CN112698032A - 一种新型冠状病毒s抗原胶体金标记工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒S抗原的胶体金标记工艺、胶体金标记抗原的稀释液，以及该胶体金标记S抗原的应用，特别是涉及一种用于新型冠状病毒抗体检测的胶体金试纸条制备。本发明的胶体金标记新型冠状病毒S抗原的方法，包括以下步骤：调节胶体金溶液的pH至8.0‑9.0，加入6‑20µg新型冠状病毒S1抗原偶联和胶体金封闭，胶体金标记抗原洗涤重悬，金标抗原使用前的稀释；本发明能够更高效的对新型冠状病毒S抗原进行标记，从而提高金标抗原捕获胶体金抗体的能力，有助于提高新冠病毒抗体的检出率。
Description
技术领域
本发明属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒S抗原胶体金标记工艺，抗原稀释液配方及其应用。具体涉及一种新型冠状病毒S抗原胶体金标记工艺，涉及一种新的抗体检测试纸条及其制备方法，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体检测的试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒属于冠状病毒科，具有四种结构蛋白：刺突糖蛋白（S，Spikeprotein）、小包膜糖蛋白（E，Envelop Protein）、膜糖蛋白（M, Membrane Protein）、和核衣壳蛋白（N蛋白）。S蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的过程中起至关重要作用，是预防和治疗新冠肺炎的重要靶点。大部分新型冠状病毒抗体检测试剂均选择使用新冠病毒的刺突蛋白作为抗原，来捕获机体产生的保护性中和抗体。S蛋白含有两部分：S1 和 S2，其中S1 主要包含受体结合域（receptor binding domain，RBD），负责识别宿主细胞上的受体ACE2；S2则参与病毒与细胞膜的融合。
中国国家药品监督管理局在2020年初应急审批通过了9个抗体检测试剂，这些检测产品都使用了新型冠状病毒S抗原或/和N蛋白作为抗体捕获抗原，其中6款产品使用了胶体金标记方法来检测。抗原标记是胶体金试纸条最具挑战的环节，金标抗原的质量及稳定性直接决定了终产品的检出率和产品稳定性。希腊研究者发现目前抗体检测试剂盒单独检测IgG和IgM的灵敏度在0.53-0.66之间，还有很大的提升空间。
发明内容
本发明目的在于：提供一种用胶体金标记新型冠状病毒S蛋白的工艺方法，旨在提高标记效率，提高新冠抗体的检出率。
本发明的再一目的在于：提供上述方法得到的胶体金标记新型冠状病毒S蛋白的金标抗原稀释液配方，以提高金标抗原在结合垫上的稳定性，最终提高以此为原料的终产品的稳定性，如新型冠状病毒抗体检测试剂盒的稳定性。
本发明的又一目的在于：提供一种上述胶体金标记的新冠S蛋白的应用。
本发明目的通过下述方案实现：一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，包括以下步骤：
调节胶体金溶液pH值至8.0-9.0；
制备金标S抗原偶联物：将6-20µg新型冠状病毒重组抗原S蛋白加入到1mL 胶体金溶液中进行偶联，较好的，上述方法中标记1ml的胶体金中加入新冠S蛋白为10µg；
用1%BSA牛血清白蛋白BSA对纳米颗粒表面进行封闭，室温孵育15min；
用金标抗原重悬洗涤液离心洗涤胶体金标记S抗原溶液，得到可用于新冠病毒抗体检测的胶体金标记新型冠状病毒S蛋白。
较好的，所述的金标抗原重悬洗涤液为至少含1%BSA、pH 8.6且浓度20mM的硼酸缓冲液。
金标S抗原偶联物用牛血清白蛋白BSA对纳米颗粒表面进行封闭完成后，离心弃上清；加入1mL含1%BSA、pH 8.6且浓度20mM的硼酸缓冲液重悬、洗涤，离心和重悬步骤重复1次以上；最终以100 µL浓度为20mM、pH 8.6且含1%BSA的硼酸缓冲液重悬后用于新冠病毒抗体检测。
