CN116381225A - 一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法，试剂盒包括盒体和试纸条，试纸条在底板上沿层析方向依次粘贴有样本垫、样本保护垫、硅金标垫、NC膜和吸样垫，样本保护垫上涂覆有样本保护液，硅金标垫上含有抗猴痘A29抗体‑胶体硅金复合物和兔IgG‑胶体硅金复合物，NC膜上设有抗原检测线和质控线，抗原检测线上包被有抗猴痘A29抗体，质控线上包被有羊抗兔IgG单抗。本发明的试剂盒可用于猴痘病毒的快速免疫检测，其采用硅金纳米颗粒，并增设了样本保护垫，具有检测时间短、高灵敏度和高特异性的优点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测技术领域，特别涉及一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
猴痘是一种由猴痘病毒引起的人畜共患病，最早发现于非洲中西部和中部地区原始森林。猴痘病毒是一种包膜双链DNA病毒，与痘苗病毒、天花病毒相似，临床表现类似天花样，但病情较轻。猴痘病毒可通过直接接触由动物传染给人体，也可以在人与人之间传播，传染途径主要包括血液和体液。
诊断猴痘感染的方法分为三大类，第一类是病原分离方法，通过细胞培养，分离出猴痘病毒，该方法结果准确，但是检测周期太长，且对实验室生物安全要求极高；第二类是基因诊断方法，采用PCR方法检测标本中的猴痘病毒核酸，该方法需要依赖PCR检测设备，容易产生污染，成本也较高；第三类电镜检测，发现样本中有与正痘病毒形态一致的病毒存在，但电镜设备昂贵，操作复杂，只适用于实验室研究，无法广泛推广。目前，PCR检测法检测是国内外主要的猴痘病毒检测方法，我国尚未建立除PCR检测法以外的其他诊断方法。因此，需要建立一种快速准确猴痘病毒诊断方法，以缩短猴痘病毒诊断的窗口期，有效降低潜伏期带来的隐形传播风险。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种猴痘病毒抗原检测试剂盒及其制备方法。
本发明采用以下技术方案：
一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，包括盒体和试纸条，所述试纸条在底板上沿层析方向依次粘贴有样本垫、样本保护垫、硅金标垫、NC膜和吸样垫，所述样本保护垫上涂覆有样本保护液，所述硅金标垫上含有抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物和兔IgG-胶体硅金复合物，所述NC膜上设有抗原检测线和质控线，所述抗原检测线上包被有抗猴痘A29抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG单抗。
进一步地，所述样本保护液包括如下组分：Tween20、抗红细胞抗体、EDTA、蛋白阻断剂、牛白蛋白、tris盐酸缓冲液。
进一步地，所述样本保护液按质量比包括如下组分：0.015～0.15％Tween20、0.2％～1％抗红细胞抗体、0.05％～0.5％EDTA、0.03％～0.2％蛋白阻断剂、0.05％～0.2％牛白蛋白，其余为10～50mmol tris盐酸缓冲液。
进一步地，所述底板为聚酯板；所述NC膜为硝酸纤维素膜。
一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，该方法用于制备上述的猴痘病毒抗原检测试剂盒，所述方法包括样本保护垫的制备方法、硅金标垫的制备方法和NC膜的制备方法；
所述样本保护垫的制备方法为：按质量比将0.015～0.15％Tween20、0.2％～1％抗红细胞抗体、0.05％～0.5％EDTA、0.03％～0.2％蛋白阻断剂和0.05％～0.2％牛白蛋白均匀溶解于10～50mmol tris盐酸缓冲液中以得到样本保护液，将所述样本保护液均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3～5h，即制得样本保护垫。
进一步地，所述硅金标垫的制备方法为：
S1、制备抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物；
S2、制备兔IgG抗体-胶体硅金复合物；
S3、将上述抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物、兔IgG抗体-胶体金复合物按1:0.5混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3-5h，即成。
进一步地，步骤S1具体为：按10～20μg/mL的比例往粒径为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入抗猴痘A29抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物。
进一步地，步骤S2具体为：按10～20μg/mL的比例往颗粒大小为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得兔IgG抗体-胶体硅金复合物。
进一步地，所述NC膜的制备方法包括抗原检测线的包被方法和对照线的包被方法；所述抗原检测线的包被方法为：将抗猴痘A29抗体用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h。
进一步地，所述对照线的包被方法为：将羊抗兔IgG单抗用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h。
