CN106519039A - 一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白及其编码基因和应用。本发明的沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC‑CTB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的基因fliC‑CTB，编码上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC‑CTB，其碱基序列如SEQ ID NO.2或3所示。本发明利用植物遗传转化技术，将沙门氏菌fliC基因与霍乱肠毒素B亚基基因融合转入马铃薯，筛选获得转基因植株，并在分子水平上证实了目的基因的整合、转录和表达，过对植物外源融合蛋白检测，证明融合蛋白具有抗原活性，利用本发明的融合基因植物表达载体可将马铃薯作为生物反应器表达该融合蛋白。也可通过本发明继续研发沙门氏菌“通用植物口服疫苗”，为沙门氏菌病防治提供一种新的有效的解决途径。

Description

一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
沙门氏菌病的病原体，属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。己发现1800种以上。沙门氏菌不但引起禽类感染，也会引起人的细菌性感染，进而导致食物中毒、急性肠胃炎等疾病，被国际兽医局列为B类疾病。目前欧盟、美、英、法、日等对肉、蛋、奶类畜禽产品中沙门氏菌的规定均为不得检出。但就目前现状而言，国内大多畜禽场采用药物控制和淘汰清除措施来消灭沙门氏菌，饲料中抗生素的使用和抗生素治疗存在诸多弊端，多次反复用药不仅使成本上升，而且带来了病原菌耐药性和药物残留等一系列问题。尽管疫苗接种是一种较好的方法，遗憾的是目前仍没有能够有效控制鸡白痢沙门氏菌的活疫苗，而灭活疫苗所产生的保护水平较低，多不能产生坚强的免疫力以抵抗野毒株的感染。减毒活疫苗在国内外研究使用中发现可以产生较高免疫水平，但疫苗的接种使用过程繁琐，价格也比较昂贵，安全评价方法带有一定缺陷性，动物机体排菌周期也比较长。
目前，随着生物技术的发展，各种基因工程疫苗研究发展异常活跃，植物作为生物制品的反应器，其具有成本廉价、保存运输方便、安全等诸多优点。沙门氏菌抗原易变异的特性带来的现地流行毒株与疫苗株不匹配的问题日益突出，因此，迫切需要开发一种可以产生交叉免疫保护作用的沙门氏菌“通用疫苗”。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以在马铃薯植物中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白。
本发明的再一目的是提供编码上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供一种制备上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白的应用。
本发明选取选取鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因(FliC)1521bp(基因序列来源NCBIgenebank Sequence ID:AL513382.1 CDS 1013788..1015308gene＝"fliC")，以及霍乱肠毒素B亚基基因(CTB)375bp(基因序列来源NCBI genebank Sequence Vibrio choleraestrain I-1300 cholera toxin B subunit(ctxB)gene complete cds(Sequence ID：HM366179.1))，通过密码子偏好文库将上述两个基因中密码子根据http://www.kazusa.or.jp/codon/中codon usage database Solanum tuberosum改造成马铃薯偏好的密码子。将上述两个基因进行拼接，并对其酶切位点用Mapdraw进行分析，最后在融合好的FliC和CTB基因序列前加Kozak序列，后面加内质网滞留肽，两端加所需酶切位，上游Ndel、Sal1，下游Sac1，设计完成后通过TAKARA公司人工合成该序列并将其插入到克隆载体中获得含沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因的重组载体T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB，并进一步通过双酶切人工构建获得可以在马铃薯植物中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白的植物表达载体pRI-101-AN-fliC-CTB。
本发明提供了一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：
其中，该酶基因编码635个氨基酸。
本发明提供了编码上述蛋白的沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB。具体地，该基因全长1932bp，其基因组序列如SEQ ID NO.2所示：
其中该编码基因的开发阅读框(ORF)长1908bp，具体如SEQ ID NO.3所示：
