CN105801673A - 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒 - Google Patents

水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105801673A
CN105801673A CN201610225372.3A CN201610225372A CN105801673A CN 105801673 A CN105801673 A CN 105801673A CN 201610225372 A CN201610225372 A CN 201610225372A CN 105801673 A CN105801673 A CN 105801673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
aleutian
detection
aleutian mink
mink disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610225372.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105801673B (zh
Inventor
杨春江
于在江
马孝斌
莫勋
李妍
秦堃
赵荣茂
华莹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Ruiying Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Ruiying Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Ruiying Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Ruiying Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610225372.3A priority Critical patent/CN105801673B/zh
Publication of CN105801673A publication Critical patent/CN105801673A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105801673B publication Critical patent/CN105801673B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14311—Parvovirus, e.g. minute virus of mice
    • C12N2750/14322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human Parvovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种水貂阿留申病毒抗原，其特征在于：所述水貂阿留申病毒抗原的核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述水貂阿留申病毒抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。能克服现有技术不能快速检测的缺陷，满足基层养殖企业使用，为广大养殖户服务。

Description

水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，涉及到水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒。
背景技术
水貂阿留申病是由阿留申病毒（aleutiandiseasevirus，ADV）所引起的一种慢性病毒病，在世界各养貂国家均有发生，所有品系的水貂均能感染。具有阿留申基因型的水貂甚至有1/3死于该病。水貂阿留申病能使母貂空怀率和仔貂死亡率显著增高，公貂的交配能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，造成经济损失，是世界公认的养貂的三大疫病之一，也是危害毛皮动物的重要疫病。
阿留申病毒属细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属，病毒中含有单股负链DNA，主要编码4种蛋白：结构蛋白VP1和VP2，非结构蛋白NS1和NS2。病毒感染动物后，需要及时淘汰净化，因此在养殖实践中主要通过检测阿留申病毒抗体来判断动物是否感染。现有检测方法主要是对流免疫电泳实验以及聚合酶链式反应，如出入境行业标准SN/T2847水貂阿留申病检疫技术规范中列出的三种方法，公开号为103993103A、104531903A、104911276A等的发明专利中公开的聚合酶链式反应方法，这些方法检测过程耗时长，操作繁琐，配套检测仪器昂贵，无法满足养殖场使用需求，尤其是在养殖户自行筛查或者销售时需要短时间出具有效且可靠结果的情况下。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水貂阿留申病毒抗原，以克服现有技术不能快速检测的缺陷，满足基层养殖企业使用，为广大养殖户服务。
本发明的目的还在于提供一种水貂阿留申病毒抗原的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种水貂阿留申病毒抗原，其特征在于：所述制备水貂阿留申病毒抗原的基因片段如SEQIDNo.1所示，所述水貂阿留申病毒抗原的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明还包括一种水貂阿留申病毒抗原的制备方法，其步骤如下：
步骤一：重组阿留申病毒VP2蛋白抗原的克隆表达
所述阿留申病毒VP2基因序列的上游引物为如SEQIDNo.3所示，下游引物为如SEQIDNo.4所示，在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和HindIII酶切位点；
所述阿留申病毒VP2基因片段以pUC-VP2质粒为模板，用PCR方法扩增，反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火条件为55.6℃45s，72℃延伸1min，30个循环后，再72℃延伸7min，4℃终止反应；
纯化的PCR产物与表达载体pET28A分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化BL21感受态细胞，所述阳性重组质粒命名为pET28A-AMD；
将表达阿留申病毒VP2蛋白的pET28a-AMD甘油菌从-20℃取出，解冻后按1﹕1000的比例无菌操作加入LB培养基中，再按1﹕1000的比例无菌操作加入抗生素，放入摇床中37℃、215rpm、16-18h或过夜摇菌，将过夜摇好的菌液无菌操作倒入干净的50ml的离心管中，配平后5000prm、10min、4℃离心，离心后去上清，留沉淀，沉淀用LB培养基无菌操作重悬，悬起后用枪移入1L的LB培养基中，再加入抗生素，放入摇床中37℃、210-215rpm摇2-2.5h，摇至OD值为0.6-0.8时诱导，诱导时先测OD值，数值在0.6-0.8范围内诱导，按1：1000的比例将IPTG诱导剂加入扩培好的菌液中，18℃、195rpm低温过夜诱导，过夜诱导后5000rpm，10min，4℃离心，离心后去上清，沉淀用bufferA悬起，所述bufferA为20mMHepes500mMNaCl5mM咪唑pH=7.5，移入干净的50ml的离心管中，体积为20ml左右，将菌体超声破碎,破碎前菌体中加入蛋白酶抑制剂，混匀后倒入20ml的小烧杯中，破碎30min左右，将破碎后的菌体移入离心管中，配平后18000rpm，30min，4℃离心；
