CN101748136A - 建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法。利用原核表达系统表达建兰花叶病毒的外壳蛋白，用原核表达的建兰花叶病毒外壳蛋白免疫兔子、BALB/C鼠制备其多抗血清，利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体，并用制备的抗体建立了检测CymMV高度特异性、灵敏性和正确性的的免疫捕获RT-PCR及ELISA方法。为该病毒病的诊断、抗病育种和脱毒苗的培育提供技术支持。本发明提供的建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法为建兰花叶病毒的快速检测诊断、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该兰花病毒病的防治打下基础。
Description
技术领域
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法。
背景技术
建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)是严重危害世界各地兰科植物的主要病毒之一。建兰花叶病毒粒子为线状，大小约为475nm×13nm或为490nm×13nm，CymMV基因组核酸为一条线状正链ssRNA。研究发现建兰花叶病毒常与齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)形成复合感染，使兰花叶片形成不规则的褪绿条纹、圆斑、环斑甚至坏死等症状，导致植物生长不良、花小而少，花期缩短，使兰花的观赏价值和经济价值大为下降，近年来，随着兰花产业的发展，该病毒在全球范围内广为传播，给兰花种植业造成极大的损失，在我国海南、广东、浙江、江苏、云南等地也有该病毒的报道。因而迫切需要建立快速、准确、简单方便的检测方法，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产提供技术支撑和物质支持。由于建兰花叶病毒常常与齿兰环斑病毒形成复合感染，故很难通过分离纯化病毒来制备高质量的抗体，本专利通过原核表达系统表达CymMV的外壳蛋白，并利用纯化的蛋白免疫兔子、羊、BALB/C鼠来制备该病毒的多抗血清和单克隆抗体，并建立了检测CymMV的免疫捕获RT-PCR及ELISA的方法。为该病毒病的诊断、分子研究、抗病育种和脱毒苗的培育提供技术支持。本专利运用原核表达系统表达建兰花叶病毒外壳蛋白，并用表达的蛋白制备CymMV特异性抗体，从而使建立的检测CymMV免疫捕获RT-PCR及ELISA血清学方法具有准确性、易标准化和规模等特点。这些检测方法为该病毒病的诊断和防治、脱毒种苗和抗病育种服务。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法。
建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达方法包括如下步骤：
1)根据GenBank中的编码CymMV外壳蛋白基因的全长序列设计引物，上游引物CP-F为5′-CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3′，下游引物CP-R为5′-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3′，上游引物下划线处为BamH I酶切位点，下游引物下划线处为Sal I酶切位点，引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
2)利用Trizol试剂提取建兰花叶病毒兰花病叶的总RNA；
3)RT-PCR克隆CymMV外壳蛋白基因：用下游引物按照RevertAidTM逆转录试剂盒合成CymMV外壳蛋白基因第一链cDNA进行，利用上述设计的一对引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，克隆CymMV外壳蛋白基因；
4)CymMV外壳蛋白基因按正确的读码框插入到原核表达载体pET-32a中，构建成重组原核表达载体pET-32a-CP；
5)将重组载体pET-32a-CP转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株；
6)用IPTG诱导表达4-6h，离心收集菌体，菌体经超声波破碎，收集上清用Ni+NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。
建兰花叶病毒抗体的制备方法包括如下步骤：
1)用权利要求1所述方法表达的建兰花叶病毒外壳蛋白免疫BALB/C鼠、羊和兔子制备多克隆抗体；
2)取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗CymMV病毒的阳性孔；
3)用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗CymMV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；
4)杂交瘤细胞注射入BALB/C鼠腹腔制备单抗腹水；
5)用间接ELISA所述的方法鉴定制备单克隆抗体仅与CymMV病毒有特异性免疫反应，而与其它植物病毒没有任何免疫反应。
所述用权利要求1方法表达的建兰花叶病毒外壳蛋白作为免疫原。所述用于田间CymMV检测、进出口CymMV检疫、病毒分子研究及为抗病育种和脱毒苗的培育服务。所述的用于田间CymMV检测的方法为：免疫捕获RT-PCR、ACP-ELISA、DAS-ELISA或TAS-ELISA。
本发明与现有技术相比具有的优点：
1)提供一种建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备的方法。该专利方法制备的建兰花叶病毒外壳蛋白含量高、纯度好，制备的抗体特异性强、灵敏度高、质量好；利用制备的抗体建立的免疫捕获RT-PCR、ELISA方法能够高度特异、准确、灵敏的检测CymMV；
