CN115819564B - 一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法 - Google Patents
一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及本申请涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法；所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述试剂盒包括单链抗体和K205R蛋白；通过对针对单链抗体进行设计，由于单链抗体中包括重链可变区和轻链可变区，而针对单链抗体的CDR区中的氨基酸序列能够特异性结合非洲猪瘟的K205R基因所表达出的K205R蛋白，并且结合能力较高，因此该单链抗体在利用间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟阶段，可以准确的结合非洲猪瘟抗原，从而保证检测的准确性，从而在ELISA技术检测的基础上实现更快速、简单、灵敏以及更准确的对非洲猪瘟的检测。
Description
技术领域
本申请涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法。
背景技术
目前非洲猪瘟(Afican swine fever,ASF)作为外来疫病，尽管ASF不是人畜共患病，不会对人造成危害，但由于没有有效的疫苗，只能通过严格的扑杀进行疫情防控，这给生猪养殖行业带来了强烈的冲击，因此现阶段生猪养殖行业将ASF称为“头号杀手”。由于ASFV基因组具有精密复杂的结构，包含150～167个ORFs，编码蛋白数量达150到200种，但是目前对于蛋白功能的研究大都集中在p72、p54、p30及CD2v等结构蛋白，对其他非结构蛋白的研究较少，因此还有绝大多数蛋白的功能是未知的，仍需要进一步探索其功能。K205R蛋白是一种由ASFV K205R基因编码的功能性非结构蛋白，有研究表明该蛋白在病毒感染宿主之后的4h就已经出现，到6h后该蛋白已经扩散到了细胞质中，因此K205R蛋白是一种主要在早期感染时表达的蛋白，并且在感染过程中该蛋白会持续存在。目前已被证实K205R蛋白可用于ASF的诊断，经K205R蛋白作用下的宿主体内可以产生明显的抗体反应，且与用于免疫的其他靶蛋白对比，K205R蛋白所引起的IgG反应是最为强烈的，同时也只有在该蛋白的刺激下染病的猪只出现了IgM反应。Lokhandwala,S.等人以腺病毒为载体将包括K205R蛋白在内的7种蛋白在佐剂的辅助下采用鸡尾酒疗法免疫商品猪，证实K205R蛋白不仅可以诱导其产生强烈的抗体应答，还可以引起IFN-γ+细胞反应。因此证实了将K205R蛋白作为检测抗原建立ASF抗体检测方法的可行性，对于ASF的早期诊断具有重要的意义。
传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种快速、简单、灵敏的检测方法，包括间接ELISA、阻断ELISA和竞争ELISA等，已被广泛用于检测各种病毒抗体。虽然目前有利用ELISA检测技术对非洲猪瘟的检测，但是存在检测结果不准确的情况，因此如何提供一种检测非洲猪瘟的单链抗体，以实现更快速、简单、灵敏以及更准确的对非洲猪瘟的检测。
发明内容
本申请提供了一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法，以解决现有技术中通过ELISA检测技术难以对非洲猪瘟进行准确的检测。
第一方面，本申请提供了一种检测非洲猪瘟的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可选的，所述单链抗体由组装scFv基因所表达，所述组装scFv基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本申请提供了一种制备第一方面所述的单链抗体的方法，所述方法包括：
以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白；
采用所述K205R蛋白进行器官的免疫，后进行RNA提取，并进行反转录，得到cDNA片段；
采用第二预设引物组对所述cDNA片段进行扩增，后以第三预设引物组进行组装，得到scFv基因；
连接噬菌粒与所述scFv基因，得到重组载体；
向感受态细胞中转入所述重组载体，后进行亲和性淘选，得到多个特异性单链抗体；
分析所述特异性单链抗体和抗原的结合能力，确定最佳结合能力的特异性单链抗体；
使所述最佳结合能力的特异性单链抗体进行表达，得到单链抗体。
可选的，所述第二预设引物组包括扩增重链可变区的上游引物VHF-SfiⅠ和扩增轻链可变区的下游引物VLR-NotⅠ；其中，所述上游引物VHF-SfiⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物VLR-NotⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选的，所述第三预设引物组包括重链可变区的连接引物VHR-Linker和轻链可变区的连接引物VLF-Linker；其中，
所述连接引物VHR-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述连接引物VLF-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
第三方面，本申请提供了一种检测非洲猪瘟的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的单链抗体和K205R蛋白。
可选的，所述K205R蛋白的制备方法包括：
以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白。
可选的，所述第一预设扩增引物组包括上游引物KF和下游引物KR，所述上游引物KF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
第四方面，本申请提供了一种间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟的方法，所述方法包括：
采用第三方面所述的试剂盒中的K205R蛋白和单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数；
根据所述最佳质量浓度和所述最佳稀释倍数，确定猪只血清的最佳稀释度、最佳竞争时间和最佳显色时间；
