CN111569056B - 一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列，本发明提供了SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原，包括编码该抗原的核苷酸序列，本发明还提供了一种制备该抗原的方法。用于制备猪轮状病毒疫苗的抗原的免疫效果较好，通过对编码该抗原的核苷酸序列进行改造，使抗原在大肠杆菌中的可溶性表达量明显增加，且制备程序简单，适于低成本大规模的工业化生产。

Description

一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，特别是涉及一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列。
背景技术
猪轮状病毒(RV)引起猪腹泻及幼猪死亡,给养殖户带来巨大的经济损失。应用疫苗免疫已经成为降低相关发病率、病死率和减轻经济负担的一个重要途径。养猪场等动物养殖场是该病的主要疫源地。目前临床主要应用减毒苗来进行防疫,但由于轮状病毒的多型性，减毒苗与野毒株基因重组,引起回复突变，以及养殖动物长期排毒,污染水源、食品；这些因素都给该病的防疫造成巨大困难。近年来国外深入开展了新型轮状病毒疫苗的研究工作,,并取得了巨大进展。其中主要为基因工程疫苗的研究，通过基因工程方法表达轮状病毒的抗原，免疫动物或人，从而达到免疫保护的目的。基因工程疫苗主要包括核酸疫苗、合成疫苗、重组表达抗原疫苗以及轮状病毒类病毒颗粒(VLP)疫苗等。但在目前使用的轮状病毒重组抗原亚单位疫苗研究中，由于轮状病毒基因组的多样性，导致制备的疫苗不能有效的预防不同基因背景的轮状病毒。
针对上述问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原、抗原的编码序列以及抗原的制备方法，用于制备猪轮状病毒疫苗的抗原的免疫效果较好，通过对编码该抗原的核苷酸序列进行改造，使抗原在大肠杆菌中的可溶性表达量明显增加，且制备程序简单，适于低成本大规模的工业化生产。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于制备猪轮状病毒疫苗的抗原，抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
编码权利要求1所述的抗原的核苷酸序列。
优选的，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，对SEQ ID NO:2进行改造以获得可溶性表达量增多的核苷酸序列，改造后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，用于表达权利要求1所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，SEQ IDNO:7是在SEQ ID NO:3上连接保护性碱基、XhoⅠ双酶切位点和补位核苷酸以及能够被大肠杆菌Sec系统识别的OmpA信号肽序列以实现抗原的表达、分离以及纯化。
优选的，SEQ ID NO:7中首位和末位各三个核苷酸序列(GGC)为保护性碱基，首位第4-9位(CCATGG)以及末位倒数4-9位核苷酸序列(CCATGG)为XhoⅠ双酶切位点，首位第10-11位(GC)和末位倒数第10位核苷酸序列(A)为补位核苷酸，首位第12-74位核苷酸序列为OmpA信号肽序列。
一种制备上述的抗原的方法，包括以下步骤：
(1)通过对A群猪轮状病毒VP6基因分析，选取高亲水区、去信号肽、高保守区的特异性序列片段进行组合，从而获得重组抗原；
(2)重新构建抗原的核苷酸序列，并在重新构建的核苷酸序列的5′端连接能被大肠杆菌的Sec系统识别OmpA信号肽序列；
(3)把构造好的核苷酸片段克隆到pGEX-4T-1载体上，然后转化入E.coli BL21中，通过IPTG诱导表达，经分离纯化后即可得到猪轮状病毒VP6主要抗原区的抗原。
一种猪轮状病毒疫苗，包含上述所述的抗原以及佐剂。
优选的，所述佐剂为白油佐剂。
优选的，每毫升疫苗中含有221μg/ml的抗原。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的抗原保持了A群猪轮状病毒VP6的主要抗原性，由于其经过了细胞周质的加工和修饰过程，结构上比单纯的原核表达的包涵体更接近于原蛋白结构，抗原特异性更强，并且该抗原为分泌表达，抗原纯化无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去除程序；该抗原适于低成本大规模工业化生产、免疫效果好，生产成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为VP6基因改造前后菌体和上清液的电泳图。
图2为VP6基因改造前后菌体和上清液的Western Blot图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1猪轮状病毒疫苗的抗原的重组
本发明通过对A群猪轮状病毒VP6基因进行分析，选取高亲水区、去信号肽、高保守区的特异性序列片段进行组合，从而获得免疫效果较好重组抗原，该抗原完全包含了上述特异性序列，最大程度上保证了抗原的高效性与特异性。该抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，编码该抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为了增加可溶性表达，对SEQ ID NO:2进行了改造，改造后的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:3所示，即把SEQ ID NO:2第93位和227位的半胱氨酸密码子替换为甘氨酸密码子。
本发明还提供一种制备上述抗原的方法，该方法包括以下步骤：
(1)通过对A群猪轮状病毒VP6基因分析，选取高亲水区、去信号肽、高保守区的特异性序列片段进行组合，从而获得重组抗原；
