CN105223354A - 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105223354A
CN105223354A CN201510602692.1A CN201510602692A CN105223354A CN 105223354 A CN105223354 A CN 105223354A CN 201510602692 A CN201510602692 A CN 201510602692A CN 105223354 A CN105223354 A CN 105223354A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
aleutian mink
mink disease
disease parvovirus
colloidal gold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510602692.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王振军
王春霞
倪佳
张晶
王萃瑜
吴威
陈立志
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Special Research Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Jilin Special Research Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Special Research Biological Technology Co Ltd filed Critical Jilin Special Research Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201510602692.1A priority Critical patent/CN105223354A/zh
Publication of CN105223354A publication Critical patent/CN105223354A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

水貂阿留申病毒胶体金检测试纸条及制备方法，涉及胶体金检测试纸条技术领域，解决了现有的AD检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且检测主要依赖实验室的问题。该试纸条包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；金标结合垫包被有纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜上的检测线包被有纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体E3，硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明的试纸条操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点。

Description

水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及胶体金检测试纸条技术领域，具体涉及一种水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法。
背景技术
水貂阿留申病(AleutianDisease，AD)是由水貂阿留申病毒(AleutianMinkDiseaseVirus，AMDV)引起的一种免疫系统紊乱、代谢异常的慢性传染病。水貂阿留申病可以严重影响水貂的毛皮质量，损害其生育能力，降低存活率，给养貂业带来巨大的经济损失，被称为毛皮动物三大疫病之一，目前国内外主要通过检测淘汰来防控该水貂阿留申病。
目前，常规的AD检测技术主要是采用对流免疫电泳(CIEP)，但该方法检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且主要依赖实验室，这些弊端严重阻碍了水貂阿留申病检测的普及和推广。因此，研究一种简单、快捷的AD检测方法具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决现有的AD检测技术存在的检测步骤繁琐、耗时，需要专业人员进行操作且检测主要依赖实验室的问题，本发明提供一种水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条，包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；所述金标结合垫包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体E3，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
本发明还提供了上述水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、水貂阿留申病毒单克隆抗体C5、E3的制备：选6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只，7天后分别腹腔注射两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，接种量均为4×106～6×106细胞/mL/只；待小鼠腹部膨大后分别抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水上清分别用50％饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐后，获得纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5和水貂阿留申病毒单克隆抗体E3；
步骤二、水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例为8.8μg～9.6μg:1mL，按照此用量比例逐滴加入水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，再加入终浓度为5％的牛血清白蛋白，搅拌后获得水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤三、试纸条的组装：采用喷金仪将水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将水貂阿留申病毒单克隆抗体E3、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存。
进一步的，步骤一中，两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞采用以下方法制备：将提纯的水貂阿留申病毒接种Balb/c小鼠，加强免疫后，收集其脾细胞，与事先准备好的骨髓瘤细胞进行融合，用1％HAT培养液培养；融合2周左右，采用间接ELISA方法筛选出两株阳性杂交瘤细胞株，并对筛选后的两株阳性杂交瘤细胞进行克隆，得到两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
进一步的，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。
进一步的，步骤二中，所述逐级稀释法确定水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将水貂阿留申病毒单克隆抗体C5逐级稀释后即含量分别为2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg、20μg，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1mL混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；
2号管至4号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，5号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒单克隆抗体C5加入量最低的离心管即5号管中的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5含量，即为稳定1mL胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒细胞单克隆抗体C5的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例为：8.8μg～9.6μg:1mL。
进一步的，步骤二中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，4℃保存备用。
进一步的，所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
进一步的，步骤三中，水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物的标记量为8.8μg～9.6μg:1mL。
进一步的，步骤三中，水貂阿留申病毒单克隆抗体E3的标记量为2μg/cm。
进一步的，步骤三中，羊抗鼠IgG的标记量为4μg/cm。
本发明的有益效果是：本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条具有特异性强、灵敏度高、简单快速、操作简单快捷等特点，易于推广，适用于基层养殖场检测，具有广阔的市场前景。
本发明将酶联免疫原理与胶体金层析技术结合，制备检测水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条并拟应用于临床，提高水貂阿留申病的预防能力，具有操作简单快速、检测结果清楚易于判断、特异性强、敏感性高、无需仪器设备等优点，因此，非常适用于现场、门诊等实验条件有限的场所进行临床样品检测。本发明提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业生产。
附图说明
图1为本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条的结构示意图。
图2为本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条结果判定示意图。
图中：1、PVC底板，2、样品垫，3、金标结合垫，4、硝酸纤维素膜，5、检测线，6、质控线，7、吸收垫。
