CN117720645A - 靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体与检测鸡减蛋综合征的试剂盒 - Google Patents

靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体与检测鸡减蛋综合征的试剂盒 Download PDF

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CN117720645A
CN117720645A CN202311753359.1A CN202311753359A CN117720645A CN 117720645 A CN117720645 A CN 117720645A CN 202311753359 A CN202311753359 A CN 202311753359A CN 117720645 A CN117720645 A CN 117720645A
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毛娅卿
孔冬妮
王嘉
李俊平
薛麒
邓永
翟天舒
刘丹
侯力丹
黄小洁
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China Institute of Veterinary Drug Control
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China Institute of Veterinary Drug Control
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Abstract

本申请提供一种靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体与检测鸡减蛋综合征的试剂盒。本申请的抗体可识别鸡减蛋综合征病毒不同株，而不与禽腺病毒I群4型(FAdV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病毒发生交叉反应，因此可用于检测EDSV病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，具有较高的特异性和灵敏度。

Description

靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体与检测鸡减蛋综合征的试剂盒
技术领域
本申请属于兽用生物技术检测技术领域，具体地，涉及一种抗鸡减蛋综合征病毒的抗体与检测鸡减蛋综合征的试剂盒。
背景技术
鸡减蛋综合征(Egg Drop Syndrome,EDS)是由鸡减蛋综合征病毒(Egg DropSyndrome virus，EDSV)引起的主要导致产蛋鸡产蛋量的突然下降，并伴随蛋质量降低，比如出现薄壳蛋、沙壳蛋以及无壳蛋等畸形蛋现象。该病自1967年首次在荷兰报道后，法国、意大利、巴西、印度、日本、新加坡、朝鲜等多个国家陆续有EDS报道。我国于1991年南京某鸡场分离到该病毒，目前在我国北京、山东、江苏、台湾等多个省份地区的鸡场均检测到EDSV感染，短短几年已在全国范围内流行，给养禽业带来巨大经济损失。EDSV的天然宿主通常是鸭和鹅，但不同日龄和品种的鸡也能感染EDSV，火鸡、麻雀、鹌鹑等大多数禽类也均能感染EDSV，并能够携带病毒。EDS可以通过垂直传播以及接触传播，在动物性成熟之前通常没有致病性，难以检测，在性成熟后病毒活化，导致产蛋禽类发病。该病在暴发流行时也可通过粪口传播的方式引起EDS的水平传播。
EDSV为无囊膜的线性双链DNA病毒，属于腺病毒科禽腺病毒属Ⅲ群,目前分离到的EDSV毒株均属于同一个血清型，但存在不同的基因型。针对EDSV的检测方法的研究很多，从病原学方法到免疫学方法再到分子生物学检测方法，检测手段之间的灵敏性也有差异。纳入国家法规的检测方法有中华人民共和国国家标准《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇二〇年版鸡检查法。《在禽源活疫苗成品检验环节，《中华人民共和国兽药典》(三部)二〇二〇年版鸡检查法，针对EDSV检验的方法是血凝抑制方法检测病毒抗体。但上述法定方法均存在缺点，EDSV血凝抑制试验抗体检测必须通过鸡检查法获得鸡血清进行检测，存在费时成本高的问题。疫苗中污染EDSV是引起EDS传播和流行的潜在风险，因此亟需建立稳定高效的检测EDSV的方法用于禽活疫苗的质量检测和EDS疫病的诊断。
发明内容
针对现有技术在检测EDSV中的不足，本申请的目的在于提供一种靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体、以及检测鸡减蛋综合征病毒的试剂盒。
具体来说，本申请涉及如下方面：
1.一种靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据项1所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，或为与SEQID NO:13或SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
3.根据项1或2所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含轻链可变区，其中：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示，或为与SEQID NO:15或SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
4.根据项1-3中任一项所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13，或为与SEQ ID NO:14、具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15，或为与SEQ ID NO:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；或
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14，或为与SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16，或为与SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