(2)重新构建抗原的核苷酸序列，即SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，在重新构建的核苷酸序列的5′端连接能被大肠杆菌的Sec系统识别OmpA信号肽序列；
(3)把构造好的核苷酸片段克隆到pGEX-4T-1载体上，然后转化入E.coli BL21中，通过IPTG诱导表达，经分离纯化后即可得到猪轮状病毒VP6主要抗原区的抗原。
在重新构建的核苷酸序列的5′端连接能被大肠杆菌的Sec系统识别OmpA信号肽序列，其是为了使表达的抗原能够转运到细胞间质，从而在抗原纯化时无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去除程序。OmpA信号肽序列如SEQ ID NO:4所示，编码OmpA信号肽的核苷酸序列为如SEQ ID NO:5所示。
为了实现抗原的准确表达以及便于后期的分离纯化过程，用于表达该抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，其中SEQ ID NO:6为对应SEQ ID NO:2的未改造的核苷酸序列，SEQ ID NO:7为对应SEQ ID NO:3的经过改造的核苷酸序列。SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中的首位和末位各三个核苷酸序列(GGC)为保护性碱基，首位第4-9位(CCATGG)以及末位倒数4-9位核苷酸序列(CCATGG)为XhoⅠ双酶切位点，首位第10-11位(GC)和末位倒数第10位核苷酸序列(A)为补位核苷酸，首位第12-74位核苷酸序列为OmpA信号肽序列。
实施例2抗原的表达
1.目的基因的克隆和重组表达质粒的构建
首先人工合成核苷酸片段SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，将10μl含人工合成核苷酸片段的质粒DNA加入到E.coli Top10混合后冰浴30min，然后在42℃热休克90s，然后立即冰浴2～3min。然后均匀涂在含氨苄西林(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。挑取含阳性菌落摇菌，提取质粒，经PCR及双酶切鉴定(NcoⅠ/XhoI)，鉴定正确的重组质粒送生工生物工程(上海)有限公司测序。用NcoⅠ和XhoI分别双酶切重组克隆质粒和表达载体pGEX-4T-1，回收基因片段和pGEX-4T-1载体片段，用T4 DNA酶16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌Top10中，挑取阳性菌落，提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒pGEX-4T-1-vp6送生工生物工程(上海)有限公司测序。
2.目的基因的诱导表达和Western blotting鉴定
通过热激法将重组表达质粒pGEX-4T-1-vp6转化入感受态E.coli BL21(DE3)中，在含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜。挑取含阳性质粒的单菌落，加入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.4-0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃振荡诱导培养4h后离心，收集菌体。取1ml菌液，4℃，3000g/min离心5min，弃上清，加入70μl 1×TE缓冲液，重悬沉淀，加入2μl 5×Loading Buffer，4.5μl DTT,95℃煮沸10min，4℃1000g离心10min，取上清12μl进行SDS-PAGE分析，其结果如图1所示；另取1ml菌液，4℃，3000g/min离心5min，取35μl上清,加入35μl 1×TE缓冲液,混匀,加入2μl 5×Loading Buffer,4.5μl DTT,95℃煮沸10min，4℃1000g离心10min，取上清12μl进行SDS-PAGE分析，其结果如图1所示。图中泳道1、2、3、4和M分别为改造后上清液、改造后菌体、改造前上清液、改造前菌体和蛋白质标准分子质量的电泳图。如图1所示，改造前后菌体和上清液中均含有蛋白质分子量为33.8KD目的蛋白，但是清晰可见改造后上清液中目的蛋白含量明显多于改造前，因此A群猪轮状病毒VP6基因经改造后分泌量明显增多。
用100％甲醇预处理PVDF膜不超过15s，用去离子水润洗后放入转膜缓冲液中浸泡几分钟；胶在负极、膜在正极，按照海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸的顺序，每层放好后赶去气泡。放入电泳槽中；电泳条件为50v，2h；电泳结束后取出PVDF膜，用去离子水略漂洗，100％甲醇浸泡，待染色。
取出PVDF膜，用5％脱脂乳封闭过夜；用TBST洗3遍，加一抗，37℃摇床摇1h；用TBST洗3遍，加酶标二抗，37℃摇床摇1h；用TBST洗3遍，加入Peroxidase SubstrateKit溶液染色10min，结果如图2所示，图2中M、1、2、3和4分别为蛋白质标准分子质量、改造后上清液、改造后菌体、改造前上清液和改造前菌体的转膜染色图。经过转膜染色，进一步证明A群猪轮状病毒VP6基因经改造后分泌量明显增多，并且是特异的。
实施例3A群猪轮状病毒VP6结构蛋白纯化、复性及亚单位疫苗制备