根据所述最佳质量浓度、所述最佳稀释倍数、所述最佳稀释度、所述最佳竞争时间和所述最佳显色时间，进行待测猪只血清的间接竞争ELISA检测；
根据所述间接竞争ELISA检测的结果是否呈阳性，确定猪只是否感染非洲猪瘟；
若所述间接竞争ELISA检测的结果为阳性，则判定猪只感染非洲猪瘟。
可选的，所述采用所述K205R蛋白和所述检测用单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的质量浓度和检测用单链抗体的稀释倍数，具体包括：
采用不同稀释倍数的所述检测用单链抗体分别混合非洲猪瘟阳性血清和非洲猪瘟阴性血清，得到阳性混合液和阴性混合液；
包被不同浓度的所述K205R蛋白于检测容器中，并进行封闭，后向所述检测容器中分别加入所述阳性混合液和所述阴性混合液，并进行竞争反应；
向所述检测容器中加入底物显色液进行显色，后加入终止液终止反应，测定所述反应容器中的吸光度数据；
根据所述吸光度数据与预设值的差异，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一种检测非洲猪瘟的单链抗体，通过对针对单链抗体进行设计，由于单链抗体中包括重链可变区和轻链可变区，而针对单链抗体的CDR区中的氨基酸序列能够特异性结合非洲猪瘟的K205R基因所表达出的K205R蛋白，并且结合能力较高，因此该单链抗体在利用间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟阶段，可以准确的结合非洲猪瘟抗原，从而保证检测的准确性，从而在ELISA技术检测的基础上实现更快速、简单、灵敏以及更准确的对非洲猪瘟的检测。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的制备单链抗体的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的制备K205R蛋白的流程示意图；
图3为本申请实施例提供的间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟方法的流程示意图；
图4为本申请实施例提供的间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟方法的详细流程示意图；
图5为本申请实施例提供的K205R基因扩增结果的示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1表示K205R基因目的片段；
图6为本申请实施例提供的菌落PCR验证结果示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1～10表示pET-30a-K205R重组质粒，11表示pET-30a质粒，12表示阴性对照；
图7为本申请实施例提供的pET-30a-K205R重组质粒双酶切结果示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1～10表示pET-30a-K205R重组质粒；
图8为本申请实施提供的K205R蛋白诱导表达结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示IPTG诱导的pET-30a-K205R，2表示未诱导的pET-30a-K205R，3表示IPTG诱导的pET-30a，4表示未诱导的pET-30a；
图9为本申请实施例提供的K205R蛋白纯化结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示K205R蛋白；
图10为本申请实施例提供的鸡血清中抗K205R蛋白抗体效价结果示意图；
图11为本申请实施例提供的脾脏总RNA提取结果示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1和2表示脾脏总RNA；
图12为本申请实施例提供的VH、VL扩增结果示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1表示约420bp的VH基因，2表示约370bp的VL基因；
图13为本申请实施例提供的scFv基因组装结果示意图，其中，M表示DL2000 DNA分子质量标准，1、2表示约750bp的scFv基因；
图14为本申请实施例提供的PCR鉴定文库阳性率结果示意图，其中，M表示DL5000DNA分子质量标准，1-24表示菌落PCR产物；
图15为本申请实施例提供的特异性phage-scFv富集程度分析结果示意图，其中，Unpanned表示未淘选，Pan1表示一轮淘选，Pan2表示二轮淘选，Pan3表示三轮淘选，Pan4表示四轮淘选，N表示阴性对照；C表示空白对照；
图16为本申请实施例提供的39株单克隆phage-scFv与K205R蛋白的结合能力分析结果示意图，其中，1-39表示39株单克隆phage-scFv，C表示空白对照，N表示阴性对照，P表示阳性对照；
图17为本申请实施例提供的scFv基因的VH、VL氨基酸序列分析结果示意图；
图18为本申请实施例提供的单链抗体诱导表达分析结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示未诱导的pET-30a，2表示IPTG诱导的pET-30a，3表示未诱导的pET-30a-scFv，4:IPTG诱导的pET-30a-scFv；
图19为本申请实施例提供的单链抗体的可溶性分析结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示pET-30a-scFv菌液超声破碎后的上清，2表示pET-30a-scFv菌液超声破碎后的沉淀；
图20为本申请实施例提供的Western Blot分析结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示单链抗体；
图21为本申请实施例提供的单链抗体纯化结果示意图，其中，M表示预染蛋白Marker，1表示单链抗体；
图22为本申请实施例提供的猪血清优化结果示意图；
图23为本申请实施例提供的抗原抗体最佳孵育时间结果示意图；
图24为本申请实施例提供的TMB最佳显色时间结果示意图；
图25为本申请实施例提供的灵敏性检测结果示意图；
图26为本申请实施例提供的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请的创造性思维为：