本发明还提供了包含上述沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB的重组植物表达载体，优选为pRI 101-AN-fliC-CTB。将本发明的沙门氏菌鞭毛蛋白基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的沙门氏菌鞭毛蛋白基因插入到载体T-VectorpMD19(simple)上的Ndel和Sac1限制性酶切位点之间，得到重组表达载体T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB。并进一步通过双酶切人工构建获得可以在马铃薯植物中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白的植物表达载体pRI-101-AN-fliC-CTB。
本发明还提供了包含上述沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB的重组马铃薯植株。具体为将包含上述沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC-CTB重组载体转染到普通马铃薯植株上，获得可表达沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的马铃薯植株。
本发明还提供了一种制备沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组沙门氏菌鞭毛融合蛋白表达；
3)回收并纯化所表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB。
其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌，优选将重组表达载体转化大肠杆菌DH5α，得到重组菌株DH5α/fliC-CTB。
本发明还提供了上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的应用。优选地，提供上述沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB在疫苗生产中的应用，进一步优选在沙门氏菌植物口服疫苗中的应用。
现在畜禽养殖国家提倡无公害可持续发展的路线。而目前大量和超量用药，导致耐药菌株出现。超范围使用人药来治疗畜禽场的细菌病，会畜禽场中很快出现耐药的菌株。这些耐药菌株的出现不但对畜禽业来说是威胁，而且对人的食品安全也是威胁。由于细菌的一些耐药因子(质粒)能够在相同菌种或不同菌种间传递，所以畜禽中出现的耐药菌株也具有一定的公共卫生学意义。并且药物残留本身对人来说就存在很大的危害。疫苗的使用，无疑是解决药物滥用的一个有效途径，而植物口服疫苗作为新型疫苗更应该值得研究和推广。随着基因工程技术的快速发展、植物转基因技术的日趋成熟，植物已成为基因重组生物制品的重要表达载体。利用转基因技术构建植物生物反应器生产口服疫苗是目前新兴的研究领域，尤其将马铃薯作为植物生物反应器生产口服疫苗，可直接将生产的马铃薯作为饲料添加到饲料中，经过畜禽的采食即可通过肠道黏膜免疫系统，使得畜禽或人体获得免疫原性。由于其独特的优越性，植物口服疫苗将成为继灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗后的一种新型疫苗。
本发明利用沙门氏菌的鞭毛C区(fliC)亚基，该基因在不同种属的沙门氏菌中序列高度保守(如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等)，并有较强的免疫原性，在融合霍乱肠毒素B亚基这个有效的粘膜免疫佐剂，利用植物遗传转化技术，将沙门氏菌fliC基因与霍乱肠毒素B亚基基因融合转入马铃薯，筛选获得转基因植株，并在分子水平上证实了目的基因的整合、转录和表达，通过对植物外源融合蛋白检测，证明融合蛋白具有抗原活性，该转基因马铃薯将会成为生产沙门氏菌“通用口服疫苗”，为沙门氏菌病防治提供廉价有效的植物口服疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例的阳性克隆大肠杆菌PCR鉴定；其中，1为Marker III；2为阳性大肠杆菌。
图2为本发明实施例的阳性农杆菌PCR鉴定；其中，1为200bp ladder Marker；2为阳性农杆菌。
图 3为本发明实施例的转fliC-CTB融合基因植株的PCR检测(pRI101-fliC-CTB)；其中，1为LD10K Marker；2-4为转基因植株PCR结果；5为非转基因植株对照。
图4为本发明实施例的转基因阳性株融合基因相对表达量。
图5为本发明实施例的转基因植物的western blot检测；其中，1-3为阳性植株；4为阴性植株对照。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体
T载体pMD19(Simple)及菌株DH5α均为市售。
2、酶类及其它生化试剂
内切酶与连接酶均为市售。本申请所使用的试剂均为市售。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1基因的选取与优化
选取鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因(FliC)1521bp，以及霍乱肠毒素B亚基基因(CTB)375bp，通过密码子偏好文库将上述两个基因中密码子改造成马铃薯偏好的密码子。将分析后的基因用DNA star软件翻译成蛋白序列，通过NCBI中的pBLAST进行蛋白比对分析。比对一致后进行基因的拼接构建，在融合序列前后分别加了增强和稳定序列，并在两端加了所需的酶切位点。
实施例2基因的融合与构建