其中，所述的胶体金中纳米金颗粒大小范围为20-100nm，优选的40nm。
在上述方案基础上，所述的胶体金溶液制备步骤为：取1980ml双蒸水放入2000ml的烧杯内加热至快要沸腾时加入20ml 1%的氯化金水溶液，加热至沸，再向其中加入18-22ml浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色变为透明的酒红色时，继续煮沸15分钟，置室温冷却得到pH值至8.6的胶体金溶液。
在上述方案基础上，金标S抗原偶联物制备按下述步骤：将6µg的新型冠状病毒S1抗原加入到pH值为8.6且浓度为1mL的胶体金溶液中，室温孵育30min得到金标S抗原偶联物；加入100 µL10%的BSA，对纳米颗粒表面进行封闭，室温孵育15min；10000rpm离心45分钟、弃上清液；加入1mL浓度为20mM、pH 8.6且含1%BSA的硼酸缓冲液重悬；离心和重悬步骤重复2次，最终以100 µL所述的硼酸缓冲液重悬洗涤待用。
本发明还提供了一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原，根据上述的方法制备得到的。
本发明也提供了一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原在制备新型冠状病毒的检测试剂盒、检测试纸或者识别新型冠状病毒的抗体中的应用。
本发明具体给出了一种胶体金免疫侧向层析检测试纸，系所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原在新型冠状病毒抗体检测试纸中的应用，按下述步骤制备：
1）用权利要求1至4方法，制备胶体金标记山羊抗体；
2）将胶体金标记山羊抗体和胶体金标记S抗原混合，用金标抗原稀释液稀释20倍，得到金标新冠总抗体的稀释液，其中，所述的金标抗原稀释液为包括1-5%的海藻糖或蔗糖、0.5%-2%的BSA和0.5%吐温20且pH 8.6的硼酸缓冲液；
3）在至少由PVC背板、上样垫、结合垫、吸收垫、NC膜五部分组成的试纸上，将步骤2）的金标新冠总抗体的稀释液喷在结合垫上，并于37℃烘干2小时，得到喷洒了金标新冠总抗体的结合垫；
4）将重组新型冠状病毒S蛋白，用10mM PBS缓冲液稀释至终浓度为1mg/mL的新冠S抗原和1mg/mL兔抗山羊IgG抗体分别在检测线T线和质控线C线上固定；
5）依序将NC膜、上样垫、结合垫分别组装到PVC背板上进行切割和处理。
所述的胶体金的纳米金颗粒尺寸优选40nm左右，用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值至pH8.6。
较好的，所述的识别新型冠状病毒抗体的抗原可以是新型冠状病毒S蛋白或者其活性片段。
在制备胶体金免疫侧向层析检测试纸时，所述的金标抗原稀释液优选5%的海藻糖、0.5%BSA和0.5%吐温20mM的硼酸缓冲液，该金标抗原稀释液的pH 值为8.6。
本发明公开了一种新型冠状病毒S抗原胶体金标记工艺，金标抗原稀释液配方及其在新冠病毒抗体检测中的应用，用于更高效的标记的检测新冠病毒S蛋白。采用本发明的制备方法还可适用于其它病毒抗体检测试剂盒的设计和制备。本发明优越性在于：
1.本发明方法高效标记新型冠状病毒S抗原。
2.本发明方法提高了以S蛋白为基础设计的胶体金抗体检测试剂的灵敏度；
3.本发明方法可以提高以S蛋白为基础设计的胶体金抗体检测试剂的稳定性。
附图说明
附图1实施例2工艺新冠抗体检测试剂盒检出率照片；
附图2对比例金标抗原稀释液配方制备的新冠抗体检测试剂盒检出率照片。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