单链抗体(scFv)作为小分子抗体，缺乏恒定区，使得分子量变小，降低了在宿主体内其自身的免疫原性，有良好的穿透能力且可在细菌系统中很方便的产生，是许多抗体噬菌体展示文库的优选形式。再加上禽类的抗体与哺乳动物抗体的不同，在抗体轻链的分型中前者仅有一种，使得抗体的制备变得更加的简单、快速。通过噬菌体展示技术将抗体的制备与基因工程技术相结合，实现了在大肠杆菌中低成本大量生产，整个过程高效、简便，避免了对细胞的繁琐操作。
传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种快速、简单、灵敏的检测方法，包括间接ELISA、阻断ELISA和竞争ELISA等，已被广泛用于检测各种病毒抗体。虽然目前有利用ELISA检测技术对非洲猪瘟的检测，但是存在检测结果为假阳性的情况，因此如何提供一种利用接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟的方法，以实现更快速、简单、灵敏以及更准确的检测非洲猪瘟抗体。
本申请实施例提供了一种检测非洲猪瘟的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些可选的实施方式，所述单链抗体由组装scFv基因所表达，所述组装scFv基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本申请实施例中，限定单链抗体由组装的scFv基因的具体核苷酸序列，能保证通过组装scFv基因能够准确表达出单链抗体，保证后续在ELISA技术检测的基础上实现更快速、简单、灵敏以及更准确的对非洲猪瘟的检测。
如图1所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种制备所述单链抗体的方法，所述方法包括：S1.以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白；S2.采用所述K205R蛋白进行器官的免疫，后进行RNA提取，并进行反转录，得到cDNA片段；S3.采用第二预设引物组对所述cDNA片段进行扩增，后以第三预设引物组进行组装，得到scFv基因；S4.连接噬菌粒与所述scFv基因，得到重组载体；S5.向感受态细胞中转入所述重组载体，后进行亲和性淘选，得到多个特异性单链抗体；S6.分析所述特异性单链抗体和抗原的结合能力，确定最佳结合能力的特异性单链抗体；S7.使所述最佳结合能力的特异性单链抗体进行表达，得到单链抗体。
本申请实施例中，通过设计的第一预设扩增引物组对K205R基因，并构建重组表达载体，再通过重组表达载体进行诱导表达和纯化，能得到较为纯净的K205R蛋白，最后通过采用K205R蛋白进行免疫，利用提取出的RNA反转录得到cDNA片段，再利用第二预设引物组和第三预设引物组，得到单链抗体的重链可变区和轻链可变区的单链抗体的基因，最后经过重组载体的表达和筛选，确定同抗原结合能力最佳的单链抗体，进而通过该方法能准确得到同抗原特异性结合的单链抗体，保证单链抗体在ELISA检测中准确的结合抗原，提高ELISA技术检测的准确性。
该方法是针对上述单链抗体的制备，该单链抗体的具体组成和序列可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，所述第二预设引物组包括扩增重链可变区的上游引物VHF-SfiⅠ和扩增轻链可变区的下游引物VLR-NotⅠ；其中，所述上游引物VHF-SfiⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物VLR-NotⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本申请实施例中，限定第二预设引物组的上游引物和下游引物的具体序列，能保证对cDNA片段的准确扩增，方便后续得到能同抗原准确结合的特异性单链抗体，保证后续准确的结合抗体，从而提高ELISA技术检测的准确性。
在一些可选的实施方式中，所述第三预设引物组包括重链可变区的连接引物VHR-Linker和轻链可变区的连接引物VLF-Linker；其中，
所述连接引物VHR-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述连接引物VLF-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本申请实施例中，限定具体的第三预设引物组的核苷酸序列，利用链可变区的连接引物VHR-Linker和轻链可变区的连接引物VLF-Linker，使得重链可变区的基因和轻链可变区的基因能够整合形成scFv基因，方便后续表达出准去的单链抗体。
基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种检测非洲猪瘟的试剂盒，所述试剂盒包括所述单链抗体和K205R蛋白。
本申请实施例中，限定试剂盒包括单链抗体和K205R蛋白，能保证后续试剂盒在间接竞争ELISA技术检测中能够准确的结合抗原，提高ELISA技术检测的准确性。
该试剂盒中包括上述单链抗体，该单链抗体的具体组成和序列可参照上述实施例，由于该试剂盒采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述K205R蛋白的制备方法包括：
S1.以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白。
本申请实施例中，限定具体的K205R蛋白的制备方法，能通过第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，保证K205R基因扩增的准确，再通过重组表达载体的构建、诱导表达和纯化，得到纯净的K205R蛋白，方便后续得到能同抗原特异性结合的单链抗体，并保证后续单链抗体在间接竞争ELISA技术检测中能够准确的结合抗原，提高ELISA技术检测的准确性。
在一些可选的实施方式中，所述第一预设扩增引物组包括上游引物KF和下游引物KR，所述上游引物KF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本申请实施例中，限定第一预设扩增引物的具体序列，能保证对K205R基因进行充分扩增，并保证K205R基因扩增的准确，从而保证得到准确的K205R蛋白，从而保证后续单链抗体在间接竞争ELISA技术检测中能够准确的结合抗原，提高ELISA技术检测的准确性。
如图3所示，基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟的方法，所述方法包括：
