一种高尔基体糖蛋白-73检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种高尔基体糖蛋白-73检测试剂盒及其制备方法和用途。
背景技术
高尔基体糖蛋白-73(GolgiProtein73,GP73)又称Ⅱ型高尔基体膜蛋白(Golgiphosphoprotein2,GOLPH2),其在慢性肝炎、肝硬化等病人血清中浓度升高,而在肝细胞肝癌病人血清中升高更加明显,和正常人或良性肝病病人之间呈显著差异。有研究表明,血清GP73用于肝癌的诊断,优于血清GP73检测。据文献报道,GP73检测肝癌的灵敏度为69%,特异性为75%。对于早期肝癌的诊断,GP73的敏感性为62%,而GP73敏感性仅为25%。GP73水平低于20μg/L的肝癌患者中,有57%的人群GP73水平显著升高。这表明,GP73的应用能够大大提高对GP73阴性的肝癌患者的检出率。
目前已知的高尔基体糖蛋白-73(GP73)检测方法还存在较多缺陷,如操作较为繁琐,耗时较长,不适宜临床上使用。目前,我国市场上的高尔基体糖蛋白-73(GP73)检测试剂盒准确度、灵敏度、重复性仍然较差。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种快速测定血清或血浆中高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量的试剂盒,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种快速测定血清或血浆中高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量的试剂盒,包括试纸卡,所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述金标垫上包含高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体,所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线,所述金标垫上的高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体采用荧光微球标记。
优选的,所述金标垫上的高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体采用180nm荧光微球标记,EX(nm)=650/Em(nm)=670,具有信号受背景干扰小,检测灵敏度高,结果重复性好的优点。
优选的,所述底板为PVC底板。
优选的,所述硝酸纤维素膜上,检测线位于离加样端较近一侧,质控线位于离加样端较远一侧。
优选的,所述检测线上包被有高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体。所述金标垫上的高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体与检测线上的高尔基体糖蛋白-73(GP73)单克隆抗体可以是相同的抗体,也可以是不同的抗体。
优选的,质控线上包被羊抗鼠抗体。
优选的,所述样品垫采用缓冲液处理,所述缓冲液选自PBS缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液和柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为20-200mM。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为5-50mM。
优选的,所述缓冲液还包括反应增强剂,所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一种,所述反应增强剂的浓度为10~50g/L。
优选的,所述缓冲溶液还包括表面活性剂,所述表面活性剂选自S-19TWEEN20、S-20TWEEN80、S-13TRITONX-45、S-14TRITONX-100、S-15TRITONX305中的任意一种或多种的组合,所述表面活性剂的浓度为10~50g/L。
优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,本发明所述的金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分:水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸,且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5-7.5g/L,缓冲液的pH值为7.2-7.6。
优选的,各组分在缓冲液中的浓度为:
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
优选的,所述试剂盒还包括卡壳,所述卡壳包括背卡和上盖,所述背卡设有试纸卡卡槽,所述试纸卡嵌于所述试纸卡卡槽内,所述上盖设有测试窗和加样孔,所述测试窗的位置与所述检测线和质控线的位置相配合,所述加样孔的位置与所述样品垫的位置相配合。
更优选的,所述卡壳为塑料卡壳。
优选的,所述检测试剂盒用于定量检测血清或血浆中高尔基体糖蛋白-73(GP73)的含量。
本发明所提供的定量检测高尔基体糖蛋白-73(GP73)的检测试剂盒,可配套免疫定量分析仪器使用。免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线(C)条带荧光信号,计算T/C信号值。使用前先将不同标准品滴加到试纸卡上,分析处理建立定标曲线(T/C信号值与标准品真实值的关系),再将检测样品时获得的T/C值与标准曲线比较,即可获得检测样品中的高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量。
本发明第二方面提供所述定量检测高尔基体糖蛋白高尔基体糖蛋白-73(GP73)的检测试剂盒的制备方法,包括如下步骤:
1)用荧光微球标记的高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体溶液喷涂金标垫,制得包含高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体的金标垫;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体及羊抗鼠抗体,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在底板上,切裁制得检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
优选的,本发明所述的金标垫还经过预处理,预处理时所使用的预处理缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、硼酸盐缓冲液的一种或多种的组合,缓冲液的浓度为5-50mM。
