CN105543261A - 马铃薯卷叶病毒重组cp抗体在制备检测试纸条中的应用 - Google Patents

马铃薯卷叶病毒重组cp抗体在制备检测试纸条中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马铃薯卷叶病毒重组CP抗体在制备检测试纸条中的应用，1)采用pET22b(+)作为起始载体，明显提高了PLRV-CP基因的表达效率；2)用5mL蛋白纯化柱提高了纯化效率，降低了纯化的难度(不易堵柱)；3)表达产物为20kDa(原来是34kDa)，只带有His标签，没有其他融合片段，减少了融合片段对抗体制备的可能干扰。本发明建立了PLRVP-CP高效表达与大量制备的体系，为多抗及单抗的制备打下了坚实的基础。并且，试纸条的研制为具体检测程序的简化与高效率进行奠定了基础。

Description

马铃薯卷叶病毒重组CP抗体在制备检测试纸条中的应用
技术领域
本发明涉及一种检测马铃薯卷叶病毒的器具，特别是涉及马铃薯卷叶病毒重组CP抗体在制备检测试纸条中的应用。
背景技术
马铃薯已成为世界第四大粮食作物，也是中国第四大主粮作物，现我国马铃薯种植面积和产量均居世界首位，其对于我国的粮食安全具有重要作用。马铃薯卷叶病毒(potatoleafrollvirusPLRV)是最重要的马铃薯病毒性病害，在所有种植马铃薯的国家发生非常普遍，易感品种的产量损失可高达90％，一般减产40％-70％。该病毒通过蚜虫传播，也通过感染病毒的块茎传播。病毒通过蚜虫以持久方式传播，其中桃蚜(Myzuspersicae)是最重要的传播介体，还能通过嫁接传播，但不能经汁液机械接种传毒。PLRV自然寄主范围有限，20多种可侵染的寄主植物主要为茄科植物，还有部分苋科、假茄科(Nolanaceae)、十字花科和马齿苋科植物。病毒具有非常好的免疫原性，与属内的甜菜西方黄化病毒、甜菜轻型黄化病毒以及黄症病毒科未归类的烟草坏死矮化病毒、菜豆卷叶病毒等有密切的血清学关系。感染病毒植株初期症状：上部叶片卷曲，尤其是小叶的基部。这些叶片趋向于直立且一般是淡黄色。对许多品种而言，它们的颜色可能是紫色、粉红色或红色。后期感染可能不会有症状，而且有些品种感染后并没有症状。高感品种的块茎薯肉中有明显的坏死组织。当年初次侵染的症状，主要表现病株顶部的幼嫩叶片直立变黄，小叶沿中脉向上卷曲，小叶基部着有紫红色。续发性为二次侵染(即用上年PLRV初侵染块茎，在下年做种再发病)侵染的病株症状，表现全植株病状较为严重，一般在马铃薯现蕾期以后，病株叶片由下部至上部沿叶片中脉卷曲，呈匙状，叶肉变脆呈革质化，叶背又是出现紫红色，上部叶片褪绿，重者全株叶片卷曲，整个植株矮化，块茎变瘦小，薯肉呈现锈色网纹斑。初侵染病株减产程度小于续发性侵染病株。
病毒病素有“蔬菜癌症”之称，防治十分困难，已成为制约蔬菜产业、乃至主要农作物发展的重要因素对病毒性危害，仅通过增加投入，像防治细菌和真菌病害那样大量使用农药是无法控制的。培育抗性品种是减少病毒危害最有效的手段之一。但由于自然界缺乏抗病毒种质资源，抗病毒育种将是一个长期和艰巨的攻关目标。进行种薯脱毒是大幅度提高马铃薯生产水平的重要环节，也是投入少、见效快的途径之一。而脱毒种薯的脱毒标准和质量则直接影响脱毒种薯应用和推广的成效，对此国内外已达成广泛共识。建立有效的马铃薯病毒检测体系、完善检测技术对提高薯类作物的产量具有重要意义。马铃薯病毒检测需要利用病毒分离鉴定、血清学检测和病毒核酸检测等实验室检测手段进行确切诊断。
目前实验室检测这三种病毒的方法有：(1)指示植物法的病毒分离与鉴定，PLRV采用带病毒蚜虫接种洋酸浆或曼陀罗，其灵敏度高，但完成整个检测过程需1～2月，具有检测周期长且技术要求高的局限性。(2)血清学检测主要包括琼脂免疫扩散试验(AGID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。AGID试验操作简便、敏感性高、成本低，不需要复杂实验设备，其缺点是有交叉反应。DAS-ELISA是PLRV血清学诊断首选方法，是最敏感和特异的PLRV抗体检测技术，其缺点在于高亲和力单克隆抗体检测试剂不易获得。(3)用反转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)检测样品中的PLRV核酸，RT-PCR和实时荧光定量PCR技术具有快速、特异、灵敏(以及定量)等特点，在PLRV核酸检测中得到广泛研究。病毒分离与鉴定和PCR检测技术操作复杂、需要仪器和较长的时间，不适合生产或现场的快速诊断需要。ELISA和AGID比病毒分离与鉴定和PCR技术简便、快速，常用来检测PLRV(ELISA)及其抗体，但仍不便于我国基层或现场普遍推广应用。因为ELISA仍需要酶标仪和试剂，较复杂的操作步骤和经验，这些仪器、试剂在基层或者缺乏，或者缺乏操作人员和保存条件。用斑点免疫金渗滤法即免疫试纸的方法检测病毒，利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，将抗原－抗体反应由ELISA的传统液相环境转到固相滤膜上快速进行，并采用胶体金印迹代替酶印迹，凭肉眼直接观察胶体金的显色状况而判断结果，因此该法比ELISA更简便、快速和实用。
快速制备大量高效价的抗血清是免疫学方法应用的关键。日前应用于马铃薯病毒抗血清制备的抗原有提纯病毒粒子及病毒外壳蛋白基因原核表达产物。以提纯的病毒粒子为抗原制备抗血清是常规途径，过程是提纯抗原，再以提纯抗原免疫家兔，最后进行采血分离抗血清。但是以提纯的病毒粒体为抗原制备抗血清存在很多弊端，一些病毒(如PLRV)在寄主体内含量低，病毒分离提纯困难，不易得到纯化的病毒粒体，难以提纯获得足够的抗原。通过基因工程技术使病毒外壳蛋白基因在原核细胞中表达，以表达产物为抗原制备特异性抗血清是一条制备病毒抗血清的新途径。该方法克服了使用提纯病毒粒体作为抗原制备抗血清的种种弊端，同时可得到大量高特异性的抗血清，并且所构建的工程菌株可在低温下长期保存，根据需要随时诱导表达。通过表达载体的构建可将外壳蛋白表达为天然蛋白或融合蛋白，研究表明两种类型的表达产物具有很好的免疫效果。马铃薯卷叶病毒CP基因结构特殊，原核表达困难。Pichova等(2011)报道利用特殊的受体菌实现了PLRV-CP基因的原核表达，并制备了重组CP抗血清，但ELISA检测显示免疫反应信号弱。《马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备》公开了将PLRV-CP基因进行缺失突变，实现了其原核表达，并制备出了重组CP多克隆抗体，该抗体可用于PLRV的DAS-ELISA检测；但是此种方法基因表达量偏低，纯化较困难。并且目前未见马铃薯卷叶病毒重组CP单和/或多克隆抗体用于组装ELISA检测试剂盒或胶体金试纸条的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种pET22b(+)质粒在提高PLRV-CP基因的表达效率的应用。
本发明采用以下技术方案：
一种pET22b(+)质粒在提高重组PLRV-CP基因的表达效率的应用，所述重组PLRV-CP基因为：从PLRV-CP基因中删除第52-177位核苷酸(如序列表SEQIDNO.2所示)，其它核苷酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQIDNO.1所示。
