寄託されている。コーディング配列は、有効に、即ち
、適当な配列で、適当な解読フレーム中で、イー・コリ
発現ベクターの調節エレメントに、標準的技術により結
合され、本発明の発現ベクターを形成する。 この様に発現されたポリペプチドを、公知の標単的タン
パク質単離技術により、増殖培養株から単離精製する。 典型的な、有用な一連の精製反応は、l)細胞の破壊、
2)細胞片の清澄化、3)本発明のポリペプチドの、清
澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチドからの分
離、4)残存ポリペプチド、炭水化物、核酸および/ま
たはりポボリサッカライドを含む残存する汚染物質を除
去するための最終精製からなる。 第1工程は、例えば、リソシームまたは他の溶解または
浸透化剤を添加するか、あるいは機械的または超音波破
壊により達成することができる。 抽出物を清澄化するための遠心操作または濾過の前に、
界面活性剤を添加して、本発明のポリペプチドを溶液状
態に保つ。 本発明の一態様としては、本発明のある種のポリペプチ
ドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の溶解性を維持
するために界面活性剤を添加した後、約80℃に加熱す
ることにより、他のポリペプチドから非常に効率よく分
離できることが判明した。少なくとも約4分間80℃に
加熱することにより、実質的に重複または他の非熱変性
配列と融合した重複からなるポリペプチドを変性させる
ことなく殆んど全ての細菌性ポリペプチドを沈殿させら
れることが判明した。変性した細菌性ポリペプチドは、
遠心操作によりペレット化し、除去することができる。 この操作は、Rtet32、RG、RLAおよびRte
tseポリペプチドを精製するのに用いられる。特に、
この操作は、以下の実施例に記載の如く、RI 6 t
etHlR32tet32、 R48tet+t、R6
4tet32、R48G、R32LAおよびRI 6
teteeをうまく精製するのに用いられるが、R16
NS1およびR32NS +を加熱すると、これらのポ
リペプチドは沈殿する。 例えば、選択的沈殿剤を添加し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーまたは逆相HP L C等の仕上クロマ
トグラフィ一工程により、本発明のポリペプチドをさら
に精製することができる。 本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理的pHに緩
衝された本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いる
ことができる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したかま
たはしていないポリペプチドを、いかなる各種公知のア
ジュバントと混合あるいは吸着させることができる。か
かるアジュバントとしては、とりわけ水酸化アルミニウ
ム、ムラミルジペプチドおよびQuit A等のサポニ
ンが挙げられる。別の変法例として、ポリペプチドをリ
ポソーム等の微粒子中に封入することができる。 さらに別法例として、死菌百日咳(B ordetel
la)または破傷風トキソイド等の免疫刺激性高分子に
接合することができる。 ワクチンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾
向および発展」ポーラ−ら編、ユニバシティー・パーク
・プレス(New Trends andDeve
lopements in Vaccine32
edited byVoller et al
、 、University Park Pres
s。 Baltimore、Maryland、U、 S、
A)、(1978)に記載されている。リポソーム中へ
の封入は、例えば、7ユラートン(F ullerto
n)、米国特許第4235877号に記載されている。 タンパク質の高分子への接合は、例えば、リクハイトC
L 1khite)、米国特許第4372945号およ
びアーモーら(armor et al、 )、米
国特許第4474757号により開示されている。Qu
il Aの使用は、例えばプレスガードら、アクタ・ベ
テリナリア・スカンジナビカ(Dalsgaard
et al、 、Acta、 Vet。 5cand、 )、第18巻、349頁、(1977)
に開示されている。 各ワクチン投与量中に存在するポリペプチドの撒は、典
型的なワクチンにおける著しく有害な副作用なしに免疫
防御応答を惹起する量として選択される。かかる量は、
どのポリペプチドを用いるか、およびワクチン(4アジ
ユバントが添加されているか否かによって異なる。一般
に、各投与量はポリペプチドを1−10.00μ9、好
ましくは、lO〜200μ9含有する。特定のワクチン
に対する最適量は、抗体力価および患者における他の応
答の観察を含めた標準的考察により確かめることができ
る。第1回接種の後、患者は好ましくは約4週間後に追
加抗原投与を受け、その後、感染の危険性が存在するか
ぎり、6力月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。 以下の実施例で本発明を説明するが、これに限定される
ものではない。CSタンパク質コーディング配列は、ジ
ェームズ・ウェーバ−、ウォルター・リード・アーミー
・インスティチュート・フォア・リサーチ(J ame
s Weber、Walter ReedArmy
In5titute for Re5earc
h)により、pUC8(標準的なイー・コリクローニン
グベクター(例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ・インコーホレイテッド(B ethesda R
esearchLaboratorie32 I nc
、 、Gaithersburg、 MD)より入手可
能)のEcoRIサイトにおけるλmPF1(前記デイ
ムら(Dame et al、 )参照)の233
7bp EcoRIフラグメント(第1a図参照)と
して得た。得られたpucs誘導体は、pUC8クロー
ンlと称する。 X車数 実施例I CSタンパク質誘導体 精製したpUC8クローンlプラスミドDNA40μ9
を培地緩衝液(50mM)リス、pH7、550mM
NaCQ、1mMジチオトレイトール(DTT)、1
0mM MgC(2t) 400 tt(l中制限エ
ンドヌクレアーゼ5tulおよびRsaI (各酵素
、それぞれ100単位)で37℃にて1.5時間消化す
る。CSタンパク質のはじめの18アミノ酸以外をコー
ドする得られた1216塩基対フラグメントを、5%ポ
リアクリルアミドゲル(PAGE)上での電気泳動によ
り単離する。発現ベクターp、AS1 10μ9を、培
地緩衝液200μσ中制限エンドヌクレアーゼT3at
aHT 25単位で、37℃にて1.5時間消化する。 切断されたプラスミドを、次いでDNAポリメラーゼ大
フラグメントで処理しくフレノウ5単位;20mM)リ
ス−HCI2.pH7,5,7mM MgC12t、
60mM NaCl2. 6mM2−メルカプトエ
タノールおよび各0.2511IMの4種のデオキシヌ
クレ才チドトリホスフェ−ト;25℃、15分)、Ba
mHIサイトの末端をうめる。C8遺伝子フラグメント
1μ9を次いで30μQリガーゼバツフアー(50mM
)リス、pH7,5、l mM D T T、 1
0 mM MgC(b、■00μM rATP)中
、1単位のT4−DNAリガーゼで4℃にて16時間、
このベクター10009に結紮する。該結紮混合物をイ
ー・コリMM294CI+株に形質転換し、アンピシリ
ン耐性コロニーを得、C8遺伝子フラグメントのpAs
I 中への挿入に関してスクリーンする。適正な構造
を有するプラスミド(pCSP)を同定し、イー・コリ
N5151株(cI ts857)に形質転換し、完全
なCSタンパク質の発現に関してテストする。 (タンパク質のアミノ末端での18アミノ酸の欠失は、
真正CSタンパク質の開裂シグナルペプチドに対応する
。)細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)中で3
2℃にて650nmでの吸収(Aa、。)が0.6とな
る様に増殖させ、2時間42°Cで発現プラスミドのP
Lプロモーターの転写およびその結果CSタンパク質誘
導体の翻訳が起こる。 細胞のIIIIQをサンプルにとり、ペレット化し、溶
解緩衝液(10mMトリス−HCl2.pH7,8,2
5%(V/ V)グリセロール、2%2−メルカプトエ
タノール、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0
.1%ブロモフェニルブルー)中に再懸濁し、105℃
加熱ブロック中で5分間インキュベートする。タンパク
質を5DS−PAGE (13%アクリルアミド30:
0.8 アクリルアミド:ビスアクリルアミド比)に
より分離する。タンパク質をニトロセルロースに移し、
イー・コリにおいて産生されたCSタンパク質を、熱帯
熱マラリア原虫CSタンパク質のテトラペプチド重複領
域と反応性の5つのモノクローナル抗体のプールを用い
て、ウェスタンプロット分析により検出する(前記デイ
ムら(Dame et al、 )参照)。 実施例2 R16tetss 精製したPUC8クローン1プラスミド100μ9を培
地緩衝液400μg中制限エンドヌクレアーゼXhoI
r40単位で37℃にて、16時間消化する。CSタン
パク質の16テトラベプチド重複をコードづける192
塩基対フラグメントを次いでPAGEにより単離する。 発現ベクターpAslを実施例1に記載したのと同様に
して制限エンドヌクレアーゼBaIIIHIで開裂させ
る。実施例1に記載したのと同様にして、192塩基対
のXhoI[フラグメント1μ9をpAsl 100
nyのBamHrサイトに結紮する。結紮ミックスをイ
ー・コリMM294CI十株に形質転換する。クローン
は、該プラスミドのBamHI −HlndII フ
ラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
りpAslのBamHIサイトで適正な配列である19
2塩基対のXhollフラグメントを含有し、Hind
■サイトがtet R遺伝子の下流であり、BamHI
サイトがcuATG および適正な配列のプラスミドの
挿入部の結合点にあるものと同定される。このプラスミ
ドpRl 6 tetesは、次の様に表されるBHB
B (図中、BHはBamH[サイトを意味し、BはBan
■サイト、Sは終止コドンを意味する)。pRL6te
tssは、イー・コリN5151株(clts857)
を形質転換するのに用いられ、ウェスタン・プロット分
析によりCSタンパク質のテトラペプチド重複の産生に
関して調べる。この様にして産生されたタンパク質は、
次の様な配列を有する:N−met−asp−pro(
asn−ala−asn−pro)+s (asn−v
alasp−pro)+T 86−C (式中、Ta2はpAsl上に存在するテトラサイクリ
ン耐性遺伝子由来の86アミノ酸である)。 N−末端メチオニン(meL)残基も、ベクター、より
詳しくは、clIタンパク質開姶コドン由来である。 実施例2A R32teteeおよびR48tet++a精製したp
RI 6 tetssプラスミドDNAl0Iを培地緩
衝液200μQ中BamHI 25単位で37℃にて2
時間、消化する。このDNA100119を次いで前記
と同様にして、192塩基対のXhoIIフラグメント
lμ9と結紮する。次のポリペプチドをコードするプラ
スミド発現ベクター、pR32tetaeおよびpR4
8tetaaを調製し、イー・コリにおいて発現させる
: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + 5−(asn−val −as
p−pro)+ ) n−T 86−C(式中、nは2
(R32tetsa)またはnは3(R48tets
g)である。)nが2または3であるpAs1クローン
は、前記と同様にして、各々nが2または3以外である
クローンから選択される。調べた全てのクローンは、適
正な配列の挿入部を有していた。R32tetseおよ
びR48tetseは両方とも、イムノブロッティング
により評価される如く、R16tetaaとほぼ同じレ
ベルで発現される。 数種のRtetseタンパク質のイムノプロット分析に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーR−250染
色により見られない不均一な生成物があることが示され
る。これらのタンパク質は、以下に記載の如(Rtet
、、ポリペプチドのおよそ半量まで蓄積されると考えら
