CN107312087B

CN107312087B - 一种抗ibrv的单链抗体、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN107312087B
Application number: CN201710388492.XA
Authority: CN
Inventors: 李永清; 许健; 吴靖; 黄秀芬
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-05-27
Filing date: 2017-05-27
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2037-05-27
Also published as: CN107312087A

Abstract

本发明提供了一种抗IBRV的单链抗体，由SEQ ID NO.1所示重链可变区、SEQ ID NO.2所示轻链可变区及连接二者的连接肽组成的蛋白质，其具有抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD蛋白抗体的特性。本发明还提供了所述单链抗体的制备方法。本发明的单链抗体能特异性地结合IBRV，也能在Western‑blot中特异性结合大肠杆菌表达产物中的IBRV gD蛋白；间接免疫荧光试验显示该单链抗体能够识别感染在牛肾细胞MDBK中的IBRV，将其应用在牛传染性鼻气管炎的检测与治疗制剂的研制中具有良好的应用价值。

Description

一种抗IBRV的单链抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗IBRV的单链抗体、其制备方法及应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)的危害养牛业的重大传染病，在国内外的养牛场广泛流行。IBRV为α疱疹病毒成员，能在牛的神经节细胞潜伏并导致持续性感染，以至于即使高效的疫苗也无法根除潜伏在牛体内的病毒，因此只能利用抗病毒制剂来杀灭和清除细胞内的病毒。目前普遍使用的抗疱疹病毒制剂包括化学药物和生物制剂。化学药物的毒副作用和药物残留不仅对动物本身，而且对畜产品的安全有很大的危害。

在诸多治疗性生物制剂里，抗体是最直接和有效的动物疫病治疗工具，然而传统方法制备的抗体如康复动物的血清、卵黄抗体以及单克隆抗体，由于其成分复杂以及异源动物间的免疫排斥现象，已经越来越不适合临床实践了。且其传统方法制备的抗体用于检测试剂的使用时，制备的检测试剂灵敏度低，交叉反应严重，易出现假阳性结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗IBRV的单链抗体，其能特异性识别IBRV的gD蛋白单链抗体，具体在ELISA中能特异性地结合IBRV，也能在Western-blot中特异性结合大肠杆菌表达产物中的IBRV gD蛋白，而且，在间接免疫荧光试验(IFA)中能够识别感染在牛肾细胞MDBK中的IBRV；本发明的另一个目的是提供制备抗IBRV的单链抗体的制备方法，本发明的再一个目的是提供抗IBRV的单链抗体的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种抗IBRV的单链抗体，其为由SEQ ID NO.1所示重链可变区、SEQ ID NO.2所示轻链可变区及连接二者的连接肽组成的蛋白质。

所述的连接肽是一段柔性氨基酸序列，合适的连接肽有助于重链可变区与轻链可变区空间结构的形成，对单链抗体的表达量、稳定性、可溶性、亲和力、特异性以及聚集状态等产生影响。在本发明中优选地所述连接肽的序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，本发明提供编码所述单链抗体的基因，在本发明一个优选的实施方式中所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，本发明提供表达抗IBRV单链抗体的表达载体，所述表达载体含有编码所述单链抗体的基因，在本发明一个优选的实施方式中所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步，本发明提供用于表达抗IBRV单链抗体的宿主，所述宿主上述的表达载体。

进一步，本发明提供一种用于制备如上所述单链抗体的制备方法，包括下述步骤：

a)用包含核苷酸分子的载体转化宿主细胞，所述核苷酸分子编码如上所述的单链抗体；

b)在容许所述单链抗体分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并且

c)自培养物回收所述单链抗体分子。

本发明的另一方面，还提供了如上所述单链抗体在用于检测牛传染性鼻气管炎病毒中的应用。用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的应用，包括所述单链抗体用于免疫学方法检测牛传染性鼻气管炎病毒。

优选地，所述免疫学方法为ELISA、Western-blot或间接免疫荧光法。需要注意的是，如上所述的用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法是非诊断性检测方法。

本发明的另一方面，还提供了如上所述单链抗体在用于制备检测牛传染性鼻气管炎病毒检测试剂中的应用。

如上所述的应用，所述检测试剂包括ELISA、Western-blot或间接免疫荧光检测试剂。

本发明的另一方面，还提供了如上所述单链抗体在制备用于治疗牛传染性鼻气管炎治疗剂中的应用。

本发明还提供含有所述单链抗体的检测试剂、含有所述单链抗体的治疗制剂。

本发明的有益效果为：

本发明提供的单链抗体是抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白单链抗体，其是由抗体重链可变区和抗体轻链可变区通过一段连接肽连接而成的一种小分子基因工程抗体，其单链抗体的表达产物经纯化后获得分子约为30kD的蛋白，其能够特异性识别IBRV的gD蛋白，不仅具备完整抗体与IBRV抗原特异性结合的特性，还具有易于构建和大规模表达、分子量小、穿透力强、免疫原性低等优点。

