CN112592401A - 一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法 - Google Patents

一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH‑VLλ11及其制备方法。ScFv抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，提取分离淋巴细胞的总mRNA，通过RT‑PCR的方法得到总cDNA片段，以cDNA为模板，在相应的带有Linker接头的引物的作用下，通过SOE‑PCR的方法得到猪源ScFv抗体基因序列，将ScFv抗体基因序列构建至PET‑30a载体，转化BL21（DE3）感受态细胞，筛选得到一个针对于非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH‑VLλ11，对筛选得到的ScFv抗体VH‑VLλ11进行初步活性鉴定发现此抗体具有非洲猪瘟反应活性。本发明的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。

Description

一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine feverVirus,ASFV)引起的猪的一种高度致死性出血性疾病，具有高度接触性传染的特点。ASFV是一种直径为200nm的正二十面体双链DNA病毒，为非洲猪瘟病毒科的唯一成员，是已知的唯一以媒介虫传播的病毒。非洲猪瘟在1921年首次爆发于非洲肯尼亚，于2018年8月传入我国，截至2019年2月，全国已有24个省份发生非洲猪瘟疫情，给养猪业造成巨大的经济损失。目前世界范围内还没有针对此病毒的有效疫苗，因此非洲猪瘟的早期诊断对该病的防控起着至关重要的作用。抗体是体液免疫中的关键效应分子，也是疫苗和诊断试剂中的核心成分，抗体的研发对非洲猪瘟的防控起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难，此时，一种新型抗体的研发与制备可能成为了防控此病的突破口。中国发明专利(公布号CN 110078819A)一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法，该抗体是通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。该专利得到的抗体为禽源非洲猪瘟抗体，存在异源性反应，且没有克服常规抗体分子量较大的问题。
单链抗体作为第三代抗体(基因工程抗体)的一种，受到人们的广泛关注。单链抗体是一种比常规抗体分子量小的抗体，只含有重链可变区与轻链可变区，因此单链抗体具有很好的穿透性，易透过血管壁与靶细胞进行接触，适用于肿瘤的诊断和治疗；此外单链抗体因很好的保留了可变区域，因此对原抗原依然具有准确的特异性与亲和性；单链抗体作为一种人工合成的抗体，还易于进行分子的改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用；单链抗体最突出的特点是克服了传统单克隆抗体鼠源性强的特点，消除了抗体应用上的异源性反应，扩宽了抗体的应用范围。凭借以上特性单链抗体与普通抗体相比有很大优势。因此，单链抗体在疾病的治疗与诊断中具有很大的价值。
回顾近些年来抗体领域的发展情况，传统的抗体已不能满足目前抗体市场的需求，人们急需一种制备简便、特异性强、稳定性高且分子量小的灵活抗体，使其高效作用于特定部位。为此，实现抗体小型化靶向癌细胞内效应分子或者其他靶细胞一直是抗体工程与抗癌研究的重要目标和研究热点。
综上所述，通过制备具有ASFV特异性、生物活性好、结合抗原能力强、具有潜在中和功能的抗体，尤其是单链抗体之类的新型抗体，对于建立敏感的ASFV的临床诊断方法，控制ASF的疫情蔓延具有及其重要的意义。
中国发明专利(公开号CN 111040031 A)和中国发明专利(公开号CN 111560069A)均公开了一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体，但这两种抗体的轻链均为κ轻链。现有技术尚未公开轻链为κ轻链以外的、抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体。
发明内容
本发明提供一种非洲猪瘟病毒特异性的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11，所述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1
MEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSEYEFRGSLIHWVRQAPGKGLEWLATICTTDPITEYADSVKGRFTISRDSSQNTAYLQMDSLRGEDTARYYCGVAFSYGGGCHRMDLRGQGVEVVV；
SEQ ID NO:2：
MSQTVIQEPAMSVSPGGTVTLTCAFSSGSESTRKYPIRFQQTPGQPPRLLIYHTNSRPTGVPSRFSGAISGNKAALTITGAQAEDEADYFCSLYIRTYNVPFGGGTHLTVL。
本发明第二方面提供编码上述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段和编码上述ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段。
优选的，编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:3所示，编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:3：
5’-ATGGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGAATACGAATTCCGTGGATCCTTGATTCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTGCAACTATCTGTACTACTGATCCTATAACGGAATACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGGCGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGGAGTTGCCTTCAGCTATGGGGGGGGCTGTCATCGAATGGATCTCAGGGGCCAAGGCGTTGAAGTCGTCGTG-3’；
