CN112858677A - 标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法、试剂条及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，标记方法包括以下步骤：（1）制备胶体金溶液；（2）将制备好的胶体金溶液调节pH值至低于最适pH值1.0～1.5；（3）一次性加入标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，加入量低于最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的60%～70%；（4）加入封闭剂和稳定剂，标记结束；打破安全范围，把免疫金放在一个相对不稳定但可控条件下，可明显提升产品显色强度和灵敏度，上述“相对不稳定但可控条件”指胶体金标记pH值略低于待标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体等电点，标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量为不饱和量，以及封闭剂和稳定剂的同时加入，最终体现在产品上显色强度明显加深，灵敏度显著提高。
Description
技术领域
本发明属于金免疫技术领域，具体涉及一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法、试剂条及试剂盒。
背景技术
金免疫技术是一种以胶体金作为标记物的免疫标记技术，胶体金是氯金酸在还原剂的作用下，形成的带负电的疏水胶溶液，该溶液由于静电作用而成为稳定的胶体状态，即为胶体金，胶体金表面带负电荷，蛋白质的正电荷基团因静电吸附力而包被到胶体金颗粒表面，此过程即为胶体金标记，也称为金免疫。
免疫金的特性主要受金颗粒、标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量、pH值影响，最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量一般为标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体完全吸附于胶体金的最大量， 最适pH值一般为接近或略高于待标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的等电点，但最适标记状态仅能够保证免疫金的稳定性，无法在免疫层析法中明显提升产品显色强度和灵敏度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，通过该方法可以提升产品显色强度和灵敏度。
还提供一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂条，其检测灵敏度高、显色速度快，显色强度好。
还提供一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂盒，其使用便捷、操作简单。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，标记方法包括以下步骤：
（1）制备胶体金溶液；
（2）将制备好的胶体金溶液调节pH值至低于最适pH值1.0～1.5；
（3）一次性加入标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，加入量低于最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的60%～70%；
（4）加入封闭剂和稳定剂，标记结束。
作为一种优化方案，步骤（3）中标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体加入时间为1s。
作为一种优化方案，步骤（3）中的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的加入量为：
每1mL胶体金溶液加入3.6~4.2µg抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，反应时间为10min。
作为一种优化方案，步骤（2）中调节pH值所用溶液为锡酸钾溶液，用锡酸钾溶液将胶体金溶液pH值调至5.5~6.0。
锡酸钾溶液制备方法为称取2g锡酸钾，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
作为一种优化方案，步骤（1）中胶体金溶液为采用柠檬酸三钠还原法制备的万分之二的纳米金。
作为一种优化方案，步骤（1）中胶体金溶液的制备方法为：
氯金酸溶液：将10g氯金酸溶于超纯水中，待完全溶解后定容至1000mL，4℃避光保存备用。
柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
将2mL氯金酸溶液和98mL超纯水加入三口烧瓶中，加热至沸腾，然后加入4.5mL柠檬酸三钠溶液，待烧瓶内液体由蓝紫色变为酒红色，反应20min，冷却后室温避光保存备用。
作为一种优化方案，步骤（4）中封闭剂和稳定剂为BSA溶液和PEG20000溶液，先加入稳定剂PEG20000溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLPEG20000溶液，再加入封闭剂BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLBSA溶液。
作为一种优化方案，BSA溶液制备方法为称取10gBSA，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配；PEG20000溶液制备方法为称取10gPEG20000，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂条，试剂条制备方法如下：
（1）膜的包被
包膜稀释液配方：0.01MPB，pH7.4，质量百分比浓度为0.05%海藻糖，将检测线和质控线从下至上依次包被于NC膜上。
（2）胶体金垫的制备
制备出胶体金溶液，然后分别按常规方法和上述方法标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体；标记完成后离心，用金复溶液浓缩，均匀铺于玻璃纤维上，放烘房烘24小时成胶体金垫。
（3）样品垫的处理
