CN110376375B - 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物疫病检测领域，具体而言，提供了一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明提供的试剂盒包括水貂阿留申病毒单抗诊断液和试纸，试纸包括带有检测点和质控点的硝酸纤维素膜；所述水貂阿留申病毒单抗诊断液含有胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1，检测点包括T1点和T2点，T1点包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体B1，T2点包被有标准水貂阿留申病毒，质控点包被有质控抗体。该试剂盒具有可同时检测水貂阿留申病毒抗原和抗体的功能，可以检测出样品是否感染阿留申病毒以及是否产生了阿留申病毒抗体。

Description

穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及动物疫病检测领域，具体而言，涉及一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

水貂阿留申病(Aleutian Disease，AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian MinkDisease Virus，AMDV)引起的一种免疫系统紊乱、代谢异常的慢性传染病。水貂阿留申病可以严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，给养貂业带来巨大的经济损失，被称为毛皮动物三大疫病之一，目前国内外主要通过检测淘汰来防控该水貂阿留申病。

目前，常规的AD检测技术主要是采用对流免疫电泳(CIEP)，但该方法检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室，这些弊端严重阻碍了水貂阿留申病检测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的AD检测方法具有十分重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，为水貂阿留申病毒抗原抗体检测提供更加简便、快捷，成本更低的检测产品。

本发明的第二目的在于提供上述试剂盒的制备方法，为现有技术提供成本更低，得到产品性能更稳定的试剂盒制备方法。

本发明的第三目的在于提供穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，包括水貂阿留申病毒单抗诊断液和试纸，所述试纸包括带有检测点和质控点的硝酸纤维素膜；

所述水貂阿留申病毒单抗诊断液含有胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1；

所述检测点包括T1点和T2点；

所述T1点包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体B1；

所述T2点包被有标准水貂阿留申病毒；

所述质控点包被有质控抗体；

水貂阿留申病毒单克隆抗体A1和标准水貂阿留申病毒的结合位点不同于水貂阿留申病毒单克隆抗体B1和标准水貂阿留申病毒的结合位点。

进一步地，所述水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6w/v％ BSA、9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠， pH8.0-8.5。

进一步地，所述试纸还包括样品吸收垫，所述样品吸收垫位于所述硝酸纤维素膜的正下方。

进一步地，所述试纸还包括外壳，所述外壳设有观察窗，所述硝酸纤维素膜对应设置在所述观察窗处。

进一步地，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液包括： 0.15-0.25MTris-HCl、1.5-2.5w/v％蔗糖、0.05-0.15v/v％Tween20、0.05-0.15 v/v％tritonX-100、0.05-0.15w/v％BSA和0.01-0.05w/v％叠氮钠， pH8.0-8.5。

穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

a)水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液混匀反应，收集固体反应物，再依次经封闭、浓缩得到水貂阿留申病毒单抗诊断液；

b)将水貂阿留申病毒单克隆抗体B1、标准水貂阿留申病毒和质控抗体分别点膜包被于硝酸纤维膜上，分别形成T1点、T2点和质控点。

进一步地，所述水貂阿留申病毒单克隆抗体A1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养，制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体A1；

优选地，所述骨髓瘤细胞为体内培养法得到，具体包括：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至1.5-2.5cm时，解剖小鼠取出瘤体，分离得到骨髓瘤细胞。

进一步地，所述水貂阿留申病毒单克隆抗体B1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体B1；

优选地，所述骨髓瘤细胞为体内培养法得到，具体包括：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至1.5-2.5cm时，解剖小鼠取出瘤体，分离得到骨髓瘤细胞。

进一步地，水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液的混合比例为 (30μg-40μg):1mL；

优选地，所述胶体金溶液中的胶体金粒径为20-30nm；

优选地，水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6w/v％BSA、 9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠，pH8.0-8.5。

穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒在如下a)或b)中应用：

a)制备检测水貂是否感染水貂阿留申病毒的产品；

b)制备检测水貂是否产生水貂阿留申病毒抗体的产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，由于设置有T1 点可以检测水貂阿留申病毒抗原，设置有T2点可以检测水貂阿留申病毒抗体，从而实现同时检测抗原抗体的功能，既可以检测出样品是否感染阿留申病毒也可以鉴定样品是否产生了阿留申病毒抗体，对水貂养殖中感染阿留申病毒的水貂淘汰以及水貂是否需要接种阿留申病毒疫苗等筛选、鉴定工作具有重要的指导作用，且具有使用简便快速、反应时间短、特异性强、敏感性高、无需仪器设备、检测结果清楚易于判断、制造成本低等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。