2)利用本发明所制备的抗体建立的检测CymMV方法，不需要昂贵的电子显微镜设备和专业的技术人员，且费用低；
3)利用本发明所制备的抗体，为该病毒病的诊断、抗病育种和脱毒苗的培育提供物质支持。
附图说明
图1RT-PCR扩增CymMV外壳蛋白基因。1：健康兰花叶子RT-PCR结果；2、3：RT-PCR扩增感染CymMV兰花病叶产物；
图2重组蛋白的SDS-PAGE分析，M：中分子量标准蛋白Marker；1：诱导后含pET-32a空载体的宿主菌；2、3：未纯化的重组蛋白；4、5：纯化的重组蛋白；
图3IC-RT-PCR方法检测CymMV病毒，1-4：CymMV感病兰花；5：健康兰花。
具体实施方式
本发明制备了含量高、纯度好的建兰花叶病毒外壳蛋白，制备了特异性强、灵敏度高、质量好的CymMV抗体，利用制备的抗体建立的免疫捕获RT-PCR、ELISA方法能够高度特异、准确、灵敏、快速检测CymMV，可为兰花脱毒鉴定和抗病育种提供有力的技术和产品支持，对该病毒病的综合防治提供直接的理论依据和技术保障，同时可应用于进出口检验、检疫等方面。
一、CymMV外壳蛋白基因的克隆
根据GenBank中的编码CymMV外壳蛋白基因的全长序列设计引物，上游引物
CP-F为5′-CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3′，下游引物CP-R为5′-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3′，上游引物下划线处为BamH I酶切位点，下游引物下划线处为Sal I酶切位点，引物由上海英俊生物技术有限公司(Invitrogen)合成。利用Trizol试剂提取病样的总RNA，第一链cDNA的合成按照RevertAidTM逆转录试剂盒说明书进行，即模板RNA 2μl，下游引物1μl，RNase Free H2o 9μl。混合后70℃下5min，取出置冰上3-5min；加入4μl5×RT Buffer，2μl dNTP Mix，1μl Rnasin Inhibitor，混合后37℃下5min；加入1μl Reverse Transcriptase，混合后42℃下反应1h，70℃下10min使逆转录酶失活。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：预变性94℃3min，变性94℃45s，退火54℃40s，延伸72℃40s，循环扩增35次，最后延伸72℃10min。扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参考试剂盒说明书进行。将回收的目的基因片段与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为pMD18-T-CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体pMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank。通过RT-PCR方法扩增得到如图1所示约670bp大小的CymMV外壳蛋白基因。序列测定和GenBankBLAST分析表明，克隆到的基因是CymMV外壳蛋白基因。将克隆产物割胶回收后连接到pMD-18T克隆载体上，经PCR和酶切鉴定得到阳性克隆pMD18-T-CP。
二、CymMV外壳蛋白基因原核表达质粒的构建及其诱导表达、纯化
重组质粒pMD18-T-CP中CP基因片段经Sal I和BamH I双酶切后定向插入经同样酶切的pET-32a表达载体中。PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-32a-CP中所携带外壳蛋白基因序列未突变且读码框正确。将重组载体pET-32a-CP和pET-32a空载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑取单菌落接种到含氨卞青霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于含氨卞青霉素抗性的新鲜LB培养基中，振荡培养至OD600≈0.5加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达4h，离心收集菌体。部分菌体加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中处理5-10min，12000rpm离心后取上清10μl进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，并用6×His单克隆抗体进行Western-blot鉴定。其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni+NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。并用TPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测，在约为45kDa处出现一较高浓度的诱导表达条带，与预计的融合蛋白大小相一致(图2A)，Ni+NTA亲和层析柱纯化回收液的SDS-PAGE电泳结果发现，仅在45kDa处有一条明显条带(图2)。进一步利用6×His标签单克隆抗体进行Western-blot分析发现，该表达的重组蛋白和20kDa空载体蛋白均能与6×His单克隆抗体起特异性反应，表明CymMV的外壳蛋白基因已经在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达，并成功进行纯化。
三、表达蛋白的多抗血清制备
纯化的表达重组蛋白经PBS透析后取约300μg的抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，对雄性新西兰大白兔进行背部脊柱两侧以及腹股沟和腋窝两侧进行多点皮下注射免疫。18天后进行二免，二免的免疫剂量为200μg，并与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行皮下注射。以后每隔18天进行加强免疫，加强免疫不加佐剂，并采用大腿肌注的方式免疫。每次免疫后7天取少量血清，用间接ELISA测定抗体的效价，当间接ELISA效价达到1∶100000以上时，取血并分离获得血清100毫升，抗血清于-80℃冰箱中保存备用。