步骤二：重组表达抗原的纯化
诱导表达菌体处理后，将通过0.22um滤孔过滤后的上清通过蠕动泵上到平衡好的镍柱上，用洗脱缓冲液bufferB梯度洗脱，所述梯度洗脱为0%→10%→20%→100%,所述洗脱缓冲液bufferB为20mMHepes500mMNaCl500mM咪唑pH=7.5，出峰就收集，将收集的组分进行SDS-PAGE电泳鉴定；
本发明还包括一种水貂阿留申病毒抗原的检测试剂盒，其步骤如下：
步骤一：胶体金标记VP-2抗原的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备得到40nm的胶体金颗粒溶液，调节pH值至9.0备用，取一定量的胶体金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的VP-2蛋白抗原以PBS按照1:2000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1%，置于在4℃和条件下冷冻离心机上慢速，所述上慢速为为11000~13000rpm，通过上慢速离心10分钟后弃去上清液，将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液，最后将沉淀物以PBS缓冲液重悬，使最终的蛋白浓度约为50μg/mL左右，保存于4℃备用；
步骤二：胶体金试纸条的组装
以PVC背板（1）为支撑物，在其上分别贴有硝酸纤维膜（4）、金标垫（2）、样品垫（3）、吸水垫（5），其中金标垫（2）采用聚酯膜，经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记VP-2抗原按照40μL喷涂，完毕，37℃烘干2h备用；
样品垫（3）采用聚酯纤维垫，采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用；
硝酸纤维膜（4）上包被有两条线：分别为质控线（6）和检测线（7），其中检测线包被物为检测抗原VP-2，质控线包被物为兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体，分别将检测抗原和兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.8mg/mL和1.2mg/mL的溶液，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，完毕，37℃烘干1h备用；
组装好的大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
本还发明还包括一种水貂阿留申病毒抗原的检测试剂盒检测方法，其步骤如下：
(1)采集样本：将水貂保定，指甲钳/剪刀用碘酊消毒后，剪断后肢脚趾指甲根部，出血后用毛细管或者吸管吸取0.5ml；
(2)样本稀释：将采集的全血样本稍微静置待析出血清后，用小吸管吸取1滴至样本稀释管中，混用待检；
(3)检测：取稀释好的样本200ul至反应微孔中，插入试纸条，确保样品垫朝下插入液体，并开始计时；
(4)结果判定：计时5-8min后取出试纸条，根据显色判定样本结果，阳性：两条线，即质控线和检测线均显色；阴性：一条线，即质控线显色，而检测限不显色；
(5)记录保存：将检测过的试纸条用剪刀剪掉样品垫端，即可长期记录保存。
通过对公开的阿留申病毒序列分析，通过基因工程手段重组表达，纯化鉴定后用双抗原夹心方法筛选配对，与阴、阳性血清筛选确认，得到了能够配对的抗原，以此为基础建立了阿留申病毒抗体的双抗原夹心胶体金检测方法及试纸条。其中所述的抗原核酸序列如SEQIDNo1所示，氨基酸序列如SEQIDNo2所示，原核表达为包被抗原VP-1和标记抗原优选为VP-2。
与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
（1）检测时间短：从采集血样到检测出结果整体需要10min，比传统的聚合酶链式反应（PCR）和对流免疫电泳（CIE）更为省时。
（2）成本低：单个试纸条的检测成本相比PCR和CIE两种方法降低了60%以上。
（3）操作方便，适合现场检测使用：检测过程无需任何特殊仪器设备，只要采集几滴血清或者全血样本加入样本稀释管即可直接用于检测，非常简便。
（4）检测效果显著：通过与现行标准方法对流免疫电泳法检测结果对比表明，胶体金法检测结果阳性符合率为95%，阴性符合率为100%；与自制ELISA检测结果对比为阳性符合率为94%，阴性符合率为96%；三种方法阳性一致率为94%，阴性一致率为98%。结果表明，本方法适合于水貂阿留申病毒抗体的筛选检测，可作为筛选手段在现场使用。
附图说明
图1：标记抗原VP-2蛋白的纯化鉴定图
图2：胶体金试纸条组装图
背板1；金标垫2；样品垫3；硝酸纤维膜4；吸水垫5；质控线6；检测线7。
具体实施方式
实施例1：阿留申病毒VP2抗原的克隆表达及纯化
一、重组阿留申病毒VP2蛋白抗原的克隆表达
参照GenBank中登录的阿留申病毒VP2基因序列设计引物，用于克隆阿留申病毒VP2基因序列的上游引物为如SEQIDNo3所示，下游引物为如SEQIDNo4所示，在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和HindIII酶切位点；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
阿留申病毒VP2基因片段以pUC-VP2质粒为模板，用PCR方法扩增。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火条件为55.6℃45s，72℃延伸1min，30个循环后，再72℃延伸7min，4℃终止反应。
纯化的PCR产物与表达载体pET28A分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化BL21感受态细胞。阳性重组质粒命名为pET28A-AMD阿留申病毒VP2。
将表达的阿留申病毒VP2蛋白(pET28a-AMD阿留申病毒VP2)的甘油菌从-20℃取出，解冻后按1﹕1000的比例无菌操作加入LB培养基中，再按1﹕1000的比例无菌操作加入抗生素，放入摇床中37℃、215rpm、16-18h或过夜摇菌。将过夜摇好的菌液无菌操作倒入干净的50ml的离心管中，配平后5000prm、10min、4℃离心，离心后去上清，留沉淀。沉淀用LB培养基无菌操作重悬，悬起后用枪移入1L的LB培养基中，再加入抗生素，放入摇床中37℃、210-215rpm摇2-2.5h，摇至OD值为0.6-0.8时诱导。诱导时先测OD值，数值在0.6-0.8范围内诱导，按1：1000的比例将IPTG诱导剂加入扩培好的菌液中，18℃、195rpm低温过夜诱导。过夜诱导后5000rpm，10min，4℃离心。离心后去上清，沉淀用bufferA(20mMHepes500mMNaCl5mM咪唑pH=7.5)悬起，移入干净的50ml的离心管中，体积为20ml左右。将菌体超声破碎,破碎前菌体中加入蛋白酶抑制剂，混匀后倒入20ml的小烧杯中，破碎30min左右。将破碎后的菌体移入离心管中，配平后18000rpm，30min，4℃离心。其鉴定如图1所示，图中1、2、3分别代表上样量4、2和1μg。
二、重组表达抗原的纯化
诱导表达菌体处理后，将过滤(0.22um)后的上清通过蠕动泵上到平衡好的镍柱上。用洗脱缓冲液(bufferB,20mMHepes500mMNaCl500mM咪唑pH=7.5)梯度洗脱(0%→10%→20%→100%)，出峰就收集。将收集的组分进行SDS-PAGE电泳鉴定。