样品垫处理液配方：0.1MPBS，pH7.4，质量百分比浓度为0.1%蔗糖，质量百分比浓度0.1% BSA，质量百分比浓度0.5% Tween-20，质量百分比浓度0.5% Triton X-100，质量百分比浓度0.1% NaN3；将处理液均匀地涂布到玻璃纤维上，放烘房烘24小时，制成样品垫。
（4）试剂条的组装
将吸水纸、NC膜、胶体金垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试纸条。
一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂盒，试剂盒包括检测卡和样本稀释液，检测卡包括相互扣合的卡体和卡盖，卡体和卡盖之间具有上述的试纸条。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的过程，是通过正负电荷的静电作用相互吸附的过程，在免疫金稳定的安全范围内，吸附到胶体金颗粒上的抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体越多，产品的显色强度和灵敏度就越高，但如果打破安全范围，把免疫金放在一个“相对不稳定但可控条件”下，可明显提升产品显色强度和灵敏度，上述“相对不稳定但可控条件”指胶体金标记pH值略低于待标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体等电点，标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量为不饱和量，以及封闭剂和稳定剂的同时加入，此条件会造成免疫金部分团聚但稳定可控，最终体现在产品上显色强度明显加深，灵敏度显著提高。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，标记方法包括以下步骤：
（1）液体配制
氯金酸溶液：将10g氯金酸溶于超纯水中，待完全溶解后定容至1000mL，4℃避光保存备用。
柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
锡酸钾溶液：称取2g锡酸钾，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
BSA溶液：称取10gBSA，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
PEG20000溶液：称取10gPEG20000，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
（2）胶体金溶液制备
将2mL氯金酸溶液和98mL超纯水加入三口烧瓶中，加热至沸腾，然后加入4.5mL柠檬酸三钠溶液，待烧瓶内液体由蓝紫色变为酒红色后，再反应20min，冷却后室温避光保存备用。
（3）胶体金标记
用锡酸钾溶液将胶体金溶液pH值调至6.0，然后每1mL胶体金溶液加入3.6µg抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，反应10min后，先加入稳定剂PEG20000溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLPEG20000溶液，再加入封闭剂BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLBSA溶液，标记结束。
其中抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的饱和加入量为每1mL胶体金溶液加入6µg，即6µg为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量，调节后的pH值至低于最适pH值1.0，即最适pH值为7.0，标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体加入时间为1s，加入量为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的60%。
实施例2：一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，标记方法包括以下步骤：
（1）液体配制
氯金酸溶液：将10g氯金酸溶于超纯水中，待完全溶解后定容至1000mL，4℃避光保存备用。
柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
锡酸钾溶液：称取2g锡酸钾，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
BSA溶液：称取10gBSA，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
PEG20000溶液：称取10gPEG20000，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
（2）胶体金溶液制备
将2mL氯金酸溶液和98mL超纯水加入三口烧瓶中，加热至沸腾，然后加入4.5mL柠檬酸三钠溶液，待烧瓶内液体由蓝紫色变为酒红色后，再反应20min，冷却后室温避光保存备用。
（3）胶体金标记
用锡酸钾溶液将胶体金溶液pH值调至5.5，然后每1mL胶体金溶液加入4.2µg抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，反应10min后，先加入稳定剂PEG20000溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLPEG20000溶液，再加入封闭剂BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLBSA溶液，标记结束。
其中抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的饱和加入量为每1mL胶体金溶液加入6µg，即6µg为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量，调节后的pH值至低于最适pH值1.5，即最适pH值为7.0，标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体加入时间为1s，加入量为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的70%。
