CN116514994A - 一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白及其制备方法与应用，所述融合蛋白以大肠杆菌肠毒素LTa为骨架蛋白，由大肠杆菌菌毛的中和表位替换LTa的非中和表位得到。该融合蛋白能够很好的将K88(FaeG)、K99(FanC)、987P(FasA)和F18(FedF)菌毛中和表位呈现出来，且以其作为免疫抗原，能够获得多种中和活性抗体，对广泛而有效地保护仔猪免受产肠毒素大肠杆菌引起的腹泻具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于多表位融合技术领域，具体涉及一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白以及其制备方法和应用。
背景技术
产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原菌。据报道，全世界每年因ETEC造成仔猪死亡约占一半以上。菌毛(黏附素)在ETEC的致病过程中起着重要的作用。ETEC主要通过这些菌毛附着在仔猪肠道上皮细胞后，分泌毒素，引起仔猪腹泻。因此，有效地抑制ETEC的菌毛对猪肠道细胞的粘附，是保护仔猪免受ETEC引起的腹泻的关键。有研究表明，几乎所有仔猪腹泻中分离的ETEC菌株的菌毛，主要包括F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F18。目前，市场上还未开发出广泛有效的疫苗或中和活性的抗体来保护仔猪免受ETEC的侵害。
多表位融合抗原是一种基于抗原结构和表位的疫苗技术，为多价疫苗的开发提供了新的平台。通过模拟抗原的天然表位并呈递多个异源中和表位，多表位融合抗原允许单个免疫原(蛋白质)携带来自多种毒力决定簇的多种抗原性元素(表位或肽)，从而具有广泛的免疫原性，为广谱性疫苗奠定基础。
由于大肠杆菌种类多，变异大、血清型复杂，目前这些方法产生的抗体特异性强，只针对免疫菌株有作用，对大肠杆菌的其他血清型细菌没有作用，很难在实际生产中进行推广应用。因此，研究出一种广谱性的猪源产肠毒素大肠杆菌菌毛抗原，就显得愈发重要，这不仅减少了资源的浪费，提高了工作效率，而且有利于预防或治疗仔猪腹泻，为养殖业的健康发展和食品安全提供保障。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白，该融合蛋白能够将常见ETEC菌毛如FaeG、FanC、FasA和FedF的中和表位全部展示出来，从而具有广谱的免疫原性，能够用于开发广谱性疫苗或中和抗体，为保护仔猪免受产肠毒素大肠杆菌引起的腹泻，提供了一种备选方案。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体为：
本发明第一方面提供了一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白，该融合蛋白以大肠杆菌肠毒素LTa作为骨架蛋白，由大肠杆菌菌毛的中和表位替换LTa蛋白的非中和表位得到；
其中，LTa的非中和表位为筛选出来的免疫原性较弱的表位，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
鉴于大肠杆菌菌毛主要亚基为FaeG(K88)、FanC(K99)、FasA(987P)和FedF(F18)，筛选上述菌毛亚基免疫原性较强的中和表位替换LTa中免疫原性较弱的表位；具体的，针对不同亚基，筛选出来的菌毛中和表位的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9和SEQ ID NO.10。
在上述融合蛋白中，可根据实际需求确定替换到骨架蛋白上的菌毛中和表位的个数。在本发明的一个具体实施例中，将上述的四个菌毛中和表位分别替换至四个LTa非中和表位上，得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
可以理解的是，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白质，以及将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质仍属于本发明的保护范围。
本发明第二方面提供了一些与上述大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白相关的生物材料，具体包括以下：
(i).编码大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的核酸分子(即基因)；
(ii).包含(i)所述基因的重组载体、表达盒或转座子；
(iii).包含(ii)所述重组载体的转化体。
在上述生物材料中，当融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示时，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在上述生物材料中，重组载体由编码基因克隆至载体上得到，其中载体优选为pET质粒，包括但不限于pET28a、pET30a、pET32a等。
在上述生物材料中，转化体由重组载体导入至受体细胞得到，其中受体细胞优选为大肠杆菌，包括但不限于BL21、DH5α、JM109等。
上述生物材料能够用于制备大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白。