れる。最小の分解生成物の大きさは、クローン中のテト
ラペプチド重複の数に比例する。これらのタンパク質の
不安定性は、不均質C0OH末端の低下による。 実施例3 R16tet3を 精製したl)R16tetss DNA I Oμ9を
培地緩衝液200μQ中制限エンドヌクレアーゼBan
I[25単位で、37℃にて2時間で切断する。切断し
たDNA100n9を次いで結紮する。この操作により
14塩基対のBanIIフラグメントが欠失し、残存す
るBanI[サイトのすぐ下流に終止コドンが生じる。 得られたプラスミドPR16tetstを用いてイー・
コ゛すN5151株においてR16tetatを発現さ
せ、R16tetstをこれから精製する。 Rl 6 tet32を含有するイー・コリ309(湿
潤重量)を緩衝液A(50mMトリスHCl2.pH8
,0,2mMエチレンジアミン四酢酸酢酸DTA)、0
.1mMジチオトレイトール、5%(V/V)グリセロ
ール)200112中に再懸濁させる。リソザイムを添
加して最終濃度を0 、2 mg/xQにし、該混合物
を水上で30分間インキュベートし、細胞を溶解させる
。該混合物を次いでワーリングブレングー中、最高値に
セットして3分間処理し、次いでブランラン350超音
波装置で1分間超音波処理することにより、微生物性D
NAを除去する。デオキシコール酸ナトリウムを添加し
て最終濃度を0.1%(w/ v)にし、この混合物を
4℃にて30分間撹拌する。該懸濁液を次いで1200
0xyで30分間遠心操作に付し、細胞片を除去する。 上清をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で10分間インキ
ュベートし、12000X9で30分間遠心分離する。 殆ど全てのイー・コリタンパク質が、加熱工程中に沈殿
し、遠心操作中にペレット化され、一方、R16tet
3.タンパク質は溶解性で、上清中に含まれる。上清を
集め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添加して、最
終濃度を飽和状態の20%とする。これにより、R16
tet32タンパク質が選択的に沈殿し、これを遠心操
作(12000×9で30分間)により集める。この時
点で、R16tet32は、他の汚染バクテリアタンパ
ク質に関して約95%純粋である。 最終クロマトグラフィ一工程(例えば、イオン交換、逆
相高速液体クロマトグラフィー、フェニルセファロース
クロマトグラフィー、サイズ・セパレーション等)を行
い、タンパク質、炭水化物、核酸またはりポポリザッカ
ライド等の他の物質による残存する汚染物質を除去する
。Rl 6 teE32を発現させ、イー・コリタンパ
ク質全体の5%にほぼ等しいレベル、即ち、フーマシー
ブルー染色により示される様な、約30〜60R9/L
で精製する。 Rl 6 tet32は次に示す配列を有する:N −
met −asp−pro ((asn−ala−as
n−pro) R5(asn−vaドasp−pro)
+) nT 32−C(式中、nは1ST32はテトラ
サイクリン耐性遺伝子由来の32アミノ酸である。)さ
らに詳しくは、Ta2は、次の様に配列ニ ー Ieu−arg−arg −thr−his−ar
g−gly−arg−his −his−arg −a
rg−h is−arg−ays−gay−ays −
trp−arg −1eu −tyr−arg−arg
−his−his−arg−trp−gly−arg−
ser−gly−ser−Cを有し、残存するBanI
Iサイトは、30および31残基の間にある。 実施例3A R32tet+t、R48tet3を 前記実施例3と実質的に同様にして、R32tet+t
およびR48tet32(各々、R16tet+tにお
いてnが2および3である)をイー・つりにおいて発現
させ、R16tets!と同じレベルおよび程度の純度
に単離する。出発ベクターは、各々、pR32tetg
gおよびpR48tet++gである。 実施例3B R64tetttq R80tet+を精製したpR4
れet、、プラスミドDNAl0゜R9を培地緩衝液2
00μ(2中BamHI25単位で、37℃にて2時間
消化する。このDNA100n9を次いで前記と同様に
して、192塩基対のXho・■フラグメントlμ9と
結紮する。次に示すポリペプチドをコードするプラスミ
ド発現ベクターを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る。 N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) R5(asn−val−asp−p
ro)+) n−T 32−G(式中、nは4 (R6
4teLat)またはnは5(R80teta*)であ
る)。nが4または5であるpAs1クローンを、前記
と同様にして、各々、nが4または5以外であるクロー
ンから選択する。 r(64tetstお上びR80t
etttは両方ともR48tet32とほぼ同じレベル
で発現する。R64tet、、を、前記RI 6 te
tst、R32tet+zおよびR48tet32と実
質的に同じ方法で精製する。 実施例3C R96tetstおよびRI l 2 tet3を前記
実施例3Bに記載したのと実質的に同様にして、R96
tet+tおよびRl 12 tet+t(各々、nは
6および7である)をR48tet32とほぼ同じレベ
ルでイー・コリにおいて発現させる。出発ベクターはp
R−80tetatである。 イムノプロット分析により、精製したRtetstポリ
ペプチドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、バ
ンドに対応する主要な反応性種がタンパク質染色により
見られる。5DS−PAGEによって得られる分子量は
、予想値の約2倍であるが、各タンパク質の移動は、各
構造中のテトラペプチドの数に比例する。数種のRte
tstポリペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予想
通りの値を示す。 実施例4 16G pTermは、配列: 5°−GATCCCGGGTGACTGACTGA
−3’3″−GGCCCACTGACTGACTCT
AG −5’を有する合成リンカ−を、pASIのBa
mHI サイトに挿入することにより調製される。p
Ast101t9を25単位のBamHIで消化する。 100n9のBamH1切断pAS1を2On9の合成
リンカ−と結紮し、プラスミドpTermをpAslの
Ban1−11サイトに挿入されたリンカ−で同定する
。このベクターはBamHIサイトを有し、全ての3種
の解読フレーム中にcU タンパク質のATG開始コド
ンの下流にTGA終止コドンが挿入される。 pR16Gは、pUC8クローン1由来の192塩基対
のXhoIIフラグメントをpTermのBamHIサ
イトに挿入することにより調製し、適正な配列の1つの
XhoI[挿入部を有するクローンを、実質的に前記と
同様にして選択する。 実質的に前記と同様にして、pR16Gをクローン化し
、イー・コリN5151株において発現させる。 R16Gは、次に示す配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) r s −(asn−val −a
sp−pro)+) n−g!y−C(式中、nはl
である)。 このタンパク質は芳香族残基を含有していないので、発
現レベルを定量化するクーマシーブリリアントブルーR
−250染色法によって視覚化することができない。C
Sタンパク質に関して特異的な5種のモノクローナル抗
体を用いたイムノプロット分析(前記デイムら(D a
me et al、)参照)により、クーマン−ブ
リリアントブルーR−250染色が可能なR16tet
atと比較して評価したレベルは、全細胞タンパク質の
約1%である。 実施例4A R32G、R48G、R64GSR80GおよびR11
2G 前記実施例4と同様にして、R32G、R48GSR6
4G、R80GおよびR112G(Rt6Gにおいて各
々、nが2.3.4.5または7である)をイー・コリ
N5151株において発現させる。これらのポリペプチ
ドは、R16Gとほぼ゛同じレベルで発現される。実質
的に実施例3に記載したのと同様にして、R48Gを精
製する。 実施例5 R16LAおよびR32LA 実質的に実施例4に記載したのと同様にして、配列: 5°−GATCCGCTGCGTT −3゜3°−
GCGACGCAACTAi5゜を有する合成リンカ−
をpAslのBamHI サイトに挿入することによ
りpT erm 2を調製する。 pT erm 2はI3amHI3Iトを有する。pU
C8クローン1由来の192塩基対のXhoIIフラグ
メントを前記と同様にして挿入する。各々、適正な配列
の1種または2種のXhoI[挿入部を有するクローン
であるpR16LAおよびpR32LAを、実質的に前
記と同様にして選択する。実質的に実施例3に記載した
のと同様にして、R32LAをイ製する。 実質的に前記と同様にして、pRI6LAおよびpR3
2LAをクローン化し、イー・コリN5151株におい
て発現させる。 R16LAおよびR32LAはっぎの配列を有する: N−met−asp−pro ((asn−ala−a
sn−pro)+5(asn−val−asp−pro
)+) n−1en−1eu−04式中、nは、各々、
lおよび2である)。C末端のロイシンおよびアルギニ
ンは、pT erm 2の合成リンカ−由来のものであ
る。R16LAは全イー・コリタンパク質の約1%で発
現され、一方、R32LAは、全細胞タンパク質の約5
%で発現される。 実施例6 16NS1 pAs1デルタEHは、pAsI 起源のpBR32
2の必須でないEcoR[−H1ndI[r領域の切除
により調製される。実質的に前記と同様にして、lOμ
9のpAslを、培地緩衝液200μσ中EcoRIお
よびHindIII(各々、20単位)で切断し、DN
Aポリメラーゼ(フレノウ)で処理し、結紮し、イー・
コリ中に形質転換する。29塩基対のEcoRI −H
lndlll フラグメントが欠失したクローンを同定
する。861塩基対のビールス原および375塩基対の
pBR322原中にインフルエンザビールス(A/PR
/8/34)NS Iコーディング領域を含有するpA
PR801の1236塩基対のBamHIフラグメント
(ヤングら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ(
Young et al、 、Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、 U。 S 、A)、第80巻、6105頁(1983)参照)
を、pAslデルタEHのBamHIサイトに挿入する
。得られたプラスミド、pAslデルタEH/801は
真正のN5I(230アミノ酸)を発現する。このプラ
スミドは、Cm翻訳開始サイトおよびNSIコーディン
グ配列間にBamHIサイトを有する。 実質的に前記と同様にして、PASIデルタEH/80
1 10μ9を、ハイ・バッファー(50IIMトリス
ーHCI2、pH7,5,1mM DTT。 10mM MgCQ*、100mM NaC12)
200μσ中EcoRI 20単位および5al12Q
単位で、37℃にて2時間で切断し、DNAポリメラー
ゼ大フラグメント(フレノウ)で処理し、結紮する。 650塩基対のEcoRI −Sal I領域が欠失し
たクローンを単離する。このプラスミド、pNslデル
タESは真正のNSIを発現する。 pUC8クローン1由来の192塩基対のXh。 ■フラグメントをpNs1デルタES中のBamH■サ
イト中に挿入することによりpR16Nslを調製し、
実質的に前記と同様にして、適正な配列の1つのXho
II挿入部を有するクローンを選択する。 煮沸工程を除いて、実質的に前記と同様にして、pR1
6Ns1をクローンし、イー・コリにおいて発現し、R
16NS1を精製する。 R16NS1は、次の配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro)+5(asn−val−asp−pr
o)+ ) n−N 227(式中、nは1、N227
は、NSI起源の227アミノ酸である)。 R16NSl調製におけるR16NS1は、煮沸または
イオン交換工程なしで、タンパク質の80%以上と評価
された。特に著しく高い比率を示すR16NS1は、総
細胞タンパク質の約25%である。 実施例6A R32NS l5R48NSLおよびR64NSL煮沸
工程を除いて、実質的に実施例3に記載したのと同様に
して、R32NSl (R16NS1においてnが2
である)をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから
精製する。R32NS 1はR16NS1とほぼ同じレ
ベルで発現され、同じ程度まで精製する。 実質的に前記と同様にして、R48NS1(R16NS
lにおいてnが3である)およびR64NSI(R16
NS1においてnが4である)をイー・コリにおいて発
現させる。R48NS1およびR64NS1は、各々、
総イー・コリタンパク質の約10%および約5%で発現
する。 実施例7 5IR4B 実質的に前記と同様にして、pR48tetssをBa
mHIで開裂させ、DNAポリメラーゼ(フレノウ)で
末端をうめる。プラスミドを次いで前記の如(BanI
[で開裂させ、3つのXhoI[フラグメントを担う6
72塩基対のフラグメントおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子由来の96塩基対を得る。 実質的に前記と同様にして、lOμ9の1)ASIデル
タEH/801をハイバッファ−200μσ中Nco1
20単位で37℃にて2時間で切断し、DNAポリメラ
ーゼ大フラグメント(フレノウ)で末端をうめる。Nc
oIサイトは、NSI中の81残基に関するコドン中に
ある。プラスミドを次いで前記の如<Bann切断して
残存するNslコドンおよびテトラサイクリン耐性遺伝
子の一部を切除し、pAs1デルタEH/801−1を
得る。 672塩基対のBaIIIHI(末端をうめたもの)−
BanIIフラグメントを1)ASIデルタEH/80
1−1に挿入してpNsIR4B を調製する。このプ
ラスミドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにお
いて発現させる。NS In28は、次の配列を有する
: N −81N −asp−pro C(asn−ala
−asn−pro) +5(asn−val−asp−
pro)+ ) n−T 32−C(式中、81NはN
SIの81N末端アミノ酸、nは3、Ta2は前記のと
おりである)。 N5IR48は総細胞タンパク質の約
5%で発現される。 実施例8 32N 実質的に前記と同様にして、lOμ9のpR32NSI
を培地緩衝液200μQ中Hindll125単位で3
7℃にて2時間で切断し、pR32Ns1−1を得る。 HindIIl サイトはNSIコーディング領域中の
残基5に関するコドン中にある。pR32NSI−11
00n9を次いで実質的に前記と同様にして結紮する。 得られたプラスミド、pR32Nは、NSIコーディン
グ配列において、5番目のコドンの後にTAA終止コド
ンを含有する。 pR32Nは、実質的に前記と同様にしてイー・コリに
おいてR32Nを発現するのに用いる。 R32Nは、次の配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + 5−(asn−val−asp
−pro)+−) n−N 5−C(式中、nは2、N
SはNSI 遺伝子由来の5つのアミノ酸である)。さ
らに詳しくは、NSは、次の配列を有するニ ーasn−thr−val−ser−ser−CR32
Nは総イー・コリタンパク質の約5%で発現される。 実施例9 抗体応答−ELISA 組換タンパク質R16tet3z、R32tet3.お
よびR48tetstを実質的に前記と同様にして精製
し、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水pH7、0(PB
S)に対して透析し、アリコートをとり、−80℃にて
貯蔵する。構築物を、PBS、水酸化アルミニウム(明
パン)または完全フロインドアジュバント(CF A)
のいずれかと混合して、50μ9のタンパク質を含有す
る0、5蛙の投与量を得る。 PBS中CFA(G T BCO,Grand l5l
and、 NewYork)十抗原をl:lの比で、機
械的撹拌機で30分間撹拌することにより乳濁化させる
。明パンをPBS中に希釈した水酸化アルミニウムゲル
(USP)から調製する。 4℃にて12時間回転式混合機で、抗原は明パンに吸着
される。該懸濁液をさらに12時間静置し、上清を廃棄
して、l投与量につきAl2O,80屑9および組換タ
ンパク質50μ9を得る。6〜8週令のC57B1/6
マウスを総量50μ9のタンパク質を皮下投与および腹
腔内投与により免疫化する(1群につき5匹)。被験動
物に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の4
週間後に追加抗原投与をする。ただし、CFA中免疫原
を受けた群には、不完全フロインドアジュバント(IF
A)中孔濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。1
週間後、尾から採取した血を全部ため、−夜4°Cにて
凝固させ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清
を必要になるまで一80℃にて保存する。 固相酵素免疫測定法(ELISA)を用いて、熱帯熱マ
ラリア原虫CSタンパク質(asn−a(2a−asn
−pro)*の4つの重複からな、る16アミノ酸合成
ペプチドとの反応性に関して、全ての血清をテストする
(デイムら、サイエンス(Dame et al、
。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)参照)。合成ペプチド抗原を牛血清アルブミン(BS
A)と結合させ、これをマイクロタイタープレートの孔
に塗布する。0.01M リン酸緩衝生理食塩水pH7
,4(’PBS)で希釈したスクリーニング抗原50μ
QC0,1μ9)をポリスチレンマイクロタイタープレ
ート(イムンロン2 ダイナチク・ラボラトリーズ(I
mmunlon 2 D ynatech L
abo−ratorie32Alexandria、
VA)のくぼみにピペットで添加し、−夜室温(約2
2℃XRT)に保つ。 孔内容物を次いで、吸引し、ブロッキングバッファー(
BB=PBS中1.0%BSA、0.5%カゼイン、0
.005%チメルソールおよびo、o o 。 5%フェノールレッド)を充填し、1時間室温に保つ。 マウスの血清を連続してBB中に希釈し、50μeを番
孔に添加する。室温にて2時間インキュベートした後、
孔を吸引し、PBS−0,05%ツイーン20(PBS
−TW20)で3回洗浄し、10%PBS中熱不活化ヒ
ト血清で11500に希釈したヤギ抗マウスIgG(H
+LXバイオラドラボラトリーズ(Bio−Rad
Laboratories。 Richmond、 CA )と接合したホースラディ
ツシュパーオキシダーゼ50μQを番孔に添加する。1
時間後、孔内容物を吸引し、PBS−TW20で3回洗
浄し、次いで基質(1mg2.2°−アジノージ−(3
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−6)10.1M
クエン酸リン酸緩衝液、pH4,0+&、使用直前に0
.005%過酸化水素を添加)を番孔に添加する。41
4nmにおける吸収を1時間後にEL I SAプレー
トリーダー(ティターチク・マルチスキャン、フロー・
ラボラトリーズ・インコーホレイテッド(T 1ter
tek Multiskan、 F lowlab
oratorie32 I nc、 、McL ean
、 V A))で測定する。 R16tetHlR32tetstおよびR48tet
3を構築物は、全てEL I SAにおいて反応する抗
体を産生する。R16tetHは、単独で投与した場合
、R32tetstおよびR48tetstに比べて免
疫原性が劣る。明パンおよびCFAは両方とも3種のタ
ンパク質全部の免疫原性を高め、抗体は、少なくともl
領域で滴定により102000検出される。 実施例1O 抗体応答−IFA 実施例9で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分折(IF
A)でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫CSタンパク
質と強く反応することが示された。 猿マラリア原虫、シノモルギマラリア原虫(P。 cynomolgi)、三日熱マラリア原虫(P 、
viva)、およびガリナケウムマラリア原虫(P 、
gallinaceum)に対する反応性は検出されな
かった。R32tet3zに対する抗血清の反応性は、
若干、嘔歯類住血胞子虫(P 、berghei)に関
してみられた。この結果は、ホックマイヤーら、プロシ
ーデンクズ・サード・インターナショナル・シンポジウ
ム・オブ・イムノバイオロジー、プロテインズペブタイ
ズ、アタッン、エム・ゼット編、プレナム(Hockm
eyer etal、、 in Proc、 3
d Int’1. Symp、 rmmuno−b
iol、 Proteins Peptide32
ed、 by Atassi。 M、2’、、、 Plenum New Yor
k(inpress)による、熱帯熱マラリア原虫に対
するある種のMabは、IFAにより、唱歯類住血胞子
虫スポロゾイトと反応することを示すデータと一致する
。 実質的にボスワース、ジャーナル・オプ・バラシトロシ
イ(Bosworth、 J 、Parasitol、
)、第61巻、769頁(1975)に記載されている
のと同様にして、スポロゾイトを感染した蚊の唾液腺か
ら摘出し、食塩水または0.5%BSAを含有するMe
dium I 99 (G I B CO)中に希釈し
、血球計算盤で計測し、2000〜5000スポロゾイ
ト/10μgに希釈する。10μρのアリコートを、マ
ルチウェルプリンテッドIFAスライドの番孔に入れ、
室温で乾燥し、−80℃にて保存する。 IFAは、まず、BBで1/100に希釈した血清20
μg容を、乾燥したスポロゾイトを入れたIFAスライ
ドの孔に入れることにより開始する。湿潤室内で室温に
て20分間インキュベートした後、該血清溶液を吸引し
、スポットを2滴のPBSで洗浄する。BBでl :4
0に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(キル
ケガード・アンド・ぺり−(Kirkegord a
nd Pery。 Gaithersburg、 MD)と接合したヤ゛
ギ抗マウス抗体20μgを次いで各スポットに添加する
。再び室温にて20分間インキュベートした後、該スポ
ットを再び2滴のPBSで洗浄し、グリセロールに添加
し、500倍のUV光の下で蛍光に関して調べる。 実施例11 C12反応 RI 6 Let、!、R32Let、、およびR48
Let3゜で免疫化したマウス由来の血清は、強いcs
P陽性反応を示す(第1表参照)。アジュバントなしで
投与した場合、RI 6 Let3.だけが、陽性のC
12反応を示す抗体を産生せず、一方、CFAまたは明
パンとともに投与した場合、3つの構築物は全て強いC
12反応を示す抗体を産生じた。 第1表 R16Let、2、R32tetHおよびR48Let
Hに対する血清のCSP反応性 抗血清 アジュバント R16tet32 R32tet32
R48tet32なし O/25(−)
17/25(2+) 21/25(4+)CFA 2
3/25(4+)21/25(4+)21/25(4+
)明パン 25/25(4+) 25/25/(4
+) 16/27(2+−4+) C12反応は、基本的にファンデルベルクら、(Van
derberg et al、 Mil、 Med、)
、第134巻(補遺l)、1183頁(1969)によ
り記載されているのと同様にして行う。Medium
199 中に再懸濁させた熱帯熱マラリア原虫500〜
1゜00を含有する蚊唾液腺スポロゾイトを、顕微鏡ス
ライド上で血清5μgと混合し、カバーガラスをかけ、
ベトロリウムゼリーをふちにつけて密封し、37℃にて
1時間インキュベートする。位相差顕微鏡で400倍で
反応を評価する。25のランダムスポロゾイトを、各血
清サンプルに関して調べ、C8P陽性生体の数を表に示
す。前記ファンデルベルクら(Vanderberg
et al、)により記載されているCSP反応度
を書き加えである。 (−)は、CSP反応性が検出されないことを示す;(
2+)は、スポロゾイトの表面上に粒状の沈殿が見られ
ることを示す;(4+)は、スポロゾイトの一端に、長
い糸状フィラメントが見られることを示す。正常マウス
血清、およびCFAのみで免疫化したマウスから得た血
清は、同様の分析で検出可能なC8P活性を示さなかっ
た。 実施例■2 肝臓細胞ブロッキング 前記実施例9で得た血清を、in vitroでの侵
入阻害分析で調べた(第2表)。これらのデータにより
、R32tetstおよびR48tetszタンパク質
はアジュバントの非存在下でも抗体に強いブロッキング
活性を惹起することがわかる。R16tet+tは、適