S1.采用所述试剂盒中的K205R蛋白和单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数；S2.根据所述最佳质量浓度和所述最佳稀释倍数，确定猪只血清的最佳稀释度、最佳竞争时间和最佳显色时间；S3.根据所述最佳质量浓度、所述最佳稀释倍数、所述最佳稀释度、所述最佳竞争时间和所述最佳显色时间，进行待测猪只血清的间接竞争ELISA检测；S4.根据所述间接竞争ELISA检测的结果是否呈阳性，确定猪只是否感染非洲猪瘟；若所述间接竞争ELISA检测的结果为阳性，则判定猪只感染非洲猪瘟；若所述间接竞争ELISA检测的结果为阴性，则判定猪只没有感染非洲猪瘟。
本申请实施例中，限定具体的ELISA技术检测方法，能够利用ELISA棋盘格滴定实验确定ELISA技术检测中的工艺参数，从而能保证间接竞争ELISA检测的准确性。
该方法是针对上述试剂盒的实际应用方法，该试剂盒的具体组成和序列可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。
如图4所示，在一些可选的实施方式中，所述采用所述K205R蛋白和所述检测用单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的质量浓度和检测用单链抗体的稀释倍数，具体包括：S101.采用不同稀释倍数的所述检测用单链抗体分别混合非洲猪瘟阳性血清和非洲猪瘟阴性血清，得到阳性混合液和阴性混合液；S102.包被不同浓度的所述K205R蛋白于检测容器中，并进行封闭，后向所述检测容器中分别加入所述阳性混合液和所述阴性混合液，并进行竞争反应；S103.向所述检测容器中加入底物显色液进行显色，后加入终止液终止反应，测定所述反应容器中的吸光度数据；S104.根据所述吸光度数据与预设值的差异，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数。
本申请实施例中，通过竞争反应分别确定包被抗原所需的K205R蛋白的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数，能保证后续对其他ELISA技术检测中工艺参数的精准确定，从而提高间接竞争ELISA检测的准确性。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1
一、K205R蛋白的表达、纯化和鉴定：
1.K205R基因引物以及pMD19-T-K205R标准质粒的合成：
从NCBI上下载首株ASFV-SY18毒株的K205R全基因序列，将下载的基因序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并将其克隆到pMD19-T质粒上，命名为pMD19-T-K205R。并以该毒株的K205R基因序列为模板，设计K205R基因的全基因扩增引物，为了后期将基因与载体进行连接，在所设计的第一预设引物组的上、下游扩增引物序列的5’端分别重新引入SacⅠ、HindⅢ酶切位点，引物的扩增长度即K205R基因的全长为618bp，具体引物序列见表1，引物均送北京擎科新业生物技术有限公司合成。
表1第一预设引物组的上、下游扩增引物序列情况表
以合成的质粒pMD19-T-K205R为模板，使用KF、KR引物扩增K205R基因，PCR结果如图5所示，结果显示获得一条与预期大小(618bp)一致的DNA片段。
2.pET-30a-K205R重组表达载体的构建及鉴定：
用引物KF和引物KR扩增K205R基因，获得K205R目的基因片段，以及实验保存的pET-30a质粒DNA，用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶于37℃水浴锅中酶切15min。
酶切反应结束后，制备浓度2％的大孔琼脂糖凝胶在120V电压下跑胶20min，放置于凝胶成像系统中，在紫外灯的照射下，将K205R基因及pET-30a质粒DNA目的条带处的胶块切下，进行胶回收，随后将胶回收的K205R基因与pET-30a质粒用T4连接酶进行16℃连接过夜，并将连接产物转化入BL21表达菌株中。
培养12h后，用接种环从LBA平板中随机挑取10个单克隆，并将其接种于含5mL的LBA液体培养基的无菌EP管中，放置于37℃摇床中转速180rpm震荡培养12h。取1μL菌液做菌液PCR验证，阳性PCR产物送公司测序；核酸检测结果如表6所示，经过菌落PCR扩增所得片段与目的基因片段(618bp)一致，并将PCR产物送公司进行测序，经MEGA 6比对测序所得基因序列与K205R基因序列完全一致。
验证完成后取阳性结果相对应的菌液500μL并等体积的加入50％的甘油保存菌种，剩余菌液全部离心处理用于质粒的提取，将质粒命名为pET-30a-K205R；取部分质粒进行双酶切鉴定：
使用SacⅠ、HindⅢ内切酶对提取的pET-30a-K205R重组质粒进行双酶切后，电泳检测结果显示，如图7所示，得到了与预期大小一致的两条带，表明pET-30a-K205R重组质粒构建成功。
参照双酶切结果，阳性结果对应的上述菌种保存，阴性的丢弃。
3.K205R蛋白的诱导表达：
从-20℃中取出测序正确的pET-30a-K205R重组质粒菌种及含pET-30a空质粒的菌种，室温溶解后分别吸取2μL菌液接种于2mL的LBA液体培养基中，37℃摇床中180rpm培养活化12h；12h后吸取培养好的菌液200μL转接于新的含20mL的LBA液体培养基的50mL离心管中，继续置于摇床中培养，注意观察菌液浑浊程度，测定OD600在0.6左右时，将离心管取出添加IPTG至最终浓度为0.8mM，将不加IPTG的设为对照，继续培养7h。培养结束后所得的菌液在低温高速离心10min，弃去菌体上清将菌体沉淀保留，吸取10mL的PBS加入管中用移液枪冲洗菌体沉淀，再次离心，反复冲洗三次。
按比例取一定量的菌液，加入5×Protein Loading Buffer，用移液枪吹打混匀后将EP管于沸水中加热煮沸10min，取出后离心1min，吸取5μL上清加入提前配制好的SDS-PAGE胶孔中，进行蛋白电泳分析：将重组质粒pET-30a-K205R菌种与pET-30a空质粒菌种同时进行诱导表达，均设置未加IPTG的对照组，SDS-PAGE结果如图8所示，结果显示前者在29KDa附近出现目的蛋白条带，pET-30a空质粒菌种对应位置没有目的蛋白条带，表明K205R蛋白表达成功。剩余菌体于-80℃中反复冻融三次，-80℃冻存。
4.K205R蛋白的纯化：
(1)K205R蛋白的大量表达：
按照上述步骤进行菌体的大量表达，培养结束后，将培养的全部菌液低温条件下转速12000rpm离心10min，同样将上清弃去将菌体沉淀收集起来，之后向管中加入10mL的PBS冲洗保留的菌体沉淀，再次离心，反复冲洗三次，置于-80℃中反复冻融三次，在低温条件下用超声细胞破碎仪将细菌裂解破碎，至菌体变得清亮后停止破碎，低温高速离心后弃取菌液上清收集沉淀。
