CN111040031B - 一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体及其制备方法，本发明从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离到的淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列连接至PET‑30a载体，然后转化BL21感受态细胞，从转化后的单个菌落中筛选得到针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，采用ELISA试验对筛选得到的ScFv抗体进行初步活性鉴定，表明此抗体具有非洲猪瘟反应活性。本发明的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。

Description

一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine feverVirus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起着至关重要的作用。抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。中国专利(公布号CN110078819A)一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法。该抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。该专利得到的抗体为禽源非洲猪瘟抗体，存在异源性反应，且没有克服常规抗体分子量较大的问题。
单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。1988年，Bird和Huston等第一次将单链抗体研制出来，在此后的三十年里，科研人员对单链抗体的研究一直没有间断，不仅研制出了单链抗体多聚体、双特异性单链抗体等多种抗体形式，还建立了单链抗体的多种展示系统。单链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗体具有很好的穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。
回顾近些年来抗体领域的发展情况，我们可以看出，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。
综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。
发明内容
本发明提供一种非洲猪瘟病毒特异性的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，所述ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面提供编码上述ScFv抗体的重链可变区的DNA片段和编码上述ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段。
优选的，编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:3所示，编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:4所示。
本发明第三方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段和编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述重组表达载体。
本发明第五方面，提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
(2)淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
(3)全基因cDNA合成：
以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
(4)第一轮扩增：
以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮扩增获得VH、VLλ和VLκ；
(5)第二轮扩增：
以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增获得VLλ-Linker、VH-Linker和VLκ-Linker；
(6)第三轮扩增：
以第二轮扩增产物为模板，进行第三轮扩增获得VH-VLκ13；
(7)T-A克隆鉴定；
(8)ScFv抗体的构建与制备：
将测序正确的扩增产物构建的VH-VLκ13插入到PET-30a质粒中，构建重组质粒VH-VLκ13-PET-30a，然后将重组质粒转化入感受态细胞中，培养转化菌液并诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟ScFv抗体。
优选的，以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’，
R1:5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’，
F1:5’-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’，
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’，
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’，
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’。
优选的，以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；
R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’；
F2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’。
优选的，以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’。
优选的，所述的淋巴细胞分离是按照以下步骤进行：
(1)自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中加入等量的全血稀释液，混匀，得到全血的稀释液；
(2)以全血的稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入步骤(1)得到抗凝血的稀释液，水平离心机1800rpm，18-22℃,30min；
(3)小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃,10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min离心；沉淀用5mL无RNA酶水重悬，随即加入45mL RPIM-1640培养液混匀，1000rpm，18～22℃，10min离心，沉淀即为淋巴细胞淋巴细胞，并将其重悬于RNALater保存液中，置-70℃保存备用。
优选的，淋巴细胞总mRNA的提取按照以下方法进行：吸取上述淋巴细胞液400μL，加入1mL TRizol，混匀，4℃静置5min；加入250μL三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450μL上清，加等量异丙醇，-20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25μL无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA。
本发明第六方面，提供抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体在制备非洲猪瘟病毒诊断试剂或非洲猪瘟病毒治疗试剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明将猪源抗体可变区的基因序列与所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH-VLκ13)的基因序列进行了比对分析，结果表明该抗体的基因序列与猪源抗体可变区的基因序列基本一致，证明所构建的抗体基因序列是正确的。
