CN116983397B - 海豚链球菌dna疫苗、制备方法及应用 - Google Patents

海豚链球菌dna疫苗、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种海豚链球菌DNA疫苗、制备方法及应用，属于生物疫苗技术领域，所述疫苗包括卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I基因和卵形鲳鲹的IL‑1β基因和载体pcDNA3.1，所述SimA I基因和IL‑1β基因连接于载体pcDNA3.1+上的EcoR I/Xba I之间，所述卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I序列如SEQ ID NO.3所示，所述卵形鲳鲹的IL‑1β基因序列如SEQ ID NO.6所示。本发明还提供了所述疫苗的制备方法和应用，所述疫苗对卵形鲳鲹起到了较好的保护作用，同时能够显著提升机体总抗氧化能力、过氧化氢酶、SOD活性以及溶菌酶活性。

Description

海豚链球菌DNA疫苗、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物疫苗技术领域，具体地涉及一种海豚链球菌（Streptococcusiniae）DNA疫苗、制备方法及应用。
背景技术
目前海豚链球菌正成为全球野生和养殖鱼类链球菌病的主要病原体，至少能够感染30余种鱼类，包括罗非鱼（Oreochromis spp.）、卵形鲳鲹（T. ovatus）、牙鲆（P.olivaceus）、银鼓鱼（Selenotoca multifasciata）等经济鱼类，每年损失达数亿美元。而在海豚链球菌病的治疗上主要依赖于多种抗生素的使用，大量抗生素的使用不仅导致了细菌的耐药性，也破坏水体的稳定性，因此海豚链球菌的早期预防就显得尤为重要。
有效的疫苗可以减少疾病发生、动物损失、抗生素依赖和相关成本，疫苗能够激发适应性免疫并在接种疫苗的鱼体内产生免疫记忆效应。然而，开发有效的海豚链球菌疫苗仍然是水产养殖发展中的一个挑战。
发明内容
本发明针对上述技术问题提供一种卵形鲳鲹源海豚链球菌DNA疫苗及其制备方法，所述疫苗以SimA I基因作为抗原基因，以细胞因子IL-1β作为细胞因子佐剂，构建了用于人工免疫的串联DNA疫苗，并从相对保护率、抗体水平、非特异性免疫指标和免疫相关基因表达调控等方面评估疫苗效果，获得到了为卵形鲳鲹提供抗海豚链球菌免疫能力的DNA疫苗。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
本发明提供了一种卵形鲳鲹源海豚链球菌（Streptococcus iniae）DNA疫苗，所述疫苗包括卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I基因和卵形鲳鲹的IL-1β基因和载体pcDNA3 .1，所述SimA I基因和IL-1β基因连接于载体pcDNA3 .1+上的EcoR Ⅰ/Xba I之间，所述卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示，所述卵形鲳鲹的IL-1β基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示。
本发明还提供所述DNA疫苗的制备方法，所述方法为将卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I基因和卵形鲳鲹的IL-1β基因连接于载体pcDNA3 .1+上的EcoR I/Xba I之间，获得pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β质粒，即为卵形鲳鲹源海豚链球菌DNA疫苗。
本发明还提供了所述的卵形鲳鲹源海豚链球菌（Streptococcus iniae）DNA疫苗在制备预防和/或治疗卵形鲳鲹源海豚链球菌病药物中的应用。
本发明还提供所述卵形鲳鲹源海豚链球菌（Streptococcus iniae）DNA疫苗在制造用作载体或者佐剂药物中的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明运用分子生物学技术将海豚链球菌的SimA Ⅰ基因和卵形鲳鲹的IL-1β基因共2401 bp核苷酸序列连接到具有强大启动子的pcDNA3.1+上，构建获得了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β，即卵形鲳鲹源海豚链球菌（Streptococcus iniae）DNA疫苗；
2、本发明基于海豚链球菌的SimA I毒力基因编码序列，以卵形鲳鲹细胞因子IL-1β作为分子佐剂构建了串联DNA疫苗，并通过细胞免疫荧光验证了其能够在真核细胞中进行表达，获得到了可能为卵形鲳鲹提供抗海豚链球菌免疫能力的DNA疫苗pcDNA3.1(+)-SimAI-IL-1β 。本研究对卵形鲳鲹进行人工免疫并在28天后进行攻毒实验，pcDNA3.1(+)、疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β在第四周的相对保护率分别为6%、49%，疫苗pcDNA3.1(+)-SimAI-IL-1β对卵形鲳鲹起到了较好的保护作用。同时疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β显著提升了卵形鲳鲹的血清的抗体水平，增强了非特异性免疫应答，提高了免疫相关基因MyD88、MHC Iα、IRF3、TNFα、MHC Ⅱ的表达。以上研究证明，串联 DNA 疫苗 pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β有更高的免疫保护率和免疫保护能力，能够作为一种卵形鲳鲹抗海豚链球菌感染的有效疫苗并具有应用潜力；
3、卵形鲳鲹源海豚链球菌DNA疫苗 pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β能够在海豚链球菌感染的情况下，能够显著提升机体总抗氧化能力、过氧化氢酶、SOD活性以及溶菌酶活性。
附图说明