5.根据项1-4中任一项所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
6.一种分离的核酸，包含编码项1-5中任一项所述的抗体的多核苷酸序列。
7.一种载体，其包含项6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其包含项6所述的核酸或项7所述的载体。
9.一种检测鸡减蛋综合征的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
项1-5中任一项所述的抗体。
10.根据项9所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含识别项1-5中任一项所述的抗体的荧光标记的羊抗鼠IgG。
11.项1-5中任一项所述的抗体在制备用于检测鸡减蛋综合征的试剂盒中的用途。
12.项1-5中任一项所述的抗体在制备用于检测禽病毒类活疫苗的外源病毒的试剂盒中的用途。
本申请的抗体可识别鸡减蛋综合征病毒不同株，而不与禽腺病毒I群4型(FAdV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病毒发生交叉反应，因此可用于检测EDSV病毒，而不对其他病毒产生交叉反应，具有较高的特异性和灵敏度。本申请的试剂盒可用于禽病毒类活疫苗的外源病毒检验，有利于进一步保证我国禽用病毒类活疫苗的纯净性和安全性，进而提高疫苗质量，还可用于EDSV的临床检测、病毒含量测定和流行病学调查。
附图说明
图1为蛋白小量表达图，其中M：Marker；1：未诱导对照(Codon plus)；2-3：IPTG诱导(Codon plus)。
图2为蛋白大量表达图，其中M：Marker；1：超声后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀。
图3为蛋白质纯化图，其中M：Marker；1：纯化后蛋白质5倍稀释；2：纯化后蛋白质10倍稀释。
图4为间接免疫荧光试剂盒检测结果，其中图4A和图4B为感染不同EDSV病毒：A为京911株；B为127株。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
本文中的术语“抗体”以广义使用，涵盖结合EDSV的、包含本文所公开的一个或多个CDR结构域的各种抗体结构分子，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段(例如Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2)、线性抗体和单链抗体分子(例如scFv)等，只要其展现所需要的与EDSV的结合活性即可。
本文中所使用的术语“单克隆抗体”中的修饰语“单克隆”是指该抗体获自实质上均质的抗体群体，仅含有微量的天然存在的突变或在单克隆抗体制备过程中出现的突变。与典型地包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂中的各单克隆抗体针对抗原上的单一表位。本申请的单克隆抗体可通过多种技术制造，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及利用含有所有或部分人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法制造。
“嵌合抗体”是具有来源于一种物种的至少一部分重链可变区和至少一部分轻链可变区以及来源于另一物种的至少一部分恒定区的抗体。例如，在一个实施方式中，嵌合抗体可包含鼠可变区和人恒定区。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方式中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。
“人类抗体”也可称为“人抗体”、“全人源抗体”或“全人抗体”，为其氨基酸序列对应于由人类产生的或人类细胞产生的氨基酸序列的抗体。此人类抗体定义特定地排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用本领域中已知的各种技术制备，包括噬菌体展示库技术，如下文献描述的技术：Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222:581(1991)。Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)。人类抗体可通过向经修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体但其内源基因座已失能的转基因动物(例如免疫异种小鼠)施用抗原来制备(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号)。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，也参见例如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)。
在一些实施方式中，本申请的抗体为全长抗体，全长抗体典型地是指由两条“重链”和两条“轻链”组成的抗体。“重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由重链可变区(VH)、重链恒定区1(CH1)，铰链区(HR)，抗体重链恒定区2(CH2)，和重链恒定区3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由轻链可变区(VL)，和轻链恒定区(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。
本申请中，所述轻链恒定区、重链恒定区可以为任意的轻链恒定区、重链恒定区。所述轻链恒定区(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。所述重链恒定区可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD中的任意一种的重链恒定区。
本领域技术人员公知，每个重链可变区可由三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)区构成，每个轻链可变区可由三个互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)区构成，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。在一些实施方式中，从N-末端至C-末端，重链可变区与轻链可变区均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。