采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：
1、本发明的试剂盒可用于猴痘病毒的快速免疫检测，具有检测时间短、高灵敏度和高特异性的优点；其采用硅金纳米颗粒制备抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物和兔IgG-胶体硅金复合物，从而形成硅金标垫，既保留了传统胶体金试剂的优点，还可提升灵敏度高达10倍以上，且硅金纳米颗粒的标记工艺比现有的磁珠、微球等材料更加简便，成本更低。
2、本发明的试剂盒还在样本垫与硅金标垫之间增加设置了样本保护垫，能有效避免样本带来的基质效应、非特异反应等干扰，从而提高试剂盒的性能；在免疫检测反应过程中，存在由于质控或类型不同的样本(如不同类型的血清血浆或全血)的干扰而导致的结果不准确的问题，这是因为：质控、类型不同的血清血浆或全血样本中可能含有抗体蛋白，而抗体蛋白会干扰猴痘抗原的检测，本发明的样本保护垫中含有样本保护液，尤其是其中的EDTA和蛋白阻断剂，能够在待测样本在进入到NC膜以前，就有效阻断样本中抗体蛋白，从而消除后续对于猴痘抗原抗体免疫结合的干扰，提高试剂盒检测的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为本发明试纸条的结构示意图。
附图标记说明：
10、底板；20、样本垫；30、样本保护垫；40、硅金标垫；50、NC膜；51、抗原检测线；52、质控线；60、吸样垫。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一
如图1所示，一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，包括盒体和试纸条，所述试纸条在底板10上沿层析方向依次粘贴有样本垫20、样本保护垫30、硅金标垫40、NC膜50和吸样垫60，所述样本保护垫30上涂覆有样本保护液，所述硅金标垫40上含有抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物和兔IgG-胶体硅金复合物，所述NC膜50上设有抗原检测线51和质控线52，所述抗原检测线51上包被有抗猴痘A29抗体，所述质控线52上包被有羊抗兔IgG单抗。所述试纸条位于盒体内部，且在盒体上对应所述样本垫20和NC膜50的位置分别开设有加样窗口和观察窗口。
所述样本保护液按质量比包括如下组分：0.1％Tween20、0.4％抗红细胞抗体、0.25％EDTA、0.15％蛋白阻断剂、0.1％牛白蛋白，其余为30mmol tris盐酸缓冲液。
所述底板10为聚酯板；所述NC膜50为硝酸纤维素膜。
本实施例的试剂盒可用于猴痘病毒的快速免疫检测，具有检测时间短、高灵敏度和高特异性的优点。其适用的待检测的样本包括体液、血液以及皮肤病灶组织液(包括水疱液、脓疱液等)，使用时，将待检测的样本滴加到加样窗口内，样本经层析反应后，在观察窗口可以直接观察检测结果，若抗原检测线51和质控线52均显色，则为阳性，若只有质控线52显色，抗原检测线51不显色，则为阴性。
本实施例的试剂盒采用硅金纳米颗粒制备抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物和兔IgG-胶体硅金复合物，从而形成硅金标垫，相比于传统的纳米金材料，灵敏度可提升10倍以上，且硅金纳米颗粒的标记工艺比现有的磁珠、微球等材料更加简便、成本更低；
3、此外，本实施例的试剂盒还在样本垫与硅金标垫之间增加设置了样本保护垫，能有效避免样本带来的基质效应、非特异反应等干扰，从而提高试剂盒的性能；在免疫检测反应过程中，存在由于质控或类型不同的样本(如不同类型的血清血浆或全血)的干扰而导致的结果不准确的问题，这是因为：质控、类型不同的血清血浆或全血样本中可能含有抗体蛋白，而抗体蛋白会干扰猴痘抗原的检测，本发明的样本保护垫中含有样本保护液，尤其是其中的EDTA和蛋白阻断剂，能够在待测样本在进入到NC膜以前，就有效阻断样本中抗体蛋白，从而消除后续对于猴痘抗原抗体免疫结合的干扰，进一步提高试剂盒检测的灵敏度和特异性。
实施例二
一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，该方法用于制备实施例一中所述的猴痘病毒抗原检测试剂盒，所述方法包括样本保护垫的制备方法、硅金标垫的制备方法和NC膜的制备方法；
所述样本保护垫的制备方法为：按质量比将0.08％Tween20、0.3％抗红细胞抗体、0.45％EDTA、0.08％蛋白阻断剂和0.2％牛白蛋白均匀溶解30mmol tris盐酸缓冲液中以得到样本保护液，将所述样本保护液均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3～5h，即制得样本保护垫。
所述硅金标垫的制备方法为：
S1、制备抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物；
S2、制备兔IgG抗体-胶体硅金复合物；
S3、将上述抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物、兔IgG抗体-胶体金复合物按1:0.5混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3-5h，即成。