实施例2：双抗原夹心胶体金试纸条的制备
一、胶体金标记VP-2抗原的制备
按照常规手段，采用柠檬酸三钠还原法制备得到40nm的胶体金颗粒溶液，调节pH值至9.0备用。取一定量的胶体金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的VP-2蛋白抗原以PBS按照1:2000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1%，置于冷冻离心机（4℃）上高速离心（速度为11000~13000rpm）10分钟后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液。最后将沉淀物以PBS缓冲液重悬，使最终的蛋白浓度约为50μg/mL左右，保存于4℃备用。
二、胶体金试纸条的组装
以PVC背板（1）为支撑物，在其上分别贴有硝酸纤维膜（4）、金标垫（2）、样品垫（3）、吸水垫（5）。其中金标垫（2）采用聚酯膜，经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记VP-2抗原按照40μL喷涂，完毕，37oC度烘干2h备用。
样品垫（3）采用聚酯纤维垫，采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用。
硝酸纤维膜（4）上包被有两条线：分别为质控线（6）和检测线（7），其中检测线包被物为检测抗原VP-2，质控线包被物为兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体，分别将检测抗原和兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.8mg/mL和1.2mg/mL的溶液，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，完毕，37℃烘干1h备用。
试纸条的组装按照图2模式进行。组装好的大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
实施例3：实际样本的检测
(1)采集样本：将水貂保定，指甲钳/剪刀用碘酊消毒后，剪断后肢脚趾指甲根部，出血后用毛细管或者吸管吸取0.5ml；
(2)样本稀释：将采集的全血样本稍微静置待析出血清后，用小吸管吸取1滴至样本稀释管中，混用待检；
(3)检测：取稀释好的样本200ul至反应微孔中，插入试纸条，确保样品垫朝下插入液体，并开始计时；
(4)结果判定：计时5-8min后取出试纸条，根据显色判定样本结果。阳性：两条线，即质控线和检测线均显色；阴性：一条线，即质控线显色，而检测限不显色。
(5)记录保存：将检测过的试纸条用剪刀剪掉样品垫端，即可长期记录保存。
虽然上面的举例了一些特定实施例来说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅局限于其中的各种细节。相反地，在等价于权利要求书的范畴和范围内可以不偏离本发明精神地在各种细节上做出各种修改。
SEQUENCELISTING
<110>北京纳百景弈生物科技有限公司
<120>水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>717
<212>DNA
<213>制备水貂阿留申病毒抗原的基因片段
<400>1
atggaggaaagaggtaagaaaaacgcagagatgaacagaattagaccttacaacataggt60
taccaatatcctgaatggataataccagcagggttacagggtagttactttgctggagga120
ccaagacagtggagtgacacaaccaaaggtgcaggtacacacagtcaacacttacaacag180
aactttagtactaggtacatctatgacagaaaccacggtggagacaacgaggtagaccta240
ttagatggaatacccattcatgaaagaagtaactactactcagacaatgagatagagcaa300
catacagcaaagcaaccaaagttacgtacaccacccattcaccactcaaaaatagactcg360
tgggaagaagaaggttggcctgctgcttcaggcacacactttgaagatgaggttatatac420
ctagactactttaactttagtggtgaacaggagctaaactttccacatgaagtattagat480
gatgctgctcagatgaaaaagctacttaactcataccaaccaacagttgctcaagacaac540
gttggtcctgtatacccgtggggacagatatgggacaagaaacctcatatggatcacaaa600
cctagcatgaacaacaacgctccatttgtatgtaaaaacaaccctccaggtcaactcttt660
gttaaactaacagaaaacctcactgatacatttaactatgatgaaaatccagactaa717
<210>2
<211>238
<212>PRT
<213>水貂阿留申病毒抗原的蛋白
<400>2
MetGluGluArgGlyLysLysAsnAlaGluMetAsnArgIleArgPro
151015
TyrAsnIleGlyTyrGlnTyrProGluTrpIleIleProAlaGlyLeu
202530
GlnGlySerTyrPheAlaGlyGlyProArgGlnTrpSerAspThrThr
354045
LysGlyAlaGlyThrHisSerGlnHisLeuGlnGlnAsnPheSerThr
505560
ArgTyrIleTyrAspArgAsnHisGlyGlyAspAsnGluValAspLeu
65707580
LeuAspGlyIleProIleHisGluArgSerAsnTyrTyrSerAspAsn
859095
GluIleGluGlnHisThrAlaLysGlnProLysLeuArgThrProPro
100105110
IleHisHisSerLysIleAspSerTrpGluGluGluGlyTrpProAla
115120125
AlaSerGlyThrHisPheGluAspGluValIleTyrLeuAspTyrPhe
130135140
AsnPheSerGlyGluGlnGluLeuAsnPheProHisGluValLeuAsp
145150155160
AspAlaAlaGlnMetLysLysLeuLeuAsnSerTyrGlnProThrVal
165170175
AlaGlnAspAsnValGlyProValTyrProTrpGlyGlnIleTrpAsp
180185190
LysLysProHisMetAspHisLysProSerMetAsnAsnAsnAlaPro
195200205
PheValCysLysAsnAsnProProGlyGlnLeuPheValLysLeuThr
210215220
GluAsnLeuThrAspThrPheAsnTyrAspGluAsnProAsp
225230235
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>阿留申病毒VP2基因序列的上游引物
<400>3
ccggaattcatggaggaaagaggtaag27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>阿留申病毒VP2基因序列的下游引物
<400>4
cccaagcttttagtctggattttcatc27

