CN117924465A - 抗禽多瘤病毒vp4蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体，一种编码所述单克隆抗体的核酸分子，一种用于检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的试剂盒，以及所述抗体在用于诊断APV的试剂盒中的用途。本申请的单克隆抗体亲和力高、灵敏度高，对将来的APV的IFA诊断、检测和治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测领域，具体涉及抗禽多瘤病毒VP4蛋白单克隆抗体及其在禽多瘤病毒感染检测中的应用。
背景技术
禽多瘤病(avian polyomavirus disease)早期又称为鹦鹉幼雏病(budgerigarfledgling disease，BFD)，对幼雏具有非常强的致病性，感染成年禽类会导致成年禽类出现慢性症状，包括羽毛异常、背部和腹部羽毛缺乏、头部和颈部肉瘤等。该病没有严格的宿主特异性，可以感染多种禽类，包括鸡、鹦鹉、鸽子、鸭等。对于该病，至今还未有可行的防控措施。
APV是一种环状双链DNA病毒，大小约为4981bp，病毒粒子为二十面体对称球形颗粒，直径约为45nm，不具囊膜。2017年国际病毒分类委员会(ICTV)将其归属于多瘤病毒科(Polyomaviridae)，γ多瘤病毒属(Gammapolyomavirus)。APV的主要蛋白质组分为早期区域编码的大T抗原和小t抗原蛋白，晚期区域编码的VP1、VP2、VP3、VP4结构蛋白及VP4变体VP4-delta，相较于哺乳动物多瘤病毒，VP4和VP4-delta是仅存在于APV中的特异性蛋白。此外，VP4在APV感染中至关重要，并被认为与细胞培养中的病毒基因组包装和细胞凋亡有关。
有研究表明，删除或灭活VP4可以减弱APV的毒力。因此，对VP4基因的功能与特性进行深入的研究，将有助于对禽多瘤病毒致病机理的探索。本研究制备针对APV结构蛋白VP4的单克隆抗体，可为APV诊断方法的建立和疫苗研究提供重要理论依据。
发明内容
在本领域中，获得反应性较好的VP4蛋白单克隆抗体，能够为检测禽多瘤病毒，建立快速检测方法和疫苗研发奠定基础。
此前，张志等发明了一种禽多瘤病毒检测试剂盒，运用特定引物通过PCR合成经地高辛标记的特异性核酸探针，通过斑点分子杂交，该特异性探针检测病料样品中禽多瘤病毒核酸的存在。李阳等发明了一种鹦鹉多重病毒检测试剂盒，可以检测鹦鹉喙羽病(psittacine beak and feather disease，PBFD)、禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)和APV感染，但二者耗时均较长，步骤复杂，24h～36h才能完成检测。刘艳、闫佳佳等的荧光定量PCR检测方法对操作人员的技术水平要求较高。而IFA作为一种基于抗体-抗原反应的免疫学检测方法,特异性强、灵敏度高、操作便捷，广泛用于临床诊断和生物学研究
因此，需要提供一种反应性较好的VP4蛋白单克隆抗体，并应用于将来基于IFA的APV快速诊断与检测方法，研发APV快速检测试剂盒。
本申请所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体及其制备方法。
本申请还要解决的技术问题是提供上述单抗的应用。具体来说，本申请涉及如下内容：
1.一种结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体，其中，包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。
2.根据项1所述的抗体，其中，CDR-H1具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQID NO.15所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。
3.根据项1所述的抗体，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.4的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。
4.根据项1所述的抗体，其中，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.5的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。
5.根据项1-4中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23所示，或为与SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
LCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26所示，或为与SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
6.根据项5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.21所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.21具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.24具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
7.根据项5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.22所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.22具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.25具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