一种重组载体，以pET22b(+)质粒为起始载体，构建重组PLRV-CP基因的原核表达载体，所述重组PLRV-CP基因为(如序列表SEQIDNO.2所示)：从PLRV-CP基因中删除第52-177位核苷酸，其它核苷酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQIDNO.1所示。
该重组载体的表达产物为20kDa(原来是34kDa)，只带有His标签，没有其他融合片段，减少了融合片段对抗体制备的干扰。
本发明还提供含有上述重组载体的重组表达菌，所述重组表达菌其出发菌株为大肠杆菌BL21。
本发明还提供采用上述重组载体表达马铃薯卷叶病毒重组CP抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体片段pET22b(+)与126bp缺失突变后的PLRV-CP基因进行连接，构建得到表达载体pET22b-LRCP；
(2)将步骤(1)中的表达载体pET22b-LRCP转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；
(3)大肠杆菌菌体总蛋白的提取和包涵体溶解，然后将目的蛋白LRCP进行纯化，即得马铃薯卷叶病毒重组CP抗原。
步骤(1)中，具体构建表达载体的步骤是：
1)以pBAD-LRCP-126为模板，以分别含有NdeI与HindIII位点的引物扩增CP基因，然后T-A克隆，获得重组质粒pMD18-LRCP；
2)pMD18-LRCP进行NdeI与HindIII双酶切后回收含CP基因的DNA片段；pET22b-PhTPS同样进行NdeI与HindIII双酶切，回收载体大片段；
3)将步骤2)中的两个片段连接，即为产物PLRV-CP基因(缺失突变基因)的原核表达载体pET22b-LRCP。
步骤1)中，具体包括以下步骤：
①从菌株TOP10(pBAD-LRCP-126)提取质粒pBAD-LRCP-126；
②PLRV-CP基因的PCR扩增
以质粒pBAD-LRCP-126为模板，以P1、P2(P1序列为5’-CATATGAGTACGGTCGTGG-3’，如序列表SEQIDNO.3所示)；P2序列为5’-AAGCTTTTTGGGGTTTTGCAA-3’，如序列表SEQIDNO.4所示)为上、下游引物，进行PCR扩增；
扩增体系：质粒DNA，2μL；P1，2.5μL；P2，2.5μL；dNTP，5μL；10×PCRbuffer，3μL；Taq酶，1μL；ddH2O，14μL；
扩增条件：94℃变性5min，然后进入循环：94℃，变性30s；46℃，退火45s；72℃，延伸1min。34个循环，最后72℃保温10min；1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增结果。
③PLRV-CP基因的回收
在紫外灯下切下大小为500bp左右的特异性DNA片段的胶条，称重后加入胶条重量3-6倍的bufferB2，50℃水浴5-10min，融化胶条；溶液移入吸附柱中，8000×g离心30s；加500μLWashSolution，9000×g离心30s并重复洗涤一次；空吸附柱9000×g离心1min；吸附柱放进1.5mL离心管中，加入15-40μLElutionSolution，静置1min，9000×g离心30s。
④T-A连接
连接体系：pMD18T载体1μL，PLRV-CP基因小片段3μL，连接Solution5μL，ddH2O1μL。金属浴中16℃保温30min。
⑤DH5α感受态制备及其转化，获得DH5α(pMD18-LRCP)，经培养后，提取得到重组质粒pMD18-LRCP。
步骤2)中，回收含CP基因的DNA片段的具体步骤如下：
①对重组质粒pMD18-LRCP进行双酶切，酶切体系如下：质粒8μL；NdeⅠ1μL；HindⅢ1μL，BufferK1μL，ddH2O9μL，37℃，保温6小时；
②酶切产物于浓度为1％的琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液和琼脂糖凝胶使用TAE缓冲液配置，琼脂糖溶解后加入EB使其终浓度达到约0.5μL/mL；
③在紫外灯下切下目的条带的胶条，回收大小约为500bp的CP基因的DNA片段。
步骤2)中，载体pET22b(+)大片段制备方法如下：
从重组菌DH5α(pET22b-PhTPS)提取质粒pET22b-PhTPS，经过NdeⅠ与HindⅢ双酶切后，回收大小约为5500bp的载体pET22b(+)大片段。其中，重组菌DH5α(pET22b-PhTPS)的构建通过常规基因工程的方法进行，其构建来源于文献所述：《坛紫菜TPS基因的克隆及其原核表达》邓淑贞，王斌，高磊，牛倩雅，刘涛，翁曼丽，郭宝太，华北农学报2013，28(5)：:66-73。
步骤3)中，两个片段连接方法如下：
连接体系(20μL)：pET22b载体大片段3μL，PLRV-CP基因小片段6μL，DNA连接酶2μL，连接Buffer2μL，ddH2O7μL，金属浴中16℃过夜连接。
步骤(2)中，优选大肠杆菌BL21，E.coliBL21感受态细胞的制备，包括以下方法：
1)蘸取BL21菌液划平板，37℃倒置过夜培养
2)挑取单菌落接种在10mLLB培养液中，37℃震荡过夜；
3)取过夜的培养液1mL加入20mL液体LB培养基中，37℃，150-200r/min震荡培养2-3小时，培养液出现浑浊后，每隔20-30min测一次OD600值，达到0.45-0.55；
4)培养液在冰上冷却片刻后分装到预冷的1.5mL离心管中，冰上放置10min；
5)4℃，8000rpm离心5min；
6)去净上清，每管加入300μL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮沉淀，冰上静置30min；
7)4℃，8000r/min离心5min；
8)去净上清，每管加入100μL混合液(850μL0.1MCaCl2中加入150μL甘油)，混匀，得到BL21感受态，-80℃保存。
两个DNA回收片段的连接物转化受体菌BL21，转化过程如下：
1)从超低温冰箱中取出感受态细胞，置于冰浴上融化，约10min后，吸取10μL连接液与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；
2)42℃水浴热激110s；
3)冰浴5min；
4)加入1mLLB液体培养液，37℃，80r/min，振荡培养45min；
5)8000r/min离心1min，弃上清，用枪吹打悬浮后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板；
6)封口，37℃，倒置培养约10h，观察菌落形成的情况。
重组菌BL21(pET22b-LRCP)采用1mmol/LIPTG诱导表达，过程如下：
1)挑取重组菌BL21(pET22b-LRCP)的单菌落接种于10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；
2)菌液按1％接种量接种于200mL相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养2.5-3小时，OD600达到0.6-0.9；
3)接出1mL未诱导的菌液，作为对照；
4)向剩余培养液中接入1％培养液体积的100mmol/LIPTG，使其终浓度达到1mmol/L，37℃震荡培养4小时；