SEQ ID NO:4：
5’-ATGTCTCAGACTGTGATCCAGGAGCCGGCGATGTCAGTGTCTCCTGGAGGGACCGTCACACTCACCTGTGCCTTTAGCTCAGGGTCAGAATCTACTAGGAAGTACCCCATTAGGTTCCAGCAGACACCAGGCCAGCCTCCCCGACTGCTGATCTACCACACCAATAGCCGCCCGACTGGGGTCCCCAGTCGCTTCTCTGGAGCCATCTCTGGGAACAAAGCCGCCCTCACTATCACGGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTATTTCTGTAGTCTCTATATAAGGACTTATAATGTTCCCTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCG-3’。
本发明第三方面提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段和编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有上述重组表达载体。
本发明第五方面，提供一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的制备方法，包括以下步骤：
(1)淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
(2)淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤(1)分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
(3)全基因cDNA合成：
以步骤(2)提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
(4)第一轮扩增：
以步骤(3)合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；W1、Q1为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98℃ 2min，98℃ 10s、52℃ 5s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min；98℃2min，98℃ 10s、53℃ 5s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min.。将扩增产物电泳，纯化收集300bp产物，-20℃保存备用；
P1:5’-CACGACGACTTCAACGCCTGGG-3’，
R1:5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCTG-3’，
W1:5’-CGAGGACGGTCAGATGGGTC-3’，
Q1:5’-TCTCAGACTGTGATCCAGGAGC-3’。
(5)第二轮扩增：
以第一轮扩增产物为模板，以P1、R2；W2、Q1为引物进行第二轮扩增，扩增程序分别为：98℃ 2min，98℃ 10s、56℃ 5s、72℃ 30s、35个循环，72℃ 10min；98℃ 2min，98℃10s、68℃ 30s、35个循环，72℃ 10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集320bp产物，置-20℃保存备用；
R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCTG-3’，W2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCCGAGGACGGTCAGATGGGTC-3’。
(6)第三轮扩增：
以第二轮扩增产物为模板，以P1、Q1为引物进行第三轮扩增，扩增程序为：①无引物：98℃ 2min，98℃ 10s、68℃ 30s、10个循环，72℃ 10min。②有引物：98℃ 2min，98℃10s、55℃ 5s、72℃ 50s、35个循环，72℃ 10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集800bp产物，置-20℃保存备用。
(7)T-A克隆鉴定：
I：将第三轮扩增产物进行3’端加“A”处理，反应程序为65℃10min；
II：将加A产物连接至PMDTM20-T载体上，连接程序为16℃(金属浴)30min；
III：将连接产物转化至E.coli JM109感受态中，100μL感受态细胞转化10μL连接产物，将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，送测序，筛选出基因序列正确的质粒。
(8)ScFv抗体VH-VLλ11的构建与制备：
制备BL21(DE3)感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL由测序正确的扩增产物构建的ScFv-PET-30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，既得抗非洲猪瘟ScFv抗体VH-VLλ11。
在本发明中，优选的，所述的淋巴细胞分离是按照以下步骤进行：
(1)自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的抗凝血中加入等量的全血稀释液，混匀，得到抗凝血的稀释液；
(2)以抗凝血的稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入步骤(1)得到抗凝血的稀释液，水平离心机1800rpm，18～22℃，30min；
(3)小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min离心；沉淀用5mL无RNA酶水重悬，随即加入45mL RPIM-1640培养液混匀，1000rpm，18～22℃，10min离心，沉淀即为淋巴细胞淋巴细胞，并将其重悬于RNALater保存液中，置-70℃保存备用。
在本发明中，优选的，所述的淋巴细胞总mRNA的提取按照以下方法进行：吸取上述淋巴细胞液400μL，加入1mL TRizol，混匀，4℃静置5min；加入250μL三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450μL上清，加等量异丙醇，-20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25μL无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA。