本发明采用ELISA检测技术对所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH-VLκ13)进行反应活性鉴定，结果表明所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体(VH-VLκ13)具有非洲猪瘟反应活性。
本发明的制备的抗体填补了目前市场上非洲猪瘟ScFv抗体的空白，提供了一种免疫源性小、特异性强的小分子抗体，为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。
附图说明
图1为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第一轮扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
M：DL2000相对分子质量标准；1～4：VH，5～8：VLλ，9～12：VLκ，13：对照，大小为300bp左右。
图2为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第二轮扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2a为VLλ-Linker基因的扩增结果，图2b为VH-Linker基因的扩增结果，泳道1～8:VH-Linker，图2c为VLκ-Linker基因的扩增结果，泳道1～16:VLκ-Linker。其中M:DL2000相对分子质量标准；目的条带大小均为320bp左右；
图3为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第三轮扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
M.DL2000相对分子质量标准；目的条带均为800bp左右；
图4为猪外周血淋巴细胞T-A克隆鉴定的质粒PCR扩增产物的电泳图；
M：DL2000相对分子质量标准；1～22：单克隆菌落的质粒PCR结果；
图5为抗非洲猪瘟ScFv抗体表达纯化产物的电泳图；
M：蛋白质分子质量标准，1：抗非洲猪瘟ScFv抗体(VH-VLκ13)表达纯化产物。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
实施例 抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体的制备
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物
一头非洲猪瘟免疫耐过猪(5个月大，来自河南新乡某猪场)。
1.1.2菌株和试剂
LTS1110猪外周血淋巴细胞分离液Kit购自天津灏洋生物制品公司；PMDTM20-T载体、E.coli JM109感受态、
Figure GDA0002321444370000061
HS DNA Polymerase、RNase-free Water、DL2,000DNA Marker、6×Loading Buffer均购自宝生物公司；BL21(DE3)感受态购自北京全式金；Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；分子生物学试剂来自Sigma公司；其它生化试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1淋巴细胞分离
颈静脉采集非洲猪瘟免疫耐过猪的猪抗凝血100mL，等量加入全血稀释液，混匀；以体积比为5:9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18～22℃，20min；小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃,10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液计数后并悬浮于RNA保存液(RNAlater)中，置-70℃保存备用。
1.2.2淋巴细胞总mRNA的提取
吸取上述淋巴细胞液400μl，加入1mL TRizol，混匀，4℃静置5min；加入250μl三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450μl上清，加等量异丙醇，-20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25μl无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA，ND2000测得Total mRNA浓度为356ng/μl，纯度OD260/OD280为1.87。
1.2.3引物的设计
第一轮扩增引物：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；
R1:5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’；
F1:5’-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
W1:5’-GAGGACGGTCAGATGGGTCC-3’；
Q1:5’-GATTCTCAGACTGTGATCCAGGAG-3’；
其中，引物P1和R1用于扩增VH序列，引物F1、Bl1、Bl2、Bl3用于扩增VLκ序列，引物W1和Q1用于扩增VLλ序列。
第二轮扩增引物：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；
R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’；
F2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
W2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGC GAGGACGGTCAGATGGGTCC-3’；
Q1:5’-GATTCTCAGACTGTGATCCAGGAG-3’；
其中，引物P1和R2用于扩增VH-Linker序列，引物F2、Bl1、Bl2、Bl3用于扩增VLκ-Linker序列，引物W2和Q1用于扩增VLλ-Linker序列。
第三轮扩增引物：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
Q1:5’-GATTCTCAGACTGTGATCCAGGAG-3’；
引物P1、Bl1、Bl2、Bl3用于扩增VH-VLκ序列，引物P1、Q1用于扩增VH-VLλ序列。
1.2.4cDNA合成双链及纯化
1.2.4.1全基因cDNA合成
在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
试剂材料 体积
DEPC水 4.5μL
5×First strand Buffer 4μL
DTT(0.1M) 2μL
Oligo(dT) 1μL
RRI 1μL
dATP 1μL
Radom primers 0.5μL
M-MLV逆转录(200u/ul) 1μL
mRNA 5μL
总体积 20μL
混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置-20℃保存备用。
1.2.4.2第一轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：
①用于扩增VH序列:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
P1引物(10pmol/μL) 1.5μl
R1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
②用于扩增VLκ序列:
Figure GDA0002321444370000081
Figure GDA0002321444370000091
③用于扩增VLλ序列：
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