实施例3：一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，标记方法包括以下步骤：
（1）液体配制
氯金酸溶液：将10g氯金酸溶于超纯水中，待完全溶解后定容至1000mL，4℃避光保存备用。
柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
锡酸钾溶液：称取2g锡酸钾，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
BSA溶液：称取10gBSA，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
PEG20000溶液：称取10gPEG20000，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
（2）胶体金溶液制备
将2mL氯金酸溶液和98mL超纯水加入三口烧瓶中，加热至沸腾，然后加入4.5mL柠檬酸三钠溶液，待烧瓶内液体由蓝紫色变为酒红色后，再反应20min，冷却后室温避光保存备用。
（3）胶体金标记
用锡酸钾溶液将胶体金溶液pH值调至5.8，然后每1mL胶体金溶液加入3.9µg抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，反应10min后，先加入稳定剂PEG20000溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLPEG20000溶液，再加入封闭剂BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLBSA溶液，标记结束。
其中抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的饱和加入量为每1mL胶体金溶液加入6µg，即6µg为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量，调节后的pH值至低于最适pH值1.2，即最适pH值为7.0，标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体加入时间为1s，加入量为最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的65%。
实施例4：一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂条，试剂条制备方法如下：
（1）膜的包被
包膜稀释液配方：0.01M PB，pH7.4，质量百分比浓度为0.05%海藻糖，将检测线和质控线从下至上依次包被于NC膜上。
（2）胶体金垫的制备
制备出胶体金溶液，然后分别按常规方法和实施例1~3任一个实施例的方法标记抗原或抗体，标记完成后离心，用金复溶液浓缩，均匀铺于玻璃纤维上，放烘房烘24小时成胶体金垫。
金复溶液配方：0.05M PBS，pH7.4，质量百分比浓度为0.01%葡萄糖，质量百分比浓度为0.01%海藻糖，质量百分比浓度为0.05% Tween-20，质量百分比浓度为0.01% BSA，质量百分比浓度为0.01% NaN3。
（3）样品垫的处理
样品垫处理液配方：0.1M PBS，pH 7.4，质量百分比浓度为0.1%蔗糖，质量百分比浓度0.1% BSA，质量百分比浓度0.5% Tween-20，质量百分比浓度0.5% Triton X-100，质量百分比浓度0.1% NaN3；将处理液均匀地涂布到玻璃纤维上，放烘房烘24小时，制成样品垫。
（4）试剂条的组装
将吸水纸、NC膜、胶体金垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试纸条。
实施例5：一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂盒，试剂盒包括检测卡和样本稀释液，检测卡包括相互扣合的卡体和卡盖，卡体和卡盖之间具有实施例4的试纸条。
抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体实验数据如下：
为了说明本专利所采用的技术方案的优势，我们将其用于免疫层析法抗间日疟原虫检测试剂中，并与常规标记方法作对比。
胶体金试纸条制备方法如下：
（1）膜的包被
包膜稀释液配方：0.01M PB，pH7.4，质量百分比浓度为0.05%海藻糖。
将检测线抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体、质控线羊抗鼠IgG多克隆抗体从下至上依次包被于NC膜上，其中包膜浓度分别为1.2mg/mL、1.5mg/mL。
（2）胶体金垫的制备
制备出胶体金溶液，然后按常规方法标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，再用实施例1～3任一个实施例的方法标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体；标记完成后离心，用金复溶液浓缩，均匀铺于玻璃纤维上，放烘房烘24小时成胶体金垫。
常规标记方法：先用配比确定出胶体金标记的最适pH值和最适蛋白量，然后将胶体金用锡酸钾溶液调至最适pH值，按最适蛋白量加入待标记蛋白，反应10min后，加入BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mL 10%质量百分浓度BSA溶液，标记结束。
金复溶液配方：0.05M PBS，pH7.4，质量百分比浓度为0.01%葡萄糖，质量百分比浓度为0.01%海藻糖，质量百分比浓度为0.05% Tween-20，质量百分比浓度为0.01% BSA，质量百分比浓度为0.01% NaN3。
（3）样品垫的处理
样品垫处理液配方：0.1M PBS，pH7.4，质量百分比浓度为0.1%蔗糖，质量百分比浓度0.1% BSA，质量百分比浓度0.5% Tween-20，质量百分比浓度0.5% Triton X-100，质量百分比浓度0.1% NaN3；将处理液均匀地涂布到玻璃纤维上，放烘房烘24小时，制成样品垫。
（4）试剂条的组装与试验
将吸水纸、NC膜、胶体金垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试纸条。
通过试验对比不同标记方法做出的抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体检测产品的效价、灵敏度、特异性和稳定性的差异。