四、CymMV单克隆抗体的制备方法
1.免疫动物
用原核表达的CymMV外壳蛋白免疫四周龄体重18-20g BALB/C雌性小鼠：1mg/ml提取CymMV外壳蛋白0.5-0.7ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2-0.3ml每只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2-0.3ml每只，共加强免疫2次，用加倍剂量的抗原进行末免，3天后取脾细胞进行融合。
2.细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(聚乙二醇，Sigma)作为融合剂，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT筛选培养基(Sigma)悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养器皿中培养。
3.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞培养器皿中培养5天后，用HAT筛选培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获250多个对CymMV有反应的阳性孔，阳性率为40％。选择8个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1A12、6C7和16E2共3株能分泌抗CymMV的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，3株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
4.单克隆抗体的特异性检测
用建兰花叶病毒(CymMV)、齿兰环斑病毒(ORSV)、香石竹斑驳病毒(CarMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、蚕豆萎蔫病毒1(BBWV-1)、蚕豆萎蔫病毒2(BBWV-2)、香石竹环斑病毒(CaRSC)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)病叶汁包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，用间接ELISA法，分别测定3株单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病叶汁分别用包被液稀释成20倍(W/V)后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭30-60min；加入单抗100ul/孔，37℃1-2小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD405的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，3株单抗对CymMV有特异性反应，而与CymMV、ORSV、CarMV、TMV、ToMV、CMV、SCMV、PVY、PVX、BBWV1、BBWV2、TuMV、CaRSC其他病毒均无特异性反应。
5.单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000-5000rpm离心3-5min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30ul/ml腹水)，室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50％饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000-5000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。
6.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b、IgG3，IgM抗体，作双向琼脂扩散试验，结果为，单抗的类型及亚类均为IgG1，3株单克隆抗体的轻链均为κ链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述3株腹水效价均在10-6以上。
7.AP-抗CymMV单克隆抗体结合物的制备
将30mg AP和1.0mg纯化的单克隆抗体混匀于0.5ml PBS(0.01mol/l、PH7.2)，加入戊二醛至终浓度为0.2％，于室温下温和搅拌2小时。反应物中加入10mMTris-HCL(pH8.0，0.15M NaCl，1MM MgCl2)至1ml，然后用上述Tris-HCL缓冲液于4C流动透析24小时。透析以后的产物即为AP-单克隆抗体结合物，结合物中加入灭菌甘油至50％(V/V)，于-20℃保存备用。
8.单克隆抗体识别位点分析
3ug/ml抗原(提纯CymMV外壳蛋白)100ul/孔于96孔ELISA板中，4℃包被过夜；用PBST洗涤三次，2％BSA 150ul/孔37℃，封闭1小时，加一种单抗腹水50ul及AP标记的另一种单抗50ul，37℃1小时；PBST洗涤三次后加硝基苯磷酸盐底物100ul/孔，37℃20分钟，OD405测定吸收值。以单抗腹水对同一AP标记的单抗抑制为100％，以已知无关单抗腹水对标记单抗的抑制为阴性对照，计算各单抗间的抑制率。即抑制率为(1-测定值OD/阴性对照值OD)X100。抑制率＞75％为相关，＞50％为不完全相关，＜50％为不相关，＜25％为完全不相关，结果表明3株抗CymMV单抗识别3个不相关的抗原结合位点。
9.用单抗建立间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法检测病毒
ACP-ELISA方法的操作步骤