本发明提供的单链抗体能在ELISA中特异性地结合IBRV，能在Western-blot中特异性结合大肠杆菌表达产物中的IBRV gD蛋白，在间接免疫荧光试验(IFA)中能够识别感染在牛肾细胞MDBK中的IBRV，其能被His标签抗体特异性结合，还具备有比抗IBRV的gD蛋白的单克隆抗体更优的特性，其将在牛传染性鼻气管炎的检测与治疗制剂的研制中具有良好的应用价值。

附图说明

图1为本发明的实施例1中ScFv-VH-VL基因的PCR扩增电泳结果图。

图2为实施例1制备的ScFv-VH-VL重组蛋白的蛋白电泳图。

图3为纯化后的ScFv-VH-VL重组蛋白的蛋白电泳图。

图4为单链抗体用于Western-blot检测gD蛋白的表达结果。

图5为单链抗体用于IFA检测MDBK中感染的IBR病毒的结果图。

图6为单链抗体用于抗原捕获ELISA检测IBRV与单抗比较结果示意图。

图7为单链抗体用于ELISA检测不同病毒的特异性的结果图。

具体实施方式

本发明经过发明人大量的研究发现，牛传染性鼻气管炎病毒的gD糖蛋白位于IBRV囊膜及感染细胞的表面，是IBRV病毒表面的主要糖蛋白之一，在病毒吸附、侵入宿主细胞的过程中发挥着重要作用，不仅能诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，因此本发明在制备了抗gD的单克隆抗体的基础上，利用RT-PCR从抗gD单克隆抗体杂交瘤细胞的RNA中获得单链抗体基因，然后利用大肠杆菌表达系统制备抗IBRV的单链抗体，并进一步应用试验鉴定了其生物学活性和价值。

具体地，采用RT-PCR方法，以自行设计的兼并引物，从分泌抗牛传染性鼻气管炎(Bovine Infectious Rhinotracheitis Virus，IBRV)gD蛋白的杂交瘤细胞中扩增出单链抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因，通过重叠延伸PCR及Linker序列即引入一段柔性肽连接重链可变区和轻链可变区两个片段，获得完整的单链抗体基因，将该单链抗体基因克隆至pET-28a载体并将其转化BL(DE3)大肠杆菌中进行诱导表达，表达产物经纯化后获得分子约为30kD的单链抗体蛋白。其中，重链可变区的氨基酸序列为SE Q ID NO.1：GSMEVKLQQSGGGLVQPGESLKLSCESNECEFPSYNISWVRKTPGKSLDLVAAIKSGYYVDTMERRFIISRDNTKKTLYLQMSSLRSEDAALYYCARRGIITTIGAKGPRSPSPQ，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.2：DIVMTQTPLSLSVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYFEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCSQGSLIPFTFGSGTKLEIKR，柔性肽即连接肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.3：GGGGSGGGGSGGGGS。通过Western blot分析了该单链抗体能特异性结合gD蛋白，运用ELISA检测了该单链抗体能特异性的结合IBRV，并且通过IFA证明了该单链抗体与MDBK细胞中的IBRV也能发生特异性结合，说明该重组的单链抗体蛋白分子具备了常规抗体的结合活性，并利用实验进一步证明由该单链抗体制备的检测试剂具有检测灵敏度高，无非特异性交叉反应，检测结果准确，无假阳性结果。

下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1单链抗体VH-VL蛋白的制备

以往获取单链抗体基因均是通过构建单链看抗体噬菌体展示文库，其费力费时，本发明是从分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取细胞总RNA后，反转录cDNA作为模板，采用PCR引物分别扩增抗体的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)后，然后挑取了100个克隆子进行了测序和比较，筛选出重复性最高的3-4个基因，采用连接肽将VH及VL进行连接成为完整的ScFv基因后，构建于PET28a表达载体后，转化表达菌制备重组的ScFv蛋白。