重链可变区或轻链可变区的CDR序列可以通过参考本领域已知的任何数字系统来鉴定，例如卡巴特系统(Kabat,E.A.等人,《免疫学关注的蛋白序列(Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院美国公共卫生局(Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD)(1991)；Chothia系统(Chothia和Lesk,“免疫球蛋白的高变区的规范结构(CanonicalStructures for theHypervariable Regions of Immunoglobulins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196,901-917(1987))；或IMGT系统(Lefranc等人,“IMGT免疫球蛋白和细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的唯一编(IMGT Unique Numbering forImmunoglobulin and CellReceptor Variable Domain s and Ig superfamily V-likedomains)”,《发展竞争免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27,55-77(2003))。在本申请的实施方式中，利用IMGT系统定义确定CDR序列。
在本文中，术语“同一性”或被定义为经过序列比对和引入空位后，氨基酸或核苷酸序列变体中相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域内是公知的。在本文中，提及的与氨基酸序列具有百分比同一性的氨基酸序列是指在所提及的氨基酸序列的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
在本文中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包含具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“核酸”或“多核苷酸”或“核酸分子”通常是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限定，否则该术语可以包括含天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸(例如示出了序列信息)相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，核酸的序列可以包括其保守方式修饰的变体，例如简并密码子置换、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
在本文中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测定亲和力。
在本文中，术语“靶向EDSV的抗体”表示能够以足够的亲和力结合EDSV、能够用作靶向EDSV的诊断剂和/或治疗剂的抗体。
本申请的靶向EDSV的抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的EDSV蛋白以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的靶向EDSV蛋白的抗体与作为其靶标的EDSV蛋白的结合能力作为100％的情况下，本申请的靶向EDSV蛋白的抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如为9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
在本文中，间接免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原-抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。
本申请提供一种靶向EDSV的抗体，其中，所述抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
在一些实施方式中，CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(GYTFTEYT)，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(FNPKNGVT)所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(VRLEVRVYAMDY)所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4(QSLLYSNIQKNY)，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5(WAS)所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6(QQYYSYPFT)所示。
在一些实施方式中，CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7(GFTFSGSA)，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8(INTGGQLT)所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9(AKTYYGNYDY)所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10(QRIVHNNGNTY)，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11(KVS)所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12(FQGSHVPLT)所示。
在一些实施方式中，所述抗体包含重链可变区，其中：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13
(EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKTLE WI)、
或SEQ ID NO:14
(EVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCVASGFTFSGSAMSWVRQTPEKRLEW VATINTGGQLTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLRSEDTAMYYCAKT YYGNYDYWGQGTTLTVSS)所示，
或为与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体包含轻链可变区，其中：所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15
(DIVMSQSPSSLDVSVGEKVTLSCKSSQSLLYSNIQKNYLAWYQQKPG QSPKLLIYWASVRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYS YPFTFGSGTKLEIK)、
或SEQ ID NO:16
(DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQRIVHNNGNTYLEWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP LTFGSGTKLELK)所示，
或为与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13，或为与SEQID NO:13具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15，或为与SEQ ID NO:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14，或为与SEQID NO:14、具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16，或为与SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
本申请还提供一种分离的核酸，其包含编码前述任一项抗体的多核苷酸序列。
本申请还提供一种载体，其包含上述的核酸。
本申请还提供一种宿主细胞，其包含上述的核酸或载体。
本申请还提供一种检测鸡减蛋综合征的试剂盒，该试剂盒可以检测EDSV的存在或/或量。其中，所述试剂盒包括上述的任意一种抗体。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包含识别任意一项上述的抗体的荧光标记的抗体，例如为羊抗鼠IgG。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括样品稀释液和洗涤液。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包含，例如，缓冲剂、防腐剂或蛋白稳定剂。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可包含检测可检测标记所必需的组分。
在一些实施方式中，所述试剂盒还可包括容器、使用说明书等。
在一些实施方式中，试剂盒还可以含有一个对照样本或一系列对照样本，其可以经测定并与测试样本进行比较。所述试剂盒的每个组分可以装在一个单独的容器中，所有多个容器可以放在单个包装中，同时在包装插页写上有关如何使用试剂盒的说明，例如，用于收集样本和/或进行检测和/或分析结果的说明。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括上述的任意一种靶向EDSV的抗体，识别靶向EDSV的抗体的荧光标记的羊抗鼠IgG，样品稀释液和洗涤液。
本申请还提供了上述的任意一种抗体在制备用于检测鸡减蛋综合征的试剂盒中的用途。
本申请还提供上述的任意一种抗体在制备用于检测禽病毒类活疫苗的外源病毒的试剂盒中的用途。
禽病毒类活疫苗可以是本领域可获得的各种类型的活疫苗，例如鸡痘活疫苗、鸡马立克氏病火鸡疱疹活疫苗、雏番鸭细小病毒、小鹅瘟二联活疫苗、鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗、鸡新城疫活疫苗、禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗、鸡传染性支气管炎活疫苗、鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗。
实施例
实施例1——EDSV Hexon蛋白序列分析
不同EDSV毒株只有一个血清型，从NCBI上下载不同EDSV毒株参考序列，通过分析发现，Hexon蛋白在不同毒株中具有较高同源性，采用DNAStar软件对Hexon蛋白进行二级结构、亲疏水性、抗原性和功能区的分析。结果发现Hexon蛋白高度保守，存在极低的抗原性差异，可作为表达蛋白的备选片段。根据蛋白序列二级结构分析及亲疏水性、抗原性等，选取Hexon蛋白作为免疫原。根据蛋白结构分析，选取全长Hexon蛋白的核苷酸片段(1707bp)进行序列合成(序列1)，并在5’和3’端加入EcoRⅠ和Xho I酶切位点，用于载体的克隆。序列合成在北京六合华大蛋白研发中心有限公司进行。
实施例2——重组表达质粒的构建和表达纯化
1.重组表达质粒的构建
用限制性内切酶EcoRⅠ和Xho I分别对合成的序列和质粒pET30a进行双酶切，将纯化回收的片段和表达载体酶切产物用DNA Ligation Kit连接后，转化至感受态细胞(Codonplus)。
2.重组蛋白的小量表达
挑取经PCR鉴定为阳性的克隆到1.5mL含相应抗性的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养；培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200r/min培养2h；取1mL诱导的菌液，12000r/min，离心1min，弃上清，沉淀用50～100μL Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)，加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃5min，电泳检测。结果显示，在大小约69KD处出现重组Hexon蛋白的特定目的条带，符合预期大小(如图1所示)，说明Hexon蛋白表达成功。
3.重组蛋白的大量表达