在本发明中，优选的，所述的全基因cDNA合成是在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
Figure BDA0002832052440000051
Figure BDA0002832052440000061
混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置-20℃保存备用。
在本发明中，优选的，所述的第一轮扩增是在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
①:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
P1引物(10pmol/μL) 1.5μl
R1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
②:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
W1引物(10pmol/μL) 1.5μl
Q1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
在步骤(4)所述扩增程序下进行第一轮扩增，将扩增产物电泳，纯化收集目标产物，-20℃保存备用。
在本发明中，优选的，所述的第二轮扩增是在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
①:
Figure BDA0002832052440000062
Figure BDA0002832052440000071
②:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
W2引物(10pmol/μL) 1.5μl
Q1引物(10pmol/μL) 1.5μl
第一轮扩增产物<sup>②</sup> 0.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 32μl
总体积 50μl
在步骤(5)所述扩增程序下进行第二轮扩增，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，置-20℃保存备用。
在本发明中，优选的，所述的第三轮扩增是在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
①:
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
第二轮扩增产物<sup>①</sup> 1μl
第二轮扩增产物<sup>②</sup> 1μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 31.5μl
总体积 48μl
②:补充引物
试剂材料 体积
P1引物(10pmol/μL) 1μL
Q1引物(10pmol/μL) 1μL
在步骤(6)所述扩增程序下进行第三轮扩增，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，置-20℃保存备用。
在本发明中，优选的，所述的T-A克隆鉴定是先于0.2mL的PCR扩增管中依次进行I、II 2个程序，再于1.5mL离心管中进行程序III：
I
试剂材料 体积
第三轮扩增产物 8μl
10×Buffer 1μL
dATP Mixture 0.5μl
A-overhang enzyme 0.5μl
总体积 10μl
II
试剂材料 体积
I加A产物 2μl
PMD<sup>TM</sup>20-T vector 1μL
DEPC水 2μl
Ligation Mighty Mix 5μl
总体积 10μl
III
试剂材料 体积
II全部连接产物 10μl
E.coli JM109 100μL
本发明第六方面，提供抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、编码ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、重组表达载体或宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒诊断试剂、非洲猪瘟病毒治疗试剂或抗原表位研究制品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明采用ELISA检测技术及间接免疫荧光实验(IFA)对所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11进行反应活性鉴定，结果表明所制备的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11具有非洲猪瘟反应活性。
本发明的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11具有非洲猪瘟反应活性显著高于VH-VLκ，如图6所示，ScFv抗体VH-VLλ11与非洲猪瘟全病毒的反应物的OD450nm值可达1.12，ScFv抗体VH-VLλ11与非洲猪瘟病毒P30蛋白的反应物的OD450nm值约为2.95。
本发明的提出为非洲猪瘟的早期诊断与防控提供新的材料，为尽快控制非洲猪瘟的疫情传播提供了新的技术支持。
附图说明
图1中1a为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第一轮扩增VH的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000相对分子质量标准；1～2：第一轮扩增VH产物；
1b为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第一轮扩增VLλ琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000相对分子质量标准；1～2：第一轮扩增VLλ产物。
图2中2a为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第二轮扩增VH-Linker的琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000相对分子质量标准；1：目的条带；