图1为海豚链球菌 SimA I基因克隆结果的凝胶电泳图 M：5000marker；1： SimAⅠ；
图2为卵形鲳鲹IL-1β基因克隆结果的凝胶电泳图；NC：阴性对照；1：IL-1β；
图3为SimAⅠ-IL-1β融合基因克隆结果的凝胶电泳图；1、2：SimAⅠ-IL-1β融合基因；3：SimAⅠ-IL-1β融合基因全长扩增；NC：阴性对照；
图4为重组质粒与空载质粒鉴定凝胶电泳图；1：pcDNA3.1(+)；2、3 ： Blunt-SimAⅠ-IL-1β；4：pcDNA3.1(+)双酶切；5：Blunt-SimAⅠ-IL-1β双酶切鉴定；
图5为重组质粒pcDNA3.1(+)-SimAⅠ-IL-1β转染牙鲆鳃细胞FG88荧光图 ；A：转染质粒pcDNA3.1(+)的细胞；B：转染重组质粒pcDNA3.1(+)-SimAⅠ-IL-1β的细胞；标尺为30 μm；
图6为海豚链球菌攻毒7天免疫组和对照组卵形鲳鲹的生存曲线图；
图7为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组血清抗体水平图；
图8为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照血清总抗氧化能力对比图；
图9为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组血清过氧化氢酶活性对比图；
图10为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组血清SOD活性对比图；
图11为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组血清溶菌酶活性对比图；
图12为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组肝脏MyD88基因表达水平对比图；
图13为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组肝脏IRF3基因表达情况水平对比图；
图14为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组肝脏TNFα基因表达水平对比图；
图15为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组肝脏MHC Iα基因表达情况水平对比图；
图16为卵形鲳鲹接种DNA疫苗后免疫组和对照组肝脏MHCⅡ基因表达情况水平对比图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：串联DNA疫苗表达载体构建
一、材料与方法
1、实验试剂：TRIzol™ Reagent、Lipofectamine™ 3000 转染试剂购买于赛默飞公司；焦碳酸二乙酯、小鼠抗6× His单克隆抗体、FITC标记兔抗小鼠IgG、抗荧光淬灭封片剂、TritonX-100购买于生工生物工程公司；pEASY®-Blunt Zero Cloning Kit购买于北京全式金生物技术公司；氨苄青霉素钠、DMEM/F-12培养基、4％组织细胞固定液、DAPI溶液购买于北京索莱宝科技公司；Recombinant DNase Ⅰ、Rnase Inhibitor、EcoRI、XbaI、T4 DNALigation购买于Takara公司；特级胎牛血清、青链霉素混合液（100×）、Opti-MEM™培养基、胰蛋白酶购买于美国Gibco™公司；pcDNA3.1(+)购买于淼灵质粒平台。
2、序列表：
allSimA-F ATGGCTAAACAAATCAAAGCCCGTA，如SEQ ID NO .1所示；
allSimA-RTTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG，如SEQ ID NO .2所示；
SimA I ：atggctaaacaaatcaaagcccgtaaacatgccttgcgcaaaatgatcacatcagcagtccttgccggaacagcaatcacaaccatcggtggtgcaatgggaagcgtcacaacagtaaaagcggatagtgatagattaaccttggaagaaaaaatggaagcgttaagaaaggtagttactagagaagtattaataggttatgctaataataatccaagatttggtttttggatgtcgttacaacaattagaaaaagaaattgataaaacccaacgtttaacttgggaaaataaaagaatggaagagactctaaaaagtaaagttgaaagaattaatgaagctggagtgctcttatcaaagaaacaaaaagatttaaatgaagcagaagcaaaaattacagatcttaattcaaaacaaacggatttaacaaatcaaaaagaacaagtagaaaaagaattaaaagatactaaagataaacttaaagattcgattgctaatgcttcaaggattgctgagcatgaagcaattcgctcagcaggtcttgaaaatcaagtgaaatcattacgtgatgtaacaaagtcacttgtttcaactatcaatactttgactaaagagtcagcaacaattaaagctaaaatggctgaaattcaagaagaggctaataaaaaaattgcagcagtacaaacagaattagaaaatattgatagtgaaaatcaaagcctatctacagctaacgagcaattaaaagcagatttggaacaagctgcacgagaattagatacgcttcaaagttcttactatacagtagaaaatgaaaaggctgaacttcaaaaacaattggcagaaaaagatgctaagattgcggaacttgaagcaaacaacacagaattaacagcaactgttgctgatttgactaaagcattagaagcggctaagaaagaagcagaagaaaaacctgctcttaaagctaaagttgcagaattagaaaaagctcttgcagaagctaaaggtttagggactaaagttgcagaacttgaaaaagaccttgagaaagcacaagcagaagctaaagaccttgaaactaaactagcagaaacaaaagctgaattggaaaaagttcaagctgaaaaagcagaacttgaagcaactattgaaaaaatgaagaaagagcatgctgaagagcttgacaaactaaatgctcttcttgctgacaaagaaaaacttgtggaagctttgaacaaagaaatcgaagcgcttaagaaagactttgacgaaaaatcaaaccattctgcacaagaaaaagctaagttccaagaagaactggaacgcctcaaaaaagaattggctgctaagatcaacatgccaatgggcaacaccaaaggcatggcaaacgctgctggaaacgcgcaaactccagctaacaacggtcaaaacaacgctgttaagaaccaattgccatcaacaggtgataaagcaggtaacccattcttcacagcaagtgctatcgcggttatggttggagctggtactctagcatacggccgtaaacgcaaagaggaagaa，如SEQ ID NO .3所示；
IL-1β-FGAATCCGAGATGAAATGCAACA，如SEQ ID NO .4所示；
IL-1β-RAGAGCGTCGCAGATGACT，如SEQ ID NO .5所示；
IL-1β ：gaatccgagatgaaatgcaacatcagccagatgtggagccccaagttgcccaagggactggacttggagatctcccatcatccaatgacaatgaagcatgtggccaacctcatcattgccttagagaggctgagggccggcacaccagagtcagtgctgagcaccgagttcagagatgaaaacctggttggcatcatgctggagagcttagtggaagaacatattgtggtcgagcgcagatcagctccaccaagtcagttcacaaggacatgccagcaccagtgcagtatgaccgacagccagaagagggatttagtcaaggacccaaacagcatggagctccatgcagtgacactacaagcaggcagtgaagaccgcaaagtgcgtctgaccatgtcgacctatgtgcacccttcacccagcaccgaggccagacctgtggctctgtgcatagatcaaaatctctacctgtcatgccacatggaagataatgtgccaaccctgcacctggagactgtggaggacaagagcagtctgcagaggatcagctcagacagcgatatggtgcgatttctgttctacagccgggtcactgggctgaacgtcagcaccttcatgtctgcccgcttccctgactggtacatcagcacagcagaggatgacaacaagccagtagagatgtgcatggagagcgagaaccggtacacaaccttccaaatccggtcaaagacaccacttactgaatgtagacttgcaccccagagtcatctgcgacgctct，如SEQ ID NO .6所示；
olSimA-F CCGGAATTCCCGACAATGGCTAAACAAATCAAAGCCCGTA，如SEQ ID NO .7所示；
olSimA-R GCTTCCTCCTCCTCCTTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG，如SEQ ID NO .8所示；
olIL-1β-FGGAGGAGGAGGAAGCGAATCCGAGATGAAATGCAACA，如SEQ ID NO .9所示；
olIL-1β-RTGCTCTAGAGCAGTGGTGATGGTGATGATGAGAGCGTCGCAGATGACT，如SEQ ID NO.10所示；
M13F：CGCCAGGGT TTTCCCAGTCACGAC，如SEQ ID NO .11所示；
M13R：AGCGGATAA CAATTTCACACAGGA，如SEQ ID NO .12所示。
3、海豚链球菌SimA基因克隆：
(1)PCR扩增：根据NCBI上已公布的海豚链球菌基因组信息（GENEBANK登录号：SAMN09104529），设计用于扩增SimA I全长序列，设计的引物交由生工生物工程（广州）有限公司合成。
选取具有卵形鲳鲹源海豚链球菌典型症状的病鱼，用酒精棉球清洁体表，在超净工作台内进行解剖，取出肝脏、肾脏和脾脏，组织匀浆液涂布接种到BHI平板和TSA羊血琼脂平板，28℃条件下倒置培养24 h。菌落长出后观察各菌落形态，挑取具有生长优势且形态单一的菌落划线接种到BHI平板，28℃倒置培养24 h获得纯化菌株，在BHI液体培养基中扩大培养后，加入40%的甘油后保存于-80℃冰箱，取对数生长期的卵形鲳鲹源海豚链球菌菌液，提取细菌DNA后使用引物AllSimA-F、AllSimA-R对 SimA I进行扩增，PCR反应体系为：2 μL细菌基因组DNA、0.5 μL AllSimA-F、0.5 μL AllSimA-R、12.5 μL 2× Phanta Max MasterMix、9.5 μL ddH2O，共25 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。PCR反应程序设定为：95℃、5min；30个循环：95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min；72℃、10 min。凝胶电泳判断扩增条带大小及引物特异性，符合预期结果配置50 μL反应体系进行胶回收。
(2) PCR产物连接克隆载体：用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化上述PCR产物，使用nanodrop测量回收产物浓度，连接反应体系为：4 μL PCR product、1 μL pEASY®-BluntZero Cloning Vector，共5 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀，PCR仪中37℃孵育1 h。
