CN106290825A - 间日疟原虫胶体金法检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。本发明提供一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体采用胶体金标记。本发明所提供的间日疟原虫胶体金检测试剂盒首次通过胶体金免疫层析技术检测间日疟原虫，兼具灵敏性和特异性，具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

Description

间日疟原虫胶体金法检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途。

背景技术

疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；其他二种少见，近年偶见国外输入的一些病例。不同的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。

疟疾为世界五大寄生虫病之一，有很高的发病率和死亡率，普遍存在于热带及亚热带地区，位于赤道周围的宽大带状区域。主要流行地区是非洲中部、南亚、东南亚及南美北部的热带地区，这其中又以非洲的疫情最甚。就中国而言，疟疾主要的流行地带为华中华南的丛林多山地区，但疫情远较非洲为轻。疟疾是以周期性冷热发作为最主要特征，脾肿大、贫血以及脑、肝、肾、心、肠、胃等受损引起的各种综合征。患者每年在3亿～5亿之间，因患疟疾而死亡的人数在1百万～3百万之间，其中大部分为儿童。

及早、快速有效地检测疟原虫是有效防治疟疾的关键。传统的检测方法是通过血涂片显微镜检查来判断，这种方法简便、经济、准确率高，缺点是判断结果受检验人员镜检水平和视力疲劳程度等因素的影响，易导致误诊和漏检且检查效率不高，不适合大规模现场调查和短时间大批量处理样本。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体采用胶体金标记。

优选的，所述金标垫上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体采用150nm胶体金标记，具有信号受背景干扰小，检测灵敏度高，结果重复性好的优点。

优选的，所述底板为PVC底板。

优选的，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。

优选的，所述检测线上包被有抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体。所述金标垫上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体与检测线上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体可以是相同的抗体，也可以是不同的抗体。

优选的，质控线上包被羊抗鼠抗体。

优选的，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为50-100mM。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10-40mM。

优选的，所述缓冲液还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为10～50g/L。

优选的，所述缓冲溶液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一种或多种的组合，所述表面活性剂的浓度为20～40g/L。

优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和特异性，本发明所述的金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：果糖、氢氧化铝、葡萄糖、氯化钠和甘氨酸，且果糖、氢氧化铝、葡萄糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为4.5－6.5g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。

优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：

果糖1.0-2.0g/L；氢氧化铝0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化钠0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

优选的，所述试剂盒还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。

更优选的，所述卡壳为塑料卡壳。

优选的，所述检测试剂盒用于检测间日疟原虫。

本发明所提供的间日疟原虫胶体金检测试剂盒，可配套免疫定量分析仪器使用。免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线(C)条带荧光信号，计算T/C信号值。使用前先将不同标准品滴加到试纸卡上，分析处理建立定标曲线(T/C信号值与标准品真实值的关系)，再将检测样品时获得的T/C值与标准曲线比较，即可获得检测样品中的间日疟原虫抗原含量。

本发明第二方面提供所述间日疟原虫胶体金检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液喷涂金标垫，制得包含抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体的金标垫；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体及羊抗鼠抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

优选的，本发明所述的金标垫还经过预处理，预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10-40mM。

优选的，所述缓冲液还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为10～50g/L。

优选的，所述缓冲溶液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一种或多种的组合，所述表面活性剂的浓度为20～40g/L。

优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和特异性，本发明所述的金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分：果糖、氢氧化铝、葡萄糖、氯化钠和甘氨酸，且果糖、氢氧化铝、葡萄糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为4.5－6.5g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。

优选的，各组分在缓冲液中的浓度为：

果糖1.0-2.0g/L；氢氧化铝0.25-0.75g/L；葡萄糖1.0-1.5g/L；氯化钠0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。

所述预处理缓冲液的溶剂为水。

所述预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡1.5～2h，取出放于36～38℃烘干。

所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。

本发明第三方面提供所述间日疟原虫胶体金检测试剂盒在间日疟原虫检测领域的用途。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的间日疟原虫胶体金检测试剂盒首次将间日疟原虫通过胶体金免疫层析技术进行检测，兼具高灵敏性和高特异性，能够快速检测间日疟原虫。此外，所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 本发明试纸卡的制备

1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理，预处理缓冲液为：果糖1.5g/L，氢氧化铝0.5g/L，葡萄糖1.25g/L，氯化钠0.3g/L，甘氨酸2.0g/L的水溶液，pH＝7.4，预处理的具体步骤为：将金标垫在预处理液中浸泡2h，取出放于37℃烘干；然后用胶体金标记的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体的金标垫，溶液中胶体金与抗体的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液和羊抗鼠抗体溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

实施例2 对比试剂盒的制备

对比例试纸卡的制备：采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，其他试剂及实验方法均同实施例1。

1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫，然后用胶体金标记的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包被抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体的金标垫，溶液中胶体金与抗体的质量比为5:1，溶液的浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液和羊抗鼠抗体溶液，喷涂量为1ul/cm，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上，切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。

实施例3 检测试剂盒的特异性实验

检测方法：

1.取实施例1制备的本发明试剂盒和实施例2的对比试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

2.待测样品的制备：按表1的四类实验对象，取全血作为待测样品。

3.每类实验对象为100人，检测结果如表1：

表1 检测试剂盒特异性试验结果

由上表可知，本发明的检测试剂盒对乙型肝炎及梅毒均无交叉反应，特异性良好。

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种间日疟原虫胶体金检测试剂盒，包括试纸卡，试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述金标垫上的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体采用胶体金标记。

2.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上，检测线位于离加样端较近一侧，质控线位于离加样端较远一侧。

3.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测线上包被有抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体。

4.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，质控线上包被羊抗鼠抗体。

5.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述样品垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为50～100mM。

6.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述金标垫采用缓冲液处理，所述缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合，缓冲液的浓度为10～40mM。

7.根据权利要求6所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液中还包括反应增强剂，所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种，所述反应增强剂的浓度为20～40g/L。

8.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，还包括卡壳，所述卡壳包括背卡和上盖，所述背卡设有试纸卡卡槽，所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内，所述上盖设有测试窗和加样孔，所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合，所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。

9.如权利要求1所述的胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测间日疟原虫。

10.根据权利要求1～9任一权利要求所述的胶体金检测试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：

1)用胶体金标记的抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体溶液喷涂经预处理的金标垫，制得包含抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体的金标垫；

2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂抗间日疟原虫醛缩酶单克隆抗体及羊抗鼠抗体，制得包被后的硝酸纤维素膜；

3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上，切裁制得检测试纸卡；最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。