W1引物(10pmol/μL) 1.5μl
Q1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
上述扩增程序分别为①：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集300bp左右的产物，即为所扩增目的产物；②：98℃2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min。将扩增产物电泳，纯化收集300bp左右的产物，即为所扩增目的产物。③：98℃2min，98℃10s、53℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min。将扩增产物电泳，纯化收集300bp左右的产物，即为所扩增目的产物。将扩增产物于-20℃保存备用。
1.2.4.3第二轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：
①用于扩增VH-Linker序列:
试剂材料(reagent) 数量(amount)
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
P1引物(10pmol/μL) 1.5μl
R2引物(10pmol/μL) 1.5μl
第一轮扩增产物<sup>①</sup> 0.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 32μl
总体积 50μl
②用于扩增VLκ-Linker序列:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
F2引物(10pmol/μL) 1μl
B1<sub>1</sub>引物(10pmol/μL) 1μl
B1<sub>2</sub>引物(10pmol/μL) 1μl
B1<sub>3</sub>引物(10pmol/μL) 1μl
第一轮扩增产物<sup>②</sup> 0.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 31μl
总体积 50μl
③用于扩增VLλ-Linker序列：
Figure GDA0002321444370000101
Figure GDA0002321444370000111
上述扩增程序分别为：①：98℃2min，98℃10s、56℃5s、72℃30s、35个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集320bp左右的产物，即为所扩增目的产物；②：98℃2min，98℃10s、68℃30s、30个循环，72℃10min。将扩增产物电泳，纯化收集320bp左右的产物，即为所扩增目的产物；③：98℃2min，98℃10s、68℃30s、35个循环，72℃10min。将扩增产物电泳，纯化收集320bp左右的产物，即为所扩增目的产物；将扩增产物置-20℃保存备用；
1.2.4.4第三轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
①无引物a，用于VH-VLκ的预拼接：
试剂材料(reagent) 数量(amount)
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
第二轮扩增产物<sup>①</sup> 1μl
第二轮扩增产物<sup>②</sup> 1μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 29.5μl
总体积 46μl
无引物b，用于VH-VLλ的预拼接：
Figure GDA0002321444370000112
Figure GDA0002321444370000121
②有引物a，用于VH-VLκ的正式拼接：
试剂材料(reagent) 数量(amount)
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
第二轮扩增产物<sup>①</sup> 1μl
第二轮扩增产物<sup>②</sup> 1μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 29.5μl
P1引物(10pmol/μL) 1μL
B1<sub>1</sub>引物(10pmol/μL) 1μL
B1<sub>2</sub>引物(10pmol/μL) 1μL
B1<sub>3</sub>引物(10pmol/μL) 1μL
总体积 50μl
有引物b，用于VH-VLλ的正式拼接：
试剂材料(reagent) 数量(amount)
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
第二轮扩增产物<sup>①</sup> 1μl
第二轮扩增产物<sup>③</sup> 1μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 31.5μl
P1引物(10pmol/μL) 1μL
Q1引物(10pmol/μL) 1μL
总体积 50μl
上述扩增程序分别为：①无引物：98℃2min，98℃10s、68℃30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃ 2min，98℃10s、55℃5s、72℃50s、35个循环，72℃10min。将扩增产物电泳，纯化收集约800bp左右的产物，即为所扩增目的产物VH-Linker-VLκ(简称为VH-VLκ)和VH-Linker-VLλ(简称为VH-VLλ)。将扩增产物置-20℃保存备用。
1.2.5T-A克隆鉴定
先在0.2mL的PCR扩增管中依次进行下列I和II这2个程序，再在1.5mL离心管中进行程序III：
I(第三轮扩增产物序列后面加“A”)
试剂材料(reagent) 数量(amount)
第三轮扩增产物 8μl
10×Buffer 1μL
dATP Mixture 0.5μl
A-overhang enzyme 0.5μl
总体积 10μl
II(I加A产物连接到T载体上)
试剂材料(reagent) 数量(amount)
I加A产物 2μl
PMD<sup>TM</sup>20-T vector 1μL
DEPC水 2μl
Ligation Mighty Mix 5μl
总体积 10μl
III(转化)
II全部连接产物 10μl
E.coli JM109 100μL
上述程序分别为I：65℃10min；II：16℃(金属浴)30min；III：将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，送测序。
1.2.5基因序列的比对
将上述测序结果与NCBI网站上发布的猪源抗体重链可变区序列、轻链lamda链、轻链Kappa链进行基因序列的比对，所用比对软件为DNA star，比对结束后，将正确的基因序列送由武汉金开瑞公司进行ScFv-PET-30a质粒的构建，得到VH-VLκ13-PET-30a质粒和VH-VLλ-PET-30a，VH-VLκ13或VH-VLλ位于PET-30a的NdeI和XhoI酶切位点之间。
1.2.6抗体的表达与纯化
准备BL21感受态细胞，每50μL感受态细胞分别转化1μL VH-VLκ13-PET-30a质粒和VH-VLλ-PET-30a，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，37℃诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟ScFv抗体。
1.2.7抗体的活性鉴定
1.2.7.1表达产物包被检测板的活性鉴定
取纯化的ScFv抗体蛋白，分别按照1:10的比例包被检测板，包被完成后，加入50μL非洲猪瘟全病毒抗原，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:5稀释的非洲猪瘟阳性血清，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:15000稀释的HRP标记的猪二抗，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
1.2.7.2ASFV全病毒抗原包被检测板的活性鉴定