2b为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第二轮扩增VLλ-Linker的琼脂糖凝胶电泳图。M：DL2000相对分子质量标准；1～2：目的条带。
图3为猪外周血淋巴细胞ds cDNA第三轮扩增VH-VLλ琼脂糖凝胶电泳图；M：DL2000相对分子质量标准；1：目的条带。
图4为猪外周血淋巴细胞T-A克隆鉴定的质粒PCR扩增结果；M：DL2000相对分子质量标准；1～22：单克隆菌落的质粒PCR结果。
图5为VH-VLλ11基因表达的特异蛋白条带。M：蛋白质分子质量标准，1、2：抗非洲猪瘟ScFv抗体VH-VLλ11表达纯化产物。
图6为VH-VLλ11基因表达的产物检测非洲猪瘟病毒全病毒结果图。Positive表示VH-VLλ11包被板+ASFV+阳性血清+猪二抗，Negative表示VH-VLλ11包被板+ASFV+阴性血清+猪二抗；blank control表示VH-VLλ11包被板+ASFV+血清稀释液+猪二抗，Positivecontrol表示VH-VLλ11包被板+ASFV+血清稀释液+P30-HRP。
图7为ASFV灭活抗原检测VH-VLλ11基因表达的产物结果图。ScFv表示ASFV包被板+VH-VLλ11+HIS二抗；Negative control表示ASFV包被板+稀释液+HIS二抗。
图8为VH-VLλ11基因表达的产物检测ASFV-p30蛋白结果图。ScFv表示ASFV-p30蛋白包被板+VH-VLλ11+HIS二抗，Negative control表示ASFV-p30蛋白包被板+稀释液+HIS二抗。
图9为IFA鉴定ScFv抗体VH-VLλ11活性。ASFV+表示ASFV接毒组，ASFV-表示对照组；DAPI为细胞核染色结果图，Alexa Fluor 555为市售产品，表示荧光染料及其波长通道，代表红色荧光；merged表示组合图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
一、抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的制备
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物
一头非洲猪瘟免疫耐过猪(5个月，来自河南新乡某猪场)。
1.1.2菌株和试剂
LTS1110猪外周血淋巴细胞分离液Kit购自天津灏洋生物制品公司；PMDTM20-T载体、E.coli JM109感受态、
Figure BDA0002832052440000101
HS DNA Polymerase、RNase-free Water、DL2,000DNA Marker、6×Loading Buffer均购自宝生物公司；Unstained protein MW marker(26610)购自Thermo Fisher Scientific公司；BL21(DE3)感受态购自北京全式金；Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；分子生物学试剂来自Sigma公司；其他生化试剂均为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1淋巴细胞分离
颈静脉采集猪抗凝血100mL，等量加入全血稀释液，混匀；以体积比为5:9的比例先加淋巴细胞分离液，之后先慢后快加稀释好的抗凝血，水平离心机1800rpm，18～22℃，20min；小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释之，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min离心；弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液并且计数后并悬浮于RNA保存液(RNAlater)中，置-70℃保存备用。
1.2.2淋巴细胞总mRNA的提取
吸取上述淋巴细胞液400ul，加入1mLTRizol，混匀，4℃静置5min；加入250ul三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450ul上清，加等量异丙醇，-20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25ul无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA，ND2000测得Total mRNA浓度为356ng/ul，纯度OD260/OD280为1.87。
1.2.3引物的设计
第一轮扩增引物：
P1:5’-CACGACGACTTCAACGCCTGGG-3’，
R1:5’-GAGGWGAAGCTGGTGGAGTCTG-3’，
W1:5’-CGAGGACGGTCAGATGGGTC-3’，
Q1:5’-TCTCAGACTGTGATCCAGGAGC-3’。
其中，引物P1和R1用于扩增VH序列，引物W1和Q1用于扩增VLλ序列。
第二轮扩增引物：
P1:5’-CACGACGACTTCAACGCCTGGG-3’，
R2:5’-GCCGCCTGACCCTCCGCCACCGAGGWGAAGCTGGTGGAGTCTG-3’，
W2:5’-GGTGGCGGAGGGTCAGGCGGCCGAGGACGGTCAGATGGGTC-3’。
Q1:5’-TCTCAGACTGTGATCCAGGAGC-3’。
其中，引物P1和R2用于扩增VH-Linker序列，引物W2和Q1用于扩增VLλ-Linker序列。
第三轮扩增引物：
P1:5’-CACGACGACTTCAACGCCTGGG-3’，
Q1:5’-TCTCAGACTGTGATCCAGGAGC-3’。
引物P1、Q1用于扩增VH-VLλ序列。
1.2.4 cDNA合成双链及纯化
1.2.4.1全基因cDNA合成
在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
试剂材料 体积
DEPC水 4.5μL
5×First strand Buffer 4μL
DTT(0.1M) 2μL
Oligo(dT) 1μL
RRI 1μL
dATP 1μL
Radom primers 0.5μL
M-MLV逆转录(200u/ul) 1μL
mRNA 5μL
总体积 20μL
混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置-20℃保存备用。
1.2.4.2第一轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：