5)吸取1mL诱导的菌液作为诱导样。
6)SDS-PAGE检测诱导效果。
步骤(3)中，目的蛋白LRCP进行纯化采用5mL镍离子亲和层析柱。经过实验验证与分析，PLRV重组CP的纯化效率明显提高了40％以上，降低了纯化难度(不易堵柱)。
本发明还提供一种采用所述重组CP制备得到抗马铃薯卷叶病毒重组CP单和/或多克隆抗体。其中，所述试纸条为胶体免疫层析条。
本发明还提供一种上述单和/或多克隆抗体在制备检测试纸条的应用。
一种检测马铃薯卷叶病毒的胶体免疫层析条，包括支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，所述纤维素膜层上标记有用马铃薯卷叶病毒抗体溶液印制的隐形检测印迹，纤维素膜层上还标记有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对照印迹，所述金标抗体纤维层上附着有与隐形检测印迹对应的以胶体金标记的抗马铃薯卷叶病毒的多克隆抗体或单克隆抗体。
所述马铃薯卷叶病毒抗体为马铃薯卷叶病毒的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述纤维素膜层为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成。
所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。
所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成。
所述吸水层用吸水纸制成。
所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成。
所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。
所述隐形检测印迹和隐形对照印迹排列组合为“‖”、“＝”、“//”、“-|”、“+”、“┴”、“：”、“●●”、“≈”和“︽”中的任意一种。
本发明具有以下有益效果：
(1)pET载体系统的载体类型多达20余种，大肠杆菌宿主也有11种。本发明采用pET22b(+)质粒和大肠杆菌BL21，两者相结合的系统表达效率很高，诱导后的外源蛋白产量较高。
本发明中影响PLRV-CP基因原核表达的主要遗传因素是：1)表达载体的启动子等调控序列。2)受体菌的基因型。3)基因的结构。本实验是所以选pET22b(+)作为表达载体，原因：1)pET22b是应用方便、具有强启动子的一个载体。2)BL21(DE3)中某些稀有密码子对应的tRNA丰度高，基因的表达能力强，基因的表达效率无法直接判断，必须通过实验验证。
本发明将5′端含有NdeⅠ位点、3′端含有HindⅢ位点的PLRV-CP基因片段插入pET22b(+)载体，构建了该基因的原核表达载体pET22b-LRCP。重组菌BL21(pET22b-LRCP)用1mmol/LIPTG诱导，SDS-PAGE结果显示获得了分子量为20KDa的特异性蛋白条带。用镍离子亲和层析柱进行纯化，SDS-PAGE显示纯化出的重组蛋白为单一条带，即获得了高纯度的PLRV重组CP。PLRV-CP基因的表达量明显提高了50％以上；用5mL镍离子亲和层析柱替代了1mL的层析柱，PLRV重组CP的纯化效率也明显提高了40％以上，降低了纯化难度(不易堵柱)。利用pET22b表达出的PLRV重组CP，表达产物为20kDa(原来是34kDa)，只带有His标签，没有其他融合片段，减少了融合片段对抗体制备的干扰。建立了PLRV-CP高效表达与大量制备的体系，抗原制备技术的解决为抗体的随时制备与大量制备提拱了保障。经纯化后用于免疫，制备出的抗血清效价为1:512K。
(2)检测特异性强，敏感性高。该快速检测试纸条以胶体金印迹高亲和力的特异性单抗/多抗为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单抗/多抗特异性和亲和力(结合力)影响很小，且具有较高的印迹率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性，可检测到2纳克的相应病毒的蛋白。
(3)操作简便，快速。使用本发明试纸条时无需附加任何其它仪器和试剂，只要将其测试端插入待检样品液中30秒左右，然后在5分钟左右即可判定检测结果。
(4)结果显示直观、准确。试纸条以显示棕红色的检测印迹和对照印迹作为检测的阳性和阴性印迹，即在纤维素膜上只显示一条棕红色对照印迹C，表示病毒在被检测样品液中未检出；如果试纸条上出现两条棕红色印迹(即出现对照印迹C和检测印迹T)，表示检测结果呈阳性，即说明待检样品中检测出PLRV；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。检测结果判定直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(5)减少投资和检测成本。使用该快速检测试纸条，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，无需支付专家诊断检查费或送样品去诊断室的路费，节省检测成本，检测费用低。
(6)应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，将原本复杂的只有在实验室通过专业人员才能完成的检测过程，简化成为“一步式”或“傻瓜式”的测试产品，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，能够满足国内种薯生产、种质资源评价、国内调种和国外引种时对病毒检测的需要，随着国家对马铃薯病毒强制性检测的规定出台，本发明将具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1：PLRV-CP基因的表达和重组CP的纯化，其中，M：蛋白maker；1:CK(无诱导)；2:用IPTG诱导；3:纯化后的重组蛋白。
图2：抗血清效价的测定。
图3：5mL镍离子亲和层析柱纯化结果；其中，M：蛋白marker；1：PLRV-CP基因诱导表达的蛋白；2,3：8mo/Ll尿素溶解获得的蛋白；4-12：纯化蛋白的洗脱物(1mL/每管)。
图4：PLRV-CP基因的亚克隆的鉴定结果；其中，M：DL2000，1-4：PCR产物。
图5：马铃薯卷叶病毒检测试纸条俯视示意图。
图6：马铃薯卷叶病毒检测试纸条剖面结构示意图。
图中：1：支撑层，2：样品纤维吸附层，3：金标抗体纤维层，4：纤维素膜层，5：吸水层，6：检测线，7：对照线，8-1：测试端保护膜，8-2：手柄端保护膜，9：样品标记线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下述实施例中所用到的实验材料和试剂如下：
实施例1pET22b(+)质粒在提高重组PLRV-CP基因的表达效率的应用
1.实验材料
1.1菌种、质粒及载体
大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自Novagen公司，克隆载体pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司。