抗体检测制备材料：山羊抗体 (CR2)和兔抗山羊IgG(ab6741)购自abcam公司。重组抗原S蛋白购自北京义翘神州（Sino Biological）。PVC背板、玻璃纤维结合垫、上样垫及硝酸纤维素NC膜购自上海捷宁生物科技有限公司。硼酸缓冲盐、牛血清白蛋白BSA购自探索平台。
实施例1
一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原，按以下步骤制备：
（1）胶体金的制备：
取1980ml双蒸水放入2000ml的烧杯内，置于电炉上加热，快要沸腾时加入20ml 1%的氯化金水溶液，加热至沸，再向其中加入约20ml±1ml 1%的柠檬酸三钠溶液，可看到溶液的颜色由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续煮沸15分钟，置室温冷却，用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值至8.6；
（2）制备金标S抗原偶联物：
将10µg新型冠状病毒重组抗原S蛋白加入到1mL步骤（1）的胶体金溶液中，室温孵育30 min，得金标S抗原偶联物溶液；
（3）用BSA对纳米颗粒表面进行封闭
在金标S抗原偶联物溶液中加入100 µL牛血清白蛋白BSA，室温孵育15min，对纳米颗粒表面进行封闭，得到胶体金标记S抗原溶液；
（4）重悬洗涤胶体金标记S抗原溶液
用金标抗原重悬洗涤液稀离心洗涤胶体金标记S抗原溶液，于10000rpm离心45分钟，弃上清；用重悬洗涤液1mL 硼酸缓冲液（20mM, pH 8.6, 含1%BSA）重悬；离心和重悬步骤重复2次，得到可用于新冠病毒抗体检测的胶体金标记重组抗原S蛋白。
实施例2
一种胶体金标记新型冠状病毒S1抗原，与实施例1步骤（3）和（4）相同，按以下步骤制备：
（1）用K2CO3溶液调节纳米金颗粒40nm左右的胶体金溶液pH值至pH8.6；
（2）加入6µg新型冠状病毒S1抗原在室温进行偶联30分钟，得金标S1抗原偶联物溶液；
（3）在金标S1抗原偶联物溶液中加入BSA封闭10分钟后，离心洗涤胶体金标记S1抗原溶液，得到胶体金标记S1抗原溶液；
（4）胶体金标记S1抗原溶液用含1%BSA的20mM硼酸缓冲液（pH 8.6）对金标抗原进行两次重悬洗涤；
（5）用含5%的海藻糖，0.5%BSA和0.5%吐温20的硼酸缓冲液（pH 8.6）作为金标抗原稀释液进行稀释重悬后用于新冠病毒抗体检测。
附图1为本实施例工艺新冠抗体检测试剂盒检出率照片，F1-F10共10个新工艺制备的抗体检测试剂盒，检出8个。
附图2为对照组，E1-E10为对照工艺试剂盒，检出7个。
说明本发明新冠抗体检测试剂盒检出率及产品稳定性优异。
应用例
一种新冠总抗体快速检测试纸，试纸主体由PVC背板、上样垫、结合垫、吸收垫、NC膜五部分组成，按下述步骤制备：
1）以实施例1和2同样方法标记山羊抗体，得到胶体金标记山羊抗体；
2）将胶体金标记山羊抗体和胶体金标记重组抗原S蛋白混合，用金标抗原稀释液稀释20倍，所述的金标抗原稀释液为：5%的海藻糖、0.5%BSA和0.5%吐温20的硼酸缓冲液（pH8.6），得到金标抗原、抗体溶液；
3）将金标抗原、抗体溶液喷于结合垫，并于37℃烘干2小时备用；
4）将新型冠状病毒重组S蛋白，用10mM PBS缓冲液稀释至终浓度为1mg/mL的新冠S抗原和1mg/mL兔抗山羊IgG抗体分别在检测线T线和质控线C线上固定；
5）依序将NC膜、上样垫、喷洒了金标抗原、抗体的结合垫分别组装到PVC背板上，进行切割和处理，得到胶体金免疫侧向层析检测试纸。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
调节胶体金溶液pH值至8.0-9.0；
制备金标S抗原偶联物：将6-20µg新型冠状病毒重组抗原S蛋白加入到1mL 胶体金溶液中进行偶联；