(1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)30倍稀释的病叶汁液100ul/孔加入ELISA板，CYMMV病叶为阳性对照，相应健叶为阴性对照，37℃2h，或4℃过夜；
(2)PBST洗涤后用5％脱脂奶粉封闭30min；
(3)单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃1h；
(4)PBST洗涤后加入5000倍稀释的AP标记的羊抗鼠IgG结合物(Sigma)，100ul/孔，37℃，1h；
(5)用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；
(6)用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用酶联免疫检测仪测OD405值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
ACP-ELISA方法检测灵敏度检测
单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1∶5至2560作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶500000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1∶5～500倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶500，ACP-ELISA方法对纯病毒的检测灵敏度可达2ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.2ng。表现ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
10.CymMV的单抗DAS-ELISA检测方法
l)抗CymMV的一株单抗5000倍稀释100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；
2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min
3)加入检测样品100ul/孔。以CymMV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃1-2h；
4)PBST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记另一单抗结合物100ul/孔，37℃1-2h
5)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
DAS-ELISA方法检测灵敏度检测
对病叶从1∶5至5120作倍比稀释，提纯病毒(5mg/l)从1∶1000至1∶1024000作倍比稀释，分别以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述DAS-ELISA方法检测。结果表明DAS-ELISA方法对1∶5～1000倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1∶1000，DAS-ELISA对纯病毒的检测灵敏度可达0.2ng/ml，每孔的病毒绝对量检测为0.02ng。表现DAS-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。
11.CymMV的TAS-ELISA检测方法
11.1.TAS-ELISA方法的操作流程：
1)将抗原核表达的外壳蛋白的兔多抗血清100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；
2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min
3)加入检测样品100ul/孔。以CymMV为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃1-2h；
4)洗涤后用封闭液稀释的单抗腹水100ul/孔，37℃1-2h
5)PBST洗涤后加入10000倍稀释碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗结合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h
6)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，2mol/L氢氧化钠终止反应后，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性或用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N＞2.1作为阳性判断标准。
11.2.TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：
采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向加多抗血清用包被缓冲液从1∶100至1∶102400倍比稀释；CymMV 1ug/ml；纵向加用PBST缓冲液从1∶5至1∶2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为CymMV的兔抗血清最适稀释度均为1∶6000；1A12、6C7和16E2的最适稀释度分别为1∶8000，1∶10000，1∶6000，1∶6000。
11.3.TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定
在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将1ug/ml的CymMV用含1-3％BSA的PBST倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA检测3株单抗的灵敏度均在0.01ng以上，说明本方法具有很好的灵敏度。