用され明パンに吸収される場合は、強いブロッキング抗
体の惹起にあまり有効でない。これは、Rl 6 te
t、、タンパク質に生じる抗血清にっいて見られる弱い
CSP反応性および低いELISA滴定値と一致する。 第2表 in viLroの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト
侵入HepG2−Al1へパトーム細胞の阻害な し
46 95
92CFA 76 92
94明パン 100 100 96培養
細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ポリングデイルら、
ジャーナル・オブ・イムノロシイ(Hollingda
le et al、、 J 、 I mmu、
nol、)第32巻、909頁(1984)により記載
されているのと実質的に同様にして行なわれる。R16
tet32、R32tetstおよびR48tetat
構築物で免疫化されたマウスから得た血清を、熱帯熱マ
ラリア原虫スポロゾイトによる培養細胞の侵入の阻害性
に関してテストした。血清を培養液中に希釈し、Hep
G2−A16細胞培養物に添加して、最終希釈度を1
: 20 (v/v)にする。次いで12000〜40
000の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適
用した培養物を、37℃にて5%CO4雰囲気下で3時
間インキュベートし、D ulbecc。 のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、メタノー
ル中で凝固させて、PBSで2回洗浄する。 細胞中にはいったスポロゾイトは、免疫パーオキシダー
ゼ分析(IPA)により視覚化できる(前記ホリングデ
イルら(Hollingdale et at、参
照)。IPAは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア
原虫に対するMab(2F 1 、1 、前記デイムら
(Dame et at、参照)で処理し、次いで
、ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したウサ
ギ抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベートし
、3.3−ジアミノベンジジンで染色することにより行
う。培養細胞中に侵入したスポロゾイトの数を、ライフ
(L eitz)の顕微鏡で、250倍で、暗青色フィ
ルターを用いて、全調製物中に存在する細胞内寄生体の
計測により測定する。 実験は、2回または3回ずつ行い、同一の実験において
は、各細胞培養物に同数のスポロゾイトを添加する。阻
害は、正常マウス血清対照例と比較した杭構築免疫血清
によるスポロゾイト侵入の減少率(%)であり、CS反
応性Mab2F 1.1により、希釈[1/20で1
00%のスポロゾイト侵入阻害が得られた。 実質的に前記と同様にして調製した組換タンパク質、R
LA、R16NS +およびR32NS 1を、同様に
ELISAおよびIFA分析でテストし、同様に、16
合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、陽性のC2
F反応を示すことが判明した。R32tet32および
R32LAは、その反応の均一性、発現レベルおよび調
製の容易性のために好ましい。 合成的に製造したワクチンの第一の問題は、合成免疫原
性に対して産生された抗体が真正分子を認識するかどう
か、および該抗体が防御を付与するのに十分な生物学的
性質を有するかどうかである。免疫蛍光分析およびCS
P反応の両方を示す実施例により、イー・コリ構築物に
対して産生された抗体は、スポロゾイトの表面と反応し
、従って、真正CSタンパク質を認識することがわかる
。 CSP抗体は動物およびヒトにおいて存在し、防御免疫
と重要な関連があることが判明している。 杭構築抗体がin vitroでヒトへプトーマのス
ポロゾイト侵入を阻害することは明らかである。前記ホ
リングデイルら(Hollingdale et
al、)は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア
原虫に対するMabは両方とも、これらの79977種
に対するヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、
スポロゾイト侵入をブロックすることを示している。i
n vitroでのスポロゾイト侵入のブロッキング
は、従って防御抗体に関する評価として考慮される。従
って、該データは全体として、侵入のワクチンは、熱帯
熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染からヒトを防御
するのに用いることができることがわかる。 ELI SA滴定により評価されるこれらの組換タンパ
ク質、表面反応性(IFAおよびCSPにより示される
)およびスポロゾイト侵入のブロッキングに対する免疫
応答は、完全フロインドアジュバントまたは明パンのい
ずれかを用いることにより高められる。完全フロインド
アジュバントは、発熱させ、肉芽腫を生じさせ、その結
果、ツベルクリン過感作となるので、ヒトにおいて用い
ることができない。明パンは、現在、ジフテリアおよび
破傷風トキソイド等の確立されたワクチン、ならびに最
新ワクチンの一種、B型肝炎において、アジュバントと
して用いられている。これは、有効で、ヒトにおいて長
期間安全に使用できることが実証されている。 実施例13 ワクチン調製物 一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。3%
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液(10mMリン酸ナ
トリウム、150 mMNac12. pH6。 8:濾過により滅菌化)に、同様の緩衝液中本発明のポ
リペプチド溶液を撹拌しながら添加し、ポリペプチドの
最終濃度を100μg/ltrσ、アルミニウム(A
Q” + )の最終濃度を1.01/!12にする。p
Hを6.6 に保つ。該混合物を約0℃にて一夜静置す
る。チメルソールを添加し、最終濃度を0.005%に
する。I)Hをチェックし、要すれば、6゜8に調節す
る。 以上の様に本発明およびその好ましい具体例を記載した
が、本発明は、記載した具体例に限定されるわけではな
く、むしろ特許請求の範囲に含まれるあらゆる修飾が含
まれる。 4、簡単な図面の説明 第1a図は、CSタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫(P lasmoduimfalc
iparum)ゲノムDNAの領域の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。 第1b図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。
熱帯熱マラリア原虫(P、 falciparum)ゲ
ノムDNAの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開裂
地図である。 第ib図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。 発明の詳細 な説明のポリペプチドは、イー・コリ(E、 coli
)において産生される4つ以上のタンデムCSタンパク
質重復単位からなる。該ポリペプチドは、CSタンパク
質ではないが、重複単位以外のCSタンパク質の部分を
含んでもよい。熱帯熱マラリア原虫(P、 falci
parum)重複単位は、次に示す配列を有するテトラ
ペプチドである: アスパラギン(asn)−アラニン(ala) −as
n−プロリン(pro)−本発明のポリペプチド内で、
種々のテトラペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱
帯熱マラリア原虫CSタンパク質に関して、その抗体の
反応性に著しく悪い影響を及ぼさない。 例えば、デイムら、サイエンス(Dame et
al、。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)に開示されている如く、天然に存在する熱帯熱マラリ
ア原虫における41テトラペプチド重複の37はasn
−ala −asn −proであり、4はasn−
バリン(val)−アスパラギン酸(asp) −pr
oである。好ましくは、本発明のポリペプチドにおける
テトラペプチド重複単位の半分以上は、いわゆる共通塩
基配列、asn−ala−asn−proである。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、約8重複(即ち
32アミノ酸)〜約148重複からなる。 さらに好ましくは、ポリペプチドは、約16〜約112
の重複からなる。 本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、即ち、非CS
タンパク質重複単位配列を有する融合ポリペプチドであ
ってもよい。かかる非CSタンパク質重複配列は、免疫
原性を高めるか、または組換微生物におけるクローニン
グおよび発現を促進する担体分子として機能し得る。あ
るいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト免疫原
、他のプラスモジウム免疫原および/または池の非プラ
スモジウム免疫原に対する1以上のエピトープを担うこ
とができる。特に、イー・コリにおいて実施可能な量で
安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する免疫化
に関して必要でないことが判明しているCSタンパク質
は、本発明から除外され本明細書において例示する本発
明のポリペプチドの種類の具体例は、次のとおりである
:重複のC末端と融合したpBR322におけるテトラ
サイクリン耐性(tet R)遺伝子由来の約32のN
−末端アミノ酸を有する少なくとも4つの重複からなる
Rtet32ポリペプチド:重複のC末端と融合したt
etR遺伝子を有する少なくとも4つの重複からなるR
tetaeポリペプチド; 重複のC末端と融合したNSIの227のアミノ酸を有
する少なくとも4つの重複からなるRNStポリペプチ
ド: 重複のN末端と融合したNSIの81のN末端アミノ酸
を有する少なくとも4つの重複からなるN5IRポリペ
プチド; 重複のC末端で−グリシン残基が続いている少なくとも
4つの重複からなるRGポリペプチド;重複のC末端で
一ロイシンーアルギニン残基につながっている少なくと
も4つの重複からなるRLAポリペプチド;および 重複のC末端で−asn−thr−val′−5et−
sczrにつながっている少なくとも4つの重複からな
るRNポリペプチド。 CSタンパク質重複単位に関する遺伝子コーディング配
列は、公知の技術により得ることができる。 ・該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリスら、
ネイチ+−(Ellis et al、 、Nat
ure)、第302巻、536頁(1983)に開示さ
れている様なメツセンジャーRNAの逆転写により、熱
帯熱マラリア原虫から得られるものによるか、または、
前記デイムら(Dame et al)により開示
されている様な、熱帯熱マラリア原虫ゲノムDNAから
得られる完全な遺伝子の直接的クローニングによるもの
が挙げられる。図面に、CSタンパク質コープ4ング領
域を示す。熱帯熱マラリア原虫およびそのスポロゾイト
は、感染したヒトおよび蚊より得ることができる。 CSタンパク質の全部または一部に対するコーディング
配列をクローンし、重複単位の全部または一部をコード
するそのサブフラグメントを、公知の技術により調製す
ることができる。第1a図に、CSタンパク質遺伝子内
の選択された有用な制限サイトを示す。好ましいサイト
はXhoUサイトである。XhoIrで切断すると、次
に示すI6重複のコーディング配列が得られる: N −asp−pro ((asn−ala−asn−
pro)+ 5(asn−val−asp−pro)+
)nC 〔式中、nは!である〕 適当な配列の多重タンデムXholIフラグメントを用
いることにより、さらに長い重複、即ち、nが1以上で
ある重複が得られる。 合成技術は公知であり、かつ、商業的に入手可能なりN
A合成装置を用いて達成することができる。実質的に同
じアミノ酸に関するコドンを有し、同じXhoII末端
または末端に異なる開裂サイトを有する合成オリゴヌク
レオチドを合成することができる。かかる合成オリゴヌ