本发明提供的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法步骤简单易操作，可以工业化生产，重复性好，生产的产品性能稳定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4中穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒中试纸的结构示意图，其中，1-检测卡上组件；2-硝酸纤维素膜；3-样品吸收垫；4-检测卡下组件；

图2为本发明实施例5中穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒结果判定示意图，其中，A图为ADV阳性；B图为ADVB阳性；C图为 ADV和ADVB双阴性；D图为无效。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，包括水貂阿留申病毒单抗诊断液和试纸，试纸包括带有检测点和质控点的硝酸纤维素膜；其中，水貂阿留申病毒单抗诊断液含有胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1；检测点包括T1点和T2点，T1点包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体B1，T2点包被有标准水貂阿留申病毒；质控点包被有质控抗体；此外，水貂阿留申病毒单克隆抗体A1和标准水貂阿留申病毒的结合位点不同于水貂阿留申病毒单克隆抗体B1和标准水貂阿留申病毒的结合位点。

该试剂盒由于设置有T1点可以检测水貂阿留申病毒抗原，设置有T2 点可以检测水貂阿留申病毒抗体，从而实现同时检测抗原抗体的功能，既可以检测出样品是否感染阿留申病毒也可以鉴定样品是否产生了阿留申病毒抗体，对水貂养殖中感染阿留申病毒的水貂淘汰以及水貂是否需要接种阿留申病毒疫苗等筛选、鉴定工作具有重要的指导作用，且具有使用简便快速、反应时间短、特异性强、敏感性高、无需仪器设备、检测结果清楚易于判断、制造成本低等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。

需要说明的是，本发明中的穿流式是指胶体金免疫渗滤分析(DIGFA) 方法，原理为加样品与固定有配体(抗原或抗体)的硝酸纤维素膜上，通过渗滤在膜中形成抗体-抗原复合物，洗涤后，再加液体的胶体金标记抗体，当结果为阳性时，在膜上会呈现红色斑点；水貂阿留申病毒单克隆抗体A1 和B1与水貂阿留申病毒结合位点不同，可以形成B1-抗原-胶体金标记A1 的双抗夹心结构(可以理解的是，B1-抗原-胶体金标记A1中抗原是指待检测样品中的水貂阿留申病毒)，对水貂阿留申病毒进行显色检测；质控抗体可以为羊抗兔抗体等。

此外，质控点用于判定检测结果的有效性，当待检测样品中含有水貂阿留申病毒时，T1点和T2点都会显色，当待检测样品中含有水貂阿留申病毒抗体时，T1点和T2点都不会显色，当待检测样品中既不含有水貂阿留申病毒也不含有水貂阿留申病毒抗体时，T1点不会显色，T2点会显色。

质控点、T1点和T2点优选为：质控点位于T1点和T2点连线中点上方，三个包被点在可形成三角形的检测阵列。

在优选地实施方式中，水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6 w/v％BSA、9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠， pH8.0-8.5。水貂阿留申病毒单抗诊断液中含有胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1，将胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1保存于本发明提供的溶液中可以保证胶体金与水貂阿留申病毒单抗A1的偶联标记物长期稳定保存。

在优选地实施方式中，试纸还包括样品吸收垫，样品吸收垫位于硝酸纤维素膜的正下方。样品吸收垫用于吸收多余的待检测液，方便结果显示，降低假阴性和假阳性的概率，可以理解的是，样品吸收垫位于硝酸纤维素膜的正下方，二者叠加放置，样品吸收垫优选大于硝酸纤维素膜的面积。

在优选地实施方式中，试纸还包括外壳，外壳设有观察窗，硝酸纤维素膜对应设置在观察窗处。外壳将硝酸纤维素膜固定，便于操作，检测点和质控点都在观察窗处，加样也直接在观察窗进行，减小试纸体积同时便于观察结果。

在优选地实施方式中，试剂盒还包括样品稀释液，样品稀释液包括： 0.15-0.25MTris-HCl、1.5-2.5w/v％蔗糖、0.05-0.15v/v％Tween20、0.05-0.15 v/v％tritonX-100、0.05-0.15w/v％BSA和0.01-0.05w/v％叠氮钠， pH8.0-8.5。当样品为较为粘稠的全血、血浆等时，需要对样品进行稀释上样，本发明提供的样品稀释液可以有效稀释样品不影响检测结果。

