CN105753947A - 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用 - Google Patents

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

一种检测牛传染性鼻气管炎的试纸条，包括PVC背板、样品垫、金标垫、纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1中的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；所述纤维素膜上的检测线和质控线分别包被有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白和兔抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗体。该试纸条检测牛血清样本中的传染性鼻气管炎病毒抗体，具有灵敏度高，特异性好，检测快速方便，容易使用且无需特殊仪器设备的特点，可以在10min检出结果，非常方便在基层养殖单位中推广使用。

Description

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及到一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎（infectiousbovinerhinotracheitis，IBR）是由牛疱疹病毒1型（BHV-1）引起的牛的一种急性接触性传染病。临床上分呼吸道、生殖道、脑、结膜等多种感染类型，危害犊牛、母牛和公牛，该病死亡率较低，多呈亚临床经过，但易继发细菌感染，导致支气管肺炎等严重呼吸道疾病，对牛群有较大危害。根据王志亮等（2011）对来自北京、天津、陕西、山西、山东、新疆、河南、河北等地l1个奶牛场的996份血清样品进行IBRV抗体检测，共检出阳性血清120份，检出的群阳性率为77.8%，最高阳性率达55.0%，最低阳性率为0%，平均阳性率为12.1%，即测试牛场中大部分都不同程度的存在IBRV感染。由此可见IBRV发病率高，在我国分布极广。
IBRV基因组为线性双股DNA，整个基因组编码33个结构蛋白和15个非结构蛋白，其中四个糖蛋白gB、gC、gD和gE是IBRV的主要抗原，而gD蛋白被认为是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，是IBRV的主要结构蛋白，也是IBRV复制的必需基因，刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白，它不但诱导体液免疫，而且诱导细胞免疫，是目前IBRV特异性诊断的主要抗原。
常规的IBRV的诊断检测主要有于经典的病毒分离培养、免疫荧光、ELISA和分子生物学检测手段如PCR等，这些均需依赖仪器设备及专业实验人员的精细操作，要么成本高昂，要么耗时耗力，无法在基层牧场开展。
发明内容
本申请的目的在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白。
本发明还要解决技术问题为提供上述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的应用
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的核酸序列为SEQIDNo.1所列的序列，其氨基酸序列为SEQIDNo.2所列的序列。
本发明的另外一个目的在于提供一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的应用。
一种所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白在制备牛传染性鼻气管炎中检测物的应用。
进一步，本发明的目的还在于提供所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白制备牛传染性鼻气管炎试剂盒中的应用。
此外，本发明还提供了一种检测牛传染性鼻气管炎的试纸条，包括PVC背板、样品垫、金标垫、纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的上述技术方案中的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；所述纤维素膜上的检测线和质控线分别包被有牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白和兔抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗体。
此外，本发明还提供了一种利用牛传染性鼻气管炎的胶体金试纸条检测方法，方法操作简易，适合于基层应用。
为了达到上述目的，本发明采取了以下的技术措施：
（1）通过昆虫细胞杆状病毒系统重组表达的方式获得牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白并纯化：参照GenBank中登记的IBRV基因序列设计引物，并引入EcoRⅠ和HindIII酶切位点。gD基因片段以pUC-gD质粒为模板，用PCR方法扩增。纯化的PCR产物与表达载体pFastBacHT-B双酶切后，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化感受态细胞，制备阳性重组质粒，并转座DH10Bac感受态细胞，筛选阳性克隆后，提取Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒，鉴定后纯化备用。
（2）重组gD蛋白的纯化：将重组杆状病毒以MOI0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行，纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量后分装，-80℃保存备用。