取非洲猪瘟全病毒抗原，按照1:10的比例包被检测板，包被完成后，分别加入50μL1:10稀释的ScFv抗体蛋白，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:5稀释的兔抗猪的抗HIS标签的二抗，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
2.结果
2.1cDNA合成双链的琼脂糖凝胶电泳
取第一轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集300bp条带。取第二轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集300bp左右条带。取第三轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集800bp左右的条带。如图1～图3所示。
图1为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第一轮扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，图中M表示DL2000相对分子质量标准；1～4表示VH，5～8表示VLλ，9～12:VLκ，13为对照，结果显示，VH、VLλ和VLκ的大小均在300bp左右。
图2为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第二轮扩增琼脂糖凝胶电泳图；图2a为VLλ-Linker基因的扩增结果，图2b为VH-Linker基因的扩增结果，泳道1～8:VH-Linker，图2c为VLκ-Linker基因的扩增结果，泳道1～16:VLκ-Linker。其中M:DL2000相对分子质量标准；目的条带VLλ-Linker、VH-Linker和VLκ-Linker的大小均在320bp左右；
图3为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第三轮扩增琼脂糖凝胶电泳图。结果显示，产物VH-Linker-VLλ的条带大小在800bp左右。
2.2T-A克隆后的质粒PCR结果
将连接好的PMDTM20-T-A进行质粒PCR鉴定，挑选基因大小在约800bp左右的质粒送测序，质粒PCR鉴定结果如图4所示。
VH-Linker-VLκ挑选了3个单克隆，经测序后发现其序列与猪免疫球蛋白可变区序列的框架区基本一致、CDR区存在差异，符合猪轻重链可变区基因结构，其中VH部分为342bp～380bp，VLκ部分为313bp～324bp，重链和轻链之间的Linker碱基序列全部正确。
其中，VH-Linker-VLκ13大小为708bp，核苷酸序列如下所示，下划线所示序列为Linker序列：
5’-ATGGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGAATCACCTTCAGTAGTGCTTCATTGAGCTGCGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTGGCAGGTATTTACACTAGAAGCAGCAGCACGTACTACGCAGAGTCTGTGACGGCCCGATTCACCATCTCCAGGGACGACTCCCAGAATACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAAGACACGGCCCACTATTACTGTGGAAGAGTGTTCGCCGCCCAGTACTACGATGATTACGGTATTGACCTCTGGGGCCCAGGCGTTGAAGTCGTCGTAGGT GGCGGAGGGTCAGGCGGCGCCATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTCTCGGAGACACGGTCTCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGCACTAGGAGTTACTCAGCGGGGTCTCGTGAACAACCAGGGAAGTCTCCTAAACGGTTGATTGTCGCTGCTTTGAATTCGCCCAGTGCCGTCGCATCACGGTTCAAGGGCAGTGGATCTGGCACCGGTTTCACCCTCACCATCAGTGGCCTGCAGGTTGAAGATGTTGGAACTTATTACTGTCAGCAGTCCACTACCGCACTTTATGGTTTCGGCGCGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA-3’。
VH-Linker-VLλ挑选了10个单克隆，经测序后发现其序列与猪免疫球蛋白可变区序列基本一致，符合猪轻重链可变区基因结构，其中VH部分为335bp～365bp左右，VLλ部分为331bp～346bp左右，重链和轻链之间的Linker碱基序列全部正确。
2.3ScFv抗体氨基酸序列比对
将测序正确的基因序列与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行基因序列的比对，比对结果以氨基酸序列形式显示。
2.3.1VH-Linker-VLκ13的VH序列比对
猪源抗体VH序列：
EENLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTSSSYGMWVRQAPGKGLEWLACIYSSGSRTYYADSVKGRCTISRDNSQNTAYLQMDSLRTEDTAHYYCVTGDASWCPFRKVHLWGPGVEVVVSS
ScFv抗体的VH序列：
MEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGITFSSASLSCVRQAPGKGLEWLAGIYTRSSSTYYAESVTARFTISRDDSQNTAYLQMNSLRAEDTAHYYCGRVFAAQYYDDYGIDLWGPGVEVVV
2.3.2VH-Linker-VLκ13的VLκ序列比对
猪源抗体VLκ序列：
AIVLTQTPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLLHTTGKNYLNWYLQKPGQSPQRLIYQATNRDTGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDAGVYYCLQFKESPPGFGAGTKLELK
ScFv抗体的VLκ13的序列：
AIVMTQSPASLAASLGDTVSITCRASQSTRSYSAGSREQPGKSPKRLIVAALNSPSAVASRFKGSGSGTGFTLTISGLQVEDVGTYYCQQSTTALYGFGAGTKLEIK
2.3.3VH-Linker-VLλ的序列比对
将上述测序正确的10个单克隆全部与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行序列比对，比对结果显示其重链和轻链序列的同源性均达80％以上。
结果表明，构建的ScFv抗体基因序列与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列框架区基本一致，其中CDR区存在差异。
2.4ScFv抗体VH-VLκ13和VH-VLλ基因的表达
VH-VLκ13基因在37℃诱导后出现1条大小为27kDa的特异蛋白条带，结果与预期相符，如图5所示。并在诱导剂浓度为1/1000，诱导时间为6h时，ScFv抗体VH-VLκ13基因的诱导表达量达高峰。其它VH-VLκ未表达成功。
VH-VLλ基因则均未表达成功。
2.5表达的ScFv抗体VH-VLκ13活性鉴定
2.5.1表达产物包被检测板的活性鉴定结果
将表达产物包被检测板，按照1.2.7.1所述程序进行检测，检测结果如下表所示，结果表明所VH-VLκ13的表达产物可以与非洲猪瘟全病毒抗原发生特异性结合。
VH-VLκ<sub>13</sub> 阴性对照
OD值 0.535 0.147
2.5.2ASFV全病毒抗原包被检测板的活性鉴定结果
将ASFV全病毒抗原包被检测板，按照1.2.7.2所述程序进行检测，检测结果如下表所示，结果表明非洲猪瘟全病毒抗原与VH-VLκ13表达产物发生了特异性结合。
VH-VLκ<sub>13</sub> 阴性对照
OD值 0.475 0.142
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体及其制备方法