クレオチドは、天然の64コドンと異なってもよく、同
じアミノ酸、または少数の、好ましくは約8未満の異な
るアミノ酸をコードし得る。ただし、これらはポリペプ
チドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさないものとす
る。典型的な合成コーディング配列は、完全に、共通塩
基配列、(asn−ala−asn−pro)n(式中
、nは少なくとも4である)をコードする。 ポリペプチドのコーディング配列は、いかなるイー・コ
リ発現ベクターにも挿入することができ、その多くは公
知であり、かつ入手可能である。イー・コリにおける本
発明のポリペプチドの高レベルの発現は、生成物の異常
なアミノ酸組成(アスパラギン(asn)約50%、ア
ラニン(ala)25%、プロリン(pro) 25%
)の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドpASlに含まれる様な、λ−PLプロ
モーターおよびλ−cII リポソーム結合サイトか
らなる調節エレメントを用いて、コーディング配列がよ
く発現されることが判明している〔ローゼンベルクら、
メソッズ・オブ・エンザイモロジー(Rosenber
get al、 、Meth、 Enzym、 )、
第101巻、123頁(1983)およびシャツラマン
ら、エクスペリメンタル・マニピュレイション・オブ・
ジーン・エクスプレッション、エム・イノウニ編、アカ
デミツクプレス、ニューヨーク(Shatzman
et al、。 in E xperimental Manipu
lation of geneExpressio
n、 edil by M、 I nouye、 A
caremicPres32New York)(1
982)参照)、pASlは、pBR322複製開始点
、アンピシリン耐性マーカーおよびPL、N抗停止機能
認識サイト(N ut LおよびNutR)、ρ−依存
性転写停止シグナル(tRl)およびG残基が直接Ba
mHT開裂サイトにつながっているcII翻訳開始サイ
トを含むc■リポソーム結合サイトを含むλ由来の一連
のフラグメントを担う。I)ASIは、pKc30cU
から、pKc30cIIのcll−pBR322結合の
BamHIサイトおよびcIIATG 間のヌクレオチ
ドを切除し、該分子を再結紮して、ATGのすぐ下流に
BamHIサイトを再生することにより得ることができ
る。pKc30cI[は、pKc30のHpaI サ
イトに、c■遺伝子を担うλ由来の1゜3kb Ha
eI[フラグメントを挿入することにより組立てること
ができる(前記シャツラマンら(Shatzman e
t at、)および前記ローゼンベルクら(Rosen
berg et al、)参照)。I)KC30は、シ
ミタケら、ネイチャー(Shimitake et
al、 、Nature)、第292巻、128頁(
1981)により記載されている。これは、pBR32
2のLet R遺伝子のHindlllおよびBamH
Iサイト間に挿入されたλの2゜4kb HindI
II−BalH4フラグメントを有するpBr(322
誘導体である。pASI に類似した構造は、コート
ニーら、ネイチャー(Courtney etal、、
Nature)、第313巻、149頁(1985)に
記載されている。pAslは、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(AmericanType
Cu1tureCo11ection、Rockvi
lle、Maryland)に、ブダペスト条約に従っ
て寄託されている。コーディング配列は、有効に、即ち
、適当な配列で、適当な解読フレーム中で、イー・コリ
発現ベクターの調節エレメントに、標準的技術により結
合され、本発明の発現ベクターを形成する。 この様に発現されたポリペプチドを、公知の標単的タン
パク質単離技術により、増殖培養株から単離精製する。 典型的な、有用な一連の精製反応は、l)細胞の破壊、
2)細胞片の清澄化、3)本発明のポリペプチドの、清
澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチドからの分
離、4)残存ポリペプチド、炭水化物、核酸および/ま
たはりポボリサッカライドを含む残存する汚染物質を除
去するための最終精製からなる。 第1工程は、例えば、リソシームまたは他の溶解または
浸透化剤を添加するか、あるいは機械的または超音波破
壊により達成することができる。 抽出物を清澄化するための遠心操作または濾過の前に、
界面活性剤を添加して、本発明のポリペプチドを溶液状
態に保つ。 本発明の一態様としては、本発明のある種のポリペプチ
ドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の溶解性を維持
するために界面活性剤を添加した後、約80℃に加熱す
ることにより、他のポリペプチドから非常に効率よく分
離できることが判明した。少なくとも約4分間80℃に
加熱することにより、実質的に重複または他の非熱変性
配列と融合した重複からなるポリペプチドを変性させる
ことなく殆んど全ての細菌性ポリペプチドを沈殿させら
れることが判明した。変性した細菌性ポリペプチドは、
遠心操作によりペレット化し、除去することができる。 この操作は、Rtet32、RG、RLAおよびRte
tseポリペプチドを精製するのに用いられる。特に、
この操作は、以下の実施例に記載の如く、RI 6 t
etHlR32tet32、 R48tet+t、R6
4tet32、R48G、R32LAおよびRI 6
teteeをうまく精製するのに用いられるが、R16
NS1およびR32NS +を加熱すると、これらのポ
リペプチドは沈殿する。 例えば、選択的沈殿剤を添加し、次いでイオン交換クロ
マトグラフィーまたは逆相HP L C等の仕上クロマ
トグラフィ一工程により、本発明のポリペプチドをさら
に精製することができる。 本発明のワクチンにおいて、好ましくは生理的pHに緩
衝された本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いる
ことができる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したかま
たはしていないポリペプチドを、いかなる各種公知のア
ジュバントと混合あるいは吸着させることができる。か
かるアジュバントとしては、とりわけ水酸化アルミニウ
ム、ムラミルジペプチドおよびQuit A等のサポニ
ンが挙げられる。別の変法例として、ポリペプチドをリ
ポソーム等の微粒子中に封入することができる。 さらに別法例として、死菌百日咳(B ordetel
la)または破傷風トキソイド等の免疫刺激性高分子に
接合することができる。 ワクチンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾
向および発展」ポーラ−ら編、ユニバシティー・パーク
・プレス(New Trends andDeve
lopements in Vaccine32
edited byVoller et al
、 、University Park Pres
s。 Baltimore、Maryland、U、 S、
A)、(1978)に記載されている。リポソーム中へ
の封入は、例えば、7ユラートン(F ullerto
n)、米国特許第4235877号に記載されている。 タンパク質の高分子への接合は、例えば、リクハイトC
L 1khite)、米国特許第4372945号およ
びアーモーら(armor et al、 )、米
国特許第4474757号により開示されている。Qu
il Aの使用は、例えばプレスガードら、アクタ・ベ
テリナリア・スカンジナビカ(Dalsgaard
et al、 、Acta、 Vet。 5cand、 )、第18巻、349頁、(1977)
に開示されている。 各ワクチン投与量中に存在するポリペプチドの撒は、典
型的なワクチンにおける著しく有害な副作用なしに免疫
防御応答を惹起する量として選択される。かかる量は、
どのポリペプチドを用いるか、およびワクチン(4アジ
ユバントが添加されているか否かによって異なる。一般
に、各投与量はポリペプチドを1−10.00μ9、好
ましくは、lO〜200μ9含有する。特定のワクチン
に対する最適量は、抗体力価および患者における他の応
答の観察を含めた標準的考察により確かめることができ
る。第1回接種の後、患者は好ましくは約4週間後に追
加抗原投与を受け、その後、感染の危険性が存在するか
ぎり、6力月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。 以下の実施例で本発明を説明するが、これに限定される
ものではない。CSタンパク質コーディング配列は、ジ
ェームズ・ウェーバ−、ウォルター・リード・アーミー
・インスティチュート・フォア・リサーチ(J ame
s Weber、Walter ReedArmy
In5titute for Re5earc
h)により、pUC8(標準的なイー・コリクローニン
グベクター(例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ・インコーホレイテッド(B ethesda R
esearchLaboratorie32 I nc
、 、Gaithersburg、 MD)より入手可
能)のEcoRIサイトにおけるλmPF1(前記デイ
ムら(Dame et al、 )参照)の233
7bp EcoRIフラグメント(第1a図参照)と
して得た。得られたpucs誘導体は、pUC8クロー
ンlと称する。 X車数 実施例I CSタンパク質誘導体 精製したpUC8クローンlプラスミドDNA40μ9
を培地緩衝液(50mM)リス、pH7、550mM
NaCQ、1mMジチオトレイトール(DTT)、1
0mM MgC(2t) 400 tt(l中制限エ
ンドヌクレアーゼ5tulおよびRsaI (各酵素
、それぞれ100単位)で37℃にて1.5時間消化す
る。CSタンパク質のはじめの18アミノ酸以外をコー
ドする得られた1216塩基対フラグメントを、5%ポ
リアクリルアミドゲル(PAGE)上での電気泳動によ
り単離する。発現ベクターp、AS1 10μ9を、培
地緩衝液200μσ中制限エンドヌクレアーゼT3at
aHT 25単位で、37℃にて1.5時間消化する。 切断されたプラスミドを、次いでDNAポリメラーゼ大
フラグメントで処理しくフレノウ5単位;20mM)リ
ス−HCI2.pH7,5,7mM MgC12t、
60mM NaCl2. 6mM2−メルカプトエ
タノールおよび各0.2511IMの4種のデオキシヌ
クレ才チドトリホスフェ−ト;25℃、15分)、Ba
mHIサイトの末端をうめる。C8遺伝子フラグメント
1μ9を次いで30μQリガーゼバツフアー(50mM
)リス、pH7,5、l mM D T T、 1
0 mM MgC(b、■00μM rATP)中
、1単位のT4−DNAリガーゼで4℃にて16時間、
このベクター10009に結紮する。該結紮混合物をイ
ー・コリMM294CI+株に形質転換し、アンピシリ
ン耐性コロニーを得、C8遺伝子フラグメントのpAs
I 中への挿入に関してスクリーンする。適正な構造
を有するプラスミド(pCSP)を同定し、イー・コリ
N5151株(cI ts857)に形質転換し、完全
なCSタンパク質の発現に関してテストする。 (タンパク質のアミノ末端での18アミノ酸の欠失は、
真正CSタンパク質の開裂シグナルペプチドに対応する
。)細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス(LB)中で3
2℃にて650nmでの吸収(Aa、。)が0.6とな
る様に増殖させ、2時間42°Cで発現プラスミドのP
Lプロモーターの転写およびその結果CSタンパク質誘
導体の翻訳が起こる。 細胞のIIIIQをサンプルにとり、ペレット化し、溶
解緩衝液(10mMトリス−HCl2.pH7,8,2
5%(V/ V)グリセロール、2%2−メルカプトエ
タノール、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0
.1%ブロモフェニルブルー)中に再懸濁し、105℃
加熱ブロック中で5分間インキュベートする。タンパク
質を5DS−PAGE (13%アクリルアミド30:
0.8 アクリルアミド:ビスアクリルアミド比)に
より分離する。タンパク質をニトロセルロースに移し、
イー・コリにおいて産生されたCSタンパク質を、熱帯
熱マラリア原虫CSタンパク質のテトラペプチド重複領
域と反応性の5つのモノクローナル抗体のプールを用い
て、ウェスタンプロット分析により検出する(前記デイ
ムら(Dame et al、 )参照)。 実施例2 R16tetss 精製したPUC8クローン1プラスミド100μ9を培