TOP10(pBAD-LRCP-126)菌株和PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126，其构建来源于文献所述：《马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备》隋炯明，何心凤，郭真，李广存，王晶珊，郭宝太，园艺学报2012，39(10)：1949–1957。
重组菌DH5α(pET22b-PhTPS)及坛紫菜TPS基因(PhTPS)的原核表达载体pET22b-PhTPS，其构建来源于文献所述：《坛紫菜TPS基因的克隆及其原核表达》邓淑贞，王斌，高磊，牛倩雅，刘涛，翁曼丽，郭宝太，华北农学报2013，28(5)：:66-73。
1.2酶、试剂与试剂盒
DNAmarker、限制性内切酶NdeⅠ与HindⅢ、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等工具酶购自宝生物工程(大连)有限公司，咪唑、三氯乙酸、SDS、Glycine、Urea、Acrylamide、Bis-arcylamide、BSA、质粒DNA小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、二抗购自生工生物工程(上海)股份有限公司，去氧胆酸钠购自上海伯奥生物科技有限公司，蛋白酶抑制剂PMSF购自Sigma，蛋白质Marker、溶菌酶购自北京索莱宝科技有限公司，5mL镍离子亲和层析柱(HiTrapChelatingHP)为HEHeacthcare产品。
其他试剂均为进口或国产的分析纯试剂。
1.3DNA引物
PLRV-CP基因的正向引物P1序列为5’-CATATGAGTACGGTCGTGG-3’(具有NdeⅠ酶切位点)；反向引物P2序列为5’-AAGCTTTTTGGGGTTTTGCAA-3’(具有HindⅢ酶切位点)，由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.4培养基
LB固体和液体培养基，pH7.4,121℃高压蒸汽灭菌15min。
氨苄抗性的筛选平板：灭菌后的固体培养基冷却至60℃后，按终浓度100μg/mL加入氨苄青霉素，倒平板。
2.方法
2.1利用pET22b载体表达PLRV-CP基因及重组CP的制备
2.1.1原核表达载体的构建
概述：将回收的pET22b(+)载体大片段和双酶切后胶回收的LRCP基因小片段进行连接，16℃金属浴过夜，转化BL21感受态，然后进行重组载体的鉴定。具体的方法步骤如下：
2.1.1.1PLRV-CP基因的亚克隆
为了利用pET22b(+)构建PLRV-CP的表达载体，先对该基因进行亚克隆，目的是使该基因两端分别带有NdeⅠ与HindⅢ的酶切位点，步骤为：
1)按照质粒DNA小量提取试剂盒的说明书从菌株TOP10(pBAD-LRCP-126)提取质粒pBAD-LRCP-126。
2)PLRV-CP基因的PCR扩增
以质粒pBAD-LRCP-126为模板，以P1、P2为上、下游引物，进行PCR扩增。
扩增体系：质粒DNA，2μL；P1，2.5μL；P2，2.5μL；dNTP，5μL；10×PCRbuffer，3μL；Taq酶，1μL；ddH2O，14μL。
扩增条件：94℃变性5min，然后进入循环：94℃，变性30s；46℃，退火45s；72℃，延伸1min。34个循环，最后72℃保温10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR的扩增结果。
3)PLRV-CP基因的回收
在紫外灯下切下大小为500bp左右的特异性DNA片段的胶条，称重后加入胶条重量3-6倍的bufferB2，50℃水浴5-10min，融化胶条；溶液移入吸附柱中，8000×g离心30s；加500μLWashSolution，9000×g离心30s并重复洗涤一次；空吸附柱9000×g离心1min；吸附柱放进1.5mL离心管中，加入15-40μLElutionSolution，静置1min，9000×g离心30s。
4)T-A连接
连接体系：pMD18T载体1μL，PLRV-CP基因小片段3μL，连接Solution5μL，ddH2O1μL。金属浴中16℃保温30min。
5)DH5α感受态制备及其转化
感受态制备：蘸取DH5α菌液划平板，37℃倒置过夜培养，挑取单菌落接种在10mLLB培养液中，37℃震荡过夜。取过夜的培养液1mL加入20mL液体LB培养基中，37℃，150-200r/min震荡培养2-3小时，培养液出现浑浊后，每隔20-30min测一次OD600值，达到0.45-0.55。培养液在冰上冷却片刻后分装到预冷的1.5mL离心管中，冰上放置10min；4℃，8000r/min离心5min；去净上清，每管加入300μL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮沉淀，冰上静置30min；4℃，8000r/min离心5min；去净上清，每管加入100μL混合液(850μL0.1mol/LCaCl2中加入150μL甘油)，混匀，得到DH5α感受态，-80℃保存。
转化：从超低温冰箱中取出感受态细胞，置于冰浴上融化，约10min后，吸取10μL连接液与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热激110s；冰浴5min；加入1mLLB液体培养液，37℃，80r/min，振荡培养45min；8000r/min离心1min，弃上清，用枪吹打悬浮后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板；封口，37℃，倒置培养约10h，观察菌落形成的情况。
6)阳性克隆的筛选与鉴定
从含氨苄青霉素的LB固体平板上挑取单菌落，接种到到含氨苄青霉素的1mL液体培养基中，37℃震荡培养5h，进行菌液PCR。反应体系：菌液2μL，其他成分及扩增条件与2.1.1.1步骤2)相同。1％琼脂糖凝胶电泳初步筛选出阳性克隆，并从阳性克隆提取质粒送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，确认PLRV-CP亚克隆的正确性，重组质粒命名为：pMD18-LRCP。
2.1.1.2PLRV-CP基因NdeⅠ-HindⅢ片段的获得
1)挑取DH5α(pMD18-LRCP)单菌落接种于10mLLB液体培养基(氨苄青霉素的终浓度为100μg/mL)中，37℃，135r/min震荡过夜培养；
2)按照质粒DNA小量提取试剂盒的说明书提取质粒pMD18-LRCP；
3)对质粒pMD18-LRCP进行双酶切，酶切体系如下：质粒8μL；NdeⅠ1μL；HindⅢ1μL，BufferK1μL，ddH2O9μL，37℃，保温6小时；
4)酶切产物于浓度为1％的琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液和琼脂糖凝胶使用TAE缓冲液配置，琼脂糖溶解后加入EB使其终浓度达到约0.5μL/mL；
5)在紫外灯下切下目的条带的胶条，参照2.1.1.1中步骤3)的方法回收大小约为500bp的片段。
2.1.1.3pET22b载体大片段的获得
从重组菌DH5α(pET22b-PhTPS)提取质粒pET22b-PhTPS，同样经过NdeⅠ与HindⅢ双酶切后，回收大小约为5500bp的载体大片段。
2.1.1.4回收片段的连接
连接体系(20μL)：pET22b载体大片段3μL，PLRV-CP基因小片段6μL，DNA连接酶2μL，连接Buffer2μL，ddH2O7μL，金属浴中16℃过夜连接。