将培养的菌液按照1:50比例转接到250mL相应抗性LB液体培养基中，37℃震荡，200r/min，培养至OD＝0.6～0.8，IPTG(0.5mM)16℃诱导过夜；收菌：8000r/min，离心6min。弃上清；超声破菌：菌体用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声波破碎(500W，180次，每次5s，间隔5s)；电泳确定表达形式：取100μL超声后的菌悬液，12000r/min，离心10min，取50μL上清至另一EP管，弃去上清后沉淀用50μL10 mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散。分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，结果在沉淀中检测到大量的目的蛋白(如图2所示)，说明该重组菌表达形式为包涵体表达。将表达好的蛋白进行纯化，方法如下：20～30ml10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min；12000r/min，离心10min，上清转入另一管中保存；用20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min；12000r/min，离心10min，弃上清。重复上述重悬和离心的步骤一次；先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10mL含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白，12000r/min，离心10min，收集上清，取50μL样品进行SDS-PAGE电泳检测(结果如图3所示)。以BSA为标准，通过SDS-PAGE凝胶扫描分析估计纯化蛋白浓度>1.0mg/mL，纯度>85％，命名为EDSV-Hexon。
实施例3——单克隆抗体的制备
1.小鼠的免疫
用EDSV-Hexon纯化蛋白与弗氏完全佐剂1:1乳化后，按30μg蛋白/只小鼠的量，皮下注射4只SPF BALB/c雌性小鼠(初次免疫)。并于初次免疫后2周、4周、6周，分别皮下注射加强免疫，免疫量为30μg/只。第三次加强免疫后10日，眼眶取血，用间接ELISA测血清效价。选择血清效价高的小鼠，用免疫原50μg进行腹腔注射免疫冲击一次，免疫后3日，进行细胞融合。
2.细胞融合实验
无菌取免疫小鼠脾脏，制备成脾细胞悬液，取免疫脾细胞与SP2/0细胞(本实验室保存)，采用常规50％PEG法进行细胞融合，并将融合细胞分置于5块96孔板中，以HAT培养液(购自Sigma公司)进行选择性培养。
3.杂交瘤细胞的克隆与筛选
将上述96孔板中培养物经EDSV-Hexon蛋白和标签蛋白包被的ELISA板进行筛选。筛选方法如下：
(1)包被ELISA板
用pH为9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液稀释纯化好的EDSV-Hexon蛋白，终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。
(2)封闭
用含2％牛奶的PBS进行封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2h，后用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。
(3)孵育一抗
分别加入杂交瘤细胞培养上清、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清用PBS做1000倍稀释)作为一抗，均为100μL/孔，37℃孵箱，1h。
(4)洗涤
用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。
(5)孵育二抗
分别加入用PBS稀释20000倍的山羊抗小鼠IgG/HRP作为二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h。
(6)洗涤
用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤3次。
(7)显色
加入显色液(含1％A液和10％B液的柠檬酸缓冲液，A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％ H2O2)100ul/孔，显色时间为5min左右。
(8)每孔加入50μL终止液(含2M硫酸)终止。
(9)读数
在双波长(450，630nm)波长下测吸光值，记录保存数据。
经检测，从328个杂交瘤细胞株筛选到7#，9#2株ELISA阳性的杂交瘤细胞株。
筛选结果如表1所示。
表1杂交瘤细胞株ELISA筛选结果
4.间接免疫荧光检测
将ELISA筛选获得的2株阳性杂交瘤细胞株(7和9号)的上清作为一抗，采用间接免疫荧光法筛选到一株与EDSV不同毒株全病毒具有良好反应性的细胞株，该细胞株命名为EDSV-Hexon蛋白杂交瘤细胞Mab-Hexon-9株。选取免疫荧光检测为阳性的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，直至细胞克隆抗体阳性率达100％。将上述亚克隆后阳性率达100％的阳性细胞株扩大培养后，液氮中保存。间接免疫荧光检测方法如下：
(1)阳性病毒板的制备
将EDSV不同毒株(不同毒株的信息如表2所示)病毒液分别用含2％新生牛血清的M199培养液稀释成100TCID50/0.1ml，接种已长成良好鸡胚肝细胞(本实验室制备)单层的96孔板，每个毒株接种4孔，100μL/孔，同时设空白对照。然后置于37℃，含5％CO2的温箱中培养5天，进行荧光染色。
表2EDSV不同毒株和对照用毒株信息表
以上病毒株来自中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心(请见中国兽医药品监察所、中国微生物菌种保藏管理委员会兽医微生物中心编著，中国兽医菌种目录，第一版，中英文合订本1992年，中国科学技术出版社，125-127、132、137和151页)；禽白血病病毒(ALV)RAV-1株来自中国兽医药品监察所(毛娅卿，王嘉，吴涛，王哲，蒋桃珍，禽白血病病毒p27蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备，《中国兽药杂志》2013年11期61-66)。
(2)染色
1)固定
弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加250μL细胞培养液，轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入100μL冷甲醇，置室温固定10～15min，弃去甲醇，自然晾干2～5min。