地緩衝液400μg中制限エンドヌクレアーゼXhoI
r40単位で37℃にて、16時間消化する。CSタン
パク質の16テトラベプチド重複をコードづける192
塩基対フラグメントを次いでPAGEにより単離する。 発現ベクターpAslを実施例1に記載したのと同様に
して制限エンドヌクレアーゼBaIIIHIで開裂させ
る。実施例1に記載したのと同様にして、192塩基対
のXhoI[フラグメント1μ9をpAsl 100
nyのBamHrサイトに結紮する。結紮ミックスをイ
ー・コリMM294CI十株に形質転換する。クローン
は、該プラスミドのBamHI −HlndII フ
ラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
りpAslのBamHIサイトで適正な配列である19
2塩基対のXhollフラグメントを含有し、Hind
■サイトがtet R遺伝子の下流であり、BamHI
サイトがcuATG および適正な配列のプラスミドの
挿入部の結合点にあるものと同定される。このプラスミ
ドpRl 6 tetesは、次の様に表されるBHB
B (図中、BHはBamH[サイトを意味し、BはBan
■サイト、Sは終止コドンを意味する)。pRL6te
tssは、イー・コリN5151株(clts857)
を形質転換するのに用いられ、ウェスタン・プロット分
析によりCSタンパク質のテトラペプチド重複の産生に
関して調べる。この様にして産生されたタンパク質は、
次の様な配列を有する:N−met−asp−pro(
asn−ala−asn−pro)+s (asn−v
alasp−pro)+T 86−C (式中、Ta2はpAsl上に存在するテトラサイクリ
ン耐性遺伝子由来の86アミノ酸である)。 N−末端メチオニン(meL)残基も、ベクター、より
詳しくは、clIタンパク質開姶コドン由来である。 実施例2A R32teteeおよびR48tet++a精製したp
RI 6 tetssプラスミドDNAl0Iを培地緩
衝液200μQ中BamHI 25単位で37℃にて2
時間、消化する。このDNA100119を次いで前記
と同様にして、192塩基対のXhoIIフラグメント
lμ9と結紮する。次のポリペプチドをコードするプラ
スミド発現ベクター、pR32tetaeおよびpR4
8tetaaを調製し、イー・コリにおいて発現させる
: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + 5−(asn−val −as
p−pro)+ ) n−T 86−C(式中、nは2
(R32tetsa)またはnは3(R48tets
g)である。)nが2または3であるpAs1クローン
は、前記と同様にして、各々nが2または3以外である
クローンから選択される。調べた全てのクローンは、適
正な配列の挿入部を有していた。R32tetseおよ
びR48tetseは両方とも、イムノブロッティング
により評価される如く、R16tetaaとほぼ同じレ
ベルで発現される。 数種のRtetseタンパク質のイムノプロット分析に
より、クーマシー・ブリリアント・ブルーR−250染
色により見られない不均一な生成物があることが示され
る。これらのタンパク質は、以下に記載の如(Rtet
、、ポリペプチドのおよそ半量まで蓄積されると考えら
れる。最小の分解生成物の大きさは、クローン中のテト
ラペプチド重複の数に比例する。これらのタンパク質の
不安定性は、不均質C0OH末端の低下による。 実施例3 R16tet3を 精製したl)R16tetss DNA I Oμ9を
培地緩衝液200μQ中制限エンドヌクレアーゼBan
I[25単位で、37℃にて2時間で切断する。切断し
たDNA100n9を次いで結紮する。この操作により
14塩基対のBanIIフラグメントが欠失し、残存す
るBanI[サイトのすぐ下流に終止コドンが生じる。 得られたプラスミドPR16tetstを用いてイー・
コ゛すN5151株においてR16tetatを発現さ
せ、R16tetstをこれから精製する。 Rl 6 tet32を含有するイー・コリ309(湿
潤重量)を緩衝液A(50mMトリスHCl2.pH8
,0,2mMエチレンジアミン四酢酸酢酸DTA)、0
.1mMジチオトレイトール、5%(V/V)グリセロ
ール)200112中に再懸濁させる。リソザイムを添
加して最終濃度を0 、2 mg/xQにし、該混合物
を水上で30分間インキュベートし、細胞を溶解させる
。該混合物を次いでワーリングブレングー中、最高値に
セットして3分間処理し、次いでブランラン350超音
波装置で1分間超音波処理することにより、微生物性D
NAを除去する。デオキシコール酸ナトリウムを添加し
て最終濃度を0.1%(w/ v)にし、この混合物を
4℃にて30分間撹拌する。該懸濁液を次いで1200
0xyで30分間遠心操作に付し、細胞片を除去する。 上清をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で10分間インキ
ュベートし、12000X9で30分間遠心分離する。 殆ど全てのイー・コリタンパク質が、加熱工程中に沈殿
し、遠心操作中にペレット化され、一方、R16tet
3.タンパク質は溶解性で、上清中に含まれる。上清を
集め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添加して、最
終濃度を飽和状態の20%とする。これにより、R16
tet32タンパク質が選択的に沈殿し、これを遠心操
作(12000×9で30分間)により集める。この時
点で、R16tet32は、他の汚染バクテリアタンパ
ク質に関して約95%純粋である。 最終クロマトグラフィ一工程(例えば、イオン交換、逆
相高速液体クロマトグラフィー、フェニルセファロース
クロマトグラフィー、サイズ・セパレーション等)を行
い、タンパク質、炭水化物、核酸またはりポポリザッカ
ライド等の他の物質による残存する汚染物質を除去する
。Rl 6 teE32を発現させ、イー・コリタンパ
ク質全体の5%にほぼ等しいレベル、即ち、フーマシー
ブルー染色により示される様な、約30〜60R9/L
で精製する。 Rl 6 tet32は次に示す配列を有する:N −
met −asp−pro ((asn−ala−as
n−pro) R5(asn−vaドasp−pro)
+) nT 32−C(式中、nは1ST32はテトラ
サイクリン耐性遺伝子由来の32アミノ酸である。)さ
らに詳しくは、Ta2は、次の様に配列ニ ー Ieu−arg−arg −thr−his−ar
g−gly−arg−his −his−arg −a
rg−h is−arg−ays−gay−ays −
trp−arg −1eu −tyr−arg−arg
−his−his−arg−trp−gly−arg−
ser−gly−ser−Cを有し、残存するBanI
Iサイトは、30および31残基の間にある。 実施例3A R32tet+t、R48tet3を 前記実施例3と実質的に同様にして、R32tet+t
およびR48tet32(各々、R16tet+tにお
いてnが2および3である)をイー・つりにおいて発現
させ、R16tets!と同じレベルおよび程度の純度
に単離する。出発ベクターは、各々、pR32tetg
gおよびpR48tet++gである。 実施例3B R64tetttq R80tet+を精製したpR4
れet、、プラスミドDNAl0゜R9を培地緩衝液2
00μ(2中BamHI25単位で、37℃にて2時間
消化する。このDNA100n9を次いで前記と同様に
して、192塩基対のXho・■フラグメントlμ9と
結紮する。次に示すポリペプチドをコードするプラスミ
ド発現ベクターを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る。 N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) R5(asn−val−asp−p
ro)+) n−T 32−G(式中、nは4 (R6
4teLat)またはnは5(R80teta*)であ
る)。nが4または5であるpAs1クローンを、前記
と同様にして、各々、nが4または5以外であるクロー
ンから選択する。 r(64tetstお上びR80t
etttは両方ともR48tet32とほぼ同じレベル
で発現する。R64tet、、を、前記RI 6 te
tst、R32tet+zおよびR48tet32と実
質的に同じ方法で精製する。 実施例3C R96tetstおよびRI l 2 tet3を前記
実施例3Bに記載したのと実質的に同様にして、R96
tet+tおよびRl 12 tet+t(各々、nは
6および7である)をR48tet32とほぼ同じレベ
ルでイー・コリにおいて発現させる。出発ベクターはp
R−80tetatである。 イムノプロット分析により、精製したRtetstポリ
ペプチドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、バ
ンドに対応する主要な反応性種がタンパク質染色により
見られる。5DS−PAGEによって得られる分子量は
、予想値の約2倍であるが、各タンパク質の移動は、各
構造中のテトラペプチドの数に比例する。数種のRte
tstポリペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予想
通りの値を示す。 実施例4 16G pTermは、配列: 5°−GATCCCGGGTGACTGACTGA
−3’3″−GGCCCACTGACTGACTCT
AG −5’を有する合成リンカ−を、pASIのBa
mHI サイトに挿入することにより調製される。p
Ast101t9を25単位のBamHIで消化する。 100n9のBamH1切断pAS1を2On9の合成
リンカ−と結紮し、プラスミドpTermをpAslの
Ban1−11サイトに挿入されたリンカ−で同定する
。このベクターはBamHIサイトを有し、全ての3種
の解読フレーム中にcU タンパク質のATG開始コド
ンの下流にTGA終止コドンが挿入される。 pR16Gは、pUC8クローン1由来の192塩基対
のXhoIIフラグメントをpTermのBamHIサ
イトに挿入することにより調製し、適正な配列の1つの
XhoI[挿入部を有するクローンを、実質的に前記と
同様にして選択する。 実質的に前記と同様にして、pR16Gをクローン化し
、イー・コリN5151株において発現させる。 R16Gは、次に示す配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) r s −(asn−val −a
sp−pro)+) n−g!y−C(式中、nはl
である)。 このタンパク質は芳香族残基を含有していないので、発
現レベルを定量化するクーマシーブリリアントブルーR
−250染色法によって視覚化することができない。C
Sタンパク質に関して特異的な5種のモノクローナル抗
体を用いたイムノプロット分析(前記デイムら(D a
me et al、)参照)により、クーマン−ブ
リリアントブルーR−250染色が可能なR16tet
atと比較して評価したレベルは、全細胞タンパク質の
約1%である。 実施例4A R32G、R48G、R64GSR80GおよびR11
2G 前記実施例4と同様にして、R32G、R48GSR6
4G、R80GおよびR112G(Rt6Gにおいて各
々、nが2.3.4.5または7である)をイー・コリ
N5151株において発現させる。これらのポリペプチ
ドは、R16Gとほぼ゛同じレベルで発現される。実質
的に実施例3に記載したのと同様にして、R48Gを精
製する。 実施例5 R16LAおよびR32LA 実質的に実施例4に記載したのと同様にして、配列: 5°−GATCCGCTGCGTT −3゜3°−
GCGACGCAACTAi5゜を有する合成リンカ−
をpAslのBamHI サイトに挿入することによ
りpT erm 2を調製する。 pT erm 2はI3amHI3Iトを有する。pU
C8クローン1由来の192塩基対のXhoIIフラグ
メントを前記と同様にして挿入する。各々、適正な配列
の1種または2種のXhoI[挿入部を有するクローン
であるpR16LAおよびpR32LAを、実質的に前
記と同様にして選択する。実質的に実施例3に記載した
のと同様にして、R32LAをイ製する。 実質的に前記と同様にして、pRI6LAおよびpR3
2LAをクローン化し、イー・コリN5151株におい
て発現させる。 R16LAおよびR32LAはっぎの配列を有する: N−met−asp−pro ((asn−ala−a
sn−pro)+5(asn−val−asp−pro
)+) n−1en−1eu−04式中、nは、各々、
lおよび2である)。C末端のロイシンおよびアルギニ