2.1.1.5E.coliBL21感受态细胞的制备与转化
BL21感受态制备与转化：方法参照2.1.1.1步骤5)。
2.1.1.6阳性克隆的PCR鉴定
挑取2.1.1.4中单菌落(转化子)接种到含有氨苄青霉素的10mLLB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；以P1与P2为引物进行菌液PCR初步筛选出阳性克隆，菌液PCR方法参照2.1.1.1步骤6)。
2.1.1.7阳性克隆的酶切鉴定
利用质粒小量提取试剂盒从2.1.1.5中的阳性克隆提取重组质粒并进行单酶切和双酶切的鉴定。
单酶切体系如下：
单酶切：重组质粒3μL，BufferH/M1μL，NdeⅠ/HindⅢμL，ddH2O5μL。
双酶切：重组质粒3μL，BufferK1μL，NdeⅠ1μL，HindⅢ1μL，ddH2O4μL。
酶切温度37℃，保温3小时，然后1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
2.1.1.8DNA序列的测定
从PCR鉴定与酶切鉴定的阳性克隆中提取重组质粒，用pET22b载体引物进行序列测定，测序任务由生工生物工程(上海)股份有限公司。测序结果符合预期的重组质粒就是构建的PLRV-CP基因原核表达载体，该表达载体命名为pET22b-LRCP。
2.1.2PLRV-CP基因在BL21中的原核表达
1)挑取重组菌BL21(pET22b-LRCP)的单菌落接种于10mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；
2)菌液按1％接种量接种于200mL相同浓度氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养2.5-3小时，OD600达到0.6-0.9；
3)接出1mL未诱导的菌液，作为对照；
4)向剩余培养液中接入1％培养液体积的100mmol/LIPTG，使其终浓度达到1mmol/L，37℃震荡培养4小时；
5)吸取1mL诱导的菌液作为诱导样；
6)SDS-PAGE检测诱导效果。
2.1.3菌体总蛋白的提取和包涵体溶解
1)2.1.2中剩余的198mL菌液在4000r/min，4℃条件下离心15min；
2)弃上清，称重，每克大肠杆菌加3mL裂解缓冲液(150mmol/LTris-HCl，1.5mol/LNaCl)重悬沉淀；
3)每克大肠杆菌中加8μLPMSF(50mmol/L)和80μL溶菌酶(10mg/mL)；
4)边搅拌边挑入去氧胆酸钠；
5)当裂解液变粘稠时，每克大肠杆菌中加入20μLDNaseI(1mg/mL)；
6)室温下放置30min至不再粘稠时，每管500μL分装，12000r/min，4℃离心2min；
7)沉淀进行包涵体溶解：每管沉淀中加入700μL结合缓冲液(20mmol/LNaH2PO4,0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea，20mmol/L咪唑)，吹打重悬沉淀，再加入700μL结合缓冲液，震荡均匀，约1min后12000r/min，4℃离心10min；收集上清液，重复上述步骤，加入700μL结合缓冲液吹打重悬，12000r/min，4℃离心15min，收集上清液；
8)上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤后上柱纯化。
2.1.4PLRV重组CP的纯化条件的优化
以构建的重组菌TOP10(pBAD-LRCP-126)为材料，活化后接种于200mLLB液体培养基中，37℃用0.2％L-阿拉伯糖诱导4h。菌体总蛋白提取及包涵体溶解方法参照2.1.3。
使用5mL蛋白镍纯化柱纯化PLRV重组CP，纯化体系如下：
1)20mLddH2O洗柱；
2)2.5mLNiSO4洗柱挂镍；
3)20mLddH2O洗柱将未挂上的镍洗掉；
4)20mL结合缓冲溶液(20mmol/LNaH2PO4,0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素，20mmol/L咪唑)平衡柱子；
5)过滤过的样品溶液5-10mL；
6)20mL结合缓冲溶液洗柱将未结合上柱的蛋白洗掉；
7)10mL洗脱缓冲液(20mmol/LNaH2PO4,0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素，0.5mol/L咪唑)洗脱目的蛋白，收集中间的5mL；
8)40mLddH2O洗柱；
9)20mL20％乙醇洗柱，封柱。
2.1.5重组菌BL21(pET22b-LRCP)表达的重组蛋白的纯化
按照2.1.4优化后的条件进行。
2.1.6SDS-PAGE鉴定
PLRV-CP基因诱导表达的效果、纯化条件优化结果及重组CP纯化效果都通过SDS-PAGE检测、确认。
1)准备玻璃板，依次用洗涤剂，水，乙醇和水冲洗，干燥后按说明安装好电泳装置；
2)配制质量分数为12％分离胶溶液，和质量分数为5％浓缩胶，灌胶，插入梳子；
3)浓缩胶聚合的同时，准备电泳的样品。未诱导和诱导的1mL菌液12000r/min离心1min，沉淀中加入10μL(5×)上样缓冲液悬浮沉淀，纯化的上清液40μL加入10μL(5×)上样缓冲液混匀，煮沸5-10min，12000r/min离心1-3min，吸取上清留待点样；
4)浓缩胶制好后，用去离子水冲洗梳子孔，甩出去离子水，将凝胶板放入电泳槽中，上下槽均加入1×电极缓冲溶液，保证无泄漏；
5)上样：蛋白Marker和每个样品上样20μL，注入梳子孔中；
6)100V电压恒压电泳约10h；
7)电泳结束后，拧开凝胶板，从浓缩胶上端撬开两页玻璃，取出凝胶，切掉上部浓缩胶，将分离胶放置到搪瓷盘中，加入10％(w/v)三氯乙酸100mL浸没凝胶，固定30min；
8)弃掉固定液，换上染色液，过夜；
9)弃掉染色液，加入脱色液，浸没凝胶，约1h换一次脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白的条带清晰为止，脱色时间约为2-4h。
2.1.7蛋白的透析、浓缩和定量
收集蛋白纯化的洗脱液，装入透析袋中，封口后，放入pH7.4的PBS中透析，后将透析袋放到PEG6000固体中浓缩1-2h，对蛋白进行定量。定量方法如下：
1)1mg/mL牛血清蛋白(BSA)标准溶液按梯度加入试管中，加入量为0,20,40,60,80,100μL，加入PBS补足到150μL；
2)样品加入试管中，分别为30μL，60μL，并用PBS补足到150μL；
3)向各个试管中加入2850μL考马斯亮蓝G250染液，摇匀；
4)不含BSA的样品作为调零的空白对照，用分光光度计测量595nm波长下的吸光值，记录读数；
5)绘制标准曲线，并计算样品中的蛋白浓度。
2.2PLRV重组CP抗血清的制备
2.2.1免疫
蛋白样品的浓度调整到1mg/mL，共需要约4-6mL。初免剂量为0.5mg/只，二免、三免、四免剂量为0.25mg/只。
1)一免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂+蛋白抗原；
2)二免：第21天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；