12.上述ELISA方法的田间检测CymMV的应用
利用制备的抗体建立的上述ELISA方法对田间兰花进行检测。在浙江丽水地区兰花上采收呈病毒症状的病样，作1∶30倍稀释，然后进行上述ELISA检测，用健株汁液作阴性对照，接种CymMV的汁液作阳性对照。检测结果表明，兰花上CymMV的带毒率很高，31.2％样品呈阳性，与电镜观察检测结果一致，这表明所制备的抗体和建立的上述ELISA方法能很好的用于田间CymMV的检测，同时，明确了CymMV病毒是田间兰花上流行的主要病毒种类。13.免疫捕获反转录PCR(Immunocapture RT-PCR，IC-RT-PCR)检测CymMV
以上游引物CP-F：5′-CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3′，下游引物CP-R：5′-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3′为引物。200μl的抗体(多抗1∶500倍稀释，单抗1∶200倍稀释)包被PCR管，37℃孵育2h；移去包被液，用PBST洗3次，每次3min；加入200μL病叶汁液上清(1g鲜叶+2mL 0.02mol/L PBS，pH 7.2研磨，3000r/min离心2min)，以健康和感染CymMV的兰花叶片分别作为阴性和阳性对照，37℃孵育2h或4℃过夜；移去抗原液，用PBST洗3次，ddH2O洗1次，洗毕作短暂离心，吸去管底余液；往管中加入ddH2O19μL、5×RT buffer 8μL、10mmo/L dNTP 4μL、100mmol/L DTT 4μL、20μmol/L3′primer 2μL、稍离心混匀后置94℃变性4min，迅速置冰上3min；往管中加入AMV(200U/μL，Promega)2μL、RNasin(20U/μL，Promega)1μL，反应总体积40μL，稍离心混匀后置42℃反转录1h；取10μL反转录产物，加入10×PCR buffer 5μL、10mmol/L dNTP 1μL、20μmol/L 5’primer 1μL、20μmol/L 3′primer 1μL、Taq plus IDNA聚合酶(5U/μL，Sangon)0.5μL、ddH2O 31.5μL，反应总体积50μL，混匀后进行PCR扩增。扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性45s，54℃退火40s，72℃延伸40s，30循环，最后一次循环后，72℃补平延伸10min；PCR结束后，取5μL反应产物进行1％琼脂糖电泳及扩增的DNA片段核酸测序验证IC-RT-PCR检测结果。琼脂糖凝胶电泳结果显示用CymMV外壳蛋白的特异性引物可以从CymMV感染兰花叶片的液汁中扩增到大小约为670bp的特异性条带，与预期的外壳蛋白基因条带大小一致，而健康兰花的液汁中未能扩增到任何条带(图3)。扩增到的基因割胶回收后进一步测序表明，扩增到的DNA片段是CymMV的外壳蛋白基因。
Claims (5)
1.一种建兰花叶病毒外壳蛋白基因的表达方法，其特征在于包括如下步骤：
1)根据GenBank中的编码CymMV外壳蛋白基因的全长序列设计引物，上游引物CP-F为5′-CGGGATCCATGGGAGAGCCCACTCCA-3′，下游引物CP-R为5′-CGGTCGACTTATTCAGTAGGGGGTGCAG-3′，上游引物下划线处为BamHI酶切位点，下游引物下划线处为SalI酶切位点；
2)利用Trizol试剂提取建兰花叶病毒兰花病叶的总RNA；
3)RT-PCR方法克隆CymMV外壳蛋白基因：用下游引物按照RevertAidTM逆转录试剂盒合成CymMV外壳蛋白基因第一链cDNA，利用上述设计的一对引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，克隆CymMV外壳蛋白基因；
4)CymMV外壳蛋白基因按正确的读码框插入到原核表达载体pET-32a中，构建成重组原核表达载体pET-32a-CP；
5)将重组载体pET-32a-CP转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株；
6)用IPTG诱导表达3-6h，离心收集菌体，菌体经超声波破碎，收集上清用Ni+NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。
2.一种建兰花叶病毒抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)用权利要求1所述方法表达的建兰花叶病毒外壳蛋白免疫BALB/C鼠、兔子或羊动物制备多克隆抗体；
2)取免疫BALB/C鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇融合剂下融合，HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗CymMV病毒抗体的阳性孔；
3)用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗CymMV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；
4)杂交瘤细胞注射入BALB/C鼠腹腔制备单抗腹水；
5)用间接ELISA方法鉴定制备单克隆抗体仅与CymMV病毒有特异性免疫反应，而与其它植物病毒没有任何免疫反应。
3.根据权利要求2所述的一种兰花建兰花叶病毒抗体的制备方法，其特征在于用权利要求1所述方法表达的建兰花叶病毒外壳蛋白作为免疫原。
4.一种如权利要求2所述方法制备的CymMV病毒抗体的用途，其特征在于用于田间CymMV检测、进出口CymMV检疫、病毒分子研究及为抗病育种和脱毒苗的培育服务。
5.根据权利要求4所述的一种CymMV病毒抗体的用途，其特征在于所述的用于田间CymMV检测的方法为：免疫捕获RT-PCR、ACP-ELISA、DAS-ELISA或TAS-ELISA。
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