(3) 连接产物转化到感受态：将感受态Trans T1置于冰上，向50 μL刚解冻的感受态中加入5 μL连接产物，轻弹EP管使液体混匀，冰浴30 min后在42℃金属浴中热激60 s，转到冰上冰浴2 min。向EP管内加入750 μL平衡至室温的AMP- LB培养基，37℃、220 rpm震荡培养1 h。培养好的菌液3000 rpm离心5 min，吸去700 μL上层培养液，用剩余培养液吹打悬浮菌体，涂布到AMP+ LB平板并在37℃培养10 ~ 12 h。
(4) 克隆载体Blunt-SimA I鉴定：M13F、M13R引物可以检测插入到载体上的片段，PCR反应体系为：0.5 μL M13F、0.5 μL M13R、12.5 μL 2× Phanta Max Master Mix、11.5μL ddH2O，共25 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀，分装到8连排中，用灭菌后的牙签挑取单菌落先在八连排中蘸两次再装入AMP+ LB液体培养基中，37℃、220 rpm条件下培养1 h。PCR反应程序设定为95℃、5 min；30个循环：95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min；72℃、10min。凝胶电泳判断扩增条带大小，PCR产物由生工生物工程（广州）有限公司进行测序，并扩大培养测序结果正确的阳性克隆。
4、卵形鲳鲹IL-1β基因克隆
(1)RNA提取：取保存于-80℃冰箱的卵形鲳鲹肝脏组织块置于已加入200 μLTrizol的EP管中，使用电动研磨仪将组织充分研磨后，再加入800 μL Trizol，轻轻颠倒EP管混匀液体，在冰盒中静置5 min，4℃、12000 rpm离心5 min；取上清到另一EP管中，加入200 μL氯仿，轻轻颠倒EP管混匀液体，在冰盒中静置15 min，4℃、12000 rpm离心15 min，离心后液体分为水相、蛋白相、有机相；吸取上层水相到新的EP管，加入500 μL预冷异丙醇，轻轻颠倒EP管混匀液体后置于-20℃冰箱中沉淀30 min，4℃、12000 rpm离心10 min；弃去上清后，用1 mL用DEPC水配制并预冷的75%乙醇吹打并悬浮沉淀，4℃、8000 rpm离心5 min；弃去上清后，用1 mL预冷无水乙醇吹打并悬浮沉淀，4℃、8000 rpm离心5 min；缓慢吸走上清，室温静置5 min，待管内干燥后加入42.75 μL 56℃预热的DEPC水，56℃孵育5 min充分溶解沉淀；
(2)去除DNA：使用DNase Ⅰ从提取的RNA中除去基因组DNA，反应体系为：42.75 μLRNA、5 μL 10× DNase Ⅰ buffer、2 μL Recombinant DNase Ⅰ、0.25 μL RnaseInhibitor，共50 μL，在冰上配置上述混合液后瞬离混匀，置于37℃金属浴中反应1 h；
(3)去除蛋白质：使用RNA清洁试剂盒（博迈德）去除RNA中的蛋白质，详细步骤如下：将去除DNA后的RNA用DEPC水补足100 μL，加入 350 μL溶液 RC、250 μL无水乙醇，混匀后迅速吸取混合液加至吸附柱内，4℃、12000 rpm离心1 min，弃去管内废液；吸取350 μL溶液RW1加至吸附柱内，4℃、12000 rpm离心1 min，弃去管内废液；吸取500 μL溶液RW加至吸附柱内，冰盒上静置1 min，4℃、12000 rpm离心1 min，弃去管内废液；重复步骤前一步骤；4℃、12000 rpm离心2 min，用EP管替换收集管；向吸附柱中加入50 μL 56℃预热的DEPC水，室温放置2 min，4℃、12000 rpm离心2 min，RNA溶液收集到EP管内；通过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop仪器检测RNA质量和浓度，RNA保存在-80℃冰箱中；
(4)cDNA合成：使用反转录试剂盒（abm）进行cDNA合成，逆转录反应体系为：4 μLAll-In-One 5X RT MasterMix、1000 ng RNA，用Nuclease-free H2O补到20 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。逆转录程序设定为37℃、15 min，65℃、10 min，反应结束后cDNA保存于-20℃冰箱备用；
(5)PCR扩增：根据NCBI数据库中卵形鲳鲹IL-1β核酸序列，使用软件primerPremier 6设计上下游引物IL-1β-F、IL-1β-R，设计引物交由生工生物工程（广州）有限公司合成，以卵形鲳鲹肝脏cDNA为模板，使用引物IL-1β-F、IL-1β-R对IL-1β完整的ORF进行扩增，PCR反应体系为：2 μL肝脏cDNA、0.5 μL IL-1β-F、0.5 μL IL-1β-R、12.5 μL 2×Phanta Max Master Mix、9.5 μL ddH2O，共25 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。PCR反应程序设定为95℃、5 min；30个循环：95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min；72℃、10 min。凝胶电泳判断扩增条带大小及引物特异性，符合预期结果配置50 μL反应体系进行胶回收；
(6) PCR产物连接：按3（2）的方法将IL-1β的PCR产物连接至克隆载体上；
(7) 转化：按照3（3）的方法将连接产物Blunt-IL-1β转化至感受态细胞中；
(8)克隆载体Blunt-IL-1β鉴定：按照3（4）的方法筛选阳性克隆，并将PCR扩增产物由生工生物工程（广州）有限公司进行测序。
5、重组质粒抽提：根据质粒快速质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明书步骤提取鉴定为阳性的克隆质粒Blunt-SimA I、Blunt-IL-1β，步骤如下：
（1）取4 mL培养10 ~ 12 h的菌液12000 rpm离心1 min，吸去EP管内的培养液；