(2)包涵体的变性复性：
1)取包涵体洗涤液Ⅰ10mL重悬沉淀，4℃洗涤搅拌2h，低温条件下12000rpm的转速离心10min，保留沉淀。2)取包涵体洗涤液Ⅱ10mL重悬沉淀，重复1)。3)取包涵体洗涤液Ⅲ10mL重悬沉淀，重复1)。4)取包涵体裂解液10mL重悬沉淀，4℃洗涤搅拌4h，离心后，收集上清。5)按照使用说明对透析袋进行预处理后加入上清，将透析袋置于1L烧杯中，并向烧杯中加入适量PBS透析液(每1L含40mL丙三醇，透析液中尿素浓度从8mol、6mol、4mol、2mol和0依次降低)，4℃洗涤搅拌，每8h更换一次透析液，结束后将透析袋中溶液收集到离心管中。6)吸取1mL透析完的溶液进行SDS-PAGE，验证包涵体的变性复性情况。
具体验证步骤：
取透析完成后的溶液进行SDS-PAGE验证，结果如图9所示，结果显示泳道中仅在目的蛋白的位置有明显的条带，表明K205R蛋白纯化成功，计算得蛋白浓度为1.07mg/ml，可用于后续免疫实验。
实施例2
将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
二、抗ASFV K205R蛋白单链抗体的筛选及表达：
1.动物免疫
将购置的SPF鸡胚放入恒温孵化箱中自行孵化，在实验室饲养到4周大小，用已纯化的K205R蛋白辅以佐剂进行免疫，首次免疫时间记为0d，免疫程序如表2所示。
表1 SPF鸡的免疫程序
| 免疫时间 | 免疫原 | 免疫途径 | 免疫剂量 | 佐剂 |
| 0d | K205R | 肌肉注射 | 250μg | 完全弗式佐剂 |
| 14d | K205R | 肌肉注射 | 250μg | 不完全弗式佐剂 |
| 28d | K205R | 肌肉注射 | 250μg | 不完全弗式佐剂 |
| 42d | K205R | 肌肉注射 | 250μg | 不完全弗式佐剂 |
| 49d | K205R | 肌肉注射 | 300μg | 不完全弗式佐剂 |
2.血清效价的测定：
完成最后一次免疫之后的第7天从鸡翅下静脉用注射器采集血液，通过间接ELISA的方法从分离的血清中检测抗K205R蛋白的抗体的效价，未免疫的鸡血清作为阴性对照，具体步骤如下：
(1)用PBS将K205R重组蛋白浓度稀释为4μg/mL，置于96孔板中，4℃包被过夜(2)弃去板中蛋白液，用PBST洗涤板子，按200μL/孔的量加入5％脱脂奶粉，37℃封闭1h；(3)弃去封闭液，洗板，加入100μL按比例稀释的血清至96孔板中，每个稀释度均做3个重复，37℃孵育1h；(4)弃去板中液体，洗板，加入100μL的HRP标记的兔抗鸡抗体，板子放于37℃培养箱中孵育1h；(5)弃去板中液体，洗板，按照索莱宝TMB显色试剂盒，将底物显色A液与B液等比例加入干净的EP管中，混匀后分别加入100μL/孔混合液，轻轻摇晃，37℃避光温育10min～30min；(6)添加100μL的硫酸作终止液并在15min内测定450nm处的吸光值，记录每个孔的数值。
测定结果如图10所示，抗K205R蛋白的抗体效价为1：16000，符合建库要求，可用于后续噬菌体抗体库的构建。
3.采集脾脏组织
血清效价达到实验要求后，将被免疫的SPF鸡安乐死迅速将脾脏组织取出，并将其剪成小块，放入1.5mL的EP管中用液氮完成速冻后放于-80℃冰箱，保存备用。
4.抗ASFV K205R单链抗体库的构建：
(1)脾脏总RNA的提取及反转录合成cDNA：
使用天根RNAsimple总RNA提取试剂盒提取冻存的脾脏组织的总RNA，RNA提取完成后，取2μL利用核酸电泳验证RNA提取结果，结果如图11所示，有三条清晰明显的条带，分别为28S、18S和5S(包括5.8S)，表明RNA未降解，提取成功，可用于后续实验。
将其余RNA分装后保存于-80℃。
按照Thermo反转录试剂盒配置如表3所示的反转录反应体系将RNA反转录。
表3反转录反应体系
| 5×Reaction Buffer | 4μL |
| Oligo(dT)18primer | 1μL |
| RiboLock RNase Inhibitor | 1μL |
| 10mM dNTP Mix | 2μL |
| RevertAid M-MuLV RT | 1μL |
| Template RNA | 5μL |
| Nuclease-free Water | 6μL |
| Total volume | 20μL |
反应程序设置为：42℃，60min；72℃，5min；4℃，Forever，反转录结束后，将所得的cDNA置于-20℃保存待用。
(2)VL、VH基因的扩增：
参照文献报道的禽源scFv基因扩增的引物序列，送北京新业擎科生物技术有限公司合成抗体轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)基因扩增引物，引物序列见表4。
表4 VL、VH基因扩增引物情况表
随后并配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，待反应完成后，各取5μL PCR反应产物将其滴入凝胶孔中进行电泳，电压为130V，20min后放置于凝胶成像系统中鉴定，结果如图12所示，都获得了与目的基因大小一致的条带，表明成功扩增出VH(约420bp)、VL(约370bp)基因。
验证正确后将VH、VL目的基因条带切胶回收，置于-20℃。
(3)组装scFv基因：
Overlap PCR可以将两个或多个DNA片段连接到一个单元中，因此利用OverlapPCR，以回收得到的VH、VL基因片段为模板，以VHR-Linker、VLF-Linker为引物，组装scFv基因。PCR反应完成后取5μL PCR反应产物将其滴入凝胶孔中进行电泳，进行验证，如图13所示，获得一条与预期大小(约750bp)相符合的DNA片段，表明scFv基因组装成功。
验证正确后，回收scFv基因，置于-20℃。
(4)重组载体的构建：
1)将pCANTAB5E噬菌粒转入TG1感受态细胞中，并提取质粒，测定浓度，-20℃保存。2)将提取的pCANTAB5E噬菌粒与回收的scFv基因首先用SfiⅠ进行酶切，冰上将体系配制好后于50℃水浴锅中酶切4h，酶切结束后通过凝胶成像系统验证，并对酶切产物进行回收，测定浓度，酶切体系如表5所示。
表5酶切体系情况表
| scFv | 3μL | pCANTAB5E | 2μL |
| SfiⅠ | 1μL | SfiⅠ | 1μL |
| 10×Buffer | 3μL | 10×Buffer | 5μL |