2)加一抗(单克隆抗体)用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，将待检的单克隆细胞株上清用PBS稀释10倍，加入EDSV病毒阳性细胞板(使用前用PBS洗涤1次)中，每孔50μL，每孔，37℃避光作用1h。
3)洗涤
弃去板孔中的单克隆抗体，用PBS洗涤5次，每孔每次加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。
4)荧光二抗染色
尽量弃尽洗液，每孔加入用PBS作适当稀释(1:100～1:200)的荧光标记的羊抗小鼠IgG 50μL，37℃避光作用1h。
5)洗涤
方法同3)。
6)观察和结果判定
在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔EDSV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔EDSV检测为阴性。
5.杂交瘤细胞的鉴定
(1)培养特性
用含10％～15％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱中培养，用显微镜检查杂交瘤细胞株的细胞形态，观察细胞形态应一致。
(2)纯净性检验
按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2020版，中国农业出版社，2020，本发明简称《中国兽药典》)附录方法进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验。
(3)胞核学检查
将培养24小时的杂交瘤细胞用秋水仙素法检查染色体数目，观察染色体特征是否符合杂交瘤细胞的染色特性。
(4)腹水的制备
取8～10周龄BALB/C小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5ml。7～10日后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞106～107个/0.5ml/只，7～10日后，观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大、行动不便时，抽取小鼠腹水，3000r/min离心10min，取上清，-40℃保存。间隔2～3日，若腹水再次产生，可再次采集，此腹水即为鼠抗EDSV Hexon单克隆抗体。得到2株单克隆抗体，其中第1株单克隆抗体对应于7#杂交瘤细胞株，第2株单克隆抗体对应于9#杂交瘤细胞株。
第1株单克隆抗体：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(GYTFTEYT)，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ IDNO:2(FNPKNGVT)所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3(VRLEVRVYAMDY)所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4(QSLLYSNIQKNY)，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5(WAS)所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6(QQYYSYPFT)所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13(EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKTLEWI)所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15(DIVMSQSPSSLDVSVGEKVTLSCKSSQSLLYSNIQKNYLAWYQQKPGQSP KLLIYWASVRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPFT FGSGTKLEIK)所示。
第2株单克隆抗体：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7(GFTFSGSA)，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ IDNO:8(INTGGQLT)所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9(AKTYYGNYDY)所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10(QRIVHNNGNTY)，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11(KVS)所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12(FQGSHVPLT)所示。
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14
(EVQLVESGGGLVRPGGSLKLSCVASGFTFSGSAMSWVRQTPEKRLEW VATINTGGQLTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSRLRSEDTAMYYCAKT YYGNYDYWGQGTTLTVSS)所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16
(DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQRIVHNNGNTYLEWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP LTFGSGTKLELK)所示。
(5)腹水效价测定
将每株单抗的腹水从1:100开始进行2倍稀释至1:51200，按照实施例3中4.，间接免疫荧光检测方法测定腹水的荧光抗体效价，为1:2000。
实施例4——检测EDSV的间接免疫进行荧光试剂盒组装及应用
本实施例针对实施例3得到的2种单克隆抗体分别组装为试剂盒并加以引用。
其中试剂盒成分包括抗EDSV的单克隆抗体，商品化的FITC标记的羊抗鼠抗体(购自：Sigma公司)，样品稀释液及洗涤液。
试剂盒检测鸡减蛋综合征病毒的步骤及判定标准如下：
1.样品接种
将处理好的样品100μL接种于长满96孔板的鸡胚肝细胞单层，置37℃，吸附1h，每孔补加100μL含2％牛血清的M199培养液，37℃培养5-7天。