步骤S1具体为：按10～20μg/mL的比例往粒径为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入抗猴痘A29抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物。
步骤S2具体为：按10～20μg/mL的比例往颗粒大小为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得兔IgG抗体-胶体硅金复合物。
所述NC膜的制备方法包括抗原检测线的包被方法和对照线的包被方法；所述抗原检测线的包被方法为：将抗猴痘A29抗体用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h，其中。所述对照线的包被方法为：将羊抗兔IgG单抗用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：包括盒体和试纸条，所述试纸条在底板上沿层析方向依次粘贴有样本垫、样本保护垫、硅金标垫、NC膜和吸样垫，所述样本保护垫上涂覆有样本保护液，所述硅金标垫上含有抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物和兔IgG-胶体硅金复合物，所述NC膜上设有抗原检测线和质控线，所述抗原检测线上包被有抗猴痘A29抗体，所述质控线上包被有羊抗兔IgG单抗。
2.如权利要求1所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：所述样本保护液包括如下组分：Tween20、抗红细胞抗体、EDTA、蛋白阻断剂、牛白蛋白、tris盐酸缓冲液。
3.如权利要求2所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：所述样本保护液按质量比包括如下组分：0.015～0.15％Tween20、0.2％～1％抗红细胞抗体、0.05％～0.5％EDTA、0.03％～0.2％蛋白阻断剂、0.05％～0.2％牛白蛋白，其余为10～50mmol tris盐酸缓冲液。
4.如权利要求3所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：所述底板为聚酯板；所述NC膜为硝酸纤维素膜。
5.一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：该方法用于制备如权利要求1～4任一项所述的猴痘病毒抗原检测试剂盒，所述方法包括样本保护垫的制备方法、硅金标垫的制备方法和NC膜的制备方法；
所述样本保护垫的制备方法为：按质量比将0.015～0.15％Tween20、0.2％～1％抗红细胞抗体、0.05％～0.5％EDTA、0.03％～0.2％蛋白阻断剂和0.05％～0.2％牛白蛋白均匀溶解于10～50mmol tris盐酸缓冲液中以得到样本保护液，将所述样本保护液均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3～5h，即制得样本保护垫。
6.如权利要求5所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硅金标垫的制备方法为：
S1、制备抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物；
S2、制备兔IgG抗体-胶体硅金复合物；
S3、将上述抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物、兔IgG抗体-胶体金复合物按1:0.5混合，然后均匀涂抹于玻璃纤维垫上，冻干3-5h，即成。
7.如权利要求6所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1具体为：按10～20μg/mL的比例往粒径为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入抗猴痘A29抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得抗猴痘A29抗体-胶体硅金复合物。
8.如权利要求7所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S2具体为：按10～20μg/mL的比例往颗粒大小为150～200nm、浓度为0.01～0.03wt％的胶体硅金分散液中快速加入兔IgG抗体，并用搅拌器快速搅拌，反应15～30min后，按10～15μL/mL的比例快速加入封闭液，反应10～30min，于3000～4000rpm离心15～30min，弃上清得沉淀，按100μL/mL的比例往该沉淀中加入复溶液，超声复溶，获得兔IgG抗体-胶体硅金复合物。
9.如权利要求8所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述NC膜的制备方法包括抗原检测线的包被方法和对照线的包被方法；所述抗原检测线的包被方法为：将抗猴痘A29抗体用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h。
10.如权利要求9所述的一种猴痘病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述对照线的包被方法为：将羊抗兔IgG单抗用包被缓冲液稀释到1～3mg/mL后进行混合包被，再于18～25℃干燥20～25h。
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