ンは、pT erm 2の合成リンカ−由来のものであ
る。R16LAは全イー・コリタンパク質の約1%で発
現され、一方、R32LAは、全細胞タンパク質の約5
%で発現される。 実施例6 16NS1 pAs1デルタEHは、pAsI 起源のpBR32
2の必須でないEcoR[−H1ndI[r領域の切除
により調製される。実質的に前記と同様にして、lOμ
9のpAslを、培地緩衝液200μσ中EcoRIお
よびHindIII(各々、20単位)で切断し、DN
Aポリメラーゼ(フレノウ)で処理し、結紮し、イー・
コリ中に形質転換する。29塩基対のEcoRI −H
lndlll フラグメントが欠失したクローンを同定
する。861塩基対のビールス原および375塩基対の
pBR322原中にインフルエンザビールス(A/PR
/8/34)NS Iコーディング領域を含有するpA
PR801の1236塩基対のBamHIフラグメント
(ヤングら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ(
Young et al、 、Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、 U。 S 、A)、第80巻、6105頁(1983)参照)
を、pAslデルタEHのBamHIサイトに挿入する
。得られたプラスミド、pAslデルタEH/801は
真正のN5I(230アミノ酸)を発現する。このプラ
スミドは、Cm翻訳開始サイトおよびNSIコーディン
グ配列間にBamHIサイトを有する。 実質的に前記と同様にして、PASIデルタEH/80
1 10μ9を、ハイ・バッファー(50IIMトリス
ーHCI2、pH7,5,1mM DTT。 10mM MgCQ*、100mM NaC12)
200μσ中EcoRI 20単位および5al12Q
単位で、37℃にて2時間で切断し、DNAポリメラー
ゼ大フラグメント(フレノウ)で処理し、結紮する。 650塩基対のEcoRI −Sal I領域が欠失し
たクローンを単離する。このプラスミド、pNslデル
タESは真正のNSIを発現する。 pUC8クローン1由来の192塩基対のXh。 ■フラグメントをpNs1デルタES中のBamH■サ
イト中に挿入することによりpR16Nslを調製し、
実質的に前記と同様にして、適正な配列の1つのXho
II挿入部を有するクローンを選択する。 煮沸工程を除いて、実質的に前記と同様にして、pR1
6Ns1をクローンし、イー・コリにおいて発現し、R
16NS1を精製する。 R16NS1は、次の配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro)+5(asn−val−asp−pr
o)+ ) n−N 227(式中、nは1、N227
は、NSI起源の227アミノ酸である)。 R16NSl調製におけるR16NS1は、煮沸または
イオン交換工程なしで、タンパク質の80%以上と評価
された。特に著しく高い比率を示すR16NS1は、総
細胞タンパク質の約25%である。 実施例6A R32NS l5R48NSLおよびR64NSL煮沸
工程を除いて、実質的に実施例3に記載したのと同様に
して、R32NSl (R16NS1においてnが2
である)をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから
精製する。R32NS 1はR16NS1とほぼ同じレ
ベルで発現され、同じ程度まで精製する。 実質的に前記と同様にして、R48NS1(R16NS
lにおいてnが3である)およびR64NSI(R16
NS1においてnが4である)をイー・コリにおいて発
現させる。R48NS1およびR64NS1は、各々、
総イー・コリタンパク質の約10%および約5%で発現
する。 実施例7 5IR4B 実質的に前記と同様にして、pR48tetssをBa
mHIで開裂させ、DNAポリメラーゼ(フレノウ)で
末端をうめる。プラスミドを次いで前記の如(BanI
[で開裂させ、3つのXhoI[フラグメントを担う6
72塩基対のフラグメントおよびテトラサイクリン耐性
遺伝子由来の96塩基対を得る。 実質的に前記と同様にして、lOμ9の1)ASIデル
タEH/801をハイバッファ−200μσ中Nco1
20単位で37℃にて2時間で切断し、DNAポリメラ
ーゼ大フラグメント(フレノウ)で末端をうめる。Nc
oIサイトは、NSI中の81残基に関するコドン中に
ある。プラスミドを次いで前記の如<Bann切断して
残存するNslコドンおよびテトラサイクリン耐性遺伝
子の一部を切除し、pAs1デルタEH/801−1を
得る。 672塩基対のBaIIIHI(末端をうめたもの)−
BanIIフラグメントを1)ASIデルタEH/80
1−1に挿入してpNsIR4B を調製する。このプ
ラスミドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにお
いて発現させる。NS In28は、次の配列を有する
: N −81N −asp−pro C(asn−ala
−asn−pro) +5(asn−val−asp−
pro)+ ) n−T 32−C(式中、81NはN
SIの81N末端アミノ酸、nは3、Ta2は前記のと
おりである)。 N5IR48は総細胞タンパク質の約
5%で発現される。 実施例8 32N 実質的に前記と同様にして、lOμ9のpR32NSI
を培地緩衝液200μQ中Hindll125単位で3
7℃にて2時間で切断し、pR32Ns1−1を得る。 HindIIl サイトはNSIコーディング領域中の
残基5に関するコドン中にある。pR32NSI−11
00n9を次いで実質的に前記と同様にして結紮する。 得られたプラスミド、pR32Nは、NSIコーディン
グ配列において、5番目のコドンの後にTAA終止コド
ンを含有する。 pR32Nは、実質的に前記と同様にしてイー・コリに
おいてR32Nを発現するのに用いる。 R32Nは、次の配列を有する: N −met−asp−pro ((asn−ala−
asn−pro) + 5−(asn−val−asp
−pro)+−) n−N 5−C(式中、nは2、N
SはNSI 遺伝子由来の5つのアミノ酸である)。さ
らに詳しくは、NSは、次の配列を有するニ ーasn−thr−val−ser−ser−CR32
Nは総イー・コリタンパク質の約5%で発現される。 実施例9 抗体応答−ELISA 組換タンパク質R16tet3z、R32tet3.お
よびR48tetstを実質的に前記と同様にして精製
し、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水pH7、0(PB
S)に対して透析し、アリコートをとり、−80℃にて
貯蔵する。構築物を、PBS、水酸化アルミニウム(明
パン)または完全フロインドアジュバント(CF A)
のいずれかと混合して、50μ9のタンパク質を含有す
る0、5蛙の投与量を得る。 PBS中CFA(G T BCO,Grand l5l
and、 NewYork)十抗原をl:lの比で、機
械的撹拌機で30分間撹拌することにより乳濁化させる
。明パンをPBS中に希釈した水酸化アルミニウムゲル
(USP)から調製する。 4℃にて12時間回転式混合機で、抗原は明パンに吸着
される。該懸濁液をさらに12時間静置し、上清を廃棄
して、l投与量につきAl2O,80屑9および組換タ
ンパク質50μ9を得る。6〜8週令のC57B1/6
マウスを総量50μ9のタンパク質を皮下投与および腹
腔内投与により免疫化する(1群につき5匹)。被験動
物に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の4
週間後に追加抗原投与をする。ただし、CFA中免疫原
を受けた群には、不完全フロインドアジュバント(IF
A)中孔濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。1
週間後、尾から採取した血を全部ため、−夜4°Cにて
凝固させ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清
を必要になるまで一80℃にて保存する。 固相酵素免疫測定法(ELISA)を用いて、熱帯熱マ
ラリア原虫CSタンパク質(asn−a(2a−asn
−pro)*の4つの重複からな、る16アミノ酸合成
ペプチドとの反応性に関して、全ての血清をテストする
(デイムら、サイエンス(Dame et al、
。 S cience)、第225巻、593頁(1984
)参照)。合成ペプチド抗原を牛血清アルブミン(BS
A)と結合させ、これをマイクロタイタープレートの孔
に塗布する。0.01M リン酸緩衝生理食塩水pH7
,4(’PBS)で希釈したスクリーニング抗原50μ
QC0,1μ9)をポリスチレンマイクロタイタープレ
ート(イムンロン2 ダイナチク・ラボラトリーズ(I
mmunlon 2 D ynatech L
abo−ratorie32Alexandria、
VA)のくぼみにピペットで添加し、−夜室温(約2
2℃XRT)に保つ。 孔内容物を次いで、吸引し、ブロッキングバッファー(
BB=PBS中1.0%BSA、0.5%カゼイン、0
.005%チメルソールおよびo、o o 。 5%フェノールレッド)を充填し、1時間室温に保つ。 マウスの血清を連続してBB中に希釈し、50μeを番
孔に添加する。室温にて2時間インキュベートした後、
孔を吸引し、PBS−0,05%ツイーン20(PBS
−TW20)で3回洗浄し、10%PBS中熱不活化ヒ
ト血清で11500に希釈したヤギ抗マウスIgG(H
+LXバイオラドラボラトリーズ(Bio−Rad
Laboratories。 Richmond、 CA )と接合したホースラディ
ツシュパーオキシダーゼ50μQを番孔に添加する。1
時間後、孔内容物を吸引し、PBS−TW20で3回洗
浄し、次いで基質(1mg2.2°−アジノージ−(3
−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−6)10.1M
クエン酸リン酸緩衝液、pH4,0+&、使用直前に0
.005%過酸化水素を添加)を番孔に添加する。41
4nmにおける吸収を1時間後にEL I SAプレー
トリーダー(ティターチク・マルチスキャン、フロー・
ラボラトリーズ・インコーホレイテッド(T 1ter
tek Multiskan、 F lowlab
oratorie32 I nc、 、McL ean
、 V A))で測定する。 R16tetHlR32tetstおよびR48tet
3を構築物は、全てEL I SAにおいて反応する抗
体を産生する。R16tetHは、単独で投与した場合
、R32tetstおよびR48tetstに比べて免
疫原性が劣る。明パンおよびCFAは両方とも3種のタ
ンパク質全部の免疫原性を高め、抗体は、少なくともl
領域で滴定により102000検出される。 実施例1O 抗体応答−IFA 実施例9で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分折(IF
A)でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫CSタンパク
質と強く反応することが示された。 猿マラリア原虫、シノモルギマラリア原虫(P。 cynomolgi)、三日熱マラリア原虫(P 、
viva)、およびガリナケウムマラリア原虫(P 、
gallinaceum)に対する反応性は検出されな
かった。R32tet3zに対する抗血清の反応性は、
若干、嘔歯類住血胞子虫(P 、berghei)に関
してみられた。この結果は、ホックマイヤーら、プロシ
ーデンクズ・サード・インターナショナル・シンポジウ
ム・オブ・イムノバイオロジー、プロテインズペブタイ
ズ、アタッン、エム・ゼット編、プレナム(Hockm
eyer etal、、 in Proc、 3
d Int’1. Symp、 rmmuno−b
iol、 Proteins Peptide32
ed、 by Atassi。 M、2’、、、 Plenum New Yor
k(inpress)による、熱帯熱マラリア原虫に対
するある種のMabは、IFAにより、唱歯類住血胞子
虫スポロゾイトと反応することを示すデータと一致する
。 実質的にボスワース、ジャーナル・オプ・バラシトロシ
イ(Bosworth、 J 、Parasitol、
)、第61巻、769頁(1975)に記載されている
のと同様にして、スポロゾイトを感染した蚊の唾液腺か
ら摘出し、食塩水または0.5%BSAを含有するMe
dium I 99 (G I B CO)中に希釈し
、血球計算盤で計測し、2000〜5000スポロゾイ
ト/10μgに希釈する。10μρのアリコートを、マ
ルチウェルプリンテッドIFAスライドの番孔に入れ、