①用于扩增VH序列：
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
P1引物(10pmol/μL) 1.5μl
R1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
②用于扩增VLλ序列
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
全长cDNA 2.5μl
W1引物(10pmol/μL) 1.5μl
Q1引物(10pmol/μL) 1.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 30μl
总体积 50μl
上述扩增程序分别为①：98℃ 2min，98℃ 10s、52℃ 5s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min；②：98℃ 2min，98℃ 10s、53℃ 5s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min.。将扩增产物电泳，纯化收集目标产物，-20℃保存备用。
1.2.4.3第二轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中分别依次加入下列组分：
①用于扩增VH-Linker序列
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
P1引物(10pmol/μL) 1.5μl
R2引物(10pmol/μL) 1.5μl
第一轮扩增产物<sup>①</sup> 0.5μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 32μl
总体积 50μl
②用于扩增VLλ-Linker序列
Figure BDA0002832052440000121
Figure BDA0002832052440000131
上述扩增程序分别为：①：98℃ 2min，98℃ 10s、56℃ 5s、72℃ 30s、35个循环，72℃ 10min；②：98℃ 2min，98℃ 10s、68℃ 30s、35个循环，72℃ 10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，置-20℃保存备用；
1.2.4.4第三轮扩增
在0.2mL的PCR扩增管中依次加入下列组分：
①无引物，VH-VLλ的预拼接
试剂材料 体积
5×PCR缓冲液 10μL
dNTP Mixture 4μl
第二轮扩增产物<sup>①</sup> 1μl
第二轮扩增产物<sup>②</sup> 1μl
DNA聚合酶混合物 0.5μL
DEPC水 31.5μl
总体积 48μl
②补充引物，VH-VLλ的扩增
试剂材料 体积
P1引物(10pmol/μL) 1μL
Q1引物(10pmol/μL) 1μL
上述扩增程序分别为：①无引物：98℃ 2min，98℃ 10s、68℃ 30s、10个循环，72℃10min。②有引物：98℃ 2min，98℃ 10s、55℃ 5s、72℃ 50s、35个循环，72℃ 10min。扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，即为所扩增目的产物VH-Linker-VLλ6(简称为VH-VLλ6)，置-20℃保存备用。
1.2.5 T-A克隆鉴定
先在0.2mL的PCR扩增管中依次进行下列2个程序，再在1.5mL离心管中进行程序III：
I第三轮扩增产物序列后面加“A”
Figure BDA0002832052440000132
Figure BDA0002832052440000141
II I加A产物连接到T载体上
试剂材料 体积
I加A产物 2μl
PMD<sup>TM</sup>20-T vector 1μL
DEPC水 2μl
Ligation Mighty Mix 5μl
总体积 10μl
III转化
II全部连接产物 10μl
E.coli JM109 100μL
上述程序分别为I：65℃10min；II：16℃(金属浴)30min；III：将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，测序。
1.2.6基因序列的比对
将上述测序结果与NCBI网站上发布的猪源抗体重链可变区序列、轻链lamda链进行基因序列的比对，所用比对软件为DNA star，比对结束后，将正确的基因序列送由武汉金开瑞公司进行ScFv-PET-30a质粒的构建，得到VH-VLλ11-PET-30a质粒，VH-VLλ11位于PET-30a的NdeI和XhoI酶切位点之间。
1.2.7抗体的构建与制备
准备BL21(DE3)感受态细胞，每50μL感受态细胞转化1μL VH-VLλ11-PET-30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8-16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，37℃诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，既得抗非洲猪瘟ScFv抗体VH-VLλ11。
1.2.8 ELISA鉴定抗体活性
1.2.8.1
取纯化的ScFv抗体VH-VLλ11(0.18mg/mL)，按照1:4的比例包被检测板，包被完成后，加入50μL灭活非洲猪瘟病毒抗原，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，分别加入50μL 1:5稀释的非洲猪瘟阳性血清2孔、1:5稀释的健康猪血清2孔、血清稀释液4孔，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，前6孔加入50μL 1:15000稀释的HRP标记的猪二抗、后2孔加入50μL 1:15000稀释的P30-HRP，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
1.2.8.2
取ASFV灭活抗原1:2包被检测板，包被完成后，分别加入50μL 1:8稀释的VH-VLλ11抗体蛋白(0.4mg/mL)、稀释液，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:5000稀释的兔抗猪HIS-HRP，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
1.2.8.3