优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,本发明所述的金标垫在预处理时所使用的预处理缓冲液包括下列组分:水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸,且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5-7.5g/L,缓冲液的pH值为7.2-7.6。
优选的,各组分在缓冲液中的浓度为:
所述预处理缓冲液的溶剂为水。
所述预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。
所述预处理缓冲液可使用本领域各种常用的pH调节剂进行pH值的调节。
本发明第三方面提供所述定量检测高尔基体糖蛋白高尔基体糖蛋白-73(GP73)的检测试剂盒在高尔基体糖蛋白-73(GP73)检测领域的用途。
本发明的有益效果为:
本发明所提供的定量检测高尔基体糖蛋白-73(GP73)的检测试剂盒首次将高尔基体糖蛋白-73(GP73)通过荧光微球免疫层析技术进行检测,兼具高灵敏性和高特异性,能够快速检测高尔基体糖蛋白-73(GP73)的含量。此外,所述检测试剂盒具有操作快速简便、结果准确、经济适用等优点,受血清(或血浆)严重血脂、溶血干扰小,当血清(或血浆)血红蛋白≤500mg/L、甘油三酯≤30mg/dL时,对准确度的影响变差<10%。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,Secondedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates;theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego,1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999等。
实施例1
本发明试纸卡的制备:
1)使用预处理缓冲液对金标垫进行预处理,预处理缓冲液为:水苏糖2g/L,明矾0.5g/L,果糖二磷酸钠1.5g/L,六偏磷酸钠0.3g/L,甘氨酸1.88g/L的水溶液,pH=7.4,预处理的具体步骤为:将金标垫在预处理液中浸泡2h,取出放于37℃烘干;然后用荧光微球标记的高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体的金标垫,溶液中荧光微球与抗体的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体溶液和羊抗鼠抗体溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。标准线曲线:
分别将浓度为0、2、5、20、60、100、200、400、600、800、1000ng/ml的高尔基体糖蛋白-73(GP73)缓冲溶液滴加于样品垫上,每个浓度设5个重复(检测结果取5个重复的平均值),膜层析10分钟以后,使用免疫分析仪器通过采集检测线(T)和质控线(C)条带荧光信号,分析仪对荧光信号的检测范围是AD值0-10000,计算T/C信号值,建立定标曲线,其中Y轴为T/C信号值,X轴为标准品真实值。
高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗干扰性和特异性的检测:
将检测样品滴加于样品垫上,每个样品设5个重复(检测结果取5个重复的平均值),膜层析10分钟以后,将检测样品时获得的T/C值与标准曲线比较,获得检测样品中的高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量的检测数据,再将检测获得的高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量数据与真实高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量数据进行对比,获得准确度影响偏差值。
样品1:1ng/ml高尔基体糖蛋白-73(GP73)、50mg/L血红蛋白、50mg/dL甘油三酯;
样品2:3ng/ml高尔基体糖蛋白-73(GP73)、500mg/L血红蛋白、10mg/dL甘油三酯;
样品3:6ng/ml高尔基体糖蛋白-73(GP73)、100mg/L血红蛋白、20mg/dL甘油三酯;
样品4:150ng/ml高尔基体糖蛋白-73(GP73)、150mg/L血红蛋白、30mg/dL甘油三酯;
样品5:500ng/ml高尔基体糖蛋白-73(GP73)、200mg/L血红蛋白、40mg/dL甘油三酯;
空白对照:50mg/L血红蛋白、50mg/dL甘油三酯;
样品1-5所获得的检测的高尔基体糖蛋白-73(GP73)含量数据分别为1.01ng/ml、2.99ng/ml、6.02ng/ml、149.99ng/ml、500.03ng/ml,准确度的影响变差<10%,空白对照中检测时未发现明显荧光信号变化。
实施例2
对比例试纸卡的制备:采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,其他试剂及实验方法均同实施例1。
1)采用25mM甘氨酸缓冲液预处理金标垫,然后用荧光微球标记的高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体溶液喷涂经预处理的金标垫,制得包被高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体的金标垫,溶液中荧光微球与抗体的质量比为5:1,溶液的浓度为10mg/ml,喷涂量为4ul/cm;
2)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷涂1mg/ml的高尔基体糖蛋白-73(GP73)抗体溶液和羊抗鼠抗体溶液,喷涂量为1ul/cm,制得包被后的硝酸纤维素膜;
3)将样品垫、步骤1)制备金标垫、步骤2)制备的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴在PVC底板上,切裁制得宽3-5mm的检测试纸卡;最后将检测试纸卡装入卡壳制得检测试剂盒。
高尔基体糖蛋白-73(GP73)的灵敏性和检测限对比实验:
用荧光仪器进行判断,分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000,根据仪器的性能,CUTOFF值为50,在特定浓度下,90%以上检测例AD值≥50,即认为试剂盒能够用于该浓度下的检测。
采用5%BSA生理盐水溶液作为空白样本,空白样本应不含被测物。取1~20pg/ml梯度浓度的高尔基体糖蛋白-73(GP73)已知样品进行灵敏性检测,每间隔0.5pg/ml设置一个梯度,每个梯度设置40个样本,记录检测结果。结果显示实施例1所制备的试剂盒的最低检测限为2.5pg/ml;而实施例2制备的试剂盒的最低检测限高于20pg/ml。
综上所述,本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性,且具有很好的灵敏性,阴性本底更低,有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。