按照以下步骤进行纯化、复性：(1)将诱导表达的菌液取出分装至50ml离心管中，4℃，5000r/min离心10min，取上清；(2)向上清液中加入硫酸铵至20％饱和度，充分混合后，置2～8℃，12～16小时,7000r/min离心30分钟，弃沉淀，收集上清；(3)上清加入硫酸铵至50％饱和度，充分混合后，置2～8℃，12～16小时,7000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀；(4)沉淀称重后按1∶10比例加入灭菌生理盐水复溶，7000r/min离心30分钟，弃沉淀，收集上清；(5)再向上清液中加入硫酸铵至45％饱和度，充分混合后，置2～8℃，12～16小时,7000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀，按1∶20比例加入灭菌生理盐水复溶。取35μl上清,加入35μl 1×TE缓冲液,混匀,加入2μl 5×Loading Buffer,4.5μl DTT,95℃煮沸10min，4℃1000g离心10min，取上清12μl用12％SDS-PAGE电泳鉴定分析获得33.8kDa目的蛋白。
将纯化好的A群猪轮状病毒VP6结构蛋白用改良Lowry法检测蛋白质含量，按照改良Lowry法蛋白质测定试剂盒(Thermo公司)说明书进行操作，操作步骤如下：
(1)用移液器准确量取标准牛血清白蛋白系列浓度样品各40μL按顺序加入“U”型96孔板中；用移液器准确量取40μL重悬待检样品加入“U”型96孔板中，每一待检样品加3个孔；
(2)每孔内加入200μL试剂盒内Lowry试剂，立即震荡混匀30s(或用移液器吹打混匀20次)，封膜，室温放置10min；
(3)每孔内加入20μL现配好的1倍酚试剂，立即震荡混匀30s(或用移液器吹打混匀20次)，封膜，室温放置30min(注意：放置时间不要过长，最好不要超过1h,否则会影响测定结果)；
(4)迅速用全光程紫外分光光度计测定其750nm吸光值；
(5)根据标准牛血清白蛋白系列浓度样品吸光值，以吸光值为X轴,以蛋白质含量为Y轴，绘制标准曲线，y＝428.45x2+371.18x-22.108，线性相关系数r＝0.9977，决定因子R2＝0.9954
(6)将待检样品吸光值x＝1.084代入多项式求解蛋白质含量为884μg/ml。
将此纯化的融合蛋白溶液与白油佐剂按体积比＝1∶3进行配苗，制备成A群猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗，相当于每毫升疫苗中含有融合蛋白221μg/ml。
实施例4A群猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗对家兔免疫反应及抗体水平检测
以1.5ml/只的剂量用肌肉注射的途径免疫2.5kg左右家兔，14日后加强免疫一次。家兔在屏障环境下内饲养，饲料及饮用水均高压灭菌，维生素及饲料添加剂亦经过无菌检测。在二免后一周、2周、3周、4周、5周分别采集血清，用中和试验检测血清中和抗体效价。中和试验采用固定病毒稀释血清的方法，当阳性、阴性、正常细胞对照均成立时才能进行判定，以完全抑制细胞出现病变的血清最高稀释度为该血清的中和抗体效价。
检测结果如下：家兔免疫接种试验表明，用制备的A群猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗加强免疫后第1～2周检测血清中和抗体效价几何平均值为7.4log2～7.6log2，加强免疫后4周，中和抗体效价达到高峰，几何平均值为11.4log2，加强免疫后5周中和抗体水平保持较高水平，几何平均值为11.2log2；显著高于对照组。
表1 A群猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗免疫后家兔中和抗体水平检测结果
Figure BDA0002509169600000071
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列，本发明提供了SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗原，包括编码该抗原的核苷酸序列，本发明还提供了一种制备该抗原的方法。用于制备猪轮状病毒疫苗的抗原的免疫效果较好，通过对编码该抗原的核苷酸序列进行改造，使抗原在大肠杆菌中的可溶性表达量明显增加，且制备程序简单，适于低成本大规模的工业化生产。
序列表
<110> 山东信得科技股份有限公司
青岛信得药业有限公司
<120> 一种猪轮状病毒疫苗、制备该疫苗的抗原及其编码序列
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 293
<212> PRT
<213> A群猪轮状病毒(Porcine rotavirus A)
<400> 1
Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Asp Ser Leu Ile Lys Leu Ser
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile
20 25 30
Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe
35 40 45
His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg
50 55 60
Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala
65 70 75 80
Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Gly Ala Ile Asn
85 90 95
Ala Pro Ala Ser Thr Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg
100 105 110
Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe
115 120 125
Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr
130 135 140
Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Ile Glu Phe Leu
145 150 155 160
Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile
165 170 175
Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg
180 185 190
Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln
195 200 205
Pro Phe Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser
210 215 220
Ala Val Trp Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala
225 230 235 240
Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val
245 250 255
Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro
260 265 270
Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg
275 280 285
Ser Met Leu Ile Lys
290
<210> 2
<211> 879
<212> DNA
<213> A群猪轮状病毒(Porcine rotavirus A)
<400> 2
caaagaaatg gaattgcacc acaatcagat tcacttataa agttatcagg cattaaattt 60
aaaagaataa attttgacaa ttcatcagaa tacatagaga actggaattt gcaaaataga 120
agacaaagaa cgggttttac atttcataaa ccaaacattt tcccttattc agcttcattc 180
acgttgaaca gatcacaacc ggctcatgat aacttgatgg gtacgatgtg gctcaatgcg 240
ggatcagaaa ttcaggtcgc tggattcgac tactcatgtg caataaacgc gccagctagt 300
acgcaacaat ttgagcatat tgtacagctt cgaagggtgt tgactacagc tacaataact 360
cttttaccag atgcagaaag atttagtttt ccaagagtga ttaattcagc tgacggagcg 420
actacatggt acttcaatcc agtgattctt agaccaaata acgttgaaat agagtttcta 480
ctaaacgggc agataataaa tacttaccaa gcaagatttg gaacgatcat agctagaaat 540
tttgatacaa ttagattgtc atttcagttg atgagaccac caaatatgac accagctgta 600
gcggcgttat ttccaaatgc gcagccattt gaacatcacg caacagtagg actcacgctt 660
agaattgaat ctgcagtttg tgaatcagta cttgccgacg caagcgaaac aatgctagca 720
aatgtgacat ctgttagaca agaatacgcg ataccagttg gaccagtttt tccaccaggt 780
atgaattgga ctgatttgat cactaactat tcgccatcta gagaggataa cttgcagcgt 840
gtatttacag tggcttccat tagaagcatg ttgattaag 879
<210> 3
<211> 879
<212> DNA
<213> A群猪轮状病毒(Porcine rotavirus A)
<400> 3
caaagaaatg gaattgcacc acaatcagat tcacttataa agttatcagg cattaaattt 60
aaaagaataa attttgacaa ttcatcagaa tacatagaga actggaattt gcaaaataga 120
agacaaagaa cgggttttac atttcataaa ccaaacattt tcccttattc agcttcattc 180
acgttgaaca gatcacaacc ggctcatgat aacttgatgg gtacgatgtg gctcaatgcg 240
ggatcagaaa ttcaggtcgc tggattcgac tactcaggtg caataaacgc gccagctagt 300
acgcaacaat ttgagcatat tgtacagctt cgaagggtgt tgactacagc tacaataact 360
cttttaccag atgcagaaag atttagtttt ccaagagtga ttaattcagc tgacggagcg 420
actacatggt acttcaatcc agtgattctt agaccaaata acgttgaaat agagtttcta 480
ctaaacgggc agataataaa tacttaccaa gcaagatttg gaacgatcat agctagaaat 540
tttgatacaa ttagattgtc atttcagttg atgagaccac caaatatgac accagctgta 600
gcggcgttat ttccaaatgc gcagccattt gaacatcacg caacagtagg actcacgctt 660
agaattgaat ctgcagtttg ggaatcagta cttgccgacg caagcgaaac aatgctagca 720
aatgtgacat ctgttagaca agaatacgcg ataccagttg gaccagtttt tccaccaggt 780