用100 µL牛血清白蛋白BSA对纳米颗粒表面进行封闭，室温孵育15min；
用金标抗原重悬洗涤液离心洗涤胶体金标记S抗原溶液，得到可用于新冠病毒抗体检测的胶体金标记新型冠状病毒S蛋白。
2.根据权利要求1所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，其特征在于，用金标抗原稀释液离心洗涤胶体金标记S抗原溶液的方法为：用重悬洗涤液离心洗涤胶体金标记S抗原溶液，离心弃上清；加入1mL浓度20mM、pH 8.6且含1%BSA的硼酸缓冲液，重新悬浮、洗涤胶体金标记S抗原，离心和重悬步骤重复1次以上；最终以100 µL浓度为20mM、pH 8.6且含1%BSA的硼酸缓冲液重悬后，得到用于新冠病毒抗体检测的胶体金标记新型冠状病毒S蛋白。
3.根据权利要求1所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，其特征在于，所述的胶体金中纳米金颗粒大小范围为20-100nm。
4.根据权利要求1所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，其特征在于，所述的胶体金溶液制备步骤为：取1980ml双蒸水放入2000ml的烧杯内加热至快要沸腾时加入20ml1%的氯化金水溶液，加热至沸，再向其中加入18-22ml浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色变为透明的酒红色时，继续煮沸15分钟，置室温冷却，调节pH值至8.6，得到胶体金溶液。
5.根据权利要求1至4任一项所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原的工艺，其特征在于，金标S抗原偶联物制备按下述步骤：将6µg的新型冠状病毒S抗原加入到pH值为8.6且浓度为1mL的胶体金溶液中，室温孵育30min得到金标S抗原偶联物；加入100 µL10%的BSA，对纳米颗粒表面进行封闭，室温孵育15min；10000rpm离心45分钟、弃上清液；加入1mL浓度为20mM、pH 8.6且含1%BSA的硼酸缓冲液重悬；离心和重悬步骤重复2次，最终以100 µL所述的硼酸缓冲液重悬洗涤待用。
6.一种胶体金标记新型冠状病毒S抗原，根据权利要求1至5任一项所述的方法制备得到的。
7.一种根据权利要求6所述的胶体金标记新型冠状病毒S抗原在制备新型冠状病毒的检测试剂盒、检测试纸或者识别新型冠状病毒的抗体中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的新型冠状病毒抗体检测试纸按下述步骤制备：
1）用权利要求1至4方法，制备胶体金标记山羊抗体；
2）将胶体金标记山羊抗体和胶体金标记S抗原混合，用金标抗原稀释液稀释20倍，得到金标新冠总抗体的稀释液，其中，所述的金标抗原稀释液为包括1-5%的海藻糖或蔗糖、0.5%-2%的BSA和0.5%吐温20且pH 8.6的硼酸缓冲液；
3）在至少由PVC背板、上样垫、结合垫、吸收垫、NC膜五部分组成的试纸上，将步骤2）的金标新冠总抗体的稀释液喷在结合垫上，并于37℃烘干2小时，得到喷洒了金标新冠总抗体的结合垫；
4）将重组新型冠状病毒S蛋白，用10mM PBS缓冲液稀释至终浓度为1mg/mL的新冠S抗原和1mg/mL兔抗山羊IgG抗体分别在检测线T线和质控线C线上固定；
5）依序将NC膜、上样垫、结合垫分别组装到PVC背板上进行切割和处理。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的胶体金的纳米金颗粒尺寸为40nm左右，用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值至pH8.6。
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