具体实验数据如下:
备注：“-”表示检测结果阴性，“+”表示检测结果阳性，“+”越多表示显色越深，效价越高，阳性越强。
效价对比：
| 阳性样本1 | 阳性样本2 | 阳性样本3 | 阳性样本4 | 阳性样本5 | |
| 不饱和标记法 | +++ | ++++ | +++++ | ++++++ | ++++++ |
| 常规标记方法 | + | ++ | +++ | ++++ | +++++ |
灵敏度对比：
| 阳性样本6 | 阳性样本7 | 阳性样本8 | 阳性样本9 | 阳性样本10 | 阳性样本11 | |
| 不饱和标记法 | + | + | + | ++ | ++ | ++ |
| 常规标记方法 | - | - | + | + | + | + |
特异性对比：
| 阴性样本1 | 阴性样本2 | 阴性样本3 | 阴性样本4 | 阴性样本5 | 阴性样本6 | 阴性样本7 | |
| 不饱和标记法 | - | - | - | - | - | - | - |
| 常规标记方法 | - | - | - | - | - | - | - |
稳定性对比：
由以上数据可知，采用不饱和标记方法标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体相对于常规标记方法，在效价、灵敏度、稳定性方面得到了显著的提高。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：标记方法包括以下步骤：
（1）制备胶体金溶液；
（2）将制备好的胶体金溶液调节pH值至低于最适pH值1.0～1.5；
（3）一次性加入标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，加入量低于最适标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体用量的60%～70%；
（4）加入封闭剂和稳定剂，标记结束。
2.如权利要求1的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（3）中标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体加入时间为1s。
3.如权利要求1的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（3）中的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的加入量为：
每1mL胶体金溶液加入3.6~4.2µg抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体，反应时间为10min。
4.如权利要求1-3任一项的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（2）中调节pH值所用溶液为锡酸钾溶液，用锡酸钾溶液将胶体金溶液pH值调至5.5~6.0；
锡酸钾溶液制备方法为称取2g锡酸钾，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。
5.如权利要求1-3任一项的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中胶体金溶液为采用柠檬酸三钠还原法制备的万分之二的纳米金。
6.如权利要求1-3任一项的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（1）中胶体金溶液的制备方法为：
氯金酸溶液：将10g氯金酸溶于超纯水中，待完全溶解后定容至1000mL，4℃避光保存备用；
柠檬酸三钠溶液：称取1g柠檬酸三钠，室温溶于100mL超纯水，用0.22μm滤膜过滤， 4℃保存备用；
将2mL氯金酸溶液和98mL超纯水加入三口烧瓶中，加热至沸腾，然后加入4.5mL柠檬酸三钠溶液，待烧瓶内液体由蓝紫色变为酒红色，反应20min，冷却后室温避光保存备用。
7.如权利要求1-3任一项的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：步骤（4）中封闭剂和稳定剂为BSA溶液和PEG20000溶液，先加入稳定剂PEG20000溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLPEG20000溶液，再加入封闭剂BSA溶液，每100mL胶体金溶液加入1mLBSA溶液。
8.如权利要求7的标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的方法，其特征在于：BSA溶液制备方法为称取10gBSA，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配；PEG20000溶液制备方法为称取10gPEG20000，室温溶于100mL超纯水，4℃存放，现用现配。
9.一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂条，其特征在于：试剂条制备方法如下：
（1）膜的包被
包膜稀释液配方：0.01MPB，pH7.4，质量百分比浓度为0.05%海藻糖，将检测线和质控线从下至上依次包被于NC膜上；
（2）胶体金垫的制备
制备出胶体金溶液，然后分别按常规方法和如权利要求1-8任一项的方法标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体；标记完成后离心，用金复溶液浓缩，均匀铺于玻璃纤维上，放烘房烘24小时成胶体金垫；
（3）样品垫的处理
样品垫处理液配方：0.1MPBS，pH7.4，质量百分比浓度为0.1%蔗糖，质量百分比浓度0.1% BSA，质量百分比浓度0.5% Tween-20，质量百分比浓度0.5% Triton X-100，质量百分比浓度0.1% NaN3；将处理液均匀地涂布到玻璃纤维上，放烘房烘24小时，制成样品垫；
（4）试剂条的组装
将吸水纸、NC膜、胶体金垫、样品垫、PVC底板按顺序组装后裁切成试纸条。
10.一种标记抗间日疟原虫pLDH单克隆抗体的试剂盒，其特征在于：试剂盒包括检测卡和样本稀释液，检测卡包括相互扣合的卡体和卡盖，卡体和卡盖之间具有权利要求9的试纸条。
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