（3）重组gD蛋白的标记：采用柠檬酸还原法制备胶体金，用常规手段将其与纯化的gD蛋白标记。
（4）胶体金试纸条的制备及组装；
（5）利用胶体金试纸条检测牛血清样本中的传染性鼻气管炎病毒抗体。
本发明的有益效果为：该试纸条以双抗原夹心法为原理，检测牛血清样本中的传染性鼻气管炎病毒抗体，具有灵敏度高，特异性好，检测快速方便，容易使用且无需特殊仪器设备的特点，可以在10min检出结果，非常方便在基层养殖单位中推广使用。
附图说明
图1：重组gD蛋白表达鉴定图
图2：胶体金试纸条组装图
图3：胶体金试纸条检测结果图
背板1；金标垫2；样品垫3；硝酸纤维膜4；吸水垫5；质控线6；检测线7。
具体实施方式
以下为结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均应涵盖在本发明的保护范围之内，本发明实施例所用试剂，如未特殊说明，均购自生化试剂供应商，所用实验技术，如未特别说明，均为常规技术。
实施例1：牛传染性鼻气管炎病毒的gD蛋白克隆表达及纯化
（1）gD蛋白克隆表达及鉴定：
参照GenBank中登录的IBRV基因序列设计引物，其上游引物gD-F为SEQIDNo.3所列的序列，其下游引物gD-R为SEQIDNo.4所列的序列，用于克隆gD基因片段，在上、下游引物中引入了EcoRⅠ和HindIII酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。gD基因片段以pUC-gD质粒为模板，用PCR方法扩增。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火条件为55.6℃45s，72℃延伸2min，30个循环后，再72℃延伸7min，4℃终止反应。纯化的PCR产物与表达载体pFastBacHT-B分别进行双酶切后，用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞。阳性重组质粒命名为pFastBacHT-gD。将阳性重组质粒转座DH10Bac感受态细胞，通过用KTG抗生素和蓝白斑筛选阳性克隆，提取Bacmid，转染SF9昆虫细胞，观察转染后的细胞病变并收集重组杆状病毒。培养上清和细胞裂解液煮样后进行SDS-PAGE电泳，通过湿法转印至NC膜上。经5%脱脂奶粉封闭后一次加入一抗（IBRV阳性血清，1：100）和二抗（兔抗牛IgGHRP，1：3000），最后加入底物显色。
其鉴定如图1所示：M代表蛋白Marker，1代表SF9上清，2代表细胞，3代表流穿液；4代表洗涤液，5代表洗脱产物。
（2）gD蛋白纯化：
将重组杆状病毒以MOI0.1感染SF9昆虫细胞，4d后5000r/min离心10min收集上清。目的蛋白的纯化参照Ni-NTA纯化系统说明书进行，纯化后的蛋白用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白含量后分装，-80℃保存备用。
实施例2：牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白胶体金标记
按照常规手段，采用柠檬酸三钠还原法制备得到40nm的胶体金颗粒溶液，调节pH值至9.0备用。取一定量的胶体金颗粒溶液，置于磁力搅拌器上，然后将纯化后的gD蛋白抗原以PBS按照1:2000的比例稀释后加入胶体金溶液中搅拌反应60分钟，然后将PEG20000溶液加入混合反应液中，使PEG的最终浓度约为1%，置于冷冻离心机（4℃）上高速离心（速度为11000~13000rpm）10分钟后弃去上清液。将下层沉淀用PBS反复洗涤并继续离心弃去多余上清液。最后将沉淀物以PBS缓冲液重悬，使最终的蛋白浓度约为50μg/mL左右，保存于4℃备用。
实施例3：胶体金试纸条组装
以PVC背板（1）为支撑物，在其上分别贴有硝酸纤维膜（4）、金标垫（2）、样品垫（3）、吸水垫（5）。其中金标垫（2）采用聚酯膜，经含有1%BSA和1%吐温-20的PBS处理后，将制备好的胶体金标记gD抗原按照40μL喷涂，完毕，37oC度烘干2h备用。
样品垫（3）采用聚酯纤维垫，采用自制含有表面活性剂的处理液浸泡后烘干备用。
硝酸纤维膜（4）上包被有两条线：分别为质控线（6）和检测线（7），其中检测线包被物为检测抗原gD，质控线包被物为兔抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗体（自制），分别将检测抗原和抗体用含有1%BSA的PBS稀释成浓度为0.8mg/mL和1.2mg/mL的溶液，然后用Biodot划膜仪喷涂于硝酸纤维膜上，完毕，37oC度烘干1h备用。
试纸条的组装按照图3模式进行。组装好的大板用切条机切成7-8mm的裸条备用。
实施例4：利用试纸条检测牛血清中的IBRV抗体
（1）采样：用采血针（BD产品）采集牛尾静脉血于无菌采血管中，析出血清后备用。如果不能及时检测，样品可以冷藏于4oC内不超过24h。长期保存需分装后冻存于-20oC。
（2）样本的稀释：检测之前，将样本恢复至室温（19-25oC），如从冷藏环境中取出后至少在室温放置30min以上。利用pH7.20.1MPBS按照1：50的比例稀释样本，混匀后备用。
（3）检测：将准备好的样品用微量移液器吸取200μL至反应微孔中，插入准备好的试纸条，确保样品垫朝下插入溶液中，开始计时。
（4）判断：计时5-8min后，根据试纸条显色判定检测结果。试纸条显示两条线，表明检测样本中有IBRV抗体存在，样本为阳性；试纸条为一条线，即质控线显色，而检测限不显色，表明样本中不含有IBRV抗体，样本为阴性。
注意：当检测线不清楚，或者有弱影存在时，表明样本为可疑样本，需要重新测试或用其他方法进一步复核检测。
虽然上面的举例了一些特定实施例来说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅局限于其中的各种细节。相反地，在等价于权利要求书的范畴和范围内可以不偏离本发明精神地在各种细节上做出各种修改。
SEQUENCELISTING
<110>北京纳百景弈生物科技有限公司