（2）吸取150 μL溶液P1至EP管内，使用移液枪吹打充分悬浮菌体；
（3）吸取150 μL溶液P2至EP管内，上下颠倒EP管，彻底裂解菌体；
（4）吸取350 μL溶液P5至EP管内，立刻上下颠充分混匀液体，此时液体内出现白色絮状沉淀，12000 rpm离心2 min；
（5）缓慢吸取离心后的上清加至吸附柱内，12000 rpm离心1 min，弃去管内废液;
（6）吸取350 μL漂洗液PWT加至吸附柱内，12000 rpm离心1 min，弃去管内废液；
（7）12000 rpm离心1 min去除吸附柱内残留液体，用EP管替换收集管；
（8）向吸附柱内加入56℃预热50 μL ddH2O，在室温下静置5 min，12000 rpm离心1min，质粒收集于EP管内。
6、真核表达载体质粒构建：
(1)引物设计：根据克隆测序得到SimA I和IL-1β序列设计引物，比较目的基因与载体上的酶切位点和酶切环境，选择EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ作为酶切位点。采用重叠延伸PCR将SimA I和IL-1β串联到一起形成融合片段，在SimA和IL-1β基因之间加入一段linker序列（GGGS）2，以保证串联蛋白空间构象和功能不受影响。在SimA基因N端依次加上EcoR Ⅰ位点、保护碱基、Kozak序列，C端删去终止密码子序列，加上linker序列。在IL-1β基因N端加上linker序列，删除起始密码子，C端加上6× His标签和Xba Ⅰ位点。
(2)重叠延伸PCR：采用三步法的方法进行基因融合：扩增单一基因片段：根据已提取克隆载体Blunt-SimA I、Blunt-IL-1β，用olSimA-F、olSimA-R扩增SimA基因作为串联基因的N端，用olIL-1β-F、olIL-1β-R扩增IL-1β基因作为串联基因的C端，PCR反应体系为：4 μL细菌DNA或肝脏cDNA、1 μL olprimer-F、1 μL olprimer-R、25 μL 2× Phanta MaxMaster Mix、11.5 μL ddH2O，共50 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。PCR反应程序设定为：95℃、5 min；30个循环：95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min；72℃、10 min。凝胶电泳判断PCR扩增条带大小，回收并纯化PCR产物。
两基因片段融合：测量SimA I和IL-1β纯化产物浓度，以等量的SimA Ⅰ和IL-1β纯化产物为模板，不添加引物，利用互补的linker序列使两个基因融合成完整的片段，PCR反应体系为： 4 μL SimA Ⅰ胶回收产物、4 μL IL-1β纯化产物、25 μL 2× Phanta MaxMaster Mix、18 μL ddH2O，共50 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。PCR反应程序设定为：95℃、5 min；13个循环：95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、9 min；72℃、10 min。
融合基因全长扩增：以上述PCR扩增的产物作为模板，使用引物olSimA-F、olIL-1β-R扩增融合基因全长。PCR反应体系为： 4 μL融合PCR产物、0.5 μL olSimA-F、0.5 μLolIL-1β-R、12.5 μL 2× Phanta Max Master Mix、11.5 μL ddH2O，共25 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。PCR反应程序设定为95℃、5 min；30个循环：95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、2 min；72℃、10 min，凝胶电泳检测PCR产物，判断在目的大小处是否有明显的条带。
(3)克隆载体构建：根据3（2）~3（4）的方法，将融合片段与Blunt-zero载体连接，转化到Trans T1感受态中，经PCR、测序、酶切验证后扩大化培养。提取质粒，得到Blunt-SimAⅠ-IL-1β质粒溶液。
(4)双酶切反应：用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ对Blunt-SimA Ⅰ-IL-1β和pcDNA3.1(+)进行酶切，双酶切反应体系为：1 μL EcoR Ⅰ、1 μL Xba Ⅰ、2 μL 0.1% BSA、2 μL 10× M buffer、5 μL胶回收产物、9 μL ddH2O，共20 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀。在PCR仪中37℃孵育6 h，凝胶电泳判断质粒酶切状态，纯化酶切后的目的片段和pcDNA3.1(+)，测量纯化产物浓度。
(5)连接：按照目的片段浓度：载体浓度 = 1：6的比例加入胶回收产物，利用T4连接酶连接表达载体与目的片段，构建重组表达质粒，按照表配置反应体系：1 μL T4 DNALigation、2 μL 10× Ligation buffer、0.65 μL载体DNA、9.5 μL目的片段DNA、6.85 μLddH2O，共20 μL，在冰上配置混合液后瞬离混匀，在PCR仪中16℃孵育过夜。
(6)转化：将连接产物pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β连接转化到感受态细胞中。
(7)重组质粒鉴定：用灭菌后的牙签挑取单菌落接种至AMP＋ LB培养基中，37℃、220 rpm培养6 h后，使用引物olSimA-F、olIL-1β-R鉴定阳性克隆后送样测序，扩大化培养正确的阳性克隆。
7、大量制备去内毒素质粒：使用金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒（康为世纪）提取pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β，按照说明书指示进行操作，最后用1 mLddH2O洗脱质粒得到质粒溶液，跑胶检测后保存于-20℃冰箱。