取麦芽糖标签的P30蛋白1：400包被检测板，包被完成后，分别加入50μL 1:16稀释的VH-VLλ11抗体蛋白(0.4mg/mL)、稀释液，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:5000稀释的兔抗猪HIS-HRP，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
1.2.8.4
取麦芽糖标签的P30蛋白1：40包被检测板，包被完成后，1：4始梯度加入ASFV阳性血清、ASFV阴性血清、血清稀释液各一列，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入1:80稀释的VH-VLλ11蛋白(0.4mg/mL)，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1:5000稀释的兔抗猪HIS-HRP，37℃温箱孵育30min，250μL PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL TMB底物溶液，37℃温箱孵育15min，加入50μL终止液(H2SO4)，在分光光度仪上读取反应物的OD450nm值。
1.2.9 IFA鉴定抗体活性
以ASFV接种猪PAMS细胞，同时设立阴性对照，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗三次，0.1％Triton-100室温透膜15min，PBS洗三次，再以5％Blocker BSA室温封闭15min后，加入VH-VLλ11抗体(1:200)4℃孵育过夜，PBS洗三次，6x-His Tag Monoclonal Antibody(HIS.H8),Alexa Fluor 555(1:60)室温避光染色1h，PBS洗三次，加入DAPI染核10min，PBS洗三次，上镜观察。
2.结果
2.1 cDNA合成双链的琼脂糖凝胶电泳
取第一轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集300bp条带。取第二轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集300bp左右条带。取第三轮扩增的ds cDNA产物进行电泳，收集800bp左右条带。如图1、图2、图3所示。
2.2 T-A克隆后的质粒PCR结果
将连接好的PMDTM20-T-A进行质粒PCR鉴定，挑选基因大小在800bp左右的质粒送测序，质粒PCR鉴定结果如图4所示。
VH-Linker-VLλ挑选了14个单克隆，经测序后发现其序列与猪免疫球蛋白可变区序列的框架区基本一致、CDR区存在差异，符合猪轻重链可变区基因结构，其中VH部分为342bp～375bp，VLλ部分为331bp～346bp，重链和轻链之间的Linker碱基序列全部正确。
其中，VH-Linker-VLλ11大小为720bp，核苷酸序列如下所示，下划线所示序列为Linker序列：
5’-ATGGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGAATACGAATTCCGTGGATCCTTGATTCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTTGCAACTATCTGTACTACTGATCCTATAACGGAATACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGGACAGCCTGAGAGGCGAAGACACGGCCCGCTATTACTGTGGAGTTGCCTTCAGCTATGGGGGGGGCTGTCATCGAATGGATCTCAGGGGCCAAGGCGTTGAAGTCGTCGTGGGTGGC GGAGGGTCAGGCGGCATGTCTCAGACTGTGATCCAGGAGCCGGCGATGTCAGTGTCTCCTGGAGGGACCGTCACACTCACCTGTGCCTTTAGCTCAGGGTCAGAATCTACTAGGAAGTACCCCATTAGGTTCCAGCAGACACCAGGCCAGCCTCCCCGACTGCTGATCTACCACACCAATAGCCGCCCGACTGGGGTCCCCAGTCGCTTCTCTGGAGCCATCTCTGGGAACAAAGCCGCCCTCACTATCACGGGGGCCCAGGCTGAGGACGAGGCCGACTATTTCTGTAGTCTCTATATAAGGACTTATAATGTTCCCTTCGGCGGTGGGACCCATCTGACCGTCCTCG-3’。
2.3 ScFv抗体基因序列比对
将测序合适的基因序列与NCBI网站上发布的猪源抗体可变区序列进行基因序列的比对。
2.3.1 VH序列比对
猪源IGG的VH序列：
EENLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTSSSYGMWVRQAPGKGLEWLACIYSSGSRTYYADSVKGRCTISRDNSQNTAYLQMDSLRTEDTAHYYCVTGDASWCPFRKVHLWGPGVEVVVSS。
VH-VLλ11的VH序列：
MEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSEYEFRGSLIHWVRQAPGKGLEWLATICTTDPITEYADSVKGRFTISRDSSQNTAYLQMDSLRGEDTARYYCGVAFSYGGGCHRMDLRGQGVEVVV。
2.3.2 VLλ序列比对
猪源IGG的VLλ序列：
VIQEPAMSVSLGGTVTLTCAFSSGSVTSSDYPGWFQQTPGQPPRTVIYSTNSRPTGVPSRFSGAISGNKATLTITGAQAEDEADYFCALRKSGGTVTFGGGTHVTVL。
VH-VLλ11的VLλ序列：
MSQTVIQEPAMSVSPGGTVTLTCAFSSGSESTRKYPIRFQQTPGQPPRLLIYHTNSRPTGVPSRFSGAISGNKAALTITGAQAEDEADYFCSLYIRTYNVPFGGGTHLTVL。
2.4 ScFv抗体VH-VLλ11基因的表达
37℃诱导后出现1条大小为27kDa的特异蛋白条带，结果与预期相符，如图5所示。并在诱导剂浓度为1/1000(终浓度为0.1mM)、诱导时间为6h时，表达量达高峰。
2.5 ELISA鉴定ScFv抗体VH-VLλ11活性
2.5.1
将VH-VLλ11基因表达产物包被检测板，按照1.2.8.1所述程序进行检测，检测结果表明所表达的产物可以与非洲猪瘟全病毒抗原发生特异性结合，如图6所示。且极有可能是针对于P30位点的。