2.荧光染色及结果判定
(1)固定
弃去96孔板的细胞培养液，每孔约加0.3mL PBS(pH7.2)轻洗细胞表面1次，尽量弃尽PBS，然后每孔加入0.2mL冷甲醇，置室温固定15min，弃去甲醇，自然晾干(5min)。
(2)加一抗
自然晾干后，用PBS(pH7.2)洗细胞面1次，然后每孔加入50μL用PBS(pH7.2～7.4)进行适当稀释的EDSV单克隆抗体，置37℃作用1h。
(3)洗涤
弃去EDSV单克隆抗体，用PBS(pH7.2)洗5次，每次每孔加入洗液0.3mL，轻微振荡洗涤。
(4)荧光二抗染色
尽量弃尽洗液，每孔加入50μL用PBS(pH7.2～7.4)进行适当稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，置37℃作用1h。
(5)洗涤
方法同(3)。
(6)观察和判定
在荧光倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)观察，细胞有完整的细胞形态。当接种孔视野中出现特异性绿色荧光，放大到200～400倍时，可见被感染细胞的细胞核和与细胞质均有着色时，判定该孔EDSV检测为阳性。当接种孔未出现特异性绿色荧光时，视野发暗，证明细胞未被感染，判定该孔EDSV检测为阴性。
3.试剂盒的特异性试验
按照已建立的间接免疫荧光操作方法，利用间接免疫荧光试剂盒检测不同的EDSV(京911株，127株)、禽腺病毒I群4型(FAdV-4)、鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性法氏囊病毒病毒(IBDV)和未接种病毒的鸡胚肝细胞对照，观察感染病毒的细胞着色情况，确定该间接免疫荧光方法的特异性。
使用第1株单克隆抗体的检测结果如图4所示，结果表明该试剂盒可以特异性地识别检测不同EDSV毒株(见图4中A-B，其中：A为京911株；B为127株，反应结果均显示为阳性)，而与FAdV-4，NDV，IBV，ALV，REV，ILTV、IBDV和未接种病毒的鸡胚肝细胞对照，反应均为阴性，证明建立的方法特异性良好，该间接免疫荧光试剂盒可应用于EDSV的特异性检测。使用第2株单克隆抗体的检测结果类似，同样可以特异性地识别检测不同EDSV毒株(京911株，127株)，而与FAdV-4，NDV，IBV，ALV，REV，ILTV、IBDV和未接种病毒的鸡胚肝细胞不反应。
4.试剂盒的敏感性试验
将EDSV(京911株)稀释为107.0TCID50/100μL，以此为基础进行10倍系列稀释至100.001TCID50/100μL，将以上8个稀释度的样品，分别接种长满单层的鸡胚肝细胞，100μL/孔，每个样品6个重复。同时设置未接种的鸡胚肝细胞组作为阴性对照。按照实施例4中检测EDSV的步骤及判定标准进行检测。
结果各剂量梯度的EDSV检测结果为，当感染剂量大于等于100.01TCID50病毒时6/6阳性。以上结果表明，该试剂盒EDSV污染的最低检出限为100.01TCID50。
5.试剂盒的初步应用
将本试剂盒应用于禽病毒类活疫苗的外源病毒检验，本试验选取了10家国内生产企业生产的禽用活疫苗重点品种，按照本专利的试剂盒进行EDSV检测，并根据《中国兽药典》2020年版三部对选取的禽病活疫苗进行EDSV污染的血清学检验。同时设置PBS组为阴性对照，感染EDSV(京911株)组为阳性对照。结果显示，血清学检验和应用本试剂盒检测的结果一致，所选取的禽用活疫苗均无EDSV污染，阴性对照为EDSV检测阴性，阳性对照为EDSV检测阳性。疫苗信息和检测结果如表3所示，其中两种单克隆抗体的检测结果相同，均如表3所示。
表3采用本申请试剂盒对国内外企业疫苗检测结果

Claims (12)

1.一种靶向鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的抗体，其中，所述抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；或
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:7，CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10，CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示，或为与SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含轻链可变区，其中：
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示，或为与SEQ IDNO:15或SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13，或为与SEQ ID NO:14、具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15，或为与SEQ ID NO:15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；或
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14，或为与SEQ ID NO:14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16，或为与SEQ ID NO:16具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的靶向鸡减蛋综合征病毒的抗体，其中，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
6.一种分离的核酸，包含编码权利要求1-5中任一项所述的抗体的多核苷酸序列。
7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的载体。
9.一种检测鸡减蛋综合征的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
权利要求1-5中任一项所述的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含识别权利要求1-5中任一项所述的抗体的荧光标记的羊抗鼠IgG。
11.权利要求1-5中任一项所述的抗体在制备用于检测鸡减蛋综合征的试剂盒中的用途。
12.权利要求1-5中任一项所述的抗体在制备用于检测禽病毒类活疫苗的外源病毒的试剂盒中的用途。
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