将上述两个基因进行拼接，并对的酶切位点用Mapdraw进行分析。最后在融合好的FliC和CTB基因序列前加Kozak序列，后面加内质网滞留肽，两端加所需酶切位，上游Ndel、Sal1，下游Sac1。将优化好的基因送到公司合成，合成基因全长为1932bp。合成序列连接到T载体pMD19(Simple)中，最终合成T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB。融合基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，其ORF长1908bp，碱基序列如SEQ ID NO.3。该基因编码635个氨基酸，包含一个终止密码子。
实施例3植物表达载体构建
T-Vector pMD19(simple)-fliC-CTB重组子质粒、pRI 101-AN DNA空载体分别用Ndel+Sac1双酶切，1％琼脂糖电泳，电压为3-5v/cm，目的的片段FliC-CTB与pRI 101-ANDNA载体分离后，在紫外灯下用手术刀片分离切割，用琼脂糖回收试剂盒回收目的片断、载体。目的片段与载体按l：l等摩尔比例用T4连接酶连接。16℃连接反应l小时，70℃终止反应。连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，取200μL转化菌液铺于含有的卡那霉素LB平扳上，用涂布器涂匀，置于37℃培养箱水平培养1小时，然后将平板倒置培养12小时。挑取克隆菌落，进行PCR扩增鉴定和测序鉴定，采用融合基因特异引物进行PCR显示，阳性克隆可扩增出一条约1900bp的目的条带，符合实验预期。将PCR鉴定的阳性克隆菌落进行测序鉴定，测序结果与融合序列结果一致。将鉴定重组成功的菌落进行摇菌。
实施例4重组质粒转化农杆菌
1)取保存于-80℃的LBA4404菌株，用接种环在含有250μg/mL Rif的LB固体培养基上划线，28℃倒置培养2天左右；
2)挑取单菌落，接种于2mL LB液体培养基中，28℃160rpm振荡培养24小时；
3)取2mL菌液于100mL培养液中继续培养，测OD600达0.5～1.0之间。
4)4℃6000rmp离心20min，弃上清；
5)用5mL预冷的20mM CaCl2将菌体悬浮起来；
6)4℃6000rmp离心20min，弃上清；
7)用1mL预冷的20mM CaCl2将菌体轻轻悬浮起来；
8)将菌液分装到1.5mL的离心管中(每管200μL)；
9)液氮处理后放入-80℃冰箱中保存备用。
实施例5转化菌株的鉴定
挑取在抗性平板上长出的单菌落，按质粒小提的方法提取农杆菌质粒，然后对所提质粒再次进行PCR鉴定(见图2)，引物同表达载体鉴定所用的特异引物，扩增到一条约1900bp，与阳性对照一致的带，结果如图1所示；通过以上鉴定，可以证明已将含目的基因的表达载体转化到农杆菌当中。
实施例6农杆菌转化马铃薯
1)在超净工作台上取马铃薯无菌苗培养2周左右的费乌瑞它组培苗，剪取顶部3-4片幼嫩叶片，予预培养基上暗培养3d；
2)将预培养后的外植体浸入菌液，轻轻摇动使得外植体与农杆菌充分接触，5min后取出外植体，用无菌滤纸吸干，转接于共培养培养基上共培养3d；
3)无菌水洗涤外植体3次，不含激素的MS液体培养基冲洗2次，无菌滤纸吸干表面水分，将叶片转入M1(预伤诱导培养基)和MSJK(筛选培养基)中，16h光照/8h黑夜，25℃/23℃培养，3周后更换培养基；
4)两到三周后，叶片出现预伤组织后，转入芽诱导培养中培养，诱导分化成芽；
5)3-4周后，待芽长到2～3cm时，将芽转入含有诱导生根培养基的上生根，从而获得转基因植株。
实施例7转基因马铃薯的鉴定
7.1转基因植株的PCR检测
取抗性植株叶片，以未转化马铃薯植株作对照，在图中，分别以融合基因特异引物均扩增到一条约1900bp、与阳性对照一致的带，结果如图3所示；通过以上鉴定，可以初步证明己将目的基因转化到马铃薯中。
7.2转基因表达水平检测
提取采用Real-Time PCR的方法，试剂盒为北京全式金生物技术有限公司TransStart Green qPCR SuperMix荧光检测试剂盒。
7.2.1植物RNA提取
取2g阳性株叶片放入研钵中，倒入液氮，研成粉未。收进50mL离心管中，加入10mL(5mL/g)65℃预热的抽提buffer，振荡30s。65℃水浴，振荡2～3min。加入等体积氯仿，振荡10min，18℃，12000g离心5min。(重复一次)加入1/4体积的LiCl(10M)，4℃过夜。10000g离心20min。500μL 0.5％SDS溶解沉淀。加入等体积氯仿，再次抽提一次。加入2倍体积无水乙醇，-20℃2h。10000g，离心20min；吹干沉淀10min。DEPC处理水溶解沉淀，-70℃保存。
7.2.2反转录cDNA
(1)将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和Rnase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
(2)根据表1配制反应体系，总体积为20μL。
(3)涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
(4)在PCR仪上42℃孵育40min，85℃孵育5min，反应结束。
(5)反转录的cDNA用于实时定量PCR反应。
表1 cDNA合成的反应体系
7.2.3实时荧光定量PCR扩增
(1)qPCR反应体系见表2：
表2 PCR反应体系
(2)PCR扩增标准程序的设定见表3：
表3 PCR扩增标准程序
(3)用法表示相对定量结果
以β-actin为内参，根据公式ΔCt＝[Ct(目标基因)]-[Ct(内参基因)]、ΔΔCt＝[ΔCt(实验组)]-[ΔCt(对照组)]，2-ΔΔCt表示实验组目标基因相对于正常对照组原始拷贝数的倍数差异，利用SPSS 13.0统计软件进行统计学检验，P<0.05为各组间差异有统计学意义。