2.5.2
将ASFV灭活抗原包被检测板，按照1.2.8.2所述程序进行检测，检测结果表明ASFV与表达产物发生了特异性结合，如图7所示。
2.5.3
将ASFV-P30蛋白包被检测板，按照1.2.8.3所述程序进行检测，检测结果表明ASFV-P30与表达产物发生了特异性结合，如图8所示。
2.5.4
固定P30蛋白浓度，按照1.2.8.4所述程序进行检测，检测结果表明，VH-VLλ11抗体具有阻断效果。
表1 VH-VLλ11蛋白的阻断ELISA鉴定
VH-VLλ11 阴性对照
阻断率 72.66％ 29.1％
2.6 IFA鉴定ScFv抗体VH-VLλ11活性
以6x-His Tag Monoclonal Antibody(HIS.H8),Alexa Fluor 555进行VH-VLλ11抗体的荧光染色，结果显示VH-VLλ11可与处于细胞质中的ASFV发生反应，如图9所示。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11及其制备方法
<130> 无
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（ARTIFICIAL SEQUENCE）
<400> 1
Met Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Glu Tyr Glu Phe Arg Gly
20 25 30
Ser Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Leu Ala Thr Ile Cys Thr Thr Asp Pro Ile Thr Glu Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Gln Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr
85 90 95
Cys Gly Val Ala Phe Ser Tyr Gly Gly Gly Cys His Arg Met Asp Leu
100 105 110
Arg Gly Gln Gly Val Glu Val Val Val
115 120
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
Met Ser Gln Thr Val Ile Gln Glu Pro Ala Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Phe Ser Ser Gly Ser Glu Ser Thr
20 25 30
Arg Lys Tyr Pro Ile Arg Phe Gln Gln Thr Pro Gly Gln Pro Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr His Thr Asn Ser Arg Pro Thr Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ala Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly
65 70 75 80
Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ser Leu Tyr Ile Arg
85 90 95
Thr Tyr Asn Val Pro Phe Gly Gly Gly Thr His Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 3
atggaggtga agctggtgga gtctggagga ggcctggtgc agcctggggg gtctctgaga 60
ctctcctgtg tcggctctga atacgaattc cgtggatcct tgattcactg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtggcttgca actatctgta ctactgatcc tataacggaa 180
tacgcagact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acagctccca gaacacggcc 240
tatctgcaaa tggacagcct gagaggcgaa gacacggccc gctattactg tggagttgcc 300
ttcagctatg gggggggctg tcatcgaatg gatctcaggg gccaaggcgt tgaagtcgtc 360
gtg 363
<210> 4
<211> 334
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 4
atgtctcaga ctgtgatcca ggagccggcg atgtcagtgt ctcctggagg gaccgtcaca 60
ctcacctgtg cctttagctc agggtcagaa tctactagga agtaccccat taggttccag 120
cagacaccag gccagcctcc ccgactgctg atctaccaca ccaatagccg cccgactggg 180
gtccccagtc gcttctctgg agccatctct gggaacaaag ccgccctcac tatcacgggg 240
gcccaggctg aggacgaggc cgactatttc tgtagtctct atataaggac ttataatgtt 300
cccttcggcg gtgggaccca tctgaccgtc ctcg 334
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 5
cacgacgact tcaacgcctg gg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 6
gaggwgaagc tggtggagtc tg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 7
cgaggacggt cagatgggtc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 8
tctcagactg tgatccagga gc 22