3)三免：第35天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；
4)三免后采血：第42天，耳静脉采血1mL，ELISA检测抗血清效价；
5)四免：第49天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白抗原；
6)四免后采血：第56天，耳静脉采血1mL，ELISA检测抗血清效价；
7)终放血：第57天，ELISA检测抗血清效价达到要求，颈动脉采全血。
2.2.2间接ELISA法测定PLRV重组CP抗血清的效价
通过间接ELISA测定抗血清效价，具体步骤如下：
样品稀释：
1)抗原：PLRV重组CP蛋白定量为2mg/mL，设定每孔包被抗原的量为0.2μg，抗原用PBS以1:1000稀释，浓度为2μg/mL，每孔抗原包被100μL；
2)抗血清：用PBST按1:1000稀释，后等比稀释；
3)二抗：辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)1:8000稀释，用PBST稀释。
4)免疫前血清：用PBS按1:1000稀释。
具体测定步骤：
1)包被抗原：将抗原按0.2μg每孔包板，阴性对照用免疫前血清100μL每孔，空白对照用碳酸盐缓冲液100μL每孔包板，37℃，2h；
2)洗板：PBST洗涤3，每次3min；
3)封闭：封闭液100μL每孔，37℃，1h；
4)洗板：同2)
5)加一抗：稀释好的抗血清一次加入，100μL每孔，37℃孵育1h；
6)洗板：同2)
7)加二抗：100μL每孔，37℃孵育45min；
8)洗板：PBST洗涤4次，每次3min；
9)显色：底物溶液100μL每孔，反应15min，最后加入100μL硫酸终止反应；
10)测OD值：450nm波长下测定OD值。
3.实验结果
3.1PLRV-CP基因的亚克隆
以构建的质粒pBAD-LRCP-126为模版，用含NdeⅠ位点的上游引物与含HindⅢ位点的下游引物进行PCR扩增，获得了分子量大小约为500bp的PLRV-CP基因条带(图4，泳道1-4)。该片段与T载体(pMD18-T)连接，产物转化DH5α感受态，获得了Amp抗性菌落。PCR初步筛选获得的阳性克隆，经测序显示重组质粒中的插入片段就PLRV-CP基因，获得的重组质粒命名为pMD18-LRCP。
3.2PLRV重组CP纯化条件的优化
以构建的重组菌TOP10(pBAD-LRCP-126)为材料，活化后接种于200mLLB液体培养基中，37℃用0.2％L-阿拉伯糖诱导4h，提取包涵体蛋白。
在以往对包涵体溶解的研究中，8mol/L尿素的溶解效果更好，与纯化时配制的结合缓冲液中的尿素浓度相符，因此在包涵体反复用结合缓冲液吹打悬浮溶解后，大多数的蛋白溶入上清液中。
过滤后进行亲和纯化，以往使用的1mL体积的镍柱纯化，为此扩大镍柱的体积，使用5mL体积的纯化柱，每次可以纯化出更多的目的蛋白，收集每mL的洗脱缓冲液，其结果见图3,前3mL洗脱液没有目的蛋白的洗脱(图3泳道4,5,6)，从第4mL开始出现目的蛋白洗脱下来(图3泳道7,8,9,10)，从第8mL则洗脱的目的蛋白减少(图3泳道11)，第9mL已经没有目的蛋白的洗脱(图3泳道12)，因此确定5mL镍柱洗脱液收集中间的5mL。纯化出的洗脱液经过Brandford法定量，蛋白浓度约为1.0-1.3mg/mL，因此，200mL诱导的菌液经过提取和纯化大约可以获得目的蛋白6mg，足够免疫两只新西兰大白兔，获得大量的抗血清。3.3利用pET22b(+)表达PLRV-CP基因及重组CP抗血清的制备
3.3.1PLRV-CP基因原核表达载体的构建
本实验采用pET22b(+)载体表达PLRV-CP基因，以期提高重组CP的表达量及制备效率。
PLRV-CP基因经亚克隆后获得重组质粒pMD18-LRCP，该质粒经双NdeⅠ和HindⅢ酶切后回收PLRV-CP基因小片段；pET22b-PhTPS经过同样的双酶切后回收载体大片段；两个片段连接构建出了PLRV-CP基因的原核表达载体pET22b-LRCP。测序结果显示pET22b-LRCP中的插入片段就是PLRV缺失突变的CP基因，碱基序列没有改变。载体构建符合要求。
3.3.2PLRV-CP基因的原核表达与重组CP的制备
当重组菌BL21(pET22b-LRCP)菌液浓度达到OD600为0.6-0.9时，加入IPTG诱导，37℃震荡培养4h，提取菌体总蛋白，诱导条带清晰(图1泳道2)，且重复性好、表达量高。包涵体经过反复溶解，确保沉淀中的目的蛋白尽量多地溶解到上清液中后，进行纯化，在SDS-PAGE图谱上重组CP表现为单一条带(图1，泳道3)，结果表明获得了高纯度重组CP。
3.4重组CP抗血清的制备
纯化的重组CP经过浓缩与定量，免疫家兔获得了抗血清。纯化的抗原浓缩定量为1mg/mL，稀释100倍，浓度为10μg/mL，抗原包被每孔100μL，即1μg，免疫前血清1:1000稀释，抗血清1:1000稀释后，倍比稀释，间接ELISA在450nm波长下测OD值(图2)，按照抗血清效价≥2.5×阴性值的作为判断效价的标准，由此测出的效价为512K(表1)。
表1PLRV重组CP抗血清效价的测定值(OD450)
按照血清效价值≥2.5×阴性值的标准判断抗血清效价≥512K
附：
(1)627bp的PLRV-CP基因(如序列表SEQIDNO.1所示)及其编码产物(如序列表SEQIDNO.5所示)，下划线标识的序列为删除的126bp序列：
(2)缺失126bp后的的PLRV-CP基因(如序列表SEQIDNO.2所示)及其编码产物(如序列表SEQIDNO.6所示)：
实施例2：一种检测马铃薯卷叶病毒的试纸条，参见图5和图6，图中1为以硬质塑胶薄片条制成的支撑层，样品纤维吸附层2用玻璃棉制成，金标抗体纤维层3用玻璃棉制成，其上附着有胶体金标记的抗PLRV单克隆抗体(W1)，纤维素膜层4用硝酸纤维素膜制成，吸水层5用吸水滤纸制成，将纤维吸附层2、金标抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水层5各层依次粘贴在支撑层1上，彼此拼接的交界处纤维互相交叉渗透。在纤维素膜层4上以抗PLRV多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记隐形检测印迹6(代号T)，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液标记出隐形对照印迹7(代号C)；隐形检测印迹6与隐形对照印迹7的排列形式为“||”。覆盖在样品纤维吸附层2和金标抗体纤维层3上的(测试端)保护膜8-1为白色，在样品吸附纤维层2和金标抗体纤维层3交界处对应的保护膜8-1上偏向于样品吸附纤维层2一侧0.5cm处印有样品标记线9，样品标记线9的右端印有箭头及max字样，吸水层5(手柄端)上覆盖有其它颜色的(如黄色)保护膜8-2。
用于隐形对照印迹的羊(或兔)抗小鼠/羊/牛IgG抗体，及用于检测印迹和金标抗体纤维层的抗PLRV的多克隆抗体和单克隆抗体的制备方法如下：
1)羊抗小鼠IgG的制备