<120>牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白及其应用
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>666
<212>DNA
<213>制备该牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的基因片段
<400>1
atggagagcgggtgcgcccggccgctgtactacatggagtacaccgagtgcgagcccagg60
aagcactttgggtactgccgctaccgcacacccccgttttgggacagcttcctggcgggc120
ttcgcctaccccacggacgacgagctgggactgattatggcggcgcccgcgcggctcgtc180
gagggccagtaccgacgcgcgctgtacatcgacggcacggtcgcctatacagatttcatg240
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ctcacgcagtactacccgcaggaggcacacaaggccatagtcgactactggttcatgcgc420
cacgggggcgtcgttccgccgtattttgaggagtcgaagggctacgagccgccgcctgcc480
gccgatgggggttcccccgcgccacccggcgacgacgaggcccgcgaggatgaaggggag540
accgaggacggggcagccgggcgggagggcaacggcggccccccaggacccgaaggcgac600
ggcgagagtcagacccccgaagccaacggaggcgccgagggcgagccgaaacccggcccc660
agctaa666
<210>2
<211>221
<212>PRT
<213>牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白
<400>2
MetGluSerGlyCysAlaArgProLeuTyrTyrMetGluTyrThrGlu
151015
CysGluProArgLysHisPheGlyTyrCysArgTyrArgThrProPro
202530
PheTrpAspSerPheLeuAlaGlyPheAlaTyrProThrAspAspGlu
354045
LeuGlyLeuIleMetAlaAlaProAlaArgLeuValGluGlyGlnTyr
505560
ArgArgAlaLeuTyrIleAspGlyThrValAlaTyrThrAspPheMet
65707580
ValSerLeuProAlaGlyAspCysTrpPheSerLysLeuGlyAlaAla
859095
ArgGlyTyrThrPheGlyAlaCysPheProAlaArgAspTyrGluGln
100105110
LysLysValLeuArgLeuThrTyrLeuThrGlnTyrTyrProGlnGlu
115120125
AlaHisLysAlaIleValAspTyrTrpPheMetArgHisGlyGlyVal
130135140
ValProProTyrPheGluGluSerLysGlyTyrGluProProProAla
145150155160
AlaAspGlyGlySerProAlaProProGlyAspAspGluAlaArgGlu
165170175
AspGluGlyGluThrGluAspGlyAlaAlaGlyArgGluGlyAsnGly
180185190
GlyProProGlyProGluGlyAspGlyGluSerGlnThrProGluAla
195200205
AsnGlyGlyAlaGluGlyGluProLysProGlyProSer
210215220
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>上游引物gD-F
<400>3
ccggaattcatggagagcgggtgcgcc27
<210>4
<211>27
<212>DNA
<213>下游引物gD-R
<400>4
cccaagcttttagctggggccgggttt27

Claims (4)

1.一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白，其特征在于，制备该牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的基因片段如SEQIDNo.1所示，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的蛋白序列如SEQIDNo.2所示。
2.一种根据权利要求所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白在制备牛传染性鼻气管炎检测装置中的应用。
3.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白在制备牛传染性鼻气管炎试剂盒中的应用。
4.一种检测牛传染性鼻气管炎的试纸条，包括PVC背板、样品垫、金标垫、纤维素膜、吸水垫，其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1中所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白；所述纤维素膜上的检测线和质控线分别包被有权利要求1中所述的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白和兔抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗体。
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