8、重组质粒表达验证：
(1)牙鲆鳃细胞FG88复苏及传代培养：细胞培养瓶（25 cm2）中提前加入4 mL细胞培养液（DMEM/f12 + 10% FBS + 1%双抗），取出冻存在液氮罐内的牙鲆鳃细胞FG88，置于37℃金属浴中快速融化，在无菌工作台中将细胞加入细胞培养瓶内，轻轻摇晃使细胞与培养液混合均匀，放入24℃培养箱内培养，次日更换培养基，根据细胞生长状态每2 ~ 3天更换一次培养液；待细胞铺满细胞培养瓶底部80%后，用1 mL无血清培养液（1%双抗）清洗三遍，加入1 mL 0.25%胰酶，消化2 ~ 3分钟后吸走胰酶，加入1 mL细胞培养液轻轻吹打悬浮细胞，细胞悬液均分至两个细胞培养瓶中，补入4 mL细胞培养液放入24℃培养箱内培养。
(2)细胞转染：
第一步、在24孔板要放置爬片的位置滴加少量培养液，放置载玻片；
第二步、细胞长满培养瓶后用胰酶消化，加入1 mL细胞培养液制成细胞悬液，吸取200 μL细胞悬液滴加到24孔板内，补入500 μL细胞培养液，在24℃培养箱内培养36 h；
第三步、当细胞密度到达80%进行转染实验，弃去细胞培养液，用1 mL无血清培养液（含1%双抗）清洗一次，实验组加入400 μL转染专用培养液Opti-MEM，对照组加入500 μL；
第四步、取两个EP管配置反应体系，分别标记为A、B管，每个孔的转染体系如下：
A管内依次加入50 μL Opti-MEM、1 μL Lipo3000 Transfection Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育5 min；
B管内依次加入50 μL Opti-MEM、1 μL质粒、1 μL P3000，轻柔吹打混匀，室温孵育5 min；
第五步、将孵育后B管内的液体加入到A管中，轻柔吹打混匀，室温孵育30 min；
第六步、往已铺好板的孔内加入100 μL预混好的脂质体DNA复合体（脂质体Lipo3000 Transfection Reagent包裹的DNA疫苗质粒），放入培养箱内培养，转染6 h后吸走孔内液体，加入细胞培养液继续培养36 h。
(3)间接免疫荧光
第一步、转染完成后吸走培养液，用PBS清洗三次，加入200 μL 4%组织细胞固定液（索莱宝4%的组织固定液）固定细胞15 min，PBS清洗三次，每次3 min；
第二步、加入200 μL 0.1% TritonX-100静置10 min，PBS清洗三次，每次3 min；
第三步、加入200 μL 3% BSA进行封闭，37℃孵育2 h，不洗；
第四步、一抗小鼠抗6× His用3% BSA以1：200稀释，每孔加入200 μL稀释后的一抗，4℃孵育过夜，PBST清洗四次，每次5 min；
第五步、二抗FITC标记兔抗小鼠IgG用3% BSA以1：500稀释，每孔加入200 μL稀释后的二抗，37℃避光孵育1 h，PBST清洗四次，每次5 min；
第六步、加入200 μL DAPI（10 μg/mL）染核，室温孵育10 min，PBST清洗三次，每次5 min；
第七步、用针头蘸取少量防荧光淬剂滴加到载玻片，爬片从24孔板内取出后倒扣在防荧光淬灭剂上，轻轻按压后用吸水纸吸走周围水分，封片后在激光共聚焦显微镜下观察、拍照，样品用锡纸包裹后保存于4℃。
二、结果
1、海豚链球菌SimAI基因克隆：通过PCR扩增海豚链球菌SimAⅠ的全长，经琼脂凝胶电泳检测后，结果显示SimAⅠ在1500 bp处检测到条带（见图1），纯化的PCR产物连接至Blunt-zero载体中，SimAⅠ基因测序结果拼接后进行序列比对，结果显示SimA I基因大小为1565 bp。
2、卵形鲳鲹IL-1β基因克隆：使用卵形鲳鲹肝脏cDNA为模板，分别使用PCR扩增IL-1β的全长，凝胶电泳检结果显示（见图2）IL-1β在750 ~ 1000 bp处检测到条带，将PCR产物纯化后连接至Blunt-zero载体中，扩大培养后送至公司测序。
3、DNA疫苗真核表达载体：使用带有Linker片段的引物olSimA-F/R、olIL1β-F/R扩增 SimA Ⅰ和IL-1β基因片段，通过重叠延伸PCR方法，利用互补的(GGGS)2序列将 SimA Ⅰ和SimA Ⅱ 分别与IL-1β串联，合成融合片段 SimA Ⅰ-IL-1β、SimA Ⅱ-IL-1β（见图3）。将融合片段连接到Blunt-zero中，经测序鉴定后得到克隆融合片段，SimA Ⅰ-IL-1β全长为2401bp。用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ对测序结果正确的克隆载体和pcDNA3.1(+)进行双酶切（见图4），连接转化并鉴定后得到重组质粒pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β。
4、重组质粒表达验证：将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β转染到牙鲆鳃细胞中，通过免疫荧光实验验证质粒在细胞中的表达情况。结果显示（见图5），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β转染的细胞中检测到了绿色荧光信号，而pcDNA3.1(+)空载体组未检测到荧光信号，证明了重组质粒pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β能够在牙鲆鳃细胞中表达。
实施例2：串联DNA疫苗免疫保护效果评价；
一、实验材料与方法：
1.实验试剂：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购买于诺唯赞生物科技公司；Tween-20购买于北京索莱宝科技公司；鱼免疫球蛋白M（IgM）ELISA Kit购买于上海朗顿生物科技公司。
2.实验动物：卵形鲳鲹（117.9 ± 4.3 g）由广西省精工海洋科技有限公司提供，鱼体在5 m × 4 m × 1.5 m的水泥池内暂养2周内没有出现发病症状和死亡。养殖水温25± 0.5℃，养殖用水为过滤曝气后的海水，每天更换二分之一的海水。每天按照鱼体重的1.5%的比例投喂一号金鲳鱼配合饲料，每天投喂2次，及时捞出未吃完的饲料。
3.所用引物：从NCBI数据库中查找卵形鲳鲹MHC Ⅰα、MHC Ⅱ、TNFα、IRF3，MyD88、β-actin的基因序列，使用软件primer Premier 6设计荧光定量引物：
β-actin-FAGCCCACAACACCTGTTCC，如SEQ ID NO .13所示；
β-actin-RTCCTCACATTCACACCGCC，如SEQ ID NO .14所示；
MHC Iα-FTCTGGTGTGAAGGAGGAG，如SEQ ID NO .15所示；
MHC Iα-RATGATGGCGACAAGAATGA，如SEQ ID NO .16所示；
MHC Ⅱ-FATCACATACATTCGGTCGTA，如SEQ ID NO .17所示；
MHC Ⅱ-RCGTTCAGCGTTCTTCACT，如SEQ ID NO .18所示；
TNFα-FGGAGGGTGAATGTAAAGTGC，如SEQ ID NO .19所示；
TNFα-RCCGTGGTTAGTTTTGAGTTGT，如SEQ ID NO .20所示；
IRF3-F TATACCGACGACATTGTTGA，如SEQ ID NO .21所示；
IRF3-RCCATCTACACTGCTTGACA，如SEQ ID NO .22所示；
MyD88-FATGAGAGTCAGAAGAAGAAGG，如SEQ ID NO .23所示；
MyD88-RGGCAGTAGCAGATGAAGG，如SEQ ID NO .24所示；
卵形鲳鲹免疫：320尾卵形鲳鲹随机分为4组，每组80尾，在免疫前一天停止喂食，免疫时用麻醉剂将鱼麻醉，在鱼体背鳍左侧肌肉进行注射，两组对照组分别注射100 μLPBS和100 μL 200 ng/μL的pcDNA3.1(+)，免疫组注射100 μL 200 ng/μL pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β。实验期间水温25 ± 0.5℃，每天进行吸底、更换二分之一的海水。
4.样品采集：在免疫的前1天、免疫后的第1天、第3天、第10天、第28天进行取样，每组随机选取3尾鱼麻醉后进行尾椎静脉取血，血液在4℃中静置过夜，4℃、4000 rpm离心10min，吸取上层血清到新的EP管，保存于液氮中。同时采集肝、肾、脾、注射部位的肌肉，样品取出后迅速放入液氮中用于RNA提取。
5.攻毒实验：在免疫14天后，使用海豚链球菌TO-GX2019对各组个体通过腹腔注射进行攻毒实验，每尾个体注射300 μL 1 × 107 CFU/mL菌液。攻毒实验后记录7天内各组的死亡数量，进行病原菌分离鉴定。按照相对保护率=[1-(免疫死亡率/实验死亡率)] ×100%的公式，计算各组的相对保护率。
6.血清抗体水平检测：使用鱼免疫球蛋白M（IgM）ELISA Kit对免疫后各个时间点卵形鲳鲹血清抗体效价进行检测：
（1）已包备抗体的酶标孔中加入待测样品，样品孔加入50 μL血清样品，空白孔加入50 μL PBS，标准孔依次加入50 μL按梯度稀释的标准品。各孔内补充50 μL生物素抗原工作液，用封板膜封口，振荡96孔板以混匀孔内液体，37℃孵育1 h；
（2）揭去封板膜，弃去液体，用1 mL PBST清洗，静置30 s甩去液体并拍干，重复5次；
（3）各孔内补充50 μL亲和素-HRP，用封板膜封口，振荡96孔板以混匀孔内液体，37℃孵育1 h；
（4）重复步骤（2）；
（5）各孔内加入50 μL显色A液后，迅速加入50 μL显色B液，避光条件下显色10min；
（6）各孔内加入50 μL 2M的H2SO4 终止反应；
（7）以空白样品孔进行调零，使用酶标仪检测OD450值。
7.免疫相关因子检测：检测免疫后各个时间点卵形鲳鲹血清中非特异性免疫指标总抗氧化能力、过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性、溶菌酶活性，使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测，具体方法按说明书指示进行。
8.免疫相关基因表达水平检测；
(1)cDNA合成：提取免疫后各时间段肝脏组织的RNA样品，去除RNA中的DNA和蛋白质，并将RNA反转为cDNA；
(2)荧光定量PCR：将合成的cDNA使用DEPC水稀释至工作浓度50 ng/μL，荧光定量PCR反应体系为： 2 μL cDNA、正反向引物（10 mM）各0.4 μL、10 μL ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix、7.2 μL DEPC水，共20 μL，混合后短暂瞬离。荧光定量PCR程序设定为：95℃、5 min；35个循环：95℃、10 s，60℃、30 s；60℃ ~ 90℃温度梯度生成熔断曲线。根据熔断曲线检验引物特异性和PCR产物纯度。每个样品重复3次，使用2-ΔΔCt方法计算结果，以β-actin基因表达量进行均一化处理，各个时期PBS组表达量设为1。
9.数据处理：使用SPSS 20对实验数据进行分析，采用单因素方差分析分析统计学差异。分析结果以平均值 ± 标准误（SEM）表示，p < 0.05代表差异显著并具有统计学意义，GraphPad Prism 9软件用于绘图。
二、结果
1、免疫相对保护率：在免疫后第28天对各组进行攻毒，由结果（见图6、表1）显示，在攻毒后的第7天，pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组的相对保护率分别为6%、49%，且从死亡个体中分离鉴定到海豚链球菌。pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β的存活率从攻毒后第3天起显著高于PBS组、pcDNA3.1(+)组。串联DNA疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β能够在海豚链球菌感染的情况下对卵形鲳鲹具有保护作用，而且在免疫第28天时免疫保护率达到49%；
表1为在海豚链球菌攻毒7天后免疫组和对照组卵形鲳鲹的死亡率、存活率、相对保护率组别
；
注：*号表示组间存在显著性差异（p < 0.05）。