本发明第三方面提供了一种制备所述大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的方法，具体为：将编码大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的目的基因克隆至载体上，再将得到的重组载体转入受体细胞中，诱导表达，纯化即得重组蛋白。
在上述制备方法中，当载体为pET质粒且受体细胞为大肠杆菌时，可采用IPTG诱导表达，诱导条件优选为：0.1～1.0mmol/L IPTG，16℃～37℃培养。最佳地，诱导条件为：使用0.4mmol/L的IPTG，在25℃下的诱导表达。
进一步地，纯化操作具体为：离心收集菌体细胞，破碎菌体收集沉淀，经过变性复性获得多菌毛表位重组蛋白。
更进一步地，用于复性的复性缓冲液具体为：15～25mM PB缓冲液(pH 8.0～9.0)、4～6％甘油、0.04～0.06mM氧化型谷胱甘肽、0.4～0.6mM还原型谷胱甘肽和尿素，所述尿素为6M、4M、2M、1M或0M。其中，复性缓冲液的使用方法为：将变性目的蛋白装入透析袋，连续用含有6、4、2、1和0mol/L尿素的复性缓冲液在4℃分步缓慢透析，最后两步不加甘油，每步透析12～24h。
本发明第四方面提供了大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的应用，包括：
作为免疫抗原在制备产肠毒素大肠杆菌K88、K99、987P和/或F18菌毛的中和抗体中的应用，或用于制备抗ETEC的疫苗。
相对于现有技术，本发明具有以下优点：
本发明提供的多菌毛表位融合蛋白利用肠毒素LTa兼具有佐剂的功能，以肠毒素LTa作为骨架蛋白；且将该融合蛋白作为免疫抗原免疫蛋鸡后，得到的卵黄抗体对含有K88、K99、987P或F18菌毛的ETEC具有良好的抑制活性，表明K88(FaeG)、K99(FanC)、987P(FasA)和F18(FedF)的菌毛中和表位能够很好地在骨架蛋白上呈现出来；可见，本发明提供的融合蛋白能够有效解决ETEC因血清型复杂导致的免疫原性较弱、表达量差等问题，对开发出广泛有效的疫苗或中和抗体具有重要意义。
附图说明
图1为实施例3中制备的菌毛多表位重组抗原的SDS-PAGE检测结果图，其中Line M为蛋白marker，Line 1为LTa-FaeG-FanC-FasA-FedF重组蛋白。
图2为实施例4中制备的卵黄抗体的SDS-PAGE检测结果图，其中Line M为蛋白marker，LineIgY为卵黄抗体。
图3为实施例4中制备的卵黄抗体对产肠毒素大肠杆菌的体外抑制生长曲线图，其中A为K88菌株，B为K99菌株，C为987P菌株，D为F18菌株。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。所用试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1获取编码大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的目的基因
(1)肠毒素LTa菌毛基因克隆及其筛选免疫原性较弱表位。
将K88菌株作为菌液模板，提取核酸后通过PCR克隆其LTa基因，其中PCR反应体系如下表所示：
PCR反应程序如下：
该PCR反应中所用引物的序列如下：
F-LTa：5’-CGAATTCGCTGATTGGACGGAAGGTC-3’(SEQ ID NO:11)；
R-LTa：5’-CCTCGAGACTATAAATAACGGTGATAG-3’(SEQ ID NO:12)。
所得LTa基因编码的蛋白质序列SEQ ID NO.21所示，对其免疫原性较弱表位的表位进行筛选及验证后，提供了4个可与菌毛中和表位替换的免疫原性较弱的表位，且其具体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6所示。
(2)目的基因的合成。
对FaeG、FanC、FasA和FedF中免疫原性强的中和表位进行筛选，得到了来自4种菌毛亚基的4个中和表位，且其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7～10所示，将4个中和表位对应替换LTa蛋白中SEQ ID NO.3～6所示序列，即得本例构建的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，编码该融合蛋白的基因(即目的基因LTa-FaeG-FanC-FasA-FedF)序列如SEQID NO.2所示。人工合成该目的基因。
(3)可通过以下PCR反应对嵌合表位进行逐一验证，反应体系如下：
PCR反应程序如下：
该PCR反应中所用引物的序列如下：
F-FaeG：5’-ATACCGTGCTCCCATGAAAAACGCTGGCGGCAC-3’(SEQ ID NO:13)，
R-FaeG：5’-CTGGGCATAAGGTTCACTTTCACGGAGCCCACTTTA-3’(SEQ ID NO:14)；
F-FanC：5’-TCTATCATCTTTTTTAAGCTGAATATTCATTTGA-3’(SEQ ID NO:15)，
R-FanC：5’-CATATCCGTCATCATATTTATAACCGCCGTTAGATGGAGC-3’(SEQ ID NO:16)；
F-FasA：5’-ATGTAATTAGCGTATACTTAGCAGCACCAGCAGAAAATAA-3’(SEQ ID NO:17)，
R-FasA：5’-TATTCCACCTAAATTTGCTTGTGAGGTA-3’(SEQ ID NO:18)；
F-FedF：5’-TTAGGTGGAATACCAATTCCAAGCAGCAGCGGAACAT-3’(SEQ ID NO:19)，R-FedF：5’-CGTTCATCAATTGTACCTGCCTGACATGTCA-3’(SEQ ID NO:20)。