atgaattgga ctgatttgat cactaactat tcgccatcta gagaggataa cttgcagcgt 840
gtatttacag tggcttccat tagaagcatg ttgattaag 879
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 4
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 5
atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggcag gtttcgctac cgtcgctcag 60
gct 63
<210> 6
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcccatggg catgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggca ggtttcgcta 60
ccgtcgctca ggctcaaaga aatggaattg caccacaatc agattcactt ataaagttat 120
caggcattaa atttaaaaga ataaattttg acaattcatc agaatacata gagaactgga 180
atttgcaaaa tagaagacaa agaacgggtt ttacatttca taaaccaaac attttccctt 240
attcagcttc attcacgttg aacagatcac aaccggctca tgataacttg atgggtacga 300
tgtggctcaa tgcgggatca gaaattcagg tcgctggatt cgactactca tgtgcaataa 360
acgcgccagc tagtacgcaa caatttgagc atattgtaca gcttcgaagg gtgttgacta 420
cagctacaat aactctttta ccagatgcag aaagatttag ttttccaaga gtgattaatt 480
cagctgacgg agcgactaca tggtacttca atccagtgat tcttagacca aataacgttg 540
aaatagagtt tctactaaac gggcagataa taaatactta ccaagcaaga tttggaacga 600
tcatagctag aaattttgat acaattagat tgtcatttca gttgatgaga ccaccaaata 660
tgacaccagc tgtagcggcg ttatttccaa atgcgcagcc atttgaacat cacgcaacag 720
taggactcac gcttagaatt gaatctgcag tttgtgaatc agtacttgcc gacgcaagcg 780
aaacaatgct agcaaatgtg acatctgtta gacaagaata cgcgatacca gttggaccag 840
tttttccacc aggtatgaat tggactgatt tgatcactaa ctattcgcca tctagagagg 900
ataacttgca gcgtgtattt acagtggctt ccattagaag catgttgatt aagactcgag 960
ggc 963
<210> 7
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcccatggg catgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggca ggtttcgcta 60
ccgtcgctca ggctcaaaga aatggaattg caccacaatc agattcactt ataaagttat 120
caggcattaa atttaaaaga ataaattttg acaattcatc agaatacata gagaactgga 180
atttgcaaaa tagaagacaa agaacgggtt ttacatttca taaaccaaac attttccctt 240
attcagcttc attcacgttg aacagatcac aaccggctca tgataacttg atgggtacga 300
tgtggctcaa tgcgggatca gaaattcagg tcgctggatt cgactactca ggtgcaataa 360
acgcgccagc tagtacgcaa caatttgagc atattgtaca gcttcgaagg gtgttgacta 420
cagctacaat aactctttta ccagatgcag aaagatttag ttttccaaga gtgattaatt 480
cagctgacgg agcgactaca tggtacttca atccagtgat tcttagacca aataacgttg 540
aaatagagtt tctactaaac gggcagataa taaatactta ccaagcaaga tttggaacga 600
tcatagctag aaattttgat acaattagat tgtcatttca gttgatgaga ccaccaaata 660
tgacaccagc tgtagcggcg ttatttccaa atgcgcagcc atttgaacat cacgcaacag 720
taggactcac gcttagaatt gaatctgcag tttgggaatc agtacttgcc gacgcaagcg 780
aaacaatgct agcaaatgtg acatctgtta gacaagaata cgcgatacca gttggaccag 840
tttttccacc aggtatgaat tggactgatt tgatcactaa ctattcgcca tctagagagg 900