本发明提供穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

a)水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液混匀反应，收集固体反应物，再依次经封闭、浓缩得到水貂阿留申病毒单抗诊断液；

b)将水貂阿留申病毒单克隆抗体B1、标准水貂阿留申病毒和质控抗体分别点膜包被于硝酸纤维膜上，分别形成形成T1点、T2点和质控点。

该方法步骤简单易操作，可以工业化生产，重复性好，生产的产品性能稳定。需要说明的是，水貂阿留申病毒单克隆抗体B1、水貂阿留申病毒和质控抗体的包被位置互不相同，检测互不影响。

在优选地实施方式中，水貂阿留申病毒单克隆抗体A1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养，制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体A1。

需要说明的是，小鼠可以优选为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，小鼠的综合免疫次数可以优选为5次，具体的免疫方案优选为：第一次免疫使用弗氏完全佐剂与纯化ADV 1:1混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量为100μg/只，免疫量0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8点，首次免疫后间隔3周；第二次免疫使用弗氏不完全佐剂与纯化ADV 1:1混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量及免疫剂量同首次，二次免疫后间隔3周；第三次免疫方法同第二次免疫；第四次免疫不使用佐剂，抗原使用量及免疫剂量同首次，免疫后间隔3周；第五次免疫不使用佐剂，抗原使用量为300μg/只，免疫量0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8点，免疫后间隔4天取脾细胞进行融合。该制备方法可以快速大量的得到目标单克隆抗体A1。

在优选地实施方式汇中，水貂阿留申病毒单克隆抗体B1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体B1。

可以理解的是，水貂阿留申病毒单克隆抗体B1的制备方法可以与水貂阿留申病毒单克隆抗体A1相同，小鼠可以优选为6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，小鼠的综合免疫次数可以优选为5次，具体的免疫方案优选为：第一次免疫使用弗氏完全佐剂与纯化ADV 1:1混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量为100μg/只，免疫量0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8 点，首次免疫后间隔3周；第二次免疫使用弗氏不完全佐剂与纯化ADV 1:1 混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量及免疫剂量同首次，二次免疫后间隔3周；第三次免疫方法同第二次免疫；第四次免疫不使用佐剂，抗原使用量及免疫剂量同首次，免疫后间隔3周；第五次免疫不使用佐剂，抗原使用量为300μg/只，免疫量0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8 点，免疫后间隔4天取脾细胞进行融合。

需要说明的是，采用本发明提供的制备方法，最后通过筛选得到与水貂阿留申病毒可以同时发生免疫结合作用的两种抗体，即两种抗体与水貂阿留申病毒结合位点不同，可以形成抗体-抗原-胶体金标记抗体的复合物结构即可。

在优选地实施方式中，骨髓瘤细胞为体内培养法得到，具体包括：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至 1.5-2.5cm时，解剖小鼠取出瘤体，分离得到骨髓瘤细胞。用此方法培养的骨髓瘤细胞可以获得更高的融合效率。

在优选地实施方式中，水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液的混合比例为(30μg-40μg):1mL。该用量比为先将水貂阿留申病毒单克隆抗体A1定量至浓度为1mg/ml，用等差递增稀释法对单抗加入量10-80μg进行系列测定而获得的值。

在优选地实施方式中，胶体金溶液中的胶体金粒径为20-30nm。胶体金溶液的制备方法优选选用高倍金溶液制备法，该法可大大降低能源消耗并提高胶体金溶液的制备效率，具体包括：取0.02％的氯金酸溶液1ml，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠3ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为橙红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得高倍胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为20-30nm。

在优选地实施方式中，水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6 w/v％BSA、9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠， pH8.0-8.5。水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液混匀反应，收集固体的反应物封闭后，浓缩保存在上述溶液中，可以保证胶体金与水貂阿留申病毒单抗A1的偶联标记物长期稳定保存。

穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒在如下a)或b)中应用：

a)制备检测水貂是否感染水貂阿留申病毒的产品；

b)制备检测水貂是否产生水貂阿留申病毒抗体的产品。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1水貂阿留申病毒单克隆抗体A1、B1的制备

(1)采用杂交瘤细胞融合法，选6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，按照特定的免疫方案，对小鼠进行5次多点皮下及脚垫综合免疫，最后一次免疫后3天取免疫鼠的脾细胞与培养的骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒的单克隆抗体的细胞株并扩大培养制备水貂阿留申病毒单克隆抗体A1、B1；

(2)特定免疫方案：第一次免疫使用弗氏完全佐剂与纯化ADV 1:1混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量为100μg/只，免疫量 0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8点，首次免疫后间隔3周；第二次免疫使用弗氏不完全佐剂与纯化ADV 1:1混合乳化后对小鼠进行多点综合免疫，抗原使用量及免疫剂量同首次，二次免疫后间隔3周；第三次免疫方法同第二次免疫；第四次免疫不使用佐剂，抗原使用量及免疫剂量同首次，免疫后间隔3周；第五次免疫不使用佐剂，抗原使用量为300μg/只，免疫量0.1-0.2ml/点，每只小鼠共免疫5-8点，免疫后间隔4天取脾细胞进行融合。