以饱和硫酸铵法提取小鼠血清中的IgG：取1份血清加2份PBS液(pH7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵液混匀，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000r/min离心15min，弃上清液；以适量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵液至其最终浓度为33％，置4℃冰箱内2小时，在4℃、10000r/min条件下离心15min，弃上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS液(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，在4℃、10000r/min条件下离心15min，收集上清液，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度。以50μg～100μg(IgG)/(kg体重)经皮下或肌肉注射抗体阴性健康羊4次，末次免疫20天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取羊抗小鼠的IgG(其提取方法与上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于标记本发明试纸条的隐形对照印迹。
兔抗小鼠、兔抗羊或兔抗牛的IgG抗体的制备与此相同。
2)抗PLRV单克隆抗体的制备
用重组表达的PLRV-CP蛋白溶液免疫Balb/c系小鼠，免疫剂量10μg/200μL.只，共免疫四次，每次间隔28天；第四次加强免疫后3天，将免疫小鼠摘眼球放血，拉颈致死，用75％酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108的脾细胞与2×107～5×107的NS0瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃水浴中缓缓加入0.7～1mL的40％～50％PEG4000(pH8.5～9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(1000μL/孔)，置于37℃5％CO2培养箱中培养10天后，以5μg/mL的纯化PLRV-CPVP7蛋白包被96孔酶标板，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(OD450≥1.0)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92～98，其分泌的抗PLRV-CPVP7的单克隆抗体W1特异地与PLRV反应，而不与甜菜及薯类病毒发生交叉反应，亲和力常数达109～10，用于制备金标单克隆抗体(Wi)。
3)抗PLRV-CPVP7金标单克隆抗体(Wi)和金标单克隆抗体纤维膜的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50～100mL沸腾的0.01～0.05％氯金酸水溶液中加入2～4mL的0.5～2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH值至8.5～9.5，以1:1000～1300的印迹比将待印迹的抗PLRV-CPVP7的单克隆抗体W1加入pH8.5～9.5的金溶胶中，印迹10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃下、1500～3000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下、15000r/min离心1小时，弃上清液，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，分别获得胶体金印迹的抗PLRV–CPVP7的单克隆抗体。将1:100～500稀释的胶体金印迹的上述单克隆抗体吸附于精制玻璃棉(尼龙纤维或聚酯纤维)中，4℃下低温真空干燥，即制得金标单克隆抗体纤维膜。
4)抗PLRV多克隆抗体(Xi)的制备
采用重组表达的PLRV-CP溶液，按2单独多次免疫接种抗体阴性健康羊。末次免疫20天后静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1:2000或1:1024以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵法提取血清中IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)。
5)上述检测试纸条的检测操作方法
a检测样品液的制备取植株叶片(从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子)于塑料袋中，如检测块茎则取幼芽和一小部分基部。向塑料袋中加入体积(mL)约3倍样品重量(g)的PBS缓冲液，用一个厚壁试管或类似物在塑料袋上研磨样品直至样品完全磨碎，置4℃或室温澄清或离心；
b检测操作将检测试纸条测试端插入待检测样品澄清液，插入深度不超过样品标记线9，约30秒后取出试纸条，水平放置约1～5分钟，同时观察结果。
c结果判断如果在检测试纸条纤维素膜上只显示出一条/个棕红色对照印迹C，表示测检结果呈阴性，说明在被检样品液中未检测出PLRV；如果检测试纸条上的纤维素膜出现两条/个棕红色印迹(即出现对照印迹C和检测印迹T)，表示检测结果呈阳性，即说明在待检样品中检测出PLRV；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作有误。
6)所述检测试纸条测试的原理如下：
当该检测试纸条测试端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过层析作用带动待检植物病毒及金标抗体纤维膜中的金标抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端吸水层中，扩散过程中待检病毒可与该病毒相对应的金标单抗相结合，进而与纤维素膜上检测印迹中的抗该病毒的多抗IgG结合，从而显示出棕红色的检测印迹T；而对照印迹中的羊抗或兔抗小鼠IgG则可与金标单抗(Wi)结合，形成棕红色对照印迹C。如果待检样品液中没有PLRV，试纸条只显示出一条/个棕红色对照印迹C；如果纤维素膜上没有任何棕红色印迹显示，则表明试纸条已失效或操作失误。
实施例3：一种检测马铃薯卷叶病毒的试纸条，其结构、制备方法与实施例2基本相同，不同之处在于：样品纤维吸附层2用聚酯纤维制成，金标抗体纤维层3由尼龙纤维制成，上面附着以胶体金标记的抗PLRV-CP金标多克隆抗体(Xi)；纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，以抗PLRV-CP单克隆抗体IgG溶液(Wi)喷涂出1条检测印迹6，并以兔抗羊IgG溶液喷涂出对照印迹7，检测印迹6与对照印迹7的排列形式为“//”。其它包括检测样品的制备、操作方法和结果判定等，均与实施例2相同，不重述。
实施例4：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例2基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3用聚酯纤维制成，其上附着有胶体金标记的抗PLRV-CP单克隆抗体(W1)；纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，上面以对应的抗PLRV-CP多克隆抗体IgG溶液(Xi)标记出一个检测印迹，并以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液印上对照印迹。检测印迹6与对照印迹7的排列形式为“＝”。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例2相同。