具体操作如下：

其中，本实施例中所用的实验材料可采用如下来源的材料：抗gD单克隆抗体杂交瘤细胞、MDBK细胞、pET-28a载体为北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术研究室保存，plB-simple-vector载体购自天根生化科技公司，TOP10感受态细胞、BL(DE3)感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司；RNeasy Mini Kit、QIAquick PCR Purification Kit、QIAprep Spin Miniprep Kit、Plasmid Maxi Kit及Gel Extraction Kit均购自QIANGEN公司，FastQuant RT Super Mix FastQuant cDNA第一链合成预混试剂、DNA marker DL2000、DNA marker DL15000、PCR相关试剂购自天根生化科技公司，DpnI酶、BseRI酶、BamHⅠ酶、XhoⅠ酶购自NEB公司；鼠抗His单克隆抗体、羊抗鼠-IgG-HRP购自SIGMA公司。

1、重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的扩增

按照RNeasy Mini Kit的操作步骤提取抗gD单克隆抗体杂交瘤细胞的总RNA，gD单抗杂交瘤细胞cDNA第一链的合成使用FastQuant RT Super Mix FastQuant cDNA第一链合成预混试剂，以cDNA为模板PCR扩增VH及VL基因，PCR反应体系为：10×pfu Buffer 10μL，FP4μL，RP 4μL，模板4μL，dNTP Mixture 8μL，pfu聚合酶2μL，ddH₂O补足至100μL。扩增VL的PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min。其中，扩增VL时，扩增体系的上游引物为VL-F，下游引物为VL-R1、VL-R2、VL-R3、VL-R4按照等比例混合后的兼并引物；扩增时将VL-R1、VL-R2、VL-R3、VL-R4等量混合成VL-R-Mix，再以VL-F及VL-R-Mix为引物进行PCR扩增。扩增VH的PCR退火温度为58℃，其余条件与VL的PCR一致，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中，扩增VL的引物为VL-R、VL-F。扩增所用引物的核苷酸序列见表1。

2、VH-Linker-VL基因的获取

PCR产物切胶回收后连接plB-simple-vector并转化Top 10感受态细胞，挑取菌液PCR鉴定为阳性的克隆子送往北京生工公司测序鉴定。提取测序鉴定正确的克隆子的质粒。以阳性VH、VL质粒为模板，Bamh1-VH-F、Linker-VH-R、xho1-VL-R、Linker-VL-F为引物通过重叠延伸PCR构建VH-Linker-VL基因，PCR产物切胶回收后连接plB-simple-vector转化Top10感受态细胞并提取阳性质粒，其所用引物的核苷酸序列见表1。

以gD单抗杂交瘤细胞的cDNA为模板扩增得到VH及VL基因，其中VH基因为334bp，VL基因为339bp，通过重叠延伸PCR将连接肽的基因，将VH及VL基因连接，得到VH-Linker-VL基因也就是单链抗体(ScFv)基因，即ScFv-VH-VL基因，其片段大小为738bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，片段大小与预期一致，电泳结果如图1所示，其中，图1中M：DNA分子质量标准；1：VH的PCR扩增产物；2：VL的PCR扩增产物；3：重叠延伸PCR构建的ScFv-VH-VL。ScFv-VH-VL的基因序列编码的氨基酸如SEQ ID NO.1、3、2序列所示。ScFv-VH-VL的基因序列也可以通过序列合成的方式或其他方式获得。

表1扩增单链抗体基因的引物表

注：VH-R、VL-F为简并引物，R/S/M/W字母代表的为不同碱基的组合，其中R表示为A/G，K表示为G/T，S表示为G/C；M表示为A/C，W表示为A/T。

3、pET-28a-scfv表达载体的构建

酶切pET-28a载体及plB-VH-Linker-VL质粒，酶切体系为：Neb Buffer 3.12μL，Bamh1酶1μL，Xho1酶1μL，质粒6μL，ddH₂O补足至20μL。37℃酶切3小时后胶回收pET-28a载体及VH-Linker-VL基因并连接载体及目的片段，连接体系为：酶切回收的pET28a 1.5μL，VH-linker-VL 1μL，T4 DNA ligase 1μL，T4 DNA ligase buffer 1μL，ddH₂O补足至10μL，配好上述体系后于16℃过夜连接，将连接产物全部转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取菌液PCR鉴定为阳性的克隆子送往北京生工公司测序鉴定。

4、重组蛋白的表达

挑取测序鉴定为阳性的BL21(DE3)表达菌接种于LB液体培养基，37℃，180rpm振荡培养过夜，再以1:100接种于LB液体培养基，当OD600达到0.6～0.8时加入IPTG诱导6h，同时对含pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，作阴性对照。