(3)两株水貂阿留申病毒单克隆抗体的制备所用的骨髓瘤细胞为体内培养法：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内进行培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至2cm左右时，解剖小鼠取出瘤体，分离骨髓瘤细胞进行融合，待融合细胞长至96孔板单孔孔底面积15％以上后，吸出上清液检测抗体，筛选阳性杂交瘤细胞孔并对其进行克隆，进而得到单克隆化的水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞。

实施例2水貂阿留申病毒单抗诊断液的制备

(1)水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与粒径为20-30nm的胶体金溶液混合，混合比例为30μg-40μg:1mL，按照此用量比例逐滴加入水貂阿留申病毒单克隆抗体A1，再加入终浓度为5％的牛血清白蛋白，搅拌后获得水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金的偶联标记物，经离心浓缩后保存在终浓度为5％BSA、10％蔗糖、0.2MTris和0.02％叠氮钠，pH值为8.0-8.5 的缓冲系统中备用；

(2)胶体金溶液采用高倍金溶液制备法：取0.02％的氯金酸溶液1ml，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠3ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为橙红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得高倍胶体金溶液，4℃保存备用，使用时倍比稀释，胶体金颗粒直径为20-30nm。

(3)水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液的混合比例为 30μg-40μg:1mL：该用量比为先将水貂阿留申病毒单克隆抗体A1定量至浓度为1mg/ml，用等差递增稀释法对单抗加入量10-80μg进行系列测定而获得的值。

实施例3反应膜的制备

反应膜采用硝酸纤维素膜(NC膜)作为基质材料，将水貂阿留申病毒单克隆抗体B1与通过转瓶培养法获得水貂阿留申病毒用点膜设备包被于硝酸纤维素膜上，形成T1(包被浓度1mg/ml、包被量0.2μl)、T2(包被浓度1mg/ml、包被量0.2μl)检测点，将质控抗体包被于T1、T2检测点连线中点上方，形成C质控点(包被浓度1mg/ml、包被量0.1μl)，三个包被点在空间可形成三角形的检测阵列，然后通过低温干燥法将硝酸纤维素膜干燥后密封保存。

实施例4试纸的组装

试纸外壳分为检测卡上组件和检测卡下组件，其中检测卡上组件设有观察窗，将检测卡上组件、包被检测点和质控点的硝酸纤维素膜、样品吸收垫、检测卡下组件依次顺序组装，样品吸收垫的厚度应使包被检测点和质控点的硝酸纤维素膜与检测卡上组件贴合。组装检测卡如图1所示。

实施例5穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒

实施例2中的水貂阿留申病毒单抗诊断液组成穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，该试剂盒的使用方式如下：

用塑料吸头吸取待检动物的血液样品，用样品稀释液稀释，于观察窗中上样，待样品穿过样品吸收垫后滴加1-2滴水貂阿留申病毒单抗诊断液， 3-10分钟即可显示结果，观察检测点T1、T2的显色情况即可判断被检水貂体内是否带有水貂阿留申病毒或者是否产生水貂阿留申病毒抗体。

结果判断如图2所示：

1、水貂阿留申病毒(ADV)阳性(图2中A图)：在检测线T1、T2 和质控点C处各出现显色，判定为ADV阳性；检测点T1色泽的深浅依检测样品中水貂阿留申病毒抗原含量的高低而变化，抗原含量越高颜色越深，反之越浅。

2、水貂阿留申病毒抗体(ADVB)阳性(图2中B图)：检测点T1、 T2均无任何显色，仅质控点C显色，说明检测样品中含水貂阿留申病毒抗体。

3、水貂阿留申病毒和水貂阿留申病毒抗体双阴性(图2中C图)：检测点T1无任何显色，检测点T2和质控点C均显色，说明样品中既没有水貂阿留申病毒，也没有水貂阿留申病毒抗体，即ADV/ADVB双阴性。

3、无效(图2中D图)：仅在检测点T1/T2显色，质控点C不显色或检测点和质控点均不显色，视为检测卡检测无效。

实施例6特异性试验

采用本发明的试剂盒对水貂阿留申病毒(AMDV)细胞毒样品、健康水貂血液样品、感染水貂阿留申病毒的水貂血液样品、水貂细小病毒性肠炎病毒(MEV)灭活疫苗样品、水貂犬瘟热病毒(CDV)活疫苗样品检测。