实时定量PCR结果如图4所示，阴性株未扩增出目的基因条带，随机抽取三株阳性株进行实时定量PCR，从结果中看出当将阳性株1号结果作为参照的话，2号与3号阳性株的FliC-CTB融合基因的表达量分别0.84与0.58。从而说明各个阳性株之间虽然存在一定的表达差异，但转入的融合基因在阳性植株中都得到了表达。
7.3转基因外源蛋白检测
7.3.1转基因植物蛋白抽提
选择阳性转化株，取其试管薯块茎进行可溶性蛋白提取。具体操作为：取新鲜马铃薯块茎，用解剖刀切成小薄片放入研钵，加入液氮冷冻后，迅速用研钵磨成粉末。按200μL/100mg的比例加入提取缓冲液(200mmol/L Tris-HCI pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巯基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)，待样品充分溶解后，于4℃、13000rpm离心20min取上清备用。用Bradford法测定蛋白质浓度。
7.3.2阳性转化株外源蛋白的检测
取50μL转基因植物蛋白抽提液加入等体积的样品缓冲液(20％蔗糖，0.05％溴酚兰，0.125％mol/L Tris-HCl pH6.8，4％SDS，14mmol/L巯基乙醇)，沸水煮5min，冰水浴2min使冷却。离心弃沉淀后样品用于电泳分析。取样品30.40μL上样12％SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE用Laemmli的方法进行，使用无浓缩胶的2.3％～4％、2％～15％、2％～6％的梯度凝胶，凝胶染色使用考马斯亮蓝染色。
蛋白印记时，先用SDS-PAGE将蛋白质分离后，转膜到硝酸纤维素(NC)膜。使用含3％明胶(Gelatin)的TBS缓冲液(pH 7.5)将此膜封闭，使用含1％明胶的TBS缓冲液(pH7.5)稀释的一抗进行反应。TBS缓冲液漂洗后，使用含1％明胶的TBS缓冲液(pH 7.5)稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗进行反应。用TBS缓冲液漂洗后，ECL反应，暗室胶片曝光，可见一条大约63KDa的特异条带，而未转基因植株叶片中未见表达。结果见图5。
本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 内蒙古医科大学
<120> 一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白及其编码基因和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 635
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可以在马铃薯植株中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白
<400> 1
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AYLTEAKVEK LCVWNNKTPH AIAAISMANS EKDEL 635
<210> 2
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可以在马铃薯植株中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白的编码基因
<400> 2
catatggtcg acgccaccat ggctcaagtt attaatacta attctctttc tcttcttact 60
caaaataatc ttaataagtc tcaatctgct cttggaactg ctattgaaag actttcttct 120
ggacttagaa ttaattctgc taaggatgat gctgctggac aagctattgc taatagattt 180
actgctaata ttaagggact tactcaagct tctagaaatg ctaatgatgg aatttctatt 240
gctcaaacta ctgaaggtgc tcttaatgaa attaataata atcttcaaag agttagagaa 300
cttgctgttc aatctgctaa tggtactaat tctcaatctg atcttgattc tattcaagct 360
gaaattactc aaagacttaa tgaaattgat agagtttctg gacaaactca atttaatgga 420
gttaaagttc ttgctcaaga taatactctt actattcaag ttggtgctaa tgatggtgaa 480
actattgata ttgatcttaa agaaatttct tctaaaacac ttggacttga taagcttaat 540
gttcaagatg cttacactcc taaagaaact gctgttactg ttgataaaac tacttataaa 600
aatggtacag atcctattac agctcaatct aatactgata ttcaaactgc tattggaggt 660
ggtgctactg gagttactgg agctgatatt aaatttaaag atggtcaata ctatcttgat 720
gttaaaggag gtgcttctgc tggtgtttat aaagctactt atgatgaaac tacaaagaaa 780
gttaatattg atactactga taaaactcct ttggctactg ctgaagctac agctattaga 840
ggaactgcta ctattactca taatcaaatt gctgaagtta caaaagaagg tgttgatact 900