5、重组蛋白的鉴定

(1)取诱导表达蛋白的菌液离心收集菌体沉淀，用PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，加入5×蛋白上样buffer煮沸10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶染色30min，用脱色液脱色直至背景清楚，观察结果。同时设pET28a空载体对照，其结果显示，表达的重组蛋白大小约为30kD，与预期的大小一致。结果如图2、图3所示，在图2中，M：预染蛋白质分子质量标准；1：pET28a空载体表达菌；2：ScFv-VH-VL重组蛋白表达菌；3：pET28a空载体表达菌与抗His单克隆抗体结合；4：ScFv-VH-VL重组蛋白表达菌与抗His单克隆抗体结合。

(2)进行Western-blot鉴定时，菌液样品进行12％SDS-PAGE凝胶电泳后转印至PVDF膜，用5％脱脂奶封闭以1:5000稀释的鼠抗His单克隆抗体以及1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG进行免疫印迹，用ECL化学发光试剂盒显色。结果表面表达的重组蛋白能特异性和鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合，说明其融合表达了6×His标签。

6、重组蛋白的纯化

取大量诱导表达蛋白的菌液离心收集菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，用超声破碎仪超声破碎后离心收集沉淀，用binding buffer溶液溶解沉淀并进行镍琼脂糖亲和层析，收集Elution buffer洗脱液作为纯化的重组单链抗体，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图3所示，说明单链抗体蛋白大小约为30kD，其中，图3中M：预染蛋白质分子质量标准；1：纯化后的ScFv-VH-VL重组蛋白。

实施例2单链抗体用于Western-blot检测gD蛋白的表达

利用实施例1中制备的单链抗体用于Western-blot检测IBRV gD蛋白，具体地，取表达gD蛋白的大肠杆菌细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转印至PVDF膜。用5％脱脂乳封闭后用纯化HRP标记的单链抗体进行免疫印迹，ECL化学发光试剂盒显色。并设表达pET28a空载体的大肠杆菌裂解液为对照。

其结果如图4所示，说明本发明制备的单链抗体可以特异性结合大肠杆菌表达的gD蛋白。其中，图4中M：预染蛋白质分子质量标准；1：表达pET 32a空载体的大肠杆菌裂解液；2：表达gD蛋白的大肠杆菌细胞裂解液。

实施例3单链抗体用于IFA检测MDBK中感染的IBR病毒

利用实施例1制备纯化后的单链抗体用于间接免疫荧光试验(IFA)检测MDBK细胞中的IBRV，具体地，用IBRV感染6孔细胞板中生长在玻片上的MDBK细胞，待出现病变时用4％多聚甲醛固定细胞1h后，以0.1％Triton X-100透化2h，0.5％BSA于37℃封闭1h，以实施例1中纯化的重组单链抗体作为一抗，以1:100稀释的FITC标记的鼠抗His单克隆抗体作为二抗进行免疫反应。荧光显微镜下进行观察，并设置gD单克隆抗体结合感染MDBK细胞的IBRV对照。

结果如图5所示，其中，图中DAPI为采用的蓝色荧光染料：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，FITC为绿色荧光染料：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)，Merge为两种染料的混合，WT表示为本底对照，不加任试剂，Control表示为对照加入抗体的稀释液，ScFv 2D1表示加ScFv，gD-McAb表示加gD单克隆抗体，各图中的短线段表示为比例尺为50μm。

结果表明，加ScFv作为一抗进行检测的IBRV感染实验组有较为明显的绿色荧光，并且在病变明显区域绿色荧光也越强烈，而未加ScFv的IBRV感染细胞对照组无明显可见的绿色荧光，加gD单克隆抗体的IBRV感染细胞对照组出现较为浅淡的绿色荧光，结果显示ScFv能与IBRV发生特异性结合，并且等质量的单链抗体结合病毒的能力强于gD单克隆抗体。

实施例4单链抗体用于抗原捕获ELISA检测IBRV

利用实施例1制备纯化后的单链抗体用于抗原捕获ELISA检测IBRV，酶标板过夜包被纯化的IBRV，用3％BSA封闭后以HRP标记的单链抗体为抗体进行ELISA检测，用TMB显色试剂盒显色后用终止液终止，并读取OD₄₅₀值，本实施例中设置gD单克隆抗体对照。

采用GraphPad数据分析软件进行数据分析，结果如图6所示，其中，图6中横坐标数值表示单克隆抗体及单链抗体进行ELISA时的包被量，单位为μg。纵坐标表示阳性值(postive)与阴性值(nagtive)的比值。ELISA结果显示本发明制备的单链抗体能特异性结合IBRV，等量的单链抗体与gD单克隆抗体相比，结合的IBRV的能力更强。

