CN113637069A - 猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物疫苗领域，尤其是一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用，制备单克隆抗体所用的免疫原为猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；猪圆环病毒4型Cap蛋白包括3个核心抗原表位，分别为表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL。本发明制备了猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，建立了以6D5单抗为捕获抗体的PCV4Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法，具有敏感性高、特异性强、稳定性好、高通量等优点。

Description

猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物疫苗技术领域，具体领域为一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，以及利用该抗体建立的可用于抗原定量的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法。
背景技术
猪圆环病毒(PCV)是一种非包膜环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。PCV是一种最小的DNA动物病毒，基因组大约是1.7kb。自从20世纪70年代发现PCV1以来，已发现的PCV主要是PCV1、PCV2和PCV3三种。基于基因序列和抗原性差异，PCV1已被鉴定为一种肾细胞污染物，不会导致猪的临床疾病。PCV2和PCV3感染会导致猪多种疾病、且在全球分布。PCV2是一种可引起多种疾病主要的致病病原，如仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，猪皮炎和肾病综合征(PNDS)，繁殖障碍和先天性震颤，严重危害养猪业。截至2019年，只有PCV1、PCV2和PCV33种圆环病毒属于已知猪的圆环病毒科。PCV3也与多种疾病密切相关，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎和肾炎综合征、心肌炎、呼吸道综合征以及神经性疾病等。2019年，PCV4在中国被首次鉴定为一种新型圆环病毒。2019年4月，在湖南出现严重临床症状(呼吸道、肠炎症状和PDNS)的猪身上鉴定出一种新型CV，与其它CV相关性差别较大。病毒基因组大小为1770个核苷酸(nt)，经鉴定为猪圆环病毒4型(PCV4)。
PCV4的基因序列与貂圆环病毒的同源性最高(66.9％)，与猪其他圆环病毒的基因组同源性为43.2％～51.5％。PCV4基因组包含12个开放阅读框(ORF)，预测的两个主要基因包括，一个复制酶(rep)基因(891nt)，编码一种由296个氨基酸组成的蛋白质，和一个衣壳(cap)基因(687nt)，编码一种由228个氨基酸组成的蛋白质。
尝试用PK-15和ST细胞系分离PCV4，都没有成功，而PCV2可以用上述细胞培养方法分离，说明PCV4的生物学特性有别于PCV2。未来可能需要采用细胞工程技术建立对PCV4更敏感的细胞系，或通过培养条件的优化促进PCV4的体外培养。PCVs一般来说很难在体外生长，如PCV2复制非常缓慢，需要添加葡萄糖胺，对于PCV3来说，感染性克隆也是直到2019年才成功构建并用于致病性研究。
目前针对PCV4的流行病学调查技术主要是PCR技术，以实时荧光定量PCR最为常用。采用一种基于SYBR Green的实时荧光定量PCR方法进行PCV4临床样本分析，显示PCV4的阳性检出率为10.71％(18/168)。采用TaqMan实时荧光定量PCR检测，结果显示湖南省PCV4流行率为12.8％。阳性率最高的是鼻拭子(28.5％)和血清样本(13.4％)，表明PCV4在该地区猪群中具有中等感染率。目前，PCV1和PCV2的致病性都已经很明确，PCV3感染的临床表现多样，甚至在无明显临床症状的猪群中也有检出，PCV4在发病猪群和健康猪群均有检出。
由于PCV4属于新发病原，加上PCV4感染导致的复杂临床现象，未来猪圆环病毒的诊断和疫苗研发更为复杂，而PCV4尚不能在细胞中进行培养，体外难以获得纯病原培养物，当务之急是研制更为精确、全面的血清学检测和抗原检测方法及抗原定量方法。
由于目前尚无针对PCV4的血清学诊断试剂及相应的方法，急需一种有效的血清学诊断技术。未来的疫苗研发也一定需要抗原定量方法，因此，本发明制备了猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体，并建立了可用于PCV4 Cap蛋白VLP抗原定量的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法。
发明内容
基于PCV4尚不能在细胞中进行培养，体外难以获得纯病原培养物，并基于以往圆环病毒疫苗和诊断产品研发现状，在没有全病毒的情况下，采用基因工程技术制备圆环病毒的Cap蛋白病毒样颗粒(VLP)疫苗和相应的检测评估方法是最快速、最成熟、最具商业化前景的。此外，由于目前缺乏有效的血清学和病原学抗原检测手段，造成对PCV4致病性和流行状况缺乏有效的掌握。
因此，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其中，制备所述单克隆抗体所用的免疫原为猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；
所述猪圆环病毒4型Cap蛋白包括3个核心抗原表位，分别为表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST，如SEQ ID NO：3所示；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI，如SEQ ID NO：4所示；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL，如SEQ ID NO：5所示。
其中，所述单克隆抗体的免疫球蛋白类型包括单克隆抗体3E6、4A7和6D5；其中，单克隆抗体3E6为IgG2b亚型，单克隆抗体4A7和6D5均为IgG 1亚型，轻链类型均为κ。单克隆抗体6D5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
其中，所述病毒样颗粒为重组猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的直径为10-20nm之间的病毒样颗粒。
本发明猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)免疫程序
将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对6～8周龄BALB/c小鼠进行腹腔多点注射，免疫剂量100μg/只；14d后将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射500μg纯化的重组猪圆环病毒4型Cap蛋白；
(2)杂交瘤细胞融合
采用PEG1450将SP2/0细胞与脾细胞进行融合，按1：5～1：2比例取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心后弃上清；缓慢加入50％PEG1400进行融合；用1％的HAT选择培养基重悬融合细胞，加至96孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2培养箱培养，每天观察细胞生长情况；采用间接ELISA方法进行MAb筛选，选取仅与猪圆环病毒4型Cap蛋白呈阳性反应的杂交瘤细胞进行细胞克隆纯化；
(3)单克隆抗体腹水的制备
取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞5×105～1×106个/只，待小鼠腹部明显增大时抽取腹水，离心去除油脂和沉淀后即为单克隆抗体腹水。
本发明所述猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒定量中的应用，其特征在于：基于单克隆抗体6D5，建立单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法，用于定量检测目的蛋白质。
其中，单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法的核心溶液的使用方法为：(1)链霉亲和素溶液工作浓度为0.1-0.3mg/mL；(2)生物素化的山羊抗鼠二级抗体溶液工作浓度为20-30ng/mL；(3)抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠单克隆抗体6D5单抗溶液工作浓度为10-30ng/mL；(4)兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗体工作浓度为20-30ng/mL；(5)FITC标记的山羊抗兔二级抗体溶液工作浓度为0.5-2ng/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明基于临床病料，采用分子生物学方法得到PCV4的Cap蛋白，并制备了PCV4Cap蛋白的VLP，对于后期疫苗开发和诊断试剂开发方面具有重要价值。
本发明基于PCV4 Cap蛋白VLP的良好免疫原性，制备了猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体，建立了以6D5单抗为捕获抗体的PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法，具有敏感性高、特异性强、稳定性好、高通量等优点，尤其是可以用于PCV4病毒样颗粒的快速定量检测，该方法的建立对于PCV4 VLP疫苗的质量评估、PCV4临床诊断和流行病学调查具有重要的应用价值。
附图说明
图1为PCV4 Cap基因的PCR扩增得到特异性的条带；其中，M：DL2000marker；1：PCV4Cap。
图2为重组PCV4 Cap蛋白的SDS-PAGE鉴定；其中，M：蛋白marker；1：BL21(DE3)-pET28a上清；2：BL21(DE3)-pET28a沉淀；3：BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap上清；4：BL21(DE3)-pET28aPCV4-Cap沉淀。
图3为PCV4 Cap蛋白形成的病毒样颗粒(VLP)。
图4为PCV4-Cap特异性单克隆与真核细胞表达的PCV4-Cap蛋白反应活性鉴定；其中，A：空载体pcDNA3.1转染的PK15细胞；B：重组质粒pcDNA-PCV4-Cap转染的PK15细胞。
图5为单抗的阻断效果试验结果。
图6为敏感性试验结果。
图7为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化抗体的试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 PCV4-Cap基因的克隆
(1)病料的采集、处理和DNA的提取
病料于2019年12月采自于江苏某猪场断奶仔猪脾脏，每1g组织加入10mL PBS研磨，于-20℃和37℃反复冻融3次，震荡15s，3000rpm离心2min，取上清于-20℃保存备用。病料DNA的提取采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取制备DNA，于-20℃保存备用。
(2)引物设计和合成
根据GenBank上公布的PCV4 Cap核酸序列(GenBank N00.:MK986820)上一段保守区设计一对特异性引物F1和R687(见表1)，如SEQ ID NO：6-7所示，扩增的目的DNA片段大小为687bp。
表1引物名称、序列、退火温度及扩增片段长度
Figure BDA0003222436440000051
注：GGATCC为BamHI酶切位点序列，GTCGAC为Sal I酶切位点序列。
(3)PCR扩增
将步骤(1)中提取制备DNA为模板进行PCR，在PCR管中配置反应液(如表2)，盖好盖子，手指轻弹5次，瞬离后进行PCR。反应程序如下：94℃预变性2min；98℃10s，60℃30s，68℃2min 30s，35个循环；68℃10min，4℃保存。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003222436440000061
结果：由图1可以看出在500-750bp标准分子量之间有扩增得到特异性的条带。
经序列测定，PCV4 Cap基因全长687bp，全长核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2重组PCV4-Cap蛋白及其病毒样颗粒的制备与鉴定
(1)PCV4 Cap基因和载体的酶切与纯化
PCR扩增的PCV4 Cap基因及其截短片段进行琼脂糖凝胶电泳，拍照记录电泳结果后用PCR产物清洁试剂盒纯化，再进行双酶切反应(如表3)，同时将pET28a载体置于相同的反应体系中(如表4)。酶切的PCV4 Cap基因和空载体再次用PCR清洁试剂盒纯化浓缩。
表3目的基因酶切体系
Figure BDA0003222436440000062
表4载体酶切体系
Figure BDA0003222436440000071
(2)重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-PCV4 Cap的构建与鉴定
将步骤(1)中纯化浓缩的目的基因与载体按下列反应体系(如表5)加入PCR管中。轻弹管底，混匀。瞬时离心，确保管壁无水珠。于16℃低温连接仪中16-18h。次日，取100μL感受态细胞BL21(DE3)，将连接液中的质粒转化到感受态细胞中，无抗LB培养基中培养60min，弃去部分培养基，剩的200μL混匀后分成150μL和50μL两份分别涂布于含抗生素的平板培养基上。于恒温培养箱中培养16-10h后挑取单菌落，在相同条件下扩大培养，提取质粒。将所制备的质粒分别按照下表(如表6)中的反应体系进行加样，轻弹管底6-8次将反应物混均匀，瞬时离心，于37℃低温连接仪中酶切15min。取双酶切产物各5μL与loading Buffer混匀进行琼脂糖电泳，将酶切结果为阳性的重组质粒送华大基因测序，拼接的序列用DNAStar软件进行分析。
表5载体与纯化PCV4 CAP连接体系
Figure BDA0003222436440000072
表6重组质粒双酶切鉴定体系
Figure BDA0003222436440000073
(3)重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap的诱导表达与目的蛋白SDS-PAGE检测
小量表达：取10μL阳性重组表达菌株和对应的空载体菌株菌液接种到2mL的LB培养基中(抗生素的终浓度为100μg·mL-1)。次日，分别将上述菌液0.8mL菌液分别接种于4mL含抗生素(以下抗生素终浓度均为100μg·mL-1)的液体LB培养基中，置于220r·min-1，37℃摇床培养2.5h。取1组加入IPTG(终浓度为1mmol·L-1)，剩余的培养基中不加诱导剂IPTG作为对照组，置于37℃，220r·min-1的摇床中诱导4h。使用细菌蛋白提取试剂盒提取上述菌株的蛋白，-80℃保存。取蛋白样品各20μL的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后取出电泳槽，弃去浓缩胶，将分离胶裁剪为合适大小，置于含有考马斯亮蓝R250的染色皿中，45r·min-1，染色3h，染色成功后用水洗掉染液，加入脱色液，45r·min-1，洗脱3h，期间每隔1h更换1次脱色液。直至条带清晰可见。置于胶片观察仪上，记录实验结果。
大量表达：分别取保存的BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap重组菌株菌液50μL加入到50mL已加入50μL Kana的3瓶液体LB培养基中，放进恒温振荡器，设置参数为，37℃，230r·min-1，过夜培养大约16-20h。次日，将活化的3瓶50mL菌液分别全部倒入200mL已加200μLKana的液体LB培养基，于37℃，230r·min-1的恒温振荡器振荡2h。向每只锥形瓶中加入终浓度为1mmoL·L-1的IPTG，放进恒温振荡器，设置参数为，37℃，230r·min-1，诱导表达6h。采用离心法将750mL菌液浓缩与1个100mL的离心管中，离心参数为8000r·min-1，10min。4℃。向管内加入30mL的灭菌PBS Buffer，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，8000r·min-1离心10min，去掉上清。往离心管中分别加入20mL的灭菌PBS Buffer，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，进行冰上超声，每次超声5s，间隔5s，合计1h。将超声裂解产物10000r·min-1，4℃，离心15min，保存一次超声上清于1个100mL的离心管中。将第一次超声后的沉淀，用20mL含终浓度为1％的TritonX-100的包涵体洗涤缓冲液，使用移液枪吹打菌体，使菌体悬起，进行冰上超声，每次超声5s，间隔5s，合计1h。将超声裂解产物10000r·min-1，4℃，离心15min，保存二次超声上清于1个100mL的离心管中，剩下的沉淀即为要收集的包涵体蛋白。用适量包涵体溶解液将得到的包涵体蛋白溶解，为能够完全溶解借助超声10min，至液体清亮，置于-20℃保存。取蛋白样品各20μL的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后取出电泳槽，弃去浓缩胶，将分离胶裁剪为合适大小，置于含有考马斯亮蓝R250的染色皿中，45r·min-1，染色3h，染色成功后用水洗掉染液，加入脱色液，45r·min-1，洗脱3h，期间每隔1h更换1次脱色液。直至条带清晰可见。置于胶片观察仪上，记录实验结果。
由图2可知，相对于空载体菌株BL21(DE3)-pET28a(泳道1和2)，重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-PCV4-Cap在26-34kDa之间有明显的一条带，说明重组PCV4 Cap蛋白得到成功表达。
(4)蛋白的亲和层析纯化
本试验采用北京天恩泽基因科技有限公司《一站式His标记蛋白质微量纯化套装》试剂盒(CAT#：100102A-20)进行纯化。
(5)病毒样颗粒的鉴定
通过透射电镜(TEM)观察重组PCV4 Cap蛋白是否形成VLPs并拍摄照片。图3结果显示，纯化的PCV4 Cap蛋白形成了直径为10-20nm之间的病毒样颗粒，颗粒大小均一，纯度高。
实施例3 PCV4-Cap蛋白的单克隆抗体(MAb)的制备与活性鉴定
(1)免疫程序
将纯化的PCV4 Cap蛋白形成的病毒样颗粒与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对6～8周龄BALB/c小鼠进行腹腔多点注射，免疫剂量约100μg/只；14d后将纯化的PCV4 Cap蛋白形成的病毒样颗粒蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射500μg纯化的重组猪圆环病毒4型Cap蛋白。
(2)杂交瘤细胞融合
采用PEG1450将SP2/0细胞与脾细胞进行融合，按1：5～1：2比例取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心后弃上清。缓慢加入50％PEG1400进行融合。用1％的HAT选择培养基重悬融合细胞，加至96孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2培养箱培养，每天观察细胞生长情况。采用间接ELISA方法进行MAb筛选，选取仅与PCV4 Cap蛋白呈阳性反应的杂交瘤细胞进行细胞克隆纯化。
(3)单克隆抗体腹水的制备
取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞(5×105～1×106个/只)，待小鼠腹部明显增大时抽取腹水，离心去除油脂和沉淀后即为单克隆抗体腹水，于-80℃冻存备用。
(4)抗PCV4 Cap的MAb的鉴定
用小鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定试剂盒(Pierce@Rapid ELISA Mouse mAbIsotyping Kit)鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型。鉴定结果显示3E6为IgG2b亚型，其余2株单克隆抗体(4A7和6D5)均为IgG1亚型，轻链类型均为κ。
(5)PCV4 Cap真核表达重组质粒的构建及表达蛋白与MAb的免疫反应
将PCV4 Cap基因克隆pcDNA3.1载体中构建重组质粒pcDNA-PCV4-Cap，转染猪肾细胞(PK15细胞)，具体步骤为：
5.1准备细胞：
贴壁猪肾细胞(PK15细胞)：转染前1天，将细胞接种于完全培养基中，使细胞充分生长，在转染时细胞密度将达到50-70％的融合。
5.2准备转染试剂：充分旋涡振荡Xfect Polymer。
5.3稀释质粒DNA：在灭菌的1.5mL EP管中，用Xfect Reaction Buffer将5μg质粒DNA(pcDNA-PCV4-Cap)稀释至最终体积为100μL。高速旋涡振荡5sec，以充分混匀。
注意事项：①在加入Xfect Polymer之前，一定要先把质粒加入Xfect ReactionBuffer；②溶液中Xfect Reaction Buffer体积不低于50μL；③每个6孔板的一个孔所用的质粒量不低于2.5μg，可以用到5-7.5μg。
5.4制备质粒—聚合物混合物：在稀释好的质粒DNA中加入1.5μL Xfect Polymer。高速旋涡振荡10sec。
注意：始终保持聚合物与DNA的比例不变。每1μg质粒DNA使用0.3μL XfectPolymer。
5.5孵育：室温孵育10分钟，使纳米颗粒复合物形成。
注意：建议Xfect聚合物在水溶液中的停留时间不要超过30min。
5.6瞬离：瞬时离心1sec，收集试管底部的物体。
5.7转染：将100μL的纳米粒复合溶液滴加到细胞培养基中。前后轻轻地晃动培养板，混合均匀。
5.8培养：37℃孵育4h，或过夜。
5.9换液：用移液枪从细胞中吸去除纳米颗粒复合物，加入2mL新鲜完全培养基，将板放回37℃培养箱直到分析时间。蛋白表达高峰通常在48h左右。
5.10设立空白对照：转染的过程中设空载体(pcDNA3.1)转染的细胞作为对照。
在转染后72h，弃掉培养基，用pH7.4 PBS洗涤3次，加入30％的丙酮-PBS，固定15min，弃掉固定液，真空干燥30min，加入200μL 1:200倍稀释的PCV4 Cap蛋白mAb，37℃1h。PBS洗涤3次。加入200μL 1：5000倍稀释的山羊抗鼠HRP-IgG酶标二抗，37℃1h，PBS洗涤3次，加入100μL AEC底物显色液，37℃15min。弃掉反应液，ddH2O洗1次，显微镜观察结果。由图4可知，所制备的单克隆抗体与重组质粒pcDNA-PCV4-Cap转染细胞发生特异性的细胞核染色反应，而与空载体pcDNA3.1转染细胞无特异性染色反应，说明所制备的Mab具有良好的免疫原性。
实施例4 PCV4 Cap蛋白抗原表位的鉴定
(1)PCV4 Cap蛋白抗原表位的初步鉴定
间接ELISA方法检测：将覆盖PCV4 Cap蛋白氨基酸序列的截短肽段进行人工合成，将人工合成的肽段进行包被，50ng/孔包入ELISA板中，以杂交瘤细胞上清作为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG作为二抗，TMB作为底物显示，进行检测。(根据免疫学原理，单抗对应肽，肽免疫动物的多克隆抗体能阻断单抗结合肽，肽能够刺激机体产生相应的单克隆抗体)。
结果显示：3E6单克隆抗体可特异性的与表位1(SEQ ID NO：3)：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST反应；4A7单克隆抗体可特异性的与表位2(SEQ ID NO：4)：NAYYRIRKIKVEFLPLI反应；6D5单克隆抗体可特异性的与表位3(SEQ ID NO：5)：SIQNSNFVQVWTVRFTL反应。且3E6单克隆抗体与表位2、表位3均不反应，4A7单克隆抗体与表位1、表位3均不反应，6D5单克隆抗体与表位1、表位2均不反应，说明三个单克隆抗体特异性较好，三者之间无交叉反应。
而且根据免疫学基本原理，单抗识别表位是特异性的，二者是一一对应的，即一个表位对应一个单抗。因此，可特异性的与表位1、表位2、表位3反应的单抗必定分别是3E6单克隆抗体、4A7单克隆抗体和6D5单克隆抗体。
(2)单抗的阻断效果试验
为了验证上述三个表位是可以刺激机体产生相应抗体的特异性的抗原表位，本发明将表位1、表位2、表位3依次与弗氏完全佐剂进行乳化，免疫90日龄的蛋鸡，免疫剂量为500μg/只，接种途径为胸部肌肉注射。在首次免疫后第21d，进行二次免疫，二次免疫原制备方法为：将表位1、表位2、表位3依次与弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫剂量为1000μg/只，接种途径为胸部肌肉注射。与二次免疫后第14天，翼下静脉采血，离心去上清制备得到阳性血清，-80℃保存备用。
试验组：分别将三个表位肽段进行包被，50ng/孔包入ELISA板中，分别加入对应识别的单抗，37℃、1h，洗涤后，再加入对应的鸡阳性血清，37℃1h，洗涤后，以山羊抗鸡HRP-IgG作为二抗，37℃、1h，洗涤后进行TMB显色。每个样本做三个重复，统计平均值和标准差。
对照组：分别将三个表位肽段进行包被，50ng/孔包入ELISA板中，分别加入对应的鸡阳性血清，37℃、1h，洗涤后，以山羊抗鸡HRP-IgG作为二抗，37℃、1h，洗涤后进行TMB显色，设置不免疫的鸡阴性血清作为对照。每个样本做三个重复，统计平均值和标准差。
由测定的数值显示(图5)：
(1)对照组表位1、表位2、表位3与对应的鸡阳性血清反应显色后的平均OD值依次为：3.4、3.8、4.1，表位1、表位2、表位3与不免疫的鸡阴性血清作为对照平均OD值为0.38、0.41、0.39，说明三个肽段都能较好的刺激机体产生特异性的抗体，且阴性血清与多肽的反应背景值较低。
(2)试验组中，经过加入对应的单克隆抗体作为阻断剂，再加入对应的鸡阳性血清，显色后，表位1、表位2、表位3的平均OD值依次为：1.2、0.95、0.42。
(3)由此说明，所制备的单克隆抗体可以特异性的阻断阳性血清与对应肽段的结合，证明了表位和单克隆抗体的一一对应关系。
(4)由(2)可以看出：在三个单抗中，6D5单克隆抗体的阻断效果最佳。
实施例5单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒(VLP)定量中的应用
利用制备的单克隆抗体，建立单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法，用于定量检测目的蛋白质。
目的蛋白检测是分子生物学研究的关键步骤，在病原和疾病检测中也具有重要意义。目前比较成熟的蛋白质定量检测方法有Western blotting、胶体金试纸、酶联免疫吸附试验(ELISA)等，现已得到广泛应用。Western blotting具有较高的灵敏度，常用于微量蛋白质的检测，然而，由于其样品预处理和测量操作复杂，往往耗时5个小时以上。
胶体金试纸条检测目标蛋白简单、快速，甚至可以用肉眼直接观察结果，但其灵敏度往往较差，因此其检测结果是定性的，而不是定量的。
依靠捕获抗体的高选择性，ELISA是另一种检测目标蛋白的工具。传统的ELISA方法通常需要很长时间在样品前准备中消耗，只能半定量地检测目标蛋白。然而，目前开发的ELISA程序相当快，甚至可以在几分钟内检测到目标蛋白，利用紧凑的检测装置和先进的检测算法，还可以实现高精度的定量检测。
为了实现不需要纳米颗粒和复杂微孔阵列的蛋白质定量检测，本发明提出了PCV4VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法，具体操作如下：
(1)外套载玻片后，将盖板清洗和胺化，钉在玻璃表面上。
(2)在T50缓冲液中配制0.1-0.3mg/mL的链霉亲和素溶液，然后将10μL的链霉亲和素-T50混合液注入样室，室温孵育5min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去多余的链霉亲和素。T50缓冲液由10mM Tris-HCl(pH＝8.0)和50mM NaCl混合制备。
(3)加入混合10μL生物素化的山羊抗鼠二级抗体(溶液浓度为20-30ng/mL)，室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；
(4)加入10μL抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠单克隆抗体(溶液浓度为10-30ng/mL)，室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；
(5)加入10μL PCV4 Cap蛋白VLP，室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；
(6)加入10μL兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗体(浓度为20-30ng/mL)，室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；
(7)加入10μL FITC-标记的山羊抗兔二级抗体溶液(浓度为0.5-2ng/mL)室温孵育10min，使用T50缓冲液20μL洗涤2次，30sec/次，去除多余试剂；
(8)最后，使用TIRF显微镜，在488nm波长的光激发FITC后，检测目标PCV4 Cap蛋白的VLP。
按照上述基本步骤进行三种单克隆抗体的有效性预实验，结果显示3E6、4A7的稳定性和敏感性均低于6D5单抗，6D5单抗使用浓度范围为：10-30ng/mL。依此确定以6D5单抗作为进一步的特异性、敏感性、稳定性试验评估。
(9)特异性试验：结果显示，6D5单抗能特异性的识别PCV4 Cap蛋白的VLP，而与猪圆环病毒(PCV)1型、2a/2b型、3型的Cap蛋白VLP以及猪细小病毒(PPV)VP2的VLP无交叉反应，说明特异性良好(如图6)。
(10)敏感性试验：以传统的ELISA(为公众知晓的方法，在此不做重复性描述)作为对照，与PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)进行敏感性对照试验，结果显示，PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)检测极限值为5ng/mL，而传统ELISA的PCV4 Cap蛋白VLP检测极限为450ng/mL，说明本发明建立的PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)的敏感性是传统ELISA方法的90倍。
(11)稳定性试验：按照操作程序配置试剂，分别置于-20℃、4℃、25℃和37℃保存，每隔7d抽样进行检测，评估其稳定性，结果显示，所有试剂在4℃及以下保存6个月、25℃保存、37℃保存4d稳定性良好。说明该方法4℃条件下保存稳定性。在实验室制备6批次，4℃保存，每隔7d对不同批次进行检测，结果显示，不同批次之间一致性良好，批间差异不明显，说明稳定性良好。
由此可见，6D5单抗为捕获抗体的PCV4 Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)能够有效、快速的定量PCV4 Cap蛋白VLP，对于后期开展PCV4疫苗抗原的定量具有重要价值。
实施例6单克隆抗体6D5的纯化及其轻链序列解析
(1)单克隆抗体6D5的纯化
采用NAbTMProtein G Spin Kit试剂盒(Thermo Scientific公司产品)纯化IgG抗体，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的抗体，经考马斯亮蓝染色、脱色后，结果如图7所示，在70kDa和25kDa分别有一条特征性的条带，分别为重链(H链)和轻链(L链)，表明抗体分子结构完整。
(2)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出轻链，经质谱技术测定了轻链可变区(VL)的氨基酸序列，序列经与Genbank中的蛋白质序列库比对，结果显示，该序列与小鼠轻链可变区的相似性高达90.18％，与小鼠IgG的κ型轻链的相似度高达89.29％，这也进一步印证了6D5单克隆抗体的轻链类型为κ型。所测得6D5单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
根据免疫学基本原理，抗体轻链的可变区是抗体与抗原结合的重要区域，即跟特定表位结合的特征区域，该区域序列是一个抗体分子区别于其他抗体分子的特征性标志。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 兆丰华生物科技（南京）有限公司
<120> 猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 687
<212> DNA
<213> PCV4-Cap基因(Artificial Sequence)
<400> 1
atgccaatca gatctaggta cagcagacgg aggcggaacc ggcggaacca gcgcaggcgg 60
agactgtggc cccgggccaa taggcggaga tcccggtgga gaaggaagaa cggaattttc 120
catgcgcgct tcatgaggga ggtgactctc agcgtgtcaa gcttttccac gccctcttgg 180
aacgttggac attacgattt caaactgaag gactttatcc caaaaggacc gggaacgatc 240
gtaaaccttt acagcctccc aaatgcatat taccggatca gaaagatcaa agtcgaattt 300
ctgccactaa ttggcattaa cagtaatagg acttactcta gcactgctat acaactggat 360
ggagactatg tgggggaagg gaaaaaccaa acttatgatg tcctggcaaa ccacagcagc 420
aggcatggtt tcaccaatat tgctagacac agtcgctatt tcactccaaa accccaagac 480
ccatccgggg aaacccacac cctccacttc cagcctaaca acaaaagaaa ccaatggtgg 540
atcagcatgg cggaccagga cctagtccat catggcctcc aatacagtat acaaaattcc 600
aactttgtgc aggtgtggac agtgagattt actttgtatg tgcaattcag agaatttgat 660
cttgttaact accccaaaca gggataa 687
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> PCV4 Cap蛋白(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Pro Ile Arg Ser Arg Tyr Ser Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Asn
1 5 10 15
Gln Arg Arg Arg Arg Leu Trp Pro Arg Ala Asn Arg Arg Arg Ser Arg
20 25 30
Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe His Ala Arg Phe Met Arg Glu Val
35 40 45
Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Ser Thr Pro Ser Trp Asn Val Gly His
50 55 60
Tyr Asp Phe Lys Leu Lys Asp Phe Ile Pro Lys Gly Pro Gly Thr Ile
65 70 75 80
Val Asn Leu Tyr Ser Leu Pro Asn Ala Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Ile
85 90 95
Lys Val Glu Phe Leu Pro Leu Ile Gly Ile Asn Ser Asn Arg Thr Tyr
100 105 110
Ser Ser Thr Ala Ile Gln Leu Asp Gly Asp Tyr Val Gly Glu Gly Lys
115 120 125
Asn Gln Thr Tyr Asp Val Leu Ala Asn His Ser Ser Arg His Gly Phe
130 135 140
Thr Asn Ile Ala Arg His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Gln Asp
145 150 155 160
Pro Ser Gly Glu Thr His Thr Leu His Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg
165 170 175
Asn Gln Trp Trp Ile Ser Met Ala Asp Gln Asp Leu Val His His Gly
180 185 190
Leu Gln Tyr Ser Ile Gln Asn Ser Asn Phe Val Gln Val Trp Thr Val
195 200 205
Arg Phe Thr Leu Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asp Leu Val Asn Tyr
210 215 220
Pro Lys Gln Gly
225
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 抗原表位1(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Arg Arg Ser Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe His Ala Arg
1 5 10 15
Phe Met Arg Glu Val Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Ser Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 抗原表位2(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ala Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Ile Lys Val Glu Phe Leu Pro Leu
1 5 10 15
Ile
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 抗原表位3(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Ile Gln Asn Ser Asn Phe Val Gln Val Trp Thr Val Arg Phe Thr
1 5 10 15
Leu
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物F1(Artificial Sequence)
<400> 6
catggatcca tgccaatcag atctaggtac agca 34
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 引物R687(Artificial Sequence)
<400> 7
catgtcgact tatccctgtt tggggtagtt aac 33
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 6D5轻链可变区(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Ser Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Lys Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Pro Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Arg Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Glu Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (6)

1.一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：制备所述单克隆抗体所用的免疫原为猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；
所述猪圆环病毒4型Cap蛋白包括3个核心抗原表位，分别为表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST，如SEQ ID NO：3所示；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI，如SEQ ID NO：4所示；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL，如SEQ ID NO：5所示。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的免疫球蛋白类型包括单克隆抗体3E6、4A7和6D5；其中，单克隆抗体3E6为IgG2b亚型，单克隆抗体4A7和6D5均为IgG1亚型，轻链类型均为κ。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体6D5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
4.权利要求1-3任一所述猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)免疫程序
将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对6～8周龄BALB/c小鼠进行腹腔多点注射，免疫剂量100μg/只；14d后将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射500μg纯化的重组猪圆环病毒4型Cap蛋白；
(2)杂交瘤细胞融合
采用PEG1450将SP2/0细胞与脾细胞进行融合，按1：5～1：2比例取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心后弃上清；缓慢加入50％PEG1400进行融合；用1％的HAT选择培养基重悬融合细胞，加至96孔细胞培养板中，置37℃、5％CO2培养箱培养，每天观察细胞生长情况；采用间接ELISA方法进行MAb筛选，选取仅与猪圆环病毒4型Cap蛋白呈阳性反应的杂交瘤细胞进行细胞克隆纯化；
(3)单克隆抗体腹水的制备
取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞5×105～1×106个/只，待小鼠腹部明显增大时抽取腹水，离心去除油脂和沉淀后即为单克隆抗体腹水。
5.权利要求1-3任一所述猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒定量中的应用，其特征在于：基于单克隆抗体6D5，建立单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法，用于定量检测目的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒定量中的应用，其特征在于，单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法的核心溶液的使用方法为：(1)链霉亲和素溶液工作浓度为0.1-0.3mg/mL；(2)生物素化的山羊抗鼠二级抗体溶液工作浓度为20-30ng/mL；(3)抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠单克隆抗体6D5单抗溶液工作浓度为10-30ng/mL；(4)兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗体工作浓度为20-30ng/mL；(5)FITC标记的山羊抗兔二级抗体溶液工作浓度为0.5-2ng/mL。
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