8.根据项5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.23所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.23具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.25具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
9.一种编码如项1-8中任一项所述的单克隆抗体的核酸分子。
10.根据项1-8中任一项所述的单克隆抗体或项9所述的核酸分子所编码的抗体在制备检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的动物的试剂中的应用。
11.一种用于检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的试剂盒，其包括：项1-8中任一项所述的单克隆抗体或项9所述的核酸分子所编码的抗体，优选所述试剂盒为基于间接免疫荧光检测法的试剂盒。
有益效果：与现有技术相比，本申请具有如下优势：
(1)本申请得到的单克隆抗体可用于检测禽多瘤病毒，特异性强，抗体效价和亲和指数高，其与感染APV的CEF细胞特异性结合，并发生荧光反应，而未感染病毒的CEF细胞未见绿色荧光。
(2)本申请的提出获得了一种针对APV的单克隆抗体，为APV诊断方法的建立和疫苗研究提供重要理论依据，同时对未来的APV的IFA诊断和检测，研发APV快速检测试剂盒具有重要意义。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为APVVP4基因的PCR结果示意图。
图2A为蛋白小量表达胶图示意图。
图2B为蛋白大量表达胶图示意图。
图3为蛋白纯化胶图示意图。
图4为免疫小鼠血清效价结果示意图。
图5为单克隆抗体SDS-PAGE纯度检测胶图示意图。
图6为单克隆抗体亲和常数及效价检测结果示意图。
图7为抗体的Western blot鉴定示意图。
图8为VP4单克隆抗体的IFA试验结果(200×)示意图(其中右下标的比例尺为200)。
图9为不同稀释度VP4蛋白单克隆抗体的间接免疫荧光试验结果(200×)示意图。
图10为不同稀释度FITC-羊抗鼠IgG的间接免疫荧光试验结果(200×)示意图。
图11为VP4蛋白单克隆抗体孵育时间的确定(200×)示意图。
图12为间接免疫荧光特异性试验结果示意图。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
在本说明书中，术语“单克隆抗体”表示获得自基本上同源的抗体的群体的抗体，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在本说明书中，术语“杂交瘤细胞”表示一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞，一般通过瘤细胞培养来制备。
在本说明书中，术语“重链”(“heavy chain，H”)、“轻链”(“light chain，L”)、“重链恒定区”(“CH”)、“轻链恒定区”(“LH”)、“轻链可变区”(“VL”)、“重链可变区”(“VH”)、“骨架区”(“Framework Region，FR”)、“互补决定区”(“CDR”)是抗体的组成部分，通过不同的组合可以形成不同种类的抗体。例如常规IgG抗体是由两条轻链和两条重链组成的四聚体。其中，VL及VH均由不同的CDR和FR组成，CDR包含与抗原接触的残基，决定VL及VH的抗原特异性，FR用于维持可变区结构并决定CDR环的位置。通常，重链可变区和重链恒定区组成一条完整的重链，而轻链可变区与轻链恒定区组成一条完整的轻链。
在本说明书中，“PEG法”是指使用化学诱导剂聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合的方法。细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。细胞融合技术是研究细胞遗传、基因定位、细胞免疫、病毒和肿瘤的重要手段。
在本说明书中，“有限稀释法”是一种常用的克隆方法，是指将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数。常用来筛选融合的动物细胞。一般用HT培养液稀释，使细胞浓度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(5.5个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含一个细胞。培养7～10天后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3～5次，直至达100％阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。
在本说明书中，“IFA”(Indirect Immunological Fluorescence Assay)，又称间接免疫荧光检测法，是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般也通称为荧光抗体技术。
在本说明书中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本说明书中，“质粒”是指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的DNA分子，存在于细胞质或细胞核中，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
本申请提供一种结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体，其中，所属抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。
在本申请一个具体实施方式中，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.3(GYTFRSYW)所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.6(ILPGSGST)所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.9(ARYRYNGAMDY)所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.12(KSISKY)所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.15(SGS)所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.18(QQHNEYPWT)所示的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.4(GYSITSDYA)的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.7(ISYSGRN)所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.10(AGATTIEGGPWFAY)所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.13(SSVNY)所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.16(DIS)所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.19(QQWNYPLYT)所示的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.5(GYTFRSYW)的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.8(ILPGSATT)所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.11(ARYRYNGAMDY)所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.14(KSISRF)所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.17(SGS)所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.20(QQHNEYPWT)所示的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述单克隆抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23所示，或为与SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
LCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26所示，或为与SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.21(QGQLQQSGAELMKPGASEKISCKATGYTFRSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTIYNAKFKGKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSGVYYCARYRYNGAMDYWGQGTSVTVSS)所示的氨基酸序列，或为与SEQID NO.21具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.24(DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK)所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.24具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.22
(DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGFISYSGRNINNPSLKSRISVTRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTGTYYCAGATTIEGGPWFAYWGQGTLVTVSA)所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.22具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.25(EIVLTQSPAITAASLGQKVTITCSASSSVNYMHWYQQKSGTSPKPWIYDISKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSVEAEDAAIYYCQQWNYPLYTFGGGTKLEIK)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在本申请的一个具体实施方式中，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.23
(QVQLQQSGAEVMKPGASEKISCKGTGYTFRSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSATTIYNAKFKGKATFTADTSSNTAYLQLSSLTSEDSGVYYCARYRYNGAMDYWGQGTSVTVSS)所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.23具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.26(DVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISRFLAWYQEKPGKTNTLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTIRSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK)所示的氨基酸序列，或为与SEQ ID NO.25具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
本申请还提供一种编码前述任一项单克隆抗体的核酸分子。
本申请还提供前述任一项的单克隆抗体或上述核酸分子所编码的抗体在制备检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的动物的试剂中的应用。
本申请还提供一种用于检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的试剂盒，其包括：前述任一项所述的单克隆抗体或上述核酸分子所编码的抗体，其用于检测APV。
优选的，所述用于检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的试剂盒为基于间接免疫荧光检测法(IFA)的试剂盒。
所述试剂盒中可以包括但不限于：已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂)；酶标记的抗原或抗体；酶的底物；阴性对照品和阳性对照品；缓冲液；固定液等。
本申请的一个具体实施方式中，由杂交瘤细胞株产生单克隆抗体的方法为本领域常规方法。
本申请还提供前述任一项的单克隆抗体在禽多瘤病毒感染检测和/或诊断中的应用。
本申请还提供了上述单克隆抗体的制备方法，本申请的一个具体实施方式中，将纯化获得的VP4蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，首免经皮下多点注射，抗原剂量60μg/只，共免疫4只SPF级BALB/c雌性小鼠；本申请的一个具体实施方式中，再将VP4蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后作为二免和三免的抗原，抗原剂量30μg/只，皮下多点注射，每次免疫间隔为2周；本申请的一个具体实施方式中，三免后10天眼眶取血，测血清效价；本申请的一个具体实施方式中，融合前3日再腹腔冲击免疫一次，不含佐剂，抗原剂量50μg/只。
本申请的一个具体实施方式中，分泌禽多瘤病毒(APV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株是将小鼠脾细胞与处于对数生长期的sp2/0细胞融合得到；本申请的一个具体实施方式中，细胞融合采用PEG细胞融合方法；本申请的一个具体实施方式中，将融合的细胞分置于10块96孔板中；本申请的一个具体实施方式中，用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，按有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，连续3次筛选，直至每孔的阳性率为100％，扩大培养细胞。
本申请的一个具体实施方式中，分泌APV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的抗原为重组表达的APV结构蛋白VP4。
本申请的一个具体实施方式中，重组表达的APV结构蛋白VP4的制备方法为在大肠杆菌表达系统表达APV结构蛋白VP4，纯化。
本申请实施例中所使用的Condon plus感受态菌株是采用大肠杆菌BL21(DE3)经过特殊工艺处理得到的感受态菌株，可以用于质粒的化学转化。
本申请实施例中所用Western blot，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
本申请中所述的“重组表达的APV结构蛋白VP4”，以及“VP4蛋白”均指的是表达之后的蛋白，是同一种蛋白。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
本申请得到的单克隆抗体可用于检测禽多瘤病毒，其与感染APV的CEF细胞特异性结合，并发生荧光反应。所述抗体特异性强，抗体效价均等于或高于1∶102400，即抗体稀释102400倍后仍可以产生可观察到的标准免疫反应，同时亲和指数超过5E+0.9，说明所述抗体活性水平与亲和力高，与抗原结合紧密，也说明包含所述抗体的药物和治疗方法效果将更有效。
本申请的提出获得了一种针对APV的单克隆抗体，为APV诊断方法的建立和疫苗研究提供重要理论依据，同时对未来的APV的IFA诊断和检测，研发APV快速检测试剂盒具有重要意义。
实施例
实施例1重组VP4蛋白的制备
1.材料及来源
1.1试验用SPF鸡胚与动物
SPF鸡胚由北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司提供。6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠购于北京六合华大蛋白研发中心有限公司。
1.2病毒与细胞
APV、鸡减蛋综合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)、禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)、禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchins virus，IBV)均由中国兽医药品监察所保存。鸡胚成纤维细胞(Chick embryofibroblast，CEF)依据《中国兽药典》附录3504进行制备。
1.3载体与菌株
载体pcDNA3.1-Flag由中国兽医药品监察所保存；Condon plus菌株及蛋白表达与纯化试剂均由北京六合华大蛋白研发中心有限公司提供。
1.4主要试剂
胎牛血清、FITC标记的羊抗鼠IgG Invitrogen公司产品；M199细胞培养液，Gibco公司产品；Ni Sepharose 6Fast Flow，购自GE Healthcare公司；Q5 Hot Start High-Fidelity 2X MasterMix、EcoRI和XhoI限制性内切酶、T4DNA连接酶，NEB公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒，美国Axygen公司产品；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂，Sigma公司；蛋白分子质量标准，TaKaRa产品；转染试剂，Transfection Reagent转染试剂，Mirus公司产品；HRP标记的羊抗小鼠IgG，北京索莱宝科技有限公司；ECL显色液，上海天能生命科学有限公司。
1.5主要仪器
电泳仪，北京六一生物科技有限公司；SDS-PAGE电泳仪、转膜仪、蛋白凝胶成像仪，Bio-Rad；荧光显微镜，OLYMPUS；酶标仪，Molecular Devices。
2.引物的设计与合成、VP4基因片段的PCR扩增
根据GenBank上公布的APV序列的VP4基因,通过生物信息分析后选出合适的区域，用Primer Express 5.0设计1对特异性引物VP4-F/VP4-R用于扩增APV株VP4基因，VP4-F:5’-ACCCTGCGCCAGGAATTAAA-3’(SEQ ID No.1),含有EcoRI酶切位点。VP4-R:5’-GGGTGGTAGCAGTAGGGGTA-3’(SEQ ID No.2)，含有XhoI酶切位点。以上引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。
采用病毒DNA/RNA提取试剂盒从APV病毒液中提取核酸，将其作为模板进行PCR扩增，反应体系为：Q5 Hot Start High-Fidelity 2X MasterMix25μL，上、下游引物各2.5μL，模板2μL，无RNA酶H2O 18μL。反应条件为：94℃2min；94℃30s、56℃30s、72℃l min，30个循环，72℃7min。以1％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，并将剩余PCR产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序。
以APV的结构蛋白VP4的特异性引物VP4-F和VP4-R对感病CEF提取的总基因进行PCR检测，扩增出长度约500bp的电泳条带(图1。其中，M：DNA标准DL 2000；1：APVVP4基因PCR产物；2：阴性对照)，与预期大小相符。测序结果显示该片段长度为531bp，经BLAST序列比对表明，该序列与GenBank数据库(登录号:AYV96736.1)一致。
3.VP4蛋白的表达、纯化
VP4基因经测序验证，纯化的PCR产物与质粒pET30a分别在限制性内切酶EcoRI和XhoI作用下进行酶切，酶切产物通过T4 DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α。PCR筛斑后选取阳性单个菌落于LB培养基中保存，送北京六合华大基因科技有限公司进行测序来确认重组表达的vp4基因序列是否正确。筛选得到的阳性克隆命名为pET-VP4。将筛选得到的阳性克隆pET-VP4转化至已制备好的Condonplus感受态细胞中，在含相应抗性的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD 600至0.6～0.8，IPTG(0.5mM)诱导37℃，200rpm培养2h。取诱导后的菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测目的蛋白表达情况。
重组表达菌小量表达后进行SDS-PAGE电泳检测，说明VP4蛋白表达成功(图2A。其中，M：预染蛋白标准；1：未诱导对照(Codon plus)；2：IPTG诱导(Codon plus))。
SDS－PAGE凝胶电泳结果显示，在上清液中检测到大量的目的蛋白，进一步验证特异性条带在37kD处，且说明其表达形式为可溶性蛋白表达(图2B。其中，M：预染蛋白标准；1：超声后全菌；2：超声后上清；3：超声后沉淀)。
将VP4蛋白过镍柱(Ni Sepharose 6Fast Flow，GE Healthcare)纯化，分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH 8.0)(含0.5M氯化钠)溶液洗脱，最后分别收集蛋白峰，SDS－PAGE凝胶电泳检测蛋白纯化效果。
SDS-PAG凝胶电泳结果显示，VP4蛋白可以纯化出来，并且纯化效果良好(图3。其中，M：预染蛋白标准；1：蛋白原样；2：流穿；3：15mM咪唑洗脱；4：60mM咪唑洗脱；5-7：300mM咪唑洗脱)。
实施例2抗APV结构蛋白VP4蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
1.动物免疫
将纯化获得的VP4蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，首免经皮下多点注射，抗原剂量60μg/只，共免疫4只SPF级BALB/c雌性小鼠；再将VP4蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后作为二免、三免和四免的抗原，抗原剂量30μg/只，皮下多点注射，每次免疫间隔为2周。并于四免后10天眼眶取血，测血清效价。融合前3日再腹腔冲击免疫一次，不含佐剂，抗原剂量50μg/只。
通过间接ELISA方法对免疫小鼠的血清抗体效价进行检测。结果显示，1-4号小鼠的免疫血清效价均为1∶12800，(图4，其中图4的横坐标显示的是小鼠血清抗体稀释倍数，纵坐标是450nm波长下测定的OD值)，随机选取3号小鼠的脾细胞与SP2/0细胞采用PEG法进行融合。
2.动物免疫阳性杂交瘤细胞株的建立
无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞，与处于对数生长期的sp2/0细胞采用PEG法进行细胞融合，并将融合的细胞分置于10块96孔板中。分别以VP4蛋白和His蛋白作为包被抗原，用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选，按有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，连续3次筛选，直至每孔的阳性率为100％，扩大培养细胞。
使用纯化的重组VP4蛋白包被ELISA板，最终得到15株能稳定分泌抗重组VP4蛋白的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为Anti-A-VP4:1、Anti-A-VP4:2、Anti-A-VP4:3、Anti-A-VP4:4、Anti-A-VP4:5、Anti-A-VP4:6、Anti-A-VP4:7、Anti-A-VP4:8、Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10、Anti-A-VP4:11、Anti-A-VP4:12、Anti-A-VP4:13、Anti-A-VP4:14、Anti-A-VP4:15。
实施例3生物学特异性检测
1.单克隆细胞亚类鉴定
取实施例2得到的15株生产VP4单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞上清液作为一抗，按照小鼠抗体亚类鉴定试剂盒中的ELISA方法对其进行鉴定。
结果显示，VP4:9、VP4:15杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体的亚型为IgG2b，其它为IgG1，而轻链类型均为κ型。选取鉴定亚型时，OD值相对较高的Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10、Anti-A-VP4:15细胞株进行后续检测。
2.VP4单克隆抗体纯度及浓度检测
选出上述3株单克隆抗体，将这3株阳性杂交瘤细胞按照腹水注射法通过腹腔注射小鼠，收集腹水，硫酸铵沉淀法纯化后用BCA蛋白定量方法检测浓度，通过SDS-PAGE凝胶电泳(12％分离胶)分析纯度。
通过SDS-PAGE凝胶电泳对筛出的3株单克隆抗体进行纯度检测。结果显示，3株单克隆抗体均在25和55kDa左右处出现明显条带，分别为单克隆抗体的轻链和重链，无其他杂带(图5。1：Anti-A-VP4:9；2：Anti-A-VP4:10；3：Anti-A-VP4:15；M：预染蛋白标准)。采用BCA蛋白质量浓度测定试剂盒检测得到Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10和Anti-A-VP4:15浓度分别为2.9mg/mL、2.6mg/mL和3.2mg/mL。综上表明本试验获得的这3株单克隆抗体纯度较好，并且浓度较高。
3.VP4单克隆抗体效价及亲和常数测定
将选出的单克隆抗体从200倍开始进行2倍梯度稀释，抗体效价和亲和常数的测定采用间接ELISA方法，以VP4重组蛋白为包被抗原，浓度为2μg/mL,经倍比稀释的抗体作为一抗进行试验。用酶标仪测定波长450nm的吸光值，画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A，亲和常数≈(150000×A)/抗体浓度，稀释倍数A则为抗体效价。
结果显示，Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10和Anti-A-VP4:15的亲和常数分别为1.06E+10；5.91E+09；9.60E+09，Anti-A-VP4:9和Anti-A-VP4:15的效价均为1∶204800，Anti-A-VP4:10的效价为1∶102400，表明三种抗体的效价均较高。检测结果见表1和图6(其中，图6-A为Anti-A-VP4:9的稀释倍数和OD值的相互关系示意图；图6-B为Anti-A-VP4:10的稀释倍数和OD值的相互关系示意图；图6-C图为Anti-A-VP4:15的稀释倍数和OD值的相互关系示意图)。
表1单克隆抗体亲和常数及效价检测结果
A代表平台的1/2OD值所对应的抗体稀释倍数
4.Western blot鉴定
用Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10和Anti-A-VP4:15对感染APV的CEF细胞和未感染的CEF细胞(对照组)进行Western blot分析。APV以0.1MOI剂量的接种CEF细胞、设置未感染的CEF细胞为对照组。感染72h后裂解蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用湿转法(100v，1h)将蛋白转至PVDF膜上,将收集的3株单克隆抗体分别作为一抗，HRP标记的羊抗小鼠作为二抗，使用超敏型ECL发光液显色，判断结果。。
结果显示,感染APV病毒的细胞样品可以特异性结合VP4,未感染病毒的细胞样品未出现条带(图7。其中，图7-A：Anti-A-VP4:9；图7-B：Anti-A-VP4:10；图7-C：Anti-A-VP4:15；M:蛋白分子量标准；1:未感染APV的CEF细胞；2:感染APV的CEF细胞)。
5.间接免疫荧光检测(IFA)
APV以0.1MOI接种到CEF细胞中，72h后用PBS洗2次，冰冷的无水甲醇固定细胞；PBS洗3次，将3株杂交瘤细胞培养上清分别加入相应的孔中，分别以Anti-A-VP4:9、Anti-A-VP4:10和Anti-A-VP4:15为一抗，37℃孵育1h；PBS洗3次，二抗用FITC-羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h；PBS洗3次。同时设立正常生长的CEF细胞作为阴性对照。
荧光显微镜下观察结果。由图8(图8-A：Anti-A-VP4:9；图8-B：Anti-A-VP4:10；图8-C：Anti-A-VP4:15；1：感染APV的CEF细胞；2：CEF正常细胞对照)可以看出，制备获得的3株VP4单克隆抗体均能与感染APV的CEF细胞产生特异性结合，荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光，而未感染病毒的CEF细胞未见绿色荧光，说明本研究制备的这3株单克隆抗体可以特异性结合APV的VP4蛋白。
实施例4细胞中APV间接免疫荧光检测方法建立
IFA试验方法的建立
在24孔板内培养单层CEF细胞，APV以0.1MOI接种到CEF细胞中，置于37℃、CO2体积分数为5％恒温箱内培养72h，弃去培养液，用PBS洗2次，加入冰冷的无水甲醇并放置4℃冰箱20min固定细胞；PBS洗3次，以用PBS稀释适宜倍数的Anti-A-VP4:15作为一抗，37℃孵育1h；PBS洗3次，二抗用PBS稀释的FITC-羊抗鼠IgG(1：200)，37℃避光孵育1h；PBS洗3次，最后每孔加入适量PBS置于倒置荧光显微镜下观察。
实施例5细胞中APV间接免疫荧光检测方法的优化及特异性试验
1.IFA试验方法的优化
试验主要对一抗工作浓度和孵育时间、二抗工作浓度进行了优化。
将Anti-A-VP4:15用PBS按1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000稀释，FITC标记的羊抗鼠IgG工作浓度按1:200稀释，确定好最佳一抗稀释倍数后，一抗用该稀释浓度稀释；
FITC标记的羊抗鼠IgG工作浓度：分别按体积比1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000稀释；
一抗孵育时间：37℃条件下孵育1h，4℃条件下过夜孵育。镜检观察结果，选择有清晰绿色荧光的为最佳条件。
(1)Anti-A-VP4:15最佳稀释倍数的确定
在已接种APV的CEF细胞中，分别加入用PBS倍比稀释的VP4蛋白单克隆抗体、二抗用1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG，同时设置空白对照。
由图9(其中，图9-A：稀释比例1∶500；图9-B：稀释比例1∶1000；图9-C：稀释比例1∶2000；图9-D：稀释比例1∶5000；图9-E：稀释比例1∶10000；图9-F：空白对照)可知，APV VP4蛋白单克隆抗体稀释1000倍时，荧光斑点最清晰，所以Anti-A-VP4:15的最佳稀释倍数为1∶1000。
(2)FITC标记的羊抗鼠IgG最佳稀释倍数的确定
在已接种APV的CEF细胞中，一抗用1:1000稀释的Anti-A-VP4:15，二抗用PBS倍比稀释的FITC-羊抗鼠IgG，并设置空白对照。
结果显示FITC标记的羊抗鼠IgG稀释倍数为1∶200时，荧光最清晰稳定(图10。其中，图10-A：稀释比例1∶200；图10-B：稀释比例1∶500；图10-C：稀释比例1∶1000；图10-D：稀释比例1∶2000；图10-E：空白对照)。
(3)Anti-A-VP4:15孵育时间
VP4蛋白单克隆抗体在4℃条件下过夜孵育条件下荧光更加清晰稳定，所以Anti-A-VP4:15均最佳孵育时间条件为4℃过夜(图11。其中，图11-A：37℃条件下孵育1h；图11-B：4℃条件下过夜孵育；图11-C：阴性对照)。
2.特异性试验
在CEF细胞生长密度达到80％后分别接种鸡减蛋综合征病毒(EDSV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和APV，同时设立不接病毒的正常细胞作为对照。接种72h后，用实施例4中建立的IFA试验方法进行检验。
在已接种EDSV、REV、ALV、APV的CEF细胞培养板中，加入1∶1000稀释的Anti-A-VP4:15、1∶200稀释的FITC-羊抗鼠IgG，正常CEF细胞的阴性对照，然后置于荧光显微镜下观察，结果显示接种EDSV、REV、ALV、NDV、IBV的细胞均无特异性荧光，而接种APV的细胞可观察到明显的特异性荧光显色，说明建立的IFA方法特异性较好(图12。其中，图12-A：鸡减蛋综合征病毒；图12-B：禽网状内皮组织增生症病毒；图12-C：禽白血病病毒；图12-D：新城疫病毒；图12-E：鸡传染性支气管炎病毒；图12-F：禽多瘤病毒；图12-G：阴性对照)。
本申请中的单克隆抗体能与感染APV的CEF细胞发生特异性的荧光反应，说明本申请获得的单克隆抗体能与APV发生特异性反应，而未感染病毒的CEF细胞未见绿色荧光，说明本申请中的单克隆抗体具有良好的特异性。
本申请提供了一种结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (11)
1.一种结合APV结构蛋白VP4的单克隆抗体，其中，包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.17所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中，CDR-H1具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQID NO.15所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.4的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述CDR-H1具有如SEQ ID NO.5的所示的氨基酸序列，所述CDR-H2具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，所述CDR-H3具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，所述CDR-L1的具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，所述CDR-L2的具有如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列，所述CDR-L3的具有如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.23所示；
LCVR的氨基酸序列如SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26所示。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.21所示的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.22所示的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其中，所述抗体重链可变区HCVR具有如SEQ IDNO.23所示的氨基酸序列；
所述抗体轻链可变区LCVR具有如序列SEQ ID NO.26所示的氨基酸序列。
9.一种编码如权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体的核酸分子。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体或权利要求9所述的核酸分子所编码的抗体在制备检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的动物的试剂中的应用。
11.一种用于检测和/或诊断禽多瘤病毒感染的试剂盒，其包括：权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体或权利要求9所述的核酸分子所编码的抗体，优选所述试剂盒为基于间接免疫荧光检测法的试剂盒。
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