实施例5单链抗体用于ELISA特异性结合IBRV

利用实施例1制备纯化后的单链抗体用于ELISA检测结合IBRV的特异性，酶标板过夜包被纯化的传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)及伪狂犬病毒(PRV)，用3％BSA封闭后以HRP标记的单链抗体为抗体进行ELISA检测，用TMB显色试剂盒显色后用终止液终止，并读取OD450值。

采用GraphPad数据分析软件进行数据分析，结果如图7所示。ELISA结果显示本发明制备的单链抗体能特异性结合IBRV，与牛的其他病原体及同科的动物疱疹病毒均不结合(其中，图7中“***”表示差异极显著p<0.001)，表明单链抗体结合IBRV是特异性的。

由上面的实施例可知本发明制备的单链抗体的特点具有：容易获取，分子量小，去除了抗体发挥诊断及治疗无关的序列、结合活性比抗体更好、具有靶向性、可以和许多诊断与治疗相关的分子连接制备靶向诊断及治疗药物，除此之外，制备成本价格低廉，可适用于牛相关传染病的检测与治疗过程中检测试剂制备的应用。本发明获得的单链抗体具有较好的结合IBRV的功能，且能特异性的识别感染细胞内的IBRV病毒粒子，识别效果比与之对应的单抗较好，这是其他诊断手段无法达到的。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种抗IBRV的单链抗体、其制备方法及应用

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 重链可变区(VH)

<400> 1

Gly Ser Met Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

1 5 10 15

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ser Asn Glu Cys Glu Phe

20 25 30

Pro Ser Tyr Asn Ile Ser Trp Val Arg Lys Thr Pro Gly Lys Ser Leu

35 40 45

Asp Leu Val Ala Ala Ile Lys Ser Gly Tyr Tyr Val Asp Thr Met Glu

50 55 60

Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Lys Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ala Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Gly Ile Ile Thr Thr Ile Gly Ala Lys Gly Pro Arg Ser Pro

100 105 110

Ser Pro Gln

115

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> 轻链可变区(VL)

<400> 2

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly

85 90 95

Ser Leu Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 连接肽

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 738

<212> DNA

<213> ScFv-VH-VL基因

<400> 4

ggatccatgg aggtcaaact gcagcagtct gggggaggct tagtgcagcc tggagagtcc 60

ctgaaactct cctgtgaatc caatgaatgc gaattccctt cctataacat atcttgggtc 120

cgcaagactc cggggaagag tctggacttg gtcgcagcca ttaagagtgg ctactatgta 180

gacaccatgg agagacgatt catcatctcc agagacaata ccaagaagac cctgtatttg 240

caaatgagca gtctgaggtc tgaggacgct gccttgtatt actgtgcaag acggggaata 300

attacgacta ttggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcaaggtgg aggcggttca 360

ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg gatattgtga tgacccagac tccactctcc 420

ctgtctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagcattgta 480

cacagtaatg gaaacactta tttcgaatgg tacttgcaga agccaggcca gtctccaagg 540

ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt 600

ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt 660

tattactgct ctcaaggttc acttattcca ttcacgttcg gctcggggac caagctggaa 720

ataaaacggt agctcgag 738

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccgttttatt tccagcttgg tccc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccgttttatt tccaactttg tccc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ccgtttcagc tccagcttgg tccc 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gatrttktga tgacccaras tccact 26

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggatccatgg aggtcaaact gcagcagtct ggg 33

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acctccgcct gaaccgcctc caccttgagg agacggtgac cgtggtcc 48

<210> 14

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggatat tgtgatgacc 60

cagactcca 69

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ctcgagctac cgttttattt ccagcttggt ccc 33

Claims

1. 一种抗IBRV的单链抗体，其为由SEQ ID NO.1所示重链可变区、SEQ ID NO.2所示轻链可变区及连接二者的连接肽组成的蛋白质；

所述连接肽序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述单链抗体的基因。

3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种用于表达抗IBRV单链抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体含权利要求2或3所述的基因。

5.一种用于表达抗IBRV单链抗体的宿主，其特征在于，所述宿主含权利要求4所述的表达载体。

6.一种如权利要求1所述单链抗体的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

a) 用包含核苷酸分子的载体转化宿主细胞，所述核苷酸分子编码如权利要求1所述的单链抗体；

b) 在容许所述单链抗体分子合成的条件下培养所述宿主细胞；并且

c) 自培养物回收所述单链抗体分子。

7.含有权利要求1所述单链抗体的检测试剂。

8.含有权利要求1所述单链抗体的治疗制剂。

9.权利要求1所述的单链抗体在制备治疗牛传染性鼻气管炎治疗剂或制备牛传染性鼻气管炎病毒检测试剂中的应用。