实施例5：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例4基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3用尼龙纤维制成，其上附着有胶体金标记的抗PLRV-CP多克隆抗体(W1)；纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，其上以抗PLRV-CP单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出一条检测印迹6，并以兔抗羊IgG溶液标记出对照印迹7，检测印迹与对照印迹的排列组合为“●●”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施例2相同。
实施例6：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条，其结构、制备方法与实施例4基本相同，不同之处在于：金标抗体纤维层3用尼龙纤维制成，其上附着有胶体金标记的抗PLRV-CP单克隆抗体(W1)；纤维素膜层4用聚偏二氟乙烯膜制成，上面以识别另一表位的抗PLRV-CP单克隆抗体IgG溶液(Xi)印制出检测印迹，并以羊(或兔)抗鼠IgG溶液标记出对照印迹，检测印迹与对照印迹的排列组合为“-|”、“+”、“┴”、“：”、“≈”和“︽”中的任意一种。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均与实施2相同。
实施例7：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条结构和实施例2基本相同，不同之处在于：支撑层1由不吸水的硬纸条制成，样品吸附纤维层2由尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜制成，以羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对照印迹。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例2，不重述。
实施例8：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条结构和实施例2基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2由聚酯纤维膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同具体实施方式2，不重述。
实施例9：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条结构和实施例4基本相同，不同之处在于：测试端的样品吸附纤维层2用尼龙纤维制成，纤维素膜层4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纤维膜。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例2，不重述。
实施例10：一种检测马铃薯卷叶病毒试纸条结构和实施例2基本相同，不同之处在于：样品吸附纤维层2用聚酯纤维膜，纤维素膜层4采用纯纤维素膜。
其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例2，不重述。

Claims (10)

1.一种pET22b(+)质粒在提高重组PLRV-CP基因的表达效率的应用，其特征是：所述重组PLRV-CP基因为：从PLRV-CP基因中删除第52-177位核苷酸，其它核苷酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQIDNO.1所示。
2.一种重组载体，其特征是：以pET22b(+)质粒为起始载体，构建重组PLRV-CP基因的原核表达载体，所述重组PLRV-CP基因为：从PLRV-CP基因中删除第52-177位核苷酸，其它核苷酸没有改变，所述PLRV-CP基因如序列表SEQIDNO.1所示。
3.一种重组表达菌，其特征是：其含有权利要求2所述的重组载体。
4.如权利要求3所述的重组表达菌，其特征是：其出发菌株为大肠杆菌BL21。
5.一种采用权利要求2所述的重组载体表达马铃薯卷叶病毒重组CP抗原，其特征是，表达方法包括以下步骤：
(1)将载体片段pET22b(+)与126bp缺失突变后的PLRV-CP基因进行连接，构建得到表达载体pET22b-LRCP；
(2)将步骤(1)中的表达载体pET22b-LRCP转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆，诱导表达重组蛋白；
(3)大肠杆菌菌体总蛋白的提取和包涵体溶解，然后将目的蛋白LRCP进行纯化，即得马铃薯卷叶病毒重组CP抗原。
6.一种采用权利要求5所述的重组CP抗原制备得到马铃薯卷叶病毒重组CP单和/或多克隆抗体。
7.一种采用权利要求6所述的CP单和/或多克隆抗体在制备检测马铃薯卷叶病毒的试纸条的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是：所述试纸条为胶体免疫层析条。
9.一种检测马铃薯卷叶病毒的胶体免疫层析条，包括支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层是由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征是：所述纤维素膜层上标记有权利要求6所述的单和/或多克隆抗体印制的隐形检测印迹，纤维素膜层上还标记有用羊抗小鼠、兔抗小鼠、羊抗牛或兔抗牛IgG溶液印制的隐形对照印迹，所述金标抗体纤维层上附着有与隐形检测印迹对应的以胶体金标记的权利要求6所述的单和/或多克隆抗体。
10.如权利要求9所述的胶体免疫层析条，其特征是：所述纤维素膜层为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜和聚偏二氟乙烯膜中的任意一种制成；
所述样品吸附纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成；
所述支撑层由不吸水的硬质塑胶片或硬纸条制成；
所述吸水层用吸水纸制成；
所述金标抗体纤维层由玻璃棉、尼龙纤维和聚酯纤维中的任意一种制成；
所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水层上敷设有保护膜，且在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上偏向样品吸附纤维层一侧0.3～0.7cm处印制有样品标记线。
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