ataacttgca gcgtgtattt acagtggctt ccattagaag catgttgatt aagactcgag 960
ggc 963

Claims (7)

1.一种用于制备猪轮状病毒疫苗的抗原，其特征在于，抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.编码权利要求1所述的抗原的核苷酸，其特征在于，所述抗原的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
3.表达权利要求1所述的抗原的核苷酸，其特征在于，所述抗原的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，SEQ ID NO:7是在SEQ ID NO:3上连接保护性碱基、酶切位点和补位核苷酸以及能够被大肠杆菌Sec系统识别的OmpA信号肽以实现抗原的表达、分离以及纯化。
4.根据权利要求3所述的核苷酸，其特征在于，SEQ ID NO:7中首位和末位各三个核苷酸（GGC）为保护性碱基，首位第4-9位（CCATGG）以及末位倒数4-9位核苷酸（GAGCTC）为酶切位点，首位第10-11位（GC）和末位倒数第10位核苷酸（A）为补位核苷酸，首位第12-74位核苷酸序列为OmpA信号肽。
5.一种猪轮状病毒疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的抗原以及佐剂。
6.根据权利要求5所述的猪轮状病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂为白油佐剂。
7.根据权利要求5所述的猪轮状病毒疫苗，其特征在于，每毫升疫苗中含有221μg/ml的抗原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005134B (zh) * 2021-03-12 2022-06-03 厦门宝太生物科技股份有限公司 一种促进胶质纤维酸性蛋白在大肠杆菌中大量表达的方法
CN113416734A (zh) * 2021-06-01 2021-09-21 苏州顺友芯智能科技有限公司 一种提高gfap蛋白表达量的基因及其可溶性表达方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0259149A2 (en) * 1986-09-03 1988-03-09 The University of Saskatchewan The use of rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
CN1952156A (zh) * 2005-10-19 2007-04-25 吉林农业大学 轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达
CN104513298A (zh) * 2014-12-09 2015-04-15 山东信得科技股份有限公司 一种表达鸡传染性法氏囊可溶性 vp 2-4-3多肽的方法
CN107722110A (zh) * 2017-11-16 2018-02-23 青岛宏昊生物科技有限公司 一种新型的猪轮状病毒疫苗的vp6抗原
CN107875380A (zh) * 2017-11-16 2018-04-06 青岛宏昊生物科技有限公司 一种猪轮状病毒vp6亚单位疫苗

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6589529B1 (en) * 1998-10-30 2003-07-08 Children's Hospital Medical Center Rotavirus subunit vaccine

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0259149A2 (en) * 1986-09-03 1988-03-09 The University of Saskatchewan The use of rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
CN1952156A (zh) * 2005-10-19 2007-04-25 吉林农业大学 轮状病毒Vp6基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组与表达
CN104513298A (zh) * 2014-12-09 2015-04-15 山东信得科技股份有限公司 一种表达鸡传染性法氏囊可溶性 vp 2-4-3多肽的方法
CN107722110A (zh) * 2017-11-16 2018-02-23 青岛宏昊生物科技有限公司 一种新型的猪轮状病毒疫苗的vp6抗原
CN107875380A (zh) * 2017-11-16 2018-04-06 青岛宏昊生物科技有限公司 一种猪轮状病毒vp6亚单位疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rotavirus morphogenesis: Domains in the major inner capsid protein essential for binding to single-shelled particles and for trimerization;Laura L.Clapp等;《Virology》;19910228;第108卷(第2期);摘要 *
猪A组轮状病毒Vp6基因工程乳酸菌的制备及其免疫效果检测;吴庆海;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》;20080215(第2期);摘要、第12页1.2.1、第16页图2-3-1、第33页2.2 *
生物合成辛伐他丁;朱丽平等;《生物加工过程》;20110930;第9卷(第5期);第15页右栏第1段 *

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