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Met Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Cys Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Ala Gly Ile Tyr Thr Arg Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
50 55 60
Val Thr Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala His Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Arg Val Phe Ala Ala Gln Tyr Tyr Asp Asp Tyr Gly Ile Asp
100 105 110
Leu Trp Gly Pro Gly Val Glu Val Val Val
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
Ala Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Thr Arg Ser Tyr
20 25 30
Ser Ala Gly Ser Arg Glu Gln Pro Gly Lys Ser Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Val Ala Ala Leu Asn Ser Pro Ser Ala Val Ala Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Gly Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
atggaggtga agctggtgga gtctggagga ggcctggtgc agcctggggg gtctctgaga 60
ctctcctgtg tcggctctgg aatcaccttc agtagtgctt cattgagctg cgtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggctggca ggtatttaca ctagaagcag cagcacgtac 180
tacgcagagt ctgtgacggc ccgattcacc atctccaggg acgactccca gaatacggcc 240
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgaa gacacggccc actattactg tggaagagtg 300
ttcgccgccc agtactacga tgattacggt attgacctct ggggcccagg cgttgaagtc 360
gtcgta 366
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
gccattgtga tgacccagtc tccagcctcc ctggctgcat ctctcggaga cacggtctcc 60
atcacttgcc gggccagtca gagcactagg agttactcag cggggtctcg tgaacaacca 120
gggaagtctc ctaaacggtt gattgtcgct gctttgaatt cgcccagtgc cgtcgcatca 180
cggttcaagg gcagtggatc tggcaccggt ttcaccctca ccatcagtgg cctgcaggtt 240
gaagatgttg gaacttatta ctgtcagcag tccactaccg cactttatgg tttcggcgcg 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321

Claims (6)

1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，其特征在于，所述ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种编码如权利要求1所述ScFv抗体的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，编码ScFv抗体的重链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:3所示，编码ScFv抗体的轻链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:4所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含有如权利要求2所述的DNA片段。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
（2）淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤（1）分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
（3）全基因cDNA合成：
以步骤（2）提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
（4）第一轮扩增：
以步骤（3）合成的全基因cDNA为模板，进行第一轮扩增获得VH、VLλ和VLκ；
以P1、R1；F1、B11、B12、B13为引物进行第一轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’，
R1: 5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG-3’，
F1:5’-TTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’，
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’，
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’，
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
（5）第二轮扩增：
以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增获得VLλ-Linker、VH-Linker和VLκ-Linker；
以P1、R2；F2、B11、B12、B13为引物进行第二轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’ ；
R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCYGG -3’ ；
F2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCTTTGAKYTCCAGCTTGGTCCC-3’；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
（6）第三轮扩增：
以第二轮扩增产物为模板，进行第三轮扩增获得VH- VLκ13；
以P1、B11、B12、B13为引物进行第三轮扩增，引物具体为：
P1:5’-ACGACGACTTCAACGCCTGG-3’ ；
B11:5’-GCCATYGTGCTGACCCAGASTCC-3’；
B12:5’-GAGCTCGTSATGACCCAGTCTCC-3’；
B13:5’-GAGCTGCGTGATACACAGTCTCC-3’；
（7）T-A克隆鉴定；
（8）ScFv抗体的构建与制备：
将测序正确的扩增产物构建的VH-VLκ13插入到PET-30a质粒中，构建重组质粒VH-VLκ13-PET-30a，然后将重组质粒转化入感受态细胞中，培养转化菌液并诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，即得抗非洲猪瘟ScFv抗体。
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