actacagttg ctgctcaact tgctgctgct ggagttactg gagctgataa ggataatact 960
tctcttgtta aactttcttt tgaagataaa aatggtaagg ttattgatgg tggttatgct 1020
gttaaaatgg gagatgattt ttatgctgct acttatgatg aaaaaacagg tgctattact 1080
gctaaaacta ctacttatac agatggtact ggagttgctc aaactggagc tgttaaattt 1140
ggtggagcta atggtaaatc tgaagttgtt actgctactg atggtaagac ttaccttgct 1200
tctgatcttg ataaacataa ttttagaaca ggaggtgaac ttaaagaagt taatacagat 1260
aagactgaaa atccacttca aaaaattgat gctgctttgg ctcaagttga tacacttaga 1320
tctgatcttg gtgctgttca aaatagattt aattctgcta ttactaatct tggaaatact 1380
gttaataatc tttcttctgc tagatctaga attgaagatt ctgattacgc tactgaagtt 1440
tctaatatgt ctagggctca aattcttcaa caagctggta cttctgttct tgctcaagct 1500
aatcaagttc ctcaaaatgt tctttctctt cttagaatta aattaaaatt tggtgttttt 1560
tttacagttt tactatcttc agcatatgca catggaacac ctcaaaatat tactgatttg 1620
tgtgcagaat accacaacac acaaatacat acgctaaatg ataagatatt ttcgtataca 1680
gaatctctag ctggaaaaag agagatggct atcattactt ttaagaatgg tgcaactttt 1740
caagtagaag taccaggtag tcaacatata gattcacaaa aaaaagcgat tgaaaggatg 1800
aaggataccc tgaggattgc atatcttact gaagctaaag tcgaaaagtt atgtgtatgg 1860
aataataaaa cgcctcatgc gattgccgca attagtatgg caaatagtga aaaggatgaa 1920
ctttaagagc tc 1932
<210> 3
<211> 1908
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 可以在马铃薯植株中表达的沙门氏菌鞭毛融合蛋白的编码基因的ORF
<400> 3
atggctcaag ttattaatac taattctctt tctcttctta ctcaaaataa tcttaataag 60
tctcaatctg ctcttggaac tgctattgaa agactttctt ctggacttag aattaattct 120
gctaaggatg atgctgctgg acaagctatt gctaatagat ttactgctaa tattaaggga 180
cttactcaag cttctagaaa tgctaatgat ggaatttcta ttgctcaaac tactgaaggt 240
gctcttaatg aaattaataa taatcttcaa agagttagag aacttgctgt tcaatctgct 300
aatggtacta attctcaatc tgatcttgat tctattcaag ctgaaattac tcaaagactt 360
aatgaaattg atagagtttc tggacaaact caatttaatg gagttaaagt tcttgctcaa 420
gataatactc ttactattca agttggtgct aatgatggtg aaactattga tattgatctt 480
aaagaaattt cttctaaaac acttggactt gataagctta atgttcaaga tgcttacact 540
cctaaagaaa ctgctgttac tgttgataaa actacttata aaaatggtac agatcctatt 600
acagctcaat ctaatactga tattcaaact gctattggag gtggtgctac tggagttact 660
ggagctgata ttaaatttaa agatggtcaa tactatcttg atgttaaagg aggtgcttct 720
gctggtgttt ataaagctac ttatgatgaa actacaaaga aagttaatat tgatactact 780
gataaaactc ctttggctac tgctgaagct acagctatta gaggaactgc tactattact 840
cataatcaaa ttgctgaagt tacaaaagaa ggtgttgata ctactacagt tgctgctcaa 900
cttgctgctg ctggagttac tggagctgat aaggataata cttctcttgt taaactttct 960
tttgaagata aaaatggtaa ggttattgat ggtggttatg ctgttaaaat gggagatgat 1020