| ddH2O | 23μL | ddH2O | 42μL |
| Total | 30μL | Total | 50μL |
3)用NotⅠ对胶回收的pCANTAB5E与scFv再次进行酶切，于37℃水浴锅中酶切2h，酶切结束后，步骤同上，再次酶切体系如6所示。
表6再次酶切体系情况表
| scFv | 4μL | pCANTAB5E | 5μL |
| NotⅠ | 1μL | NotⅠ | 1μL |
| 10×Buffer | 3μL | 10×Buffer | 5μL |
| ddH2O | 22μL | ddH2O | 39μL |
| Total | 30μL | Total | 50μL |
4)将胶回收的pCANTAB5E与scFv借助T4连接酶配制连接体系，16℃过夜连接，配制所用连接体系，所述连接体系如表7所示。
表7连接体系情况表
| scFv | 5μL |
| pCANTAB5E | 3μL |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| 10×T4 DNA Ligase Buffer | 2μL |
| ddH2O | 9μL |
| Total | 20μL |
(5)原始抗体库的构建
1)连接反应完成后，吸取连接产物5μL将其转化入100μL的TG1感受态细胞中，按照实施例1的步骤，利用42℃热激法共转化10个TG1感受态细胞，热激后冰上放置30min，之后加入无菌的LB液体培养基于37℃摇床中培养活化1h，离心1min，舍弃掉900μL上清，将剩下的菌液沉淀重悬后用涂布棒分别涂布于SOBAG平板上，剩余一管菌液，将其按10-1～10-7连续倍比稀释后涂布，所有平板放置于37℃培养箱中培养12h。
2)次日，收集9个未稀释的平板上的菌落，取2YT培养基3mL将菌落轻轻刮下，并用移液枪将其转移至50mL无菌离心管中，之后再取2mL对平板进行冲洗收集菌液，此时管中即为scFv-K205R原始抗体库，并向其中加入灭菌甘油保菌，混匀后，为便于后续实验将管中菌液按照2mL/支的剂量进行分装，短期内使用可放于4℃，长期保存则需于-80℃冰箱冻存。
3)对1)中的平板进行菌落计数，计算所得到的文库的库容；并随机挑取单菌落，利用菌落PCR验证文库的阳性率，PCR反应体系及反应程序均与组装scFv时所用程序一致；具体步骤为：SfiⅠ、NotⅠ内切酶对pCANTAB5E噬菌粒与回收纯化的scFv基因进行双酶切，完成连接后，将重组的噬菌体质粒转化入TG1感受态细胞中，得到库容量为5.8×106pfu/mL的原始噬菌体文库，并随机挑取24个单菌落，通过菌落PCR鉴定，如图14所示，阳性菌落数为22个，原始库阳性率为91.6％。
4)将上一步检测结果为阳性的PCR产物，送公司测序，分析测序结果鉴定原始抗体库的多样性。
5.特异性抗ASFV K205R单链抗体的淘选：
(1)辅助噬菌体的增殖与滴度测定：
由于pCANTAB5E噬菌粒与常用的质粒载体不同，是一种人工构建的特殊质粒载体，改造时保留了M13丝状噬菌体的复制起始位点，但缺少了编码噬菌体蛋白所需要的基因，因此自身不具有产生子代噬菌体的能力，在感染过程中，需要借助辅助噬菌体才可以完成增殖。
选用辅助噬菌体M13KO7，其增殖与滴定的步骤如下:
1)取出于-20℃冰箱中冻存的TG1菌种，在2YT固体培养基中划线，37℃培养12h；2)第二天，挑取TG1单克隆，接种于2YT液体培养基中，于37℃、180rpm培养12h；3)取100μL培养好的TG1菌液转入灭菌的EP管中，向EP管中加入等体积的辅助噬菌体M13KO7，混合均匀后于室温下静置10min，此时可将2YT固体培养基放置于37℃培养箱中提前预热；4)加入静置后的混合菌液到0.75％的上层琼脂中，轻轻摇动使其混合均匀后，将其倒入2YT固体培养基中，摇晃平板，将其平铺于固体培养基之上，完全凝固后，于37℃倒置培养12h；5)次日，挑取单噬菌斑，接种于2YT-AG液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养12h；6)次日，将菌液收集至离心管中，低温条件下转速4000rpm离心15min，将上清小心转移至新的管子中，用0.22μm的滤器完成对上清的过滤，将所得滤液分装至1.5mL的无菌EP管中，存放于4℃，保存待用，此时完成了辅助噬菌体的增殖过程；7)将在37℃培养12h的TG1菌液转接于新的液体培养基中，继续37℃、180rpm振荡培养，直到OD600≈0.6；8)用灭菌的2YT液体培养基将步骤6)中分装的噬菌体上清从10-1～10-11依次进行10倍梯度稀释，取10-8、10-9、10-10、10-11四个稀释度下的噬菌体上清各100μL；9)取等体积的TG1菌液，依次加入四个稀释度下的噬菌体上清中，充分混匀，静置10min；10)重复步骤4)；11)第二天，对平板中的噬菌斑计数，计算辅助噬菌体的滴度。滴度计算公式如下：
M13KO7滴度(pfu)＝(噬菌斑数/接种噬菌体的体积(mL))×M13K07原液的稀释倍数。
(2)特异性单链抗体的亲和性淘选：
由于噬菌体原始库是一个随机肽库，常用固相淘选的策略进行淘选；以96孔酶标板为固相支持物，加入K205R蛋白为包被原，通过4轮吸附、洗脱、扩增，从原始库中筛选与K205R蛋白特异性的结合的重组噬菌体，完成scFv的富集，具体操作如下：
1)-80℃冰箱中取出保存的scFv-K205R原始抗体库即2mL菌液接种到200mL的含20％葡萄糖的2YT液体培养基中，于37℃、220rpm振荡培养至OD600nm＝0.4～0.6；2)添加200μL的Amp+及20MOI的M13KO7辅助噬菌体到培养基中，于37℃摇床中，先将转速调为150rpm培养30min，之后再将转速调整至250rpm培养30min；3)所得菌液分装到50mL离心管中于低温条件下转速10000g离心15min，离心完成后，将上清倒掉；4)另取500mL的2YT-AK液体培养基将所得沉淀充分悬浮，置于37℃摇床中220rpm培养12h；5)同样将所得菌液分装后低温条件下转速10000g离心20min，离心完成后，收集上清，转移至无菌的三角瓶中；6)量取1/5上清体积的预冷过的PEG/NaCl加入三角瓶中，混匀后将三角瓶置于冰上静置2h；7)冰浴结束后，将溶液转移至离心管中，低温10000g离心20min，将上清液弃去，收集沉淀；8)加入2mL的PBS-1％ BSA将所得的沉淀重新悬浮，低温10000g离心10min，此时离心后，所得到的上清，即为重组噬菌体，将其转移至灭菌的离心管中，于4℃冰箱中保存；9)用K205R蛋白包被酶标板，用PBS将K205R蛋白进行稀释，按照10μg/孔的蛋白量完成抗原包被，于4℃包被过夜；10)倒掉包被液，PBST洗板5次，拍干，之后用PBS洗板5次，拍干；11)加入200μL/孔5％ PBSM，37℃封闭2h；12)封闭期间，取出8)中得到的重组噬菌体，并加入2mL的2％ PBSM，于室温下静置20min；13)封闭结束后，弃去封闭液，PBST洗板8次，拍干后，用PBS洗板5次，拍干；14)向酶标板中加入12)中处理过的噬菌体上清200μL，37℃孵育2h；15)弃去板中液体，PBST洗板10次，拍干后，用PBS洗8次，拍干，以除去游离的噬菌体粒子；16)向酶标板各个孔中加入200μL的0.2M Gly-HCl(pH＝2.5)进行洗脱，37℃缓慢摇动10min或手动振荡10min，之后立即添加相同体积的pH＝7.5的1M Tris-HCl缓冲液进行中和；17)将洗脱液及缓冲液的混合液体吸出转移至50mL无菌离心管中，同时向离心管中加入相同体积的新鲜TG1菌液中，于37℃摇床中转速150rpm慢摇培养1h，至此就完成了对抗体库的第一轮淘选，获得的抗体库即为一级噬菌体抗体库；18)用灭菌的2YT液体培养基将上一步培养的所得菌液上述步骤操作，对第一轮淘选所得到的抗体库，进行库容的测定。19)向所获得的一级抗体库中添加终浓度是100μg/mL的Amp+，置于37℃摇床中220rpm快摇培养1h，此时即开始第二轮淘选工作；20)补加2YT培养基使其最终体积为20mL，添加终浓度为2％葡萄糖溶液，以及5×1011pfu的辅助噬菌体M13KO7，于37℃、150rpm慢摇1h；21)低温10000g离心10min，将上清倒掉，将沉淀用100mL新的2YT-AK液体培养基重新悬浮，置于37℃摇床中220rpm快摇培养过夜；22)从步骤5)开始重复上述操作，进行第二轮淘选以及后续三、四轮淘选工作。
具体实验数据如表8所示，通过对每一轮淘选后得到的噬菌体进行滴定，结果表明携带抗K205R蛋白的单链抗体的噬菌体呈现逐轮递增的趋势，表现为库容量逐步增加，说明抗K205R蛋白的scFv得到了富集。
表8抗K205R蛋白单链抗体的富集情况
6.phage-ELISA分析单链抗体结合能力：
(1)四轮淘选特异性scFv富集程度分析：
完成上述淘选工作后，需要对每一轮淘选后得到的抗体库通过phage-ELISA分析，来反映特异性scFv是否得到有效富集，具体操作步骤如下：
1)用PBS将包被原K205R蛋白稀释为终浓度是10μg/mL，100μL/孔，同时100μL/孔的PBS为空白对照，100μL/孔的1％的BSA为阴性对照，100μL/孔的M13KO7作为阳性对照，4℃包被过夜；
2)第二天，弃去包被液，PBST洗板3次，拍干，用PBS洗板3次，拍干后，加入150μL/孔PBSM，于37℃，封闭2h；
3)弃去封闭液，用同样的方式洗涤板子，拍干后，向板中加入稀释100倍的各级抗体库，即原始抗体库、一、二、三、四级抗体库，于37℃孵育2h；
4)弃去板中液体，继续洗板，拍干后，以PBST为抗体稀释液，按照1：2000的比例将HRP标记的抗M13KO7的抗体进行稀释后，100μL/孔的量加入酶标板中，37℃，孵育1h；
5)弃去板中抗体，洗板，拍干后，按照索莱宝TMB显色试剂盒，将底物显色A液与B液等比例加入干净的EP管中混匀，混匀后分别加入100μL/孔混合液，轻轻摇晃，37℃避光条件下温育10min～30min；
6)每孔100μL加入硫酸为终止液并在15min内测定450nm处的吸光值，并做好相应的记录。
结果如图15所示，phage-scFv在OD450nm处的吸光值随着淘选次数的增加数值不断增加，未淘选时OD450nm为0.35，到第三轮淘选时OD450nm达到最大值1.50，而第四轮淘选后的数值为1.14，相对于前一轮数值有所下降，表明经过四轮特异性生物淘选过程，有效的富集了特异性抗ASFV K205R蛋白的噬菌体单链抗体。
(2)重组单链抗体结合能力分析：
从最后一次淘选的平板中随机挑选单克隆培养后验证其与K205R蛋白的结合能力，具体步骤如下：
同样用PBS将包被原K205R蛋白稀释至10μg/mL，100μL/孔，同时100μL/孔的PBS为空白对照，100μL/孔的1％的BSA为阴性对照，此时阳性对照为抗K205R蛋白卵黄抗体IgY，100μL/孔，4℃包被过夜；剩余步骤与上述步骤基本一致，不同之处在于封闭完成后加入的是从第四轮淘选后的平板上挑取的已鉴定为阳性的单克隆噬菌体的扩增产物，阳性对照孔则加入100μL按照1：2000的比例稀释的HRP标记的兔抗鸡抗体为二抗，其余操作完全一致。
利用phage-ELISA对39株单克隆与K205R蛋白的结合能力进行分析，判断标准为样品在OD450nm处的吸光值/阴性对照在OD450nm处的吸光值≥2.1，由图16可以看出绝大多数的单克隆均符合判断标准，因此大部分的单克隆与K205R蛋白有很好的结合能力，选择图中吸光值最高的7号单克隆，命名为S-7，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，用于后续scFv的表达。
7.单链抗体序列的分析：
选取phage-ELISA分析鉴定后吸光值较高的单克隆菌株，送公司测序，进一步对VH、VL氨基酸序列进行比对分析，具体步骤为：
选取结合能力较高的18株送公司进行测序，并使用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对分析，结果如图17所示在抗体分子的CDR区所有VH、VL对应的氨基酸序列与鸡胚系的基因序列相比有很大的差异，其中以CDR3区VH、VL氨基酸序列的变化最大；所有氨基酸在FR区变化较小，仅有少量氨基酸的变化，FR区的氨基酸序列本身就相对恒定，出现这种现象可能是在PCR过程中发生的碱基突变。
8.抗抗ASFV K205R蛋白单链抗体的表达：
(1)表达菌株的选择：
基于前面的phage-ELISA的分析结果，选择结合能力最好的单克隆进行后续表达实验；将单克隆接种于LBA液体培养基中于37℃，180rpm振荡培养12h，提取质粒，-20℃保存。
(2)单链抗体重组表达载体的构建：
1)scFv基因的扩增及回收：
为将scFv基因连接到pET-30a载体上，在扩增scFv基因时，需要引入新的酶切位点，PCR扩增引物见表8，PCR反应体系及PCR反应程序同前述步骤，经电泳检测后，进行胶回收，测定浓度，保存于-20℃。
表9 scFv基因扩增引物
| 引物序列 | 引物序列(5’-3’) | 酶切位点 |
| SF | GAAGATCTGGCCGTGACGTTGGACG | BglⅡ |
| SR | AATAAGCTTACCTAGGACGGTTCAGGG | HindⅢ |
2)重组载体的构建及鉴定:
将回收的scFv及提取的pET-30a质粒，用BglⅡ、HindⅢ进行双酶切，体系如表9所示。
表10双酶切体系情况表
| scFv | 3μL | pET-30a | 1μL |
| BglⅡ | 1μL | BglⅡ | 1μL |
| HindⅢ | 1μL | HindⅢ | 1μL |
| 10×Buffer | 2μL | 10×Buffer | 2μL |
| ddH2O | 13μL | ddH2O | 15μL |
| Total | 20μL | Total | 20μL |
于37℃水浴锅中酶切0.5h，酶切反应结束后，进行核酸电泳验证，对酶切产物进行回收。
回收后的产物利用T4连接酶进行16℃过夜连接，具体连接体系设置如表10所示。
表10连接体系情况表
| scFv | 3μL |
| pET-30a | 2μL |
| T4 DNA Ligase | 1μL |
| 10×T4 DNA Ligase Buffer | 2μL |
| ddH2O | 12μL |
| Total | 20μL |
连接反应完成后，首先将连接产物转化入DH5α克隆菌株中完成对质粒的扩增，取部分菌液进行质粒的提取，取10μL质粒送公司测序，测序分析正确后，将质粒再次转化入BL21表达菌株中培养。于-20℃保存菌种。
(3)单链抗体的诱导表达：
单链抗体的诱导表达方法同实施例1。
SDS-PAGE结果如图18所示，在对应位置出现与预期一致的大小为33KDa的条带，表明抗体诱导表达成功。
如图19所示，通过可溶性分析，表明scFv主要存在于沉淀中，表明所表达的scFv主要以包涵体的形式存在。
经过Western Blot验证，如图20所示，结果显示在对应位置出现与预期一致的大小为33KDa的条带，表明scFv表达成功。
(4)单链抗体的纯化
特异性单链抗体的纯化方法同实施例1，
经过条件优化后确定了最佳诱导条件为0.1mM的IPTG，37℃诱导5h，按照该条件诱导表达，经包涵体变性复性之后，利用SDS-PAGE进行验证，结果如图21所示，单链抗体纯化成功，且条带单一，经计算得蛋白浓度为2.04mg/mL。
(5)单链抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记
利用HRP偶联试剂盒(过碘酸盐法)将特异性单链抗体进行HRP标记。
实施例3
将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：
三、间接竞争ELISA检测非洲猪瘟ASFV方法的建立：
1.操作程序：
1)96孔板的包被：
取包被缓冲液稀释纯化的K205R蛋白100μL滴加到96孔板中，4℃包被12h。
2)封闭：
用3％的脱脂奶粉封闭96孔反应板，每孔加入300μL封闭液，封闭后，用洗涤液洗涤3次。
3)竞争反应：
取抗ASFV K205R单链抗体50μL分别与非洲猪瘟阳性和阴性血清50μL，混合后滴加到96孔板中，37℃孵育1h，随后用含有0.5％吐温-20的洗涤液(PBST)洗涤3次。
4)显色
将底物显色液TMB向每个反应孔中加入100μL，37摄氏度避光显色15min，随后每孔加入100μL终止液(2mol/L H2SO4)终止反应。
5)反应结果测定：
用自动酶标测定仪测定每孔在波长450nm处的吸光值(OD450nm)。最终，OD450nm的阳性/阴性值(P/N)最低，确定该抗体为最佳竞争抗体。
2.包被抗原包被质量浓度确定和抗ASFV K205R单链抗体稀释倍数的选择：
采用直接ELISA棋盘格滴定实验法确定包被抗原包被质量浓度和抗体的最佳稀释倍数，具体稀释比例：包被量抗原(200ng、400ng、800ng和1600ng/孔)和抗ASFV K205R单链抗体稀释倍数(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256)按比例稀释，然后分别加入到每孔中，最后经过酶标仪测定读数，当OD450nm值接近1.0时确定最佳工艺条件，结果如表11所示，OD值在1.0左右时的包被抗原质量浓度为800ng/孔，抗ASFV K205R单链抗体稀释倍数为1：16。
表11不同HRP标记的抗ASFV K205R单链抗体的稀释倍数的情况表
3.试验猪血清的稀释度的优化：
将阳性血清和阴性血清分别稀释为1:10、1:50、1:100、1:500进行cELISA检测，结果如图22所示，在阳性和阴性血清的cELISA中检测猪血清的不同稀释倍数，猪血清的最佳稀释倍数为1:10。
4.最佳竞争时间和最佳显色时间的确定：
在竞争反应中，将试验猪血清与K205R蛋白抗原的单链抗体的竞争时间分别设为20min、40min和60min，随后通过酶标仪测定相应的数值。在显色反应中，将TMB的显色反应分别设为15min和20min，其余条件不变，最后通过酶标仪测定相应数值，当阳性血清与阴性血清的OD450nm值之比(P/N)达到最小时，得到优化条件；结果如图23和24所示，确定抗原-抗体反应的最佳孵育时间为40min，此时P/N值最小，为0.15，加入TMB进行比色反应后，孵育15min后，此时P/N值最小，为0.18。
5.间接竞争ELISA检测非洲猪瘟(ASFV)方法灵敏性和特异性的研究：
将阳性血清和阴性血清稀释到不同比例(1:10，1:100，1:1000and1:10000)，然后按照前面优化好的检测条件进行灵敏度的检测，具体步骤为：
使用cELISA检测不同浓度的非洲猪瘟血清阳性样品，结果如图25所示，当非洲猪瘟血清阳性样本稀释至1:1000，PI值仍大于36％，因此对于大多数非洲猪瘟血清阳性样本，检测抗非洲猪瘟抗体的最大稀释倍数为1:1000。
选择猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、伪狂犬病毒(PRV)等常见的猪病病毒的阳性血清对建立的检测方法进行特异性研究，按照前面优化好的反应条件进行检测，结果如图26所示，只有非洲猪瘟血清阳性样本能够与被膜K205R蛋白竞争HRP标记的抗ASFV K205R蛋白单链抗体蛋白，其他阳性血清无阳性反应。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (2)
1.一种检测非洲猪瘟的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种检测非洲猪瘟的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的单链抗体和K205R蛋白。
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