具体实施方式
本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条，包括PVC底板1、样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4和吸收垫7，样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4、吸收垫7依次粘贴在PVC底板1上，金标结合垫3包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，硝酸纤维素膜4上的检测线5包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体E3，硝酸纤维素膜4上的质控线6包被有羊抗鼠IgG。
本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条的使用方法如下：
用塑料吸头吸取待检动物的尿液样品于加样孔中，5～10分钟即可显示结果，对比检测线5和对照线6的颜色即可判断被检水貂体内是否带有水貂阿留申病毒或者被水貂阿留申病毒感染。
结果判断如图2所示：
1、阳性：在检测线5和质控线6处各出现一条红色条带，判定为阳性；检测线5条带色泽的深浅依检测样品中水貂阿留申病毒抗原含量的高低而变化，抗原含量越高色带越深，反之越浅。
2、阴性：在质控线6出现一条红色条带，检测线5未出现红色条带，说明检测样品中无水貂阿留申病毒抗原存在。
3、无效：仅在检测线5有条带或在检测线5和质控线6均无明显条带出现，视为试纸条检测无效。
以下结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1水貂阿留申病毒单克隆抗体C5、E3的制备
(1)将提纯的水貂阿留申病毒接种Balb/c小鼠，加强免疫后，收集其脾细胞，与事先准备好的骨髓瘤细胞进行融合，用1％HAT培养液培养；融合2周左右，采用间接ELISA方法筛选出两株阳性杂交瘤细胞株，并对筛选后的阳性杂交瘤细胞进行克隆，得到两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(2)选6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只，7天后分别腹腔注射上述获得的两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，接种量均为4×106～6×106细胞/mL/只；待小鼠腹部膨大后(约一周)分别抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水上清分别用50％饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐后，获得纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5和水貂阿留申病毒单克隆抗体E3。
实施例2胶体金溶液的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液：取1％氯金酸溶液1mL，加入99mL的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1mL并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却后4℃保存备用，获得胶体金溶液。吸取少量胶体金颗粒用透射电镜观察，胶体金颗粒大小基本一致，分布均匀，直径约40nm方为合格。
实施例3水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物(金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5)的制备
(1)逐级稀释法确定水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，取11支洁净的离心管，编号为1号管至11号管，每管加入胶体金溶液1mL；将纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5逐级稀释后即含量分别为2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg、20μg，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1mL混匀，室温静置2小时以上观察结果；1号管中未加入水貂阿留申病毒单克隆抗体C5和氯化钠溶液，设为对照管；
水貂阿留申病毒单克隆抗体C5加入量不足以稳定胶体金的离心管(2号管至4号管)，即出现由红变蓝的聚沉现象，而水貂阿留申病毒单克隆抗体C5加入量达到或超过最低稳定量的离心管(5号管至11号管)，则保持胶体金的红色不变。因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒单克隆抗体C5加入量最低的离心管(5号管)中的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5含量(8μg)，即为稳定1mL胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1mL胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的实际使用量，即水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例为：8.8μg～9.6μg:1mL。
(2)用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，在磁力搅拌下，按照上述确定的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例(8.8μg～9.6μg:1mL)向胶体金溶液中逐滴加入水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，继续搅拌20分钟，加入终浓度为5％的牛血清白蛋白，再搅拌15分钟，获得水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物即金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，4℃保存备用。
(3)金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的纯化
采用低温超速离心法纯化金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，以去除溶液中未标记的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5和未充分标记的胶体金以及在标记中可能形成的各种聚合物。首先将金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5(体积为V)在4℃下，以3000rpm/min低速离心40分钟，小心吸取上清液，弃去沉淀；再将上清液在4℃下，以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V)，充分稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液(内含1％BSA和0.02％叠氮钠)溶解沉淀至原体积(指的是金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V)的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，该纯化的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5位于离心管底部，为深红色的松散沉淀，4℃保存备用。
实施例4试纸条的组装
(1)采用喷金仪(XYZ3000DispensingPlatform)将水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜，水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物的标记量为8.8μg～9.6μg:1mL，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫3，4℃保存备用；
(2)采用划膜仪将水貂阿留申病毒单克隆抗体E3、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜4上的检测线5和质控线6上，水貂阿留申病毒单克隆抗体E3、羊抗鼠IgG的标记量分别为2μg/cm、4μg/cm，室温条件下自然干燥，密封，获得带有检测线5(包被有纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体E3)和质控线6(包被有羊抗鼠IgG)的硝酸纤维素膜4，4℃保存备用；
(3)将上述处理好的样品垫2、金标结合垫3、带有检测线5和质控线6的硝酸纤维素膜4、吸收垫7等材料依次粘贴在PVC底板1上，切条、组装、密封，获得本发明的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条，室温保存备用。组装后的试纸条如图1所示。
实施例5特异性试验
采用本发明的试纸条对水貂阿留申病毒(AMDV)细胞毒样品、健康水貂尿液样品、被水貂阿留申病毒感染的水貂尿液样品、水貂细小病毒性肠炎病毒(MEV)灭活疫苗样品、水貂犬瘟热病毒(CDV)活疫苗样品检测。
结果显示：仅水貂阿留申病毒细胞毒样品和水貂阿留申病毒感染的水貂尿液样品出现明显的检测线5和对照线6，其余样品检测均为阴性，说明本发明的试纸条具有良好的特异性。
实施例6敏感性试验
选择同一批次制备的胶体金试纸条对稀释的不同浓度的水貂阿留申病毒细胞毒样品进行检测，稀释浓度依次为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL。结果显示：病毒稀释液浓度大于等于3.13μg/mL时，在检测线和质控线均能出现红色条带，证明本发明试纸条的敏感性较强。
实施例7重复性试验
(1)组内重复性检测：
用同一批次的本发明的试纸条检测水貂阿留申病毒阴性样品、水貂阿留申病毒阳性样品各30份样本(三次重复试验)。结果显示，本发明的试纸条检测的阴性、阳性结果分别为30例，这表明本发明的试纸条具有良好的重复性。
(2)组间重复性检测：
用3个不同批次的本发明的试纸条检测水貂阿留申病毒阴性样品、水貂阿留申病毒阳性样品各30份样本(三次重复试验)。结果显示，每个批次试纸条检测的阴性、阳性结果分别为30例，再次表明本发明的试纸条具有良好的重复性。