Claims (6)

1.一种水貂阿留申病毒抗原，其特征在于：所述水貂阿留申病毒抗原的基因序列如SEQIDNo1所示，抗原蛋白的序列如SEQIDNo2所示。
2.一种根据权利要求1所述的水貂阿留申病毒抗原的制备方法，主要步骤为：
根据SEQIDNo1设计上游引物SEQIDNo3和下游引物SEQIDNo4,经克隆表达得到抗原蛋白VP-2，经镍柱纯化，SDS-PAGE鉴定后备用。
3.根据权利要求1所述的水貂阿留申病毒抗原在检测或辅助检测水貂阿留申病毒检测装置中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种水貂阿留申病毒抗原在制备检测或辅助检测水貂阿留申病毒试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1所述的一种水貂阿留申病毒抗原试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有独立包装的权利要求1所述的水貂阿留申病毒抗原。
6.根据权利要求5所述的一种水貂阿留申病毒抗原试剂盒的制备方法，其步骤如下：
步骤一：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用来标记纯化的VP-2蛋白作为金标抗原；步骤二：胶体金试纸条的组装：以PVC背板（1）为支撑物，在其上分别贴有硝酸纤维膜（4）、金标垫（2）、样品垫（3）、吸水垫（5），其中金标垫（2）采用聚酯膜，经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记VP-2抗原按照40μL喷涂，完毕，37℃烘干2h备用；样品垫（3）采用聚酯纤维垫，采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用；
硝酸纤维膜（4）上标记有两条线：分别为质控线（6）和检测线（7），其中检测线包被物为检测抗原VP-2，质控线包被物为兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体，分别将检测抗原和兔抗阿留申病毒VP1蛋白多克隆抗体用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.8mg/mL和1.2mg/mL的溶液，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，完毕，37℃烘干1h备用；组装好的大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
CN201610225372.3A 2016-04-12 2016-04-12 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒 Active CN105801673B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610225372.3A CN105801673B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610225372.3A CN105801673B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105801673A true CN105801673A (zh) 2016-07-27
CN105801673B CN105801673B (zh) 2019-04-30