室温で乾燥し、−80℃にて保存する。 IFAは、まず、BBで1/100に希釈した血清20
μg容を、乾燥したスポロゾイトを入れたIFAスライ
ドの孔に入れることにより開始する。湿潤室内で室温に
て20分間インキュベートした後、該血清溶液を吸引し
、スポットを2滴のPBSで洗浄する。BBでl :4
0に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(キル
ケガード・アンド・ぺり−(Kirkegord a
nd Pery。 Gaithersburg、 MD)と接合したヤ゛
ギ抗マウス抗体20μgを次いで各スポットに添加する
。再び室温にて20分間インキュベートした後、該スポ
ットを再び2滴のPBSで洗浄し、グリセロールに添加
し、500倍のUV光の下で蛍光に関して調べる。 実施例11 C12反応 RI 6 Let、!、R32Let、、およびR48
Let3゜で免疫化したマウス由来の血清は、強いcs
P陽性反応を示す(第1表参照)。アジュバントなしで
投与した場合、RI 6 Let3.だけが、陽性のC
12反応を示す抗体を産生せず、一方、CFAまたは明
パンとともに投与した場合、3つの構築物は全て強いC
12反応を示す抗体を産生じた。 第1表 R16Let、2、R32tetHおよびR48Let
Hに対する血清のCSP反応性 抗血清 アジュバント R16tet32 R32tet32
R48tet32なし O/25(−)
17/25(2+) 21/25(4+)CFA 2
3/25(4+)21/25(4+)21/25(4+
)明パン 25/25(4+) 25/25/(4
+) 16/27(2+−4+) C12反応は、基本的にファンデルベルクら、(Van
derberg et al、 Mil、 Med、)
、第134巻(補遺l)、1183頁(1969)によ
り記載されているのと同様にして行う。Medium
199 中に再懸濁させた熱帯熱マラリア原虫500〜
1゜00を含有する蚊唾液腺スポロゾイトを、顕微鏡ス
ライド上で血清5μgと混合し、カバーガラスをかけ、
ベトロリウムゼリーをふちにつけて密封し、37℃にて
1時間インキュベートする。位相差顕微鏡で400倍で
反応を評価する。25のランダムスポロゾイトを、各血
清サンプルに関して調べ、C8P陽性生体の数を表に示
す。前記ファンデルベルクら(Vanderberg
et al、)により記載されているCSP反応度
を書き加えである。 (−)は、CSP反応性が検出されないことを示す;(
2+)は、スポロゾイトの表面上に粒状の沈殿が見られ
ることを示す;(4+)は、スポロゾイトの一端に、長
い糸状フィラメントが見られることを示す。正常マウス
血清、およびCFAのみで免疫化したマウスから得た血
清は、同様の分析で検出可能なC8P活性を示さなかっ
た。 実施例■2 肝臓細胞ブロッキング 前記実施例9で得た血清を、in vitroでの侵
入阻害分析で調べた(第2表)。これらのデータにより
、R32tetstおよびR48tetszタンパク質
はアジュバントの非存在下でも抗体に強いブロッキング
活性を惹起することがわかる。R16tet+tは、適
用され明パンに吸収される場合は、強いブロッキング抗
体の惹起にあまり有効でない。これは、Rl 6 te
t、、タンパク質に生じる抗血清にっいて見られる弱い
CSP反応性および低いELISA滴定値と一致する。 第2表 in viLroの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト
侵入HepG2−Al1へパトーム細胞の阻害な し
46 95
92CFA 76 92
94明パン 100 100 96培養
細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ポリングデイルら、
ジャーナル・オブ・イムノロシイ(Hollingda
le et al、、 J 、 I mmu、
nol、)第32巻、909頁(1984)により記載
されているのと実質的に同様にして行なわれる。R16
tet32、R32tetstおよびR48tetat
構築物で免疫化されたマウスから得た血清を、熱帯熱マ
ラリア原虫スポロゾイトによる培養細胞の侵入の阻害性
に関してテストした。血清を培養液中に希釈し、Hep
G2−A16細胞培養物に添加して、最終希釈度を1
: 20 (v/v)にする。次いで12000〜40
000の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適
用した培養物を、37℃にて5%CO4雰囲気下で3時
間インキュベートし、D ulbecc。 のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、メタノー
ル中で凝固させて、PBSで2回洗浄する。 細胞中にはいったスポロゾイトは、免疫パーオキシダー
ゼ分析(IPA)により視覚化できる(前記ホリングデ
イルら(Hollingdale et at、参
照)。IPAは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア
原虫に対するMab(2F 1 、1 、前記デイムら
(Dame et at、参照)で処理し、次いで
、ホースラディツシュパーオキシダーゼと接合したウサ
ギ抗マウスイムノグロブリンとともにインキュベートし
、3.3−ジアミノベンジジンで染色することにより行
う。培養細胞中に侵入したスポロゾイトの数を、ライフ
(L eitz)の顕微鏡で、250倍で、暗青色フィ
ルターを用いて、全調製物中に存在する細胞内寄生体の
計測により測定する。 実験は、2回または3回ずつ行い、同一の実験において
は、各細胞培養物に同数のスポロゾイトを添加する。阻
害は、正常マウス血清対照例と比較した杭構築免疫血清
によるスポロゾイト侵入の減少率(%)であり、CS反
応性Mab2F 1.1により、希釈[1/20で1
00%のスポロゾイト侵入阻害が得られた。 実質的に前記と同様にして調製した組換タンパク質、R
LA、R16NS +およびR32NS 1を、同様に
ELISAおよびIFA分析でテストし、同様に、16
合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、陽性のC2
F反応を示すことが判明した。R32tet32および
R32LAは、その反応の均一性、発現レベルおよび調
製の容易性のために好ましい。 合成的に製造したワクチンの第一の問題は、合成免疫原
性に対して産生された抗体が真正分子を認識するかどう
か、および該抗体が防御を付与するのに十分な生物学的
性質を有するかどうかである。免疫蛍光分析およびCS
P反応の両方を示す実施例により、イー・コリ構築物に
対して産生された抗体は、スポロゾイトの表面と反応し
、従って、真正CSタンパク質を認識することがわかる
。 CSP抗体は動物およびヒトにおいて存在し、防御免疫
と重要な関連があることが判明している。 杭構築抗体がin vitroでヒトへプトーマのス
ポロゾイト侵入を阻害することは明らかである。前記ホ
リングデイルら(Hollingdale et
al、)は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア
原虫に対するMabは両方とも、これらの79977種
に対するヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、
スポロゾイト侵入をブロックすることを示している。i
n vitroでのスポロゾイト侵入のブロッキング
は、従って防御抗体に関する評価として考慮される。従
って、該データは全体として、侵入のワクチンは、熱帯
熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染からヒトを防御
するのに用いることができることがわかる。 ELI SA滴定により評価されるこれらの組換タンパ
ク質、表面反応性(IFAおよびCSPにより示される
)およびスポロゾイト侵入のブロッキングに対する免疫
応答は、完全フロインドアジュバントまたは明パンのい
ずれかを用いることにより高められる。完全フロインド
アジュバントは、発熱させ、肉芽腫を生じさせ、その結
果、ツベルクリン過感作となるので、ヒトにおいて用い
ることができない。明パンは、現在、ジフテリアおよび
破傷風トキソイド等の確立されたワクチン、ならびに最
新ワクチンの一種、B型肝炎において、アジュバントと
して用いられている。これは、有効で、ヒトにおいて長
期間安全に使用できることが実証されている。 実施例13 ワクチン調製物 一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。3%
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液(10mMリン酸ナ
トリウム、150 mMNac12. pH6。 8:濾過により滅菌化)に、同様の緩衝液中本発明のポ
リペプチド溶液を撹拌しながら添加し、ポリペプチドの
最終濃度を100μg/ltrσ、アルミニウム(A
Q” + )の最終濃度を1.01/!12にする。p
Hを6.6 に保つ。該混合物を約0℃にて一夜静置す
る。チメルソールを添加し、最終濃度を0.005%に
する。I)Hをチェックし、要すれば、6゜8に調節す
る。 以上の様に本発明およびその好ましい具体例を記載した
が、本発明は、記載した具体例に限定されるわけではな
く、むしろ特許請求の範囲に含まれるあらゆる修飾が含
まれる。 4、簡単な図面の説明 第1a図は、CSタンパク質のコーディング配列を担う
熱帯熱マラリア原虫(P lasmoduimfalc
iparum)ゲノムDNAの領域の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ開裂地図である。 第1b図は、pAslの部分的制限エンドヌクレアーゼ
の開裂地図である。
Claims (12)
- (1)4つ以上の熱帯熱マラリア原虫 (Plasmodium falciparum)CS
タンパク質のタンデム重複単位からなることを特徴とす
るポリペプチド。 - (2)少なくとも4重複からなる前記第(1)項のポリ
ペプチド。 - (3)少なくとも約16重複単位〜約148重複単位か
らなる前記第(1)項のポリペプチド。 - (4)Rtet_3_2ポリペプチド、RNS1ポリペ
プチド、NS1Rポリペプチド、Rtet_8_6ポリ
ペプチド、RGポリペプチド、RLAポリペプチドおよ
びRNポリペプチドからなる群より選ばれる前記第(1
)項のポリペプチド。 - (5)R16tet_8_6 R32G R32tet_8_6 R48G R48tet_8_6 R64G R16tet_3_2 R80G R32tet_3_2 R112G R48tet_3_2 R16LA R64tet_3_2 R32LA R80tet_3_2 R16NS1R96te
t_3_2 R32NS1R112tet_3_
2 R48NS1R16G R
64NS1NS1R48 R32N である前記第(4)項のポリペプチド。 - (6)R32tet_3_2またはR32LAである前
記第(4)項のポリペプチド。 - (7)免疫防御量の前記第(1)項のポリペプチドおよ
び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
を防御するためのワクチン。 - (8)免疫防御量の前記第(2)項のポリペプチドおよ
び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
を防御するためのワクチン。 - (9)免疫防御量の前記第(3)項のポリペプチドおよ
び医薬上許容される担体からなることを特徴とする、熱
帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒト
を防御するためのワクチン。 - (10)免疫防御量の前記第(4)項のポリペプチドお
よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
トを防御するためのワクチン。 - (11)免疫防御量の前記第(5)項のポリペプチドお
よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
トを防御するためのワクチン。 - (12)免疫防御量の前記第(6)項のポリペプチドお
よび医薬上許容される担体からなることを特徴とする、
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる感染に対してヒ
トを防御するためのワクチン。
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