Claims (10)

1.水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条，包括PVC底板，依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫；其特征在于：所述金标结合垫包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，所述硝酸纤维素膜上的检测线包被有水貂阿留申病毒单克隆抗体E3，所述硝酸纤维素膜上的质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.制备权利要求1所述的水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、水貂阿留申病毒单克隆抗体C5、E3的制备：选6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5mL/只，7天后分别腹腔注射两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，接种量均为4×106～6×106细胞/mL/只；待小鼠腹部膨大后分别抽取腹水，5000rpm离心15min，取上清备用；将腹水上清分别用50％饱和度的硫酸铵盐析2次，透析除盐后，获得纯化的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5和水貂阿留申病毒单克隆抗体E3；
步骤二、水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物的制备：逐级稀释法确定水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例为8.8μg～9.6μg:1mL，按照此用量比例逐滴加入水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，再加入终浓度为5％的牛血清白蛋白，搅拌后获得水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化；
步骤三、试纸条的组装：采用喷金仪将水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物喷在玻璃纤维素膜，室温条件下自然干燥，密封，获得金标结合垫；采用划膜仪将水貂阿留申病毒单克隆抗体E3、羊抗鼠IgG分别划膜于硝酸纤维素膜上的检测线和质控线上；将处理好的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜依次粘帖在PVC底板上，切条、组装、密封，获得水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条，室温保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤一中，两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞采用以下方法制备：将提纯的水貂阿留申病毒接种Balb/c小鼠，加强免疫后，收集其脾细胞，与事先准备好的骨髓瘤细胞进行融合，用1％HAT培养液培养；融合2周左右，采用间接ELISA方法筛选出两株阳性杂交瘤细胞株，并对筛选后的阳性杂交瘤细胞进行克隆，得到两株水貂阿留申病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液采用柠檬酸三钠还原法制备：取1％氯金酸溶液1ml，加入99ml的超纯水配置成终浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾后，加入1％柠檬酸三钠1ml并继续加热，溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为酒红色，颜色稳定后继续加热5分钟，室温冷却，获得胶体金溶液，4℃保存备用，胶体金颗粒直径为40nm。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述逐级稀释法确定水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例的具体过程如下：用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的PH值为8.4，向11支离心管中分别加入1ml胶体金溶液；将水貂阿留申病毒单克隆抗体C5逐级稀释后即含量分别为2μg、4μg、6μg、8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg、20μg，按照上述顺序加入到2号管至11号管中，并与离心管中的胶体金溶液混匀，5分钟后在2号管至11号管中分别加入10％的氯化钠溶液1mL混匀，室温静置2小时以上观察结果，1号管为空白对照；
2号管至4号管中，出现由红变蓝的聚沉现象，5号管至11号管中，保持胶体金的红色不变；因此，胶体金红色不变且水貂阿留申病毒单克隆抗体C5加入量最低的离心管即5号管中的水貂阿留申病毒单克隆抗体C5含量，即为稳定1mL胶体金溶液所需的最低稳定量，在该最低稳定量的基础上再加上10％～20％即为稳定1ml胶体金溶液所需的水貂阿留申病毒细胞单克隆抗体C5的实际使用量，即水貂阿留申病毒细胞单克隆抗体C5与胶体金溶液的用量比例为：8.8μg～9.6μg:1mL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，采用低温超速离心法对该偶联标记物进行纯化的具体过程如下：首先将体积为V的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5在4℃下以3000rpm/min离心40分钟，吸取上清液，弃沉淀；再将上清液在4℃下以10000rpm/min离心40分钟，弃去上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V，稳定后过夜：4℃下，再以10000rpm/min离心40分钟，弃上清，用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液溶解沉淀至原体积即金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5的体积V的1/10，获得纯化的金标水貂阿留申病毒单克隆抗体C5，4℃保存备用。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液中含有1％BSA和0.02％叠氮钠。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，水貂阿留申病毒单克隆抗体C5与胶体金的偶联标记物的标记量为8.8μg～9.6μg:1mL。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，水貂阿留申病毒单克隆抗体E3的标记量为2μg/cm。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，羊抗鼠IgG的标记量为4μg/cm。
CN201510602692.1A 2015-09-21 2015-09-21 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法 Pending CN105223354A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510602692.1A CN105223354A (zh) 2015-09-21 2015-09-21 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510602692.1A CN105223354A (zh) 2015-09-21 2015-09-21 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105223354A true CN105223354A (zh) 2016-01-06