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 9
gccgcctgac cctccgccac cgaggwgaag ctggtggagt ctg 43
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 10
ggtggcggag ggtcaggcgg ccgaggacgg tcagatgggt c 41

Claims (10)

1.一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11，其特征在于，所述ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.编码权利要求1中所述的抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，编码ScFv抗体VH-VLλ11的重链可变区的DNA片段如SEQ ID NO:3所示，编码ScFv抗体VH-VLλ11的轻链可变区的DNA片段如SEQ IDNO:4所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2中的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求4所述的重组表达载体。
6.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒诊断试剂中的应用。
7.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备非洲猪瘟病毒治疗试剂中的应用。
8.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11、权利要求2所述的编码抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体VH-VLλ11的DNA片段、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备抗原表位研究制品中的应用。
9.权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）淋巴细胞分离：
从自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的外周血中分离得到淋巴细胞，保存备用；
（2）淋巴细胞总mRNA的提取：
提取步骤（1）分离得到的淋巴细胞的总mRNA；
（3）全基因cDNA合成：
以步骤（2）提取的淋巴细胞的总mRNA为模板，合成全基因cDNA；
（4）第一轮扩增：
以步骤（3）合成的全基因cDNA为模板，以P1、R1；W1、Q1为引物进行第一轮扩增，扩增程序分别为：98°C 2min，98°C 10s、52°C 5s、72°C 30s、30个循环，72°C 10min；98°C 2min，98°C 10s、53°C 5s、72°C 30s、30个循环，72°C 10min，将扩增产物电泳，纯化收集目标产物，-20℃保存备用；
（5）第二轮扩增：
以第一轮扩增产物为模板，以P1、R2；W2、Q1为引物进行第二轮扩增，扩增程序分别为：98°C 2min，98°C 10s、56°C 5s、72°C 30s、35个循环，72°C 10min；98°C 2min，98°C 10s、68°C 30s、35个循环，72°C 10min，扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，置-20°C保存备用；
（6）第三轮扩增
以第二轮扩增产物为模板，以P1、Q1为引物进行第三轮扩增，扩增程序为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
无引物：98°C 2min，98°C 10s、68°C 30s、10个循环，72°C 10min；
Figure 811032DEST_PATH_IMAGE002
有引物：98°C 2min，98°C 10s、55°C 5s、72°C 50s、35个循环，72°C 10min；扩增产物电泳，凝胶回收试剂盒从凝胶中纯化收集目标产物，置-20°C保存备用；
（7）T-A克隆鉴定
Figure DEST_PATH_IMAGE003
：将第三轮扩增产物进行3’端加“A”处理，反应程序为65℃ 10min；
Figure 790489DEST_PATH_IMAGE004
：将加A产物连接至PMDTM20-T载体上，连接程序为16℃30min；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
：将连接产物转化至E.coli JM109感受态中，100µL感受态细胞转化10µL连接产物，将转化的菌液均匀涂布于LB-A+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-A+液体培养基中培养，提取质粒，送测序，筛选出基因序列正确的质粒；
（8）ScFv抗体VH-VLλ11的构建与制备：
制备BL21感受态细胞，每50µL感受态细胞转化1µL 由测序正确的扩增产物构建的ScFv-PET-30a质粒，将转化的菌液均匀涂布于LB-K+平板上，37℃倒置培养8～16h直至单克隆出现，挑取单克隆菌落于LB-K+液体培养基中，诱导表达抗体蛋白，对表达的抗体蛋白进行收集、洗涤、纯化，既得抗非洲猪瘟ScFv抗体VH-VLλ11。
10.根据权利要求9所述的一种抗非洲猪瘟病毒的ScFv抗体VH-VLλ11的制备方法，其特征在于，
所述的淋巴细胞分离是按照以下步骤进行：
（1）自然感染非洲猪瘟免疫耐过猪的抗凝血中加入等量的全血稀释液，混匀，得到抗凝血的稀释液；
（2）以抗凝血的稀释液与淋巴细胞分离液体积比为5:9的比例，量取淋巴细胞分离液，之后先慢后快加入步骤（1）得到抗凝血的稀释液，水平离心机1800rpm，18～22℃，30min；
（3）小心收集淋巴细胞层于新的收集管，以5倍量细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min；弃上清，沉淀再用细胞洗涤液稀释，水平离心机1500rpm，18～22℃，10min离心；沉淀用5 mL无RNA酶水重悬，随即加入45mL RPIM-1640培养液混匀，1000rpm，18～22℃，10min离心，沉淀即为淋巴细胞淋巴细胞，并将其重悬于RNALater保存液中，置-70℃保存备用。
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