实施例2重组质粒pET28a-LTa-FaeG-FanC-FasA-FedF的制备
对载体和目的基因进行双酶切，酶切反应体系如下表所示：
酶切反应条件：37℃，水浴酶切3h。
分别将双酶切的产物进行纯化回收，再利用T4连接酶进行连接，连接反应体系如下表：
连接反应条件：混匀后16℃连接过夜。筛选获取阳性单克隆质粒。
实施例3多菌毛表位融合蛋白的表达与纯化
将实施例2制备的阳性单克隆质粒化转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。挑取单个克隆于SB-羧苄培养基中培养，加入IPTG诱导过夜表达(0.4mmol/L IPTG,25℃)。
离心收集菌体细胞，破碎菌体收集沉淀，经过变性复性获得多菌毛表位重组蛋白。其中变性缓冲溶液为：20mM PB缓冲液(pH 7.4)、0.5M NaCl和8M尿素，复性缓冲溶液为20mMpH 8.0PB缓冲液、5％甘油、0.05mM氧化型谷胱甘肽、0.5mM还原型谷胱甘肽和尿素(6、4、2、1、0M)。
采用SDS-PAGE分析所得重组蛋白，结果见图1，大小与预期一致；且经氨基酸测序分析，所得多菌毛表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，表明构建的多菌毛表位融合蛋白能够高效的表达。
实施例4多菌毛表位融合蛋白免疫蛋鸡所得卵黄抗体对产肠毒素大肠杆菌的抑制作用
(1)SPF蛋鸡免疫以及卵黄抗体的提取。
将分离纯化后的多菌毛表位融合蛋白作为免疫抗原，注射免疫15-20周龄的SPF蛋鸡，初次免疫注射，免疫剂量为100μg/只，初次免疫14天之后，进行3次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为50μg/只。
收集三免之后SPF蛋鸡所生产的蛋，分离卵黄，用PBS(0.01M,pH 5)按照1:9进行稀释，混匀，4℃静置过夜。次日弃去上清，收集沉淀，即为卵黄抗体(IgY)，保存在-20℃备用。
同时，将收集非免疫的鸡蛋，按照上述方法制备非特异性卵黄抗体，保存在-20℃备用。
保存前通过SDS-PAGE分析获取的卵黄抗体，检测结果见图2，IgY抗体主要包括两条带，分别是65kDa的重链和25kDa的轻链，与文献报道的IgY抗体分子量大小一致，表明所提取的IgY抗体纯度较高。
(2)卵黄抗体对产肠毒素大肠杆菌生长抑制作用的检测。
产肠毒素大肠杆菌特异性卵黄抗体(效价1600)溶于LB液体培养基中至5mg/ml，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。分别将产肠毒素大肠杆菌K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)和F18加入上述培养基中，使细菌终浓度为107cfu/ml。采用5mg/mL非特异性卵黄抗体和5mg/mL抗LTa卵黄抗体(以LTa蛋白为免疫抗原制备的卵黄抗体，制备方法参照步骤(1))为阴性对照，l mg/mL头孢哌酮抗生素为阳性对照，于37℃，80r/min，孵育，每隔2h取样，用酶标仪测吸光值(620nm)。
结果如图3所示，从结果可知：本发明制备的卵黄抗体能够同时对K88、K99、987P和F18的生长产生一定的抑制作用。表明本发明制备的融合蛋白以LTa作为骨架蛋白，能够将K88、K99、987P和F18菌毛的中和表位展示出来，从而获取中和活性抗体，抑制病原体生长。
综上，本发明以产肠毒素大肠杆菌菌毛LTa作为骨架蛋白，将常见的K88、K99、987P和F18菌毛的中和表位替换LTa蛋白上的免疫原性较弱的表位，即将多种抗原表位融合在一起，所获取的重组蛋白仍然能够将K88、K99、987P和F18菌毛的中和表位展示出来；且以该重组蛋白为免疫抗原免疫蛋鸡，可以获取多种中和活性抗体，进而有效抑制不同种类的大肠杆菌生长。通过本发明提供的多表位融合蛋白制备中和抗体，能有效克服传统方法制备大肠杆菌菌毛抗体操作复杂、过程繁琐耗时等缺点，同时大大降低了制备成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白以大肠杆菌肠毒素LTa为骨架蛋白，由大肠杆菌菌毛的中和表位替换LTa的非中和表位得到；
其中，所述LTa的非中和表位序列选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQID NO.6，所述大肠杆菌菌毛的中和表位序列选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，或为在SEQ ID NO:1所示序列的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。
5.包含权利要求3所述核酸分子的表达盒或重组载体。
6.包含权利要求5所述重组载体的转化体。
7.一种大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的制备方法，其特征在于，将编码权利要求1所述融合蛋白的目的基因克隆至载体上，得到重组载体并转入受体细胞进行诱导表达，纯化得到重组蛋白。
8.根据权利要求7所述大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述载体为pET质粒，所述受体细胞为大肠杆菌。
9.权利要求1或2所述的大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白作为免疫抗原在制备产肠毒素大肠杆菌的中和抗体中的应用。
10.权利要求1或2所述的大肠杆菌多菌毛表位融合蛋白在制备抗ETEC疫苗中的应用。
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