Family

ID=54992423

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510602692.1A Pending CN105223354A (zh) 2015-09-21 2015-09-21 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105223354A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105801673A (zh) * 2016-04-12 2016-07-27 北京瑞鹰生物技术有限公司 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
CN106226518A (zh) * 2016-07-08 2016-12-14 中国农业科学院特产研究所 犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN110376375A (zh) * 2019-08-23 2019-10-25 中国农业科学院特产研究所 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN111596062A (zh) * 2019-12-31 2020-08-28 贵州省烟草科学研究院 一种同时检测tmv和pvy的速测卡及其制备、使用方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
华育平，等: "水貂阿留申病病毒单克隆抗体的制备和初步应用", 《中国畜禽传染病》 *
吴威，等: "水貂阿留申病毒（ADV）单克隆抗体的研制", 《吉林农业大学学报》 *
姜亦飞，等: "水貂阿留申病毒VP2单克隆抗体的制备", 《山东农业科学》 *
徐磊: "水貂阿留申胶体金免疫层析诊断方法的初步建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105801673A (zh) * 2016-04-12 2016-07-27 北京瑞鹰生物技术有限公司 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
CN105801673B (zh) * 2016-04-12 2019-04-30 北京纳百生物科技有限公司 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
CN106226518A (zh) * 2016-07-08 2016-12-14 中国农业科学院特产研究所 犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN110376375A (zh) * 2019-08-23 2019-10-25 中国农业科学院特产研究所 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN111596062A (zh) * 2019-12-31 2020-08-28 贵州省烟草科学研究院 一种同时检测tmv和pvy的速测卡及其制备、使用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101925819B (zh) 结核分歧杆菌复合群的免疫检出方法
CN106226518A (zh) 犬瘟热病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法
US7687278B2 (en) Pretreatment kit for saliva and pretreatment method for saliva
CN105223354A (zh) 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法
CN104597255B (zh) 一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡及制备方法和应用
CN107741495A (zh) 一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心elisa试剂盒及其应用
CN102520169A (zh) 一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用
Vrublevskaya et al. A sensitive and specific lateral flow assay for rapid detection of antibodies against glycoprotein B of Aujeszky's disease virus
CN105181964A (zh) 水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法
CN103739675B (zh) 草莓镶脉病毒抗体及其抗原多肽、免疫原和应用
CN105753981A (zh) 抗人呼吸道合胞病毒n蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN102539768A (zh) EB 病毒 Zta IgA 抗体胶体金检测试剂盒及其制备方法
CN104965083B (zh) 一种检测h3n2亚型犬流感病毒的试剂盒
CN101587122A (zh) 一种猪血凝性脑脊髓炎病毒胶体金抗原检测试纸条及其制备方法
CN105842450A (zh) 一种蓝舌病抗体竞争液及其对应的快速elisa检测方法
CN105732810A (zh) 一种降钙素原单克隆抗体及其应用
CN105486871A (zh) 一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法
CN105753982B (zh) 抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN109946457A (zh) 一种检测猪流行性腹泻病毒的胶体金试纸条
CN104330569B (zh) 一种快速检测抗体的试纸条
CN103864929A (zh) 一种β-酪蛋白单克隆抗体的制备方法和β-酪蛋白胶体金检测试纸条及其制备方法
CN105585635A (zh) 抗人肺炎支原体p1蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105585633A (zh) 抗人流感嗜血杆菌p6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN105585634B (zh) 抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
JP4022005B2 (ja) 簡易抗体検査方法及び検査用キット

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160106

RJ01 Rejection of invention patent application after publication