ttttatgctg ctacttatga tgaaaaaaca ggtgctatta ctgctaaaac tactacttat 1080
acagatggta ctggagttgc tcaaactgga gctgttaaat ttggtggagc taatggtaaa 1140
tctgaagttg ttactgctac tgatggtaag acttaccttg cttctgatct tgataaacat 1200
aattttagaa caggaggtga acttaaagaa gttaatacag ataagactga aaatccactt 1260
caaaaaattg atgctgcttt ggctcaagtt gatacactta gatctgatct tggtgctgtt 1320
caaaatagat ttaattctgc tattactaat cttggaaata ctgttaataa tctttcttct 1380
gctagatcta gaattgaaga ttctgattac gctactgaag tttctaatat gtctagggct 1440
caaattcttc aacaagctgg tacttctgtt cttgctcaag ctaatcaagt tcctcaaaat 1500
gttctttctc ttcttagaat taaattaaaa tttggtgttt tttttacagt tttactatct 1560
tcagcatatg cacatggaac acctcaaaat attactgatt tgtgtgcaga ataccacaac 1620
acacaaatac atacgctaaa tgataagata ttttcgtata cagaatctct agctggaaaa 1680
agagagatgg ctatcattac ttttaagaat ggtgcaactt ttcaagtaga agtaccaggt 1740
agtcaacata tagattcaca aaaaaaagcg attgaaagga tgaaggatac cctgaggatt 1800
gcatatctta ctgaagctaa agtcgaaaag ttatgtgtat ggaataataa aacgcctcat 1860
gcgattgccg caattagtat ggcaaatagt gaaaaggatg aactttaa 1908

Claims (9)

1.一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因fliC-CTB，其特征在于，编码权利要求1所述的沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因fliC-CTB，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2或3所示。
4.包含权利要求2或3所述沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因fliC-CTB的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为植物表达重组载体pRI-101-AN-fliC-CTB。
6.包含权利要求2或3所述沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因fliC-CTB的重组马铃薯植株。
7.权利要求1所述沙门氏菌鞭毛融合蛋白FliC-CTB的应用。
8.权利要求2或3所述沙门氏菌鞭毛融合蛋白基因fliC-CTB的应用。
9.权利要求4或5所述重组载体的应用。
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. A. S. BAPTISTA 等: "Immune response of broiler chickens immunized orally with the recombinant proteins flagellin and the subunit B of cholera toxin associated with Lactobacillus spp.", 《POULTRY SCIENCE》 *
ANA ANGELITA S. BAPTISTA 等: "Induction of immune response in broiler chickens immunized with recombinant FliC and challenged by Salmonella Typhimurium", 《PESQ. VET. BRAS.》 *
HELGA ZELENYÁNSZKI 等: "The green capsule: edible vaccine production in transgenic plants", 《NEW BIOTECHNOLOGY》 *
张二芹 等: "外源基因在转基因植物中表达量的优化研究进展", 《河南农业科学》 *
李晶: "转基因植物疫苗的方法学概述", 《海峡药学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109627298A (zh) * 2018-11-23 2019-04-16 武汉大学 一种具有抗hiv-1作用的重组鞭毛蛋白及其编码基因和应用
CN109627298B (zh) * 2018-11-23 2020-12-18 武汉大学 一种具有抗hiv-1作用的重组鞭毛蛋白及其编码基因和应用

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