结果显示：水貂阿留申病毒细胞毒样品检测点T1、T2均显色，表明水貂阿留申病毒抗原检测阳性；水貂阿留申病毒感染的水貂血液样品仅质控点C出现明显的颜色，表明水貂阿留申病毒抗体检测阳性；其余样品检测均检测点T2和质控点C显色，表明剩余样品中水貂阿留申病毒抗原、抗体均为阴性，说明本发明的检测卡具有良好的特异性。

实施例7重复性试验

(1)组内重复性检测：

用同一批次的本发明的检测卡检测水貂阿留申病毒阴性样品、水貂阿留申病毒阳性样品、感染水貂阿留申病毒的阳性血清各30份样本(三次重复试验)。结果显示，本发明的检测卡检测的阴性样品、水貂阿留申病毒抗原阳性样品、水貂阿留申病毒抗体阳性样品结果分别为30例，这表明本发明的检测卡具有良好的重复性。

(2)组间重复性检测：

用3个不同批次的本发明的检测卡检测水貂阿留申病毒阴性样品、水貂阿留申病毒阳性样品、感染水貂阿留申病毒的阳性血清各30份样本(三次重复试验)。结果显示，每个批次检测卡检测的阴性样品、水貂阿留申病毒抗原阳性样品、水貂阿留申病毒抗体阳性样品结果分别为30例，再次表明本发明的检测卡具有良好的重复性。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (13)

1.一种穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于，包括水貂阿留申病毒单抗诊断液和试纸，所述试纸包括带有检测点和质控点的硝酸纤维素膜；

所述水貂阿留申病毒单抗诊断液含有胶体金标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体A1；

所述水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6w/v％BSA、9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠，pH8.0-8.5；

所述检测点包括T1点和T2点；

所述T1点包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体B1；

所述T2点包被有标准水貂阿留申病毒；

所述质控点包被有质控抗体；

水貂阿留申病毒单克隆抗体A1和标准水貂阿留申病毒的结合位点不同于水貂阿留申病毒单克隆抗体B1和标准水貂阿留申病毒的结合位点。

2.根据权利要求1所述的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试纸还包括样品吸收垫，所述样品吸收垫位于所述硝酸纤维素膜的正下方。

3.根据权利要求或2所述的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试纸还包括外壳，所述外壳设有观察窗，所述硝酸纤维素膜对应设置在所述观察窗处。

4.根据权利要求1或2所述的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液，所述样品稀释液包括：0.15-0.25M Tris-HCl、1.5-2.5w/v％蔗糖、0.05-0.15v/v％Tween20、0.05-0.15v/v％tritonX-100、0.05-0.15w/v％BSA和0.01-0.05w/v％叠氮钠，pH8.0-8.5。

5.权利要求1-4任一项所述的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a)水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液混匀反应，收集固体反应物，再依次经封闭、浓缩得到水貂阿留申病毒单抗诊断液；

b)将水貂阿留申病毒单克隆抗体B1、标准水貂阿留申病毒和质控抗体分别点膜包被于硝酸纤维膜上，分别形成T1点、T2点和质控点。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述水貂阿留申病毒单克隆抗体A1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养，制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体A1。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为体内培养法得到，具体包括：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至1.5-2.5cm时，解剖小鼠取出瘤体，分离得到骨髓瘤细胞。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述水貂阿留申病毒单克隆抗体B1的制备方法包括：利用水貂阿留申病毒对小鼠进行多点皮下及脚垫综合免疫，免疫完成后2-4天取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能够分泌特异性水貂阿留申病毒单克隆抗体的细胞株并扩大培养制备得到水貂阿留申病毒单克隆抗体B1。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述骨髓瘤细胞为体内培养法得到，具体包括：将培养的骨髓瘤细胞注入小鼠体内培养诱生瘤体，当瘤体直径增大至1.5-2.5cm时，解剖小鼠取出瘤体，分离得到骨髓瘤细胞。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，水貂阿留申病毒单克隆抗体A1与胶体金溶液的混合比例为(30μg-40μg):1mL。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液中的胶体金粒径为20-30nm。

12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，水貂阿留申病毒单抗诊断液的溶液包括：4-6w/v％BSA、9-11w/v％蔗糖、0.15-0.25mol/L Tris和0.01-0.05w/v％叠氮钠，pH8.0-8.5。

13.权利要求1-4任一项所述的穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒在如下a)或b)中应用：

a)制备检测水貂是否感染水貂阿留申病毒的产品；

b)制备检测水貂是否产生水貂阿留申病毒抗体的产品。

Images