Family

ID=56459832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610225372.3A Active CN105801673B (zh) 2016-04-12 2016-04-12 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105801673B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110376375A (zh) * 2019-08-23 2019-10-25 中国农业科学院特产研究所 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104991057A (zh) * 2015-07-02 2015-10-21 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种水貂阿留申病毒抗体elisa快速检测试剂盒及其制备方法
CN105181964A (zh) * 2015-09-21 2015-12-23 吉林特研生物技术有限责任公司 水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法
CN105223354A (zh) * 2015-09-21 2016-01-06 吉林特研生物技术有限责任公司 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104991057A (zh) * 2015-07-02 2015-10-21 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种水貂阿留申病毒抗体elisa快速检测试剂盒及其制备方法
CN105181964A (zh) * 2015-09-21 2015-12-23 吉林特研生物技术有限责任公司 水貂阿留申病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法
CN105223354A (zh) * 2015-09-21 2016-01-06 吉林特研生物技术有限责任公司 水貂阿留申病毒胶体金免疫层析检测试纸条及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG,Q.等: "登录号：JN040434.1", 《GENBANK》 *
徐磊: "《水貂阿留申胶体金免疫层析诊断方法的初步建立》", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110376375A (zh) * 2019-08-23 2019-10-25 中国农业科学院特产研究所 穿流式水貂阿留申病毒抗原抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105801673B (zh) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103756974B (zh) 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用
CN104407137B (zh) 一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸
CN105753947A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用
CN102614507B (zh) 一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法
CN104459144B (zh) 一种猪伪狂犬病毒强毒株和疫苗毒株鉴别检测试纸
CN102175853A (zh) 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒
CN105273065B (zh) 一种1型鸭甲肝病毒vp2重组蛋白、elisa试剂盒及其制备方法
CN103033626B (zh) 猪tgev抗体与猪pedv抗体胶体金试纸条
CN110058019A (zh) 一种猪瘟抗体阻断检测试纸
CN102520169A (zh) 一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用
CN107937352A (zh) 用于检测小反刍兽疫病毒h 蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条
CN109187967A (zh) 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法
CN105906711A (zh) 一种抗o型和a型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途
CN106190986B (zh) 抗蓝舌病病毒血清4型vp2蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及用途
CN109320606B (zh) 一种特异性结合口蹄疫非结构蛋白的单克隆抗体及其应用
CN106771237B (zh) 一种检测猪萨佩罗病毒抗体的elisa试剂盒
CN108624713A (zh) 一种猪伪狂犬病疫苗毒与野毒鉴别检测的方法及试剂盒
CN105801673A (zh) 水貂阿留申病毒抗原及其制备方法和检测试剂盒
CN101012445A (zh) 一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用
CN104120109A (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒gB抗体检测阻断ELISA试剂盒及用途
CN109212230A (zh) 用于检测犬细小病毒结构蛋白vp2抗体的致敏聚苯乙烯纳米微球及其制备方法和应用
CN110484510B (zh) 杂交瘤细胞株、其分泌的识别盖他病毒单克隆抗体及应用
CN105330727B (zh) 一种1型鸭甲肝病毒vp4重组蛋白、elisa试剂盒及其制备方法
CN107557344A (zh) 一株表达猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系csfv‑3h3g6及抗体与试剂盒
CN105543261A (zh) 马铃薯卷叶病毒重组cp抗体在制备检测试纸条中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 101111 Beijing City, Daxing District branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street No. 88 biomedicine garden room E1-506

Applicant after: Beijing one hundred Biological Technology Co., Ltd.

Address before: 101111 Beijing City, Daxing District branch of Beijing economic and Technological Development Zone Street No. 88 biomedicine garden room E1-506

Applicant before: BEIJING RUIYING BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant