CN117903298A - 猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫检测技术领域，公开了一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用，猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的常见重要病原体之一，且存在众多基因型，对养猪业造成了巨大损失，由于PPV7的进化及近年来猪场PPV7感染呈上升趋势，导致PPV的防控面临新挑战，Cap蛋白是PPV7主要免疫原性蛋白，建立基于Cap蛋白的血清学检测方法对PPV7的防控具有重要意义。本发明提供的单克隆抗体能够在蛋白水平和细胞水平特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，具有特异性好、亲和性高等优点，可以用于猪细小病毒7型的检测以及相关检测制剂的研发，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。
背景技术
目前，猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的常见重要病原体之一，且存在众多基因型。
PPV7是单股线性DNA病毒，基因组大小约为4kb，PPV7与PPV1～6基因组同源性较低，包含2个开放阅读框，其中ORF2编码病毒衣壳蛋白Cap，是PPV7主要免疫原性蛋白，能够诱导抗病毒感染的特异性中和抗体，在病毒感染和复制中发挥着重要作用。
目前新发现的PPV7的研究报道多集中在核酸检测，ELISA血清学检测相比于病原学检测具有操作简便和高通量的优点，因此在养殖场的大规模检测中应用更加广泛。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前缺乏有效疫苗和特异性治疗方法，针对PPV7的防控只能依赖严格的检疫诊断措施。现有PPV7核酸检测方法对操作人员要求较高，检测成本较大，且需要相应的仪器设备和操作环境，不适于基层养殖场的大规模检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。
本发明是这样实现的，一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，抗体重链可变区序列如SEQ IDNO:2所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步，所述Cap蛋白是通过伴侣蛋白GRO7共表达的方法由原核表达系统制备的；其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白类型为IgG，结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成Y字形结构；轻链N端1～108个氨基酸序列多边，称为轻链可变区VL，重链N端1～130个氨基酸组成多变，称为重链可变区HL，在VL和HL中各有3个区域的氨基酸组成变化更大，称为高变区，高变区构成了与抗原B细胞表位特异互补结合的构型。
本发明的另一目的在于提供一种所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将纯化后的Cap蛋白与弗氏佐剂混合，乳化成疫苗，皮下接种6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg，共免疫4次，四免后一周尾静脉采集小鼠血液，分离血清，通过间接ELISA检测血清Cap蛋白抗体效价，选取抗体水平较高的小鼠进行细胞融合；
第二步，取加强免疫后3d的BALB/c小鼠经眼球摘除放血致死且收集阳性血清以备用；无菌取出小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞并与SP2/0细胞混合，在37℃水浴条件下加入1mLPEG-1500使两种细胞融合，加入含有HAT、10％胎牛血清的1640培养基，将细胞均匀的铺至96孔细胞培养板中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养；
第三步，于细胞融合后的第7天，用含HT的培养基对融合的细胞进行半量换液，融合后的第9天用含HT的培养基对融合的细胞进行全量换液，融合后的第11天，用间接ELISA方法测细胞上清抗体效价，重复测2次，将稳定分泌抗体的孔进行2～3次亚克隆，用间接ELISA方法测细胞效价，直至筛选出能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞3D10；
第四步，选取8-12周龄的BALB/c小鼠，提前7d向腹腔注射不完全弗氏佐剂，每只500μL，7d后把筛选出的单克隆细胞800rpm，离心10min，弃上清，用PBS重悬，进行活细胞计数，每只小鼠注射1×106个单克隆细胞至腹腔。7～10d后用无菌注射器抽取小鼠腹水，12000rpm，离心30min；用Protein G亲和层析纯化腹水。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的猪细小病毒7型Cap蛋白的制备，截取PPV7 Cap蛋白全长碱基序列，根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，在其N端和C端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶，合成并克隆至pET28a表达载体，获得重组载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并加入IPTG进行诱导表达，保存表达量较高的重组菌株；
活化重组菌株被制备成感受态，将表达伴侣蛋白pGRO7的质粒转入重组细胞中，利用抗性标记对阳性克隆进行筛选，建立共表达体系；
将重组菌株1:100接种于LB培养基，加入相应抗生素和1mg/ml的阿拉伯糖，37℃、220rpm培养2h，诱导GRO7蛋白的表达，然后加入0.1mM IPTG，30℃、220rpm培养12h，诱导Cap蛋白的表达；诱导结束后取出培养瓶，离心收集菌体，用PBS清洗2次后将菌体重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心分离上清和沉淀，上清用来纯化可溶性Cap蛋白，沉淀用适量PBS重悬后留作SDS-PAGE检测样品。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白诱导情况，然后用硫酸铵粗纯和亲和层析两步法纯化目的蛋白；
首先用梯度硫酸铵沉淀法确定目的蛋白盐析所需的饱和硫酸铵浓度，蛋白析出沉淀用适量PBS溶解并透析，经0.22μm滤膜过滤后置于冰上或4℃暂存；Ni-excel亲和介质经平衡液平衡后，将过滤后的细胞培养上清以1mL/min的流速在4℃条件下结合，用20倍柱体积的平衡液洗去未结合的蛋白，然后用20倍柱体积含有30mM咪唑的溶液洗去与Ni填料结合能力差的杂蛋白，最后用含100mM咪唑的平衡液配置成的洗脱缓冲液对结合的重组蛋白进行洗脱；
纯化蛋白的SDS-PAGE检测，使用BCA法测定蛋白浓度，取部分纯化后的蛋白，加入5×上样缓冲液混合后煮沸10min变性，经12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品后使用考马斯亮蓝溶液进行染色，脱色完成后使用凝胶成像系统进行观察，结果显示纯化后的重组蛋白分子量为54Kd。
进一步，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的单克隆抗体的检测用间接ELISA的方法，包被抗原为原核表达纯化的Cap蛋白，包被浓度为10μg/孔，并设阴性孔和阳性孔对照，将单克隆抗体倍比稀释作为一抗，以OD450值大于阴性孔3倍为阳性判定标准，测定单克隆抗体的效价为1:1024000；
单克隆抗体类型和亚型检测：使用商品化单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体3D10的亚型进行鉴定，结果显示3D10的重链为IgG1，轻链为kappa；
单克隆抗体可变区序列的测定：根据鼠源IgG的序列特征，设计针对3D10的重链可变区引物和轻链可变区引物并合成；复苏杂交瘤细胞并提取其细胞总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物进行测序；
单克隆抗体特异性检测：使用Westernblot，以纯化后的Cap蛋白为抗原，以原核细胞表达的且带His-tag的PPV1型VP2蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白为对照抗原，以单克隆抗体为一抗，HRP-G@M-IgG为二抗，分析单克隆抗体与Cap蛋白结合的特异性，结果显示单克隆抗体只与PPV7 Cap蛋白反应，特异性良好；将真核表达质粒PPV7-Cap-pcDNA3.1转染PK-15细胞，用间接免疫荧光方法IFA，分别检测单克隆抗体3D10与细胞水平的Cap蛋白结合情况，结果表明3D10只与Cap蛋白发生特异性反应，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型的检测为阴性。
本发明的另一目的在于提供一种所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体在猪细小病毒7型Cap蛋白检测中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、本发明提供的PPV7 Cap蛋白单克隆抗体由可溶性表达的Cap蛋白为抗原而制备，与伴侣蛋白共表达的可溶性Cap蛋白具有正确的结构和抗原表位，使得所制备的单克隆抗体具有高度的特异性和亲和性，能够识别真核表达的Cap蛋白，为PPV7病毒感染猪血清的检测提供了保障。
第二，本发明提供的Cap蛋白单克隆抗体能够用于PPV7血清学ELISA检测方法的建立，该方法具有操作简便、特异性高、成本较低的优点，可用于基层养殖场的大规模检测。
本发明提供的Cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌，制备简单，可大批量生产。单克隆抗体的高特异性和亲和性为PPV7抗原检测提供了有利工具，转化后可用于PPV7抗原检测试剂盒的研发，具有较大的商业价值。
第三，本发明技术方案的优点还体现在：
特异性强：通过特定的抗体重链和轻链可变区序列，确保该单克隆抗体能特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，提高检测的准确性。
表达效率高：采用原核表达系统配合伴侣蛋白GRO7共表达的方法，提高Cap蛋白的表达效率和可溶性。
多样化抗体选择：提供单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体等多种形式，适用于不同的研究和应用需求。
稳定的抗体生产：通过杂交瘤细胞稳定分泌抗体，保证了抗体的质量和持续供应。
附图说明
图1是本发明实施例提供的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法流程图；
图2是本发明实施例提供的PPV7阳性血清对重组Cap蛋白的Westernblot鉴定结果示意图；泳道1：未诱导破碎上清，泳道2：未诱导破碎沉淀，泳道3：诱导后破碎上清，泳道4：诱导后破碎沉淀；
图3是本发明实施例提供的SDS-PAGE鉴定结果。泳道1：纯化前Cap蛋白，泳道2：纯化后Cap蛋白示意图；
图4是本发明实施例提供的单克隆抗体3D10Westernblot鉴定结果。泳道1：3D10与Cap蛋白的Westernblot鉴定结果示意图；
图5是本发明实施例提供的单克隆抗体3D10 IFA鉴定结果。A.3D10，B.阴性对照示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的两个具体实施例为：
实施例1：猪细小病毒7型感染的快速检测
使用猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，检测猪血清中的PPV7 Cap蛋白。将血清样本加入到包被有Cap蛋白的ELISA板孔中，让抗体与抗原特异性结合。使用二抗和显色剂来检测和量化结合反应。
根据颜色变化和OD值，快速判断样本是否为PPV7阳性。对比实验室传统的PCR方法，评估ELISA方法的准确性和灵敏度。
实施例2：猪细小病毒7型疫苗的效果评估
选择健康的猪只，进行PPV7疫苗的接种。定期收集疫苗接种猪只的血清样本。使用单克隆抗体，通过ELISA技术检测血清中PPV7特异性抗体的水平。
根据抗体滴度的变化，评估疫苗引发的免疫应答强度。将接种疫苗后的抗体水平与自然感染猪只的抗体水平进行比较，评估疫苗的保护效果。
本发明实施例提供的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体能够特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
Cap蛋白是通过伴侣蛋白GRO7共表达的方法由原核表达系统制备的。其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；
单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
SEQ ID NO:1：
ATGGCTGAACACATAACTCTATCAAATACATTCATGGCATACTGGGAAAATGATCCGTACCAATATCCGACCTACAAACCATTCCAAAAAAACGAAGTTTTGACCTATAACACCGGCTGGCATATTCTGCCAAACATCTTGTGGCGTCATTTTCTGTCGCCGAAGCAGTGGTACGAGTTATGCATTAACTATGAAGCATATCACGTGGAGGGCACCTCCACTACGGTGTTCAATCCGATCCCGATCACGAATAACTTGGCGATTCAGGGTACGTCTACCTTTACCGCGTTTAACAACACCATTTACAGCCTGGGCGCGAGCGACGACCTGTATGAGACAGGCTACCACAACTGGTACGAGGACACCCTGTGGCGTAGCTGGTACGTGGCCTACAAAGAAGGCCTGGTTCCGAAGCCGACTACGGCTACCAAAGAGGGTGTTGGTAATTCCTGGTCTCGGCTGACCTTGCCGACCTATCTGTGGAGCGCTCCGATTACTGCGCCGGAAACCAACTGGACCTGGACGTGGAACACCAACAAGCCGTACCCGACCGCGGGCACGACCTGGCCGCACACCGATGCAGGTACTGAGCAGGTTGCGGCTCCGGCTGGATGTTTTTGGGATCCATTCACCAACCCGGATTCGATCCAAGAGCTGCGTCCGGGTAAAAACGCCATGAGTTTTCATTGGAAAACCCACGGCGCGGATGAACACTGCTGGTATAATCTCGACAGCCTGGTGAAGCTGTTTCCGTACACCCCCGAGAGCGGTTACAGCCATAATATTCGTGAAAAGAAGTATCAAGGTCCGCCTGGTACCCGTATCGTGAATGAAAATTTCCAGCATCCGACTCCGCAGACCTCCATCAGCTCCGACCAGAGCAAAGTGTTCATTGAGCACGATGTTCCGAACATTCTGAATGCCCCGATTGTCCCGATCCAGTGGTTTTGGATTGAACTGGAACGTAATCTTATCGAGGACAAAAAGGTCGAAAAGCCACAACTGGGCTGGCCTGGTACCGAATGGGCAACCCCGAAGTACCCCCCGATGAATAACTTCATCAAAGGTATTCCGCTGACCGACGAGAACGGCACTTTGGTTAAGACCGTCACCATGGGTTGCTTCCGCAACTCCATCCACCTGAGCTGTAAAAAACGTCGCAGCCGCATGTTTGCGCCGACGTGGGGTCCGATGAGCGTAGAGATGACGCACGGCATCGATAGCGCGTTCGTGCTCCCTACCGTTCGTTATCGCACCGGTGGTGCGCGTAGAAGCTGGCAGGCCCGTACACGCGACACCCGTGACAAGGAGCCGCAACAGCCGTGGTATCAATGGAACCCGTATATGACCGGCACCTACTCATCCACAACCACCACCTCTACATACACCACTACGACCTCTCGTAAGTAA
SEQ ID NO:2：
DRLPSLVRGHARC.LVRGLQRRGGSEARPVYQRGCWGFLVAVSVHDLS VERKEVCAGNQLDLDVEHQQAVPDRGHDLAAHRCRYHAGCGSGWMFLGY PYREGFDPRAASGQKRHEF
SEQ ID NO:3：
GILHYAPLVKTSMQQDALRDSVGMVWEQRPPASMEDIRAPDPQIEAFLSQKAHRPGPSMEYMMNTGLCFCAIDNTTMALGASIYLISQGQRFAEKEKQKQKRKQILGP
如图1所示，本发明实施例提供的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S101：将纯化后的Cap蛋白与弗氏佐剂混合，乳化成疫苗，皮下接种6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg，共免疫4次，四免后一周尾静脉采集小鼠血液，分离血清，通过间接ELISA检测血清Cap蛋白抗体效价，选取抗体水平较高的小鼠进行细胞融合；
S102：取加强免疫后3d的BALB/c小鼠经眼球摘除放血致死且收集阳性血清以备用。无菌取出小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞并与SP2/0细胞混合，在37℃水浴条件下加入1mLPEG-1500使两种细胞融合，加入含有HAT、10％胎牛血清的1640培养基，将细胞均匀的铺至96孔细胞培养板中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养；
S103：于细胞融合后的第7天，用含HT的培养基对融合的细胞进行半量换液，融合后的第9天用含HT的培养基对融合的细胞进行全量换液，融合后的第11天，用间接ELISA方法测细胞上清抗体效价，重复测2次，将稳定分泌抗体的孔进行2～3次亚克隆，用间接ELISA方法测细胞效价，直至筛选出能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞(3D10)；
S104：选取8-12周龄的BALB/c小鼠，提前7d向腹腔注射不完全弗氏佐剂，每只500μL，7d后把筛选出的单克隆细胞800rpm，离心10min，弃上清，用PBS重悬，进行活细胞计数，每只小鼠注射1×106个单克隆细胞至腹腔。7～10d后用无菌注射器抽取小鼠腹水，12000rpm，离心30min。用Protein G亲和层析纯化腹水。
本发明实施例提供的单克隆抗体是指一类由单一B细胞分泌的，能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。免疫球蛋白类型为IgG，其结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成Y字形结构。轻链N端1～108个氨基酸序列多边，称为轻链可变区VL，重链N端1～130个氨基酸组成多变，称为重链可变区HL，在VL和HL中各有3个区域的氨基酸组成变化更大，称为高变区，这些高变区构成了与抗原B细胞表位特异互补结合的构型。
在本发明实施例中，猪细小病毒7型Cap蛋白的制备，截取PPV7 Cap蛋白全长碱基序列，根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，在其N端和C端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶，委托南京金斯瑞生物科技公司合成并克隆至pET28a表达载体，获得重组载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并加入IPTG进行诱导表达。保存表达量较高的重组菌株。
活化重组菌株被制备成感受态，将表达伴侣蛋白pGRO7的质粒转入重组细胞中，利用抗性标记对阳性克隆进行筛选，建立共表达体系。
将重组菌株1:100接种于LB培养基，加入相应抗生素和1mg/ml的阿拉伯糖，37℃、220rpm培养2h，诱导GRO7蛋白的表达，然后加入0.1mM IPTG，30℃、220rpm培养12h，诱导Cap蛋白的表达。诱导结束后取出培养瓶，离心收集菌体，用PBS清洗2次后将菌体重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心分离上清和沉淀，上清用来纯化可溶性Cap蛋白，沉淀用适量PBS重悬后留作SDS-PAGE检测样品。
在本发明实施例中，SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白诱导情况，然后用硫酸铵粗纯和亲和层析两步法纯化目的蛋白。
首先用梯度硫酸铵沉淀法确定目的蛋白盐析所需的饱和硫酸铵浓度，蛋白析出沉淀用适量PBS溶解并透析，经0.22μm滤膜过滤后置于冰上或4℃暂存。Ni-excel亲和介质经平衡液(20mM PB，300mM NaCl，pH 7.2)平衡后，将过滤后的细胞培养上清以1mL/min的流速在4℃条件下结合，用20倍柱体积的平衡液洗去未结合的蛋白，然后用20倍柱体积含有30mM咪唑的溶液洗去与Ni填料结合能力差的杂蛋白，最后用含100mM咪唑的平衡液配置成的洗脱缓冲液对结合的重组蛋白进行洗脱。需要注意的是，在此纯化过程中，使用的洗杂和洗脱缓冲液的体积不是固定不变的，它与细胞培养上清的体积和Ni填料的体积大小有关，在纯化过程中，操作人员可使用蛋白指示剂的颜色变化和微型分光光度计检测蛋白含量对纯化进程进行判断。洗脱的重组蛋白经透析除去咪唑。
在本发明实施例中，纯化蛋白的SDS-PAGE检测，使用BCA法测定蛋白浓度，取部分纯化后的蛋白，加入5×上样缓冲液混合后煮沸10min变性，经12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品后使用考马斯亮蓝溶液进行染色，脱色完成后使用凝胶成像系统进行观察(图4)，结果显示纯化后的重组蛋白蛋白分子量为54Kd。
抗猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备
应用常规的杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体。
动物免疫：将纯化后的Cap蛋白与弗氏佐剂混合，乳化成疫苗，皮下接种6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg，共免疫4次，四免后一周尾静脉采集小鼠血液，分离血清，通过间接ELISA检测血清Cap蛋白抗体效价，选取抗体水平较高的小鼠进行细胞融合。
细胞融合：取加强免疫后3d的BALB/c小鼠经眼球摘除放血致死且收集阳性血清以备用。无菌取出小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞并与SP2/0细胞混合，在37℃水浴条件下加入1mL PEG-1500使两种细胞融合，加入含有HAT、10％胎牛血清的1640培养基，将细胞均匀的铺至96孔细胞培养板中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养。
杂交瘤细胞的筛选：于细胞融合后的第7天，用含HT的培养基对融合的细胞进行半量换液，融合后的第9天用含HT的培养基对融合的细胞进行全量换液，融合后的第11天，用间接ELISA方法测细胞上清抗体效价，重复测2次，将稳定分泌抗体的孔进行2～3次亚克隆，用间接ELISA方法测细胞效价，直至筛选出能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞(3D10)。
腹水的制备与纯化：选取8-12周龄的BALB/c小鼠，提前7d向腹腔注射不完全弗氏佐剂，每只500μL，7d后把筛选出的单克隆细胞800rpm，离心10min，弃上清，用PBS重悬，进行活细胞计数，每只小鼠注射1×106个单克隆细胞至腹腔。7～10d后用无菌注射器抽取小鼠腹水，12000rpm，离心30min。用Protein G亲和层析纯化腹水。
单克隆抗体的检测
单克隆抗体的反应性检测：用间接ELISA的方法，包被抗原为原核表达纯化的Cap蛋白，包被浓度为10μg/孔，并设阴性孔和阳性孔对照，将单克隆抗体倍比稀释作为一抗，以OD450值大于阴性孔3倍为阳性判定标准，测定单克隆抗体的效价为1:1024000。
单克隆抗体类型和亚型检测：使用商品化单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体3D10的亚型进行鉴定，结果显示3D10的重链为IgG1，轻链为kappa。
单克隆抗体可变区序列的测定：根据鼠源IgG的序列特征，设计针对3D10的重链可变区引物和轻链可变区引物并合成。复苏杂交瘤细胞并提取其细胞总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物进行测序。
单克隆抗体特异性检测：一方面使用Westernblot，以纯化后的Cap蛋白为抗原，以原核细胞表达的且带His-tag的PPV1型VP2蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白为对照抗原，以单克隆抗体为一抗，HRP-G@M-IgG为二抗，分析单克隆抗体与Cap蛋白结合的特异性，结果显示单克隆抗体只与PPV7 Cap蛋白反应，特异性良好。另一方面，将真核表达质粒PPV7-Cap-pcDNA3.1转染PK-15细胞，用间接免疫荧光方法(IFA)，分别检测单克隆抗体3D10与细胞水平的Cap蛋白结合情况，结果表明3D10只与Cap蛋白发生特异性反应，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型的检测为阴性，说明3D10特异性良好。
本发明的应用实施例提供了一种PPV7 Cap蛋白可溶性表达方法，所述表达方法是利用大肠杆菌细胞，将Cap蛋白与GRO7伴侣蛋白共表达，使得Cap蛋白能够正确折叠，具有与天然蛋白相似的抗原表位。
本发明的应用实施例提供了一种PPV7 Cap蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体可用于PPV7血清学抗原检测方法的建立。
图1给出了本发明通过原核表达系统制备的Cap蛋白与PPV7临床阳性血清的反应结果。由图可知，Cap蛋白在与伴侣蛋白GRO7共表达的条件下，实现了部分可溶性表达，存在于细胞破碎上清中，可溶性表达量约为50％，且能够与阳性血清发生特异性结合。
图4给出了本发明所述单克隆抗体与真核细胞表达Cap蛋白的反应结果。由图可知，单克隆抗体3D10能够特异性识别来自真核细胞的Cap蛋白，具有检测临床PPV7病毒感染血清的潜力。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体特异性结合猪细小病毒7型Cap蛋白，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:2所示，其轻链可变区序列如SEQ ID NO:3所示。
2.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述Cap蛋白是通过伴侣蛋白GRO7共表达的方法由原核表达系统制备的；其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体包括选自单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体和猪源单克隆抗体中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体由一株杂交瘤细胞稳定分泌。
5.如权利要求1所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的免疫球蛋白类型为IgG，结构包括两条相同的重链和两条相同的轻链，重链和轻链通过二硫键相互连接，形成Y字形结构；轻链N端1～108个氨基酸序列多边，称为轻链可变区VL，重链N端1～130个氨基酸组成多变，称为重链可变区HL，在VL和HL中各有3个区域的氨基酸组成变化更大，称为高变区，高变区构成了与抗原B细胞表位特异互补结合的构型。
6.一种如权利要求1～5任意一项所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
第一步，将纯化后的Cap蛋白与弗氏佐剂混合，乳化成疫苗，皮下接种6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫100μg，共免疫4次，四免后一周尾静脉采集小鼠血液，分离血清，通过间接ELISA检测血清Cap蛋白抗体效价，选取抗体水平较高的小鼠进行细胞融合；
第二步，取加强免疫后3d的BALB/c小鼠经眼球摘除放血致死且收集阳性血清以备用；无菌取出小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞并与SP2/0细胞混合，在37℃水浴条件下加入1mLPEG-1500使两种细胞融合，加入含有HAT、10％胎牛血清的1640培养基，将细胞均匀的铺至96孔细胞培养板中，放在37℃、5％CO2培养箱中培养；
第三步，于细胞融合后的第7天，用含HT的培养基对融合的细胞进行半量换液，融合后的第9天用含HT的培养基对融合的细胞进行全量换液，融合后的第11天，用间接ELISA方法测细胞上清抗体效价，重复测2次，将稳定分泌抗体的孔进行2～3次亚克隆，用间接ELISA方法测细胞效价，直至筛选出能稳定分泌单一抗体的杂交瘤细胞3D10；
第四步，选取8-12周龄的BALB/c小鼠，提前7d向腹腔注射不完全弗氏佐剂，每只500μL，7d后把筛选出的单克隆细胞800rpm，离心10min，弃上清，用PBS重悬，进行活细胞计数，每只小鼠注射1×106个单克隆细胞至腹腔；7～10d后用无菌注射器抽取小鼠腹水，12000rpm，离心30min；用Protein G亲和层析纯化腹水。
7.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的猪细小病毒7型Cap蛋白的制备，截取PPV7 Cap蛋白全长碱基序列，根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化，在其N端和C端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶，合成并克隆至pET28a表达载体，获得重组载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆并加入IPTG进行诱导表达，保存表达量较高的重组菌株；
活化重组菌株被制备成感受态，将表达伴侣蛋白pGRO7的质粒转入重组细胞中，利用抗性标记对阳性克隆进行筛选，建立共表达体系；
将重组菌株1:100接种于LB培养基，加入相应抗生素和1mg/ml的阿拉伯糖，37℃、220rpm培养2h，诱导GRO7蛋白的表达，然后加入0.1mM IPTG，30℃、220rpm培养12h，诱导Cap蛋白的表达；诱导结束后取出培养瓶，离心收集菌体，用PBS清洗2次后将菌体重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心分离上清和沉淀，上清用来纯化可溶性Cap蛋白，沉淀用适量PBS重悬后留作SDS-PAGE检测样品。
8.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白诱导情况，然后用硫酸铵粗纯和亲和层析两步法纯化目的蛋白；
首先用梯度硫酸铵沉淀法确定目的蛋白盐析所需的饱和硫酸铵浓度，蛋白析出沉淀用适量PBS溶解并透析，经0.22μm滤膜过滤后置于冰上或4℃暂存；Ni-excel亲和介质经平衡液平衡后，将过滤后的细胞培养上清以1mL/min的流速在4℃条件下结合，用20倍柱体积的平衡液洗去未结合的蛋白，然后用20倍柱体积含有30mM咪唑的溶液洗去与Ni填料结合能力差的杂蛋白，最后用含100mM咪唑的平衡液配置成的洗脱缓冲液对结合的重组蛋白进行洗脱；
纯化蛋白的SDS-PAGE检测，使用BCA法测定蛋白浓度，取部分纯化后的蛋白，加入5×上样缓冲液混合后煮沸10min变性，经12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品后使用考马斯亮蓝溶液进行染色，脱色完成后使用凝胶成像系统进行观察，结果显示纯化后的重组蛋白分子量为54Kd。
9.如权利要求6所述的猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法的单克隆抗体的检测用间接ELISA的方法，包被抗原为原核表达纯化的Cap蛋白，包被浓度为10μg/孔，并设阴性孔和阳性孔对照，将单克隆抗体倍比稀释作为一抗，以OD450值大于阴性孔3倍为阳性判定标准，测定单克隆抗体的效价为1:1024000；
单克隆抗体类型和亚型检测：使用商品化单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单克隆抗体3D10的亚型进行鉴定，结果显示3D10的重链为IgG1，轻链为kappa；
单克隆抗体可变区序列的测定：根据鼠源IgG的序列特征，设计针对3D10的重链可变区引物和轻链可变区引物并合成；复苏杂交瘤细胞并提取其细胞总RNA，然后反转录为cDNA，以cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物进行测序；
单克隆抗体特异性检测：使用Westernblot，以纯化后的Cap蛋白为抗原，以原核细胞表达的且带His-tag的PPV1型VP2蛋白、猪圆环病毒2型Cap蛋白为对照抗原，以单克隆抗体为一抗，HRP-G@M-IgG为二抗，分析单克隆抗体与Cap蛋白结合的特异性，结果显示单克隆抗体只与PPV7 Cap蛋白反应，特异性良好；将真核表达质粒PPV7-Cap-pcDNA3.1转染PK-15细胞，用间接免疫荧光方法IFA，分别检测单克隆抗体3D10与细胞水平的Cap蛋白结合情况，结果表明3D10只与Cap蛋白发生特异性反应，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型的检测为阴性。
10.一种如权利要求1～5任意一项所述猪细小病毒7型Cap蛋白单克隆抗体在猪细小病毒7型Cap蛋白检测中的应用。
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