2、血清抗体水平：对免疫后第1、3、10、28天的各组血清进行了IgM抗体水平检测，结果显示（见图7）：免疫后第三天pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的抗体水平有略有升高（p< 0.05）。与PBS组、pcDNA3.1(+)组相比，免疫后第10天、28天pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的抗体水平显著上升（p < 0.05），免疫后第28天pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的抗体水平达到了最高水平说明DNA疫苗pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β提高了卵形鲳鲹的抗体水平，能够显著诱导鱼体特异性免疫。
3、血清免疫相关因子活性：在总抗氧化能力方面（见图8），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β的总抗氧化能力在免疫后第3天高于pcDNA3.1(+)组，并在第10天、第28天持续保持较高水平（p < 0.05）；
在过氧化氢酶活性方面（见图9），pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组的过氧化氢酶活性在免疫后第1天、第3天显著高于PBS组，在免疫后第10天、第28天显著高于PBS组、pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在SOD活性方面（见图10），pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组的SOD活性在免疫后第3天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05），pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组在免疫后第10天的SOD活性显著高于PBS组（p < 0.05），在免疫后第28天pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组的活性显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在溶菌酶活性方面（见图11），pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β组的溶菌酶活性在免疫后第3天、第10天和第28天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）。
4、免疫相关基因表达水平：对DNA疫苗免疫后第1、3、10、28天的免疫组和对照组卵形鲳鲹的肝脏中MyD88、IRF3、TNFα、MHC Ⅰα、MHC Ⅱ免疫相关基因表达情况进行了检测；
在MyD88基因表达情况方面（见图12），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的MyD88表达量在免疫后第1天、第3天显著高于PBS组，在免疫后第10天、第28天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在IRF3基因表达情况方面（见图13），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的IRF3基因的表达量在免疫后第3天和第10天显著高于PBS组、pcDNA3.1(+)组，在免疫后第28天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在TNFα基因表达情况方面（见图14），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的TNFα基因表达量在免疫后第3天、第10天和第28天显著高于PBS组、pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在MHC Ⅰα基因表达情况方面（见图15），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的MHC Ⅰα基因表达量在免疫后第1天显著高于PBS组，在免疫后第3天和第28天显著高于开始PBS组、pcDNA3.1(+)组，在免疫后第10天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）；
在MHC Ⅱ基因表达情况方面（见图16），pcDNA3.1(+)-SimA Ⅰ-IL-1β组的MHC Ⅱ基因表达量在免疫后第1天、第3天和第10天显著高于开始PBS组、pcDNA3.1(+)组，在免疫后第28天显著高于PBS组和pcDNA3.1(+)组（p < 0.05）。
综上所述，疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β的使用延后了死亡时间，降低了死亡率，对鱼体有一定免疫保护作用。血清中IgM抗体水平在注射疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β后第3天开始小幅度的提高，并在后续的时间内持续上升，表明DNA疫苗均有效的提升了卵形鲳鲹的抗体水平。疫苗pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β还增强了机体非特异性免疫水平。研究了免疫卵形鲳鲹后MyD88、MHC Ⅰα、IRF3、TNFα、MHC Ⅱ免疫相关基因表达水平的变化，发现该疫苗的接种有效增强了对抗原肽的呈递，提升了特异性体液免疫水平，提高机体对海豚链球菌的识别和杀灭能力。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗包括卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimAI基因和卵形鲳鲹的IL-1β基因和载体pcDNA3.1，所述SimA I基因和IL-1β基因连接于载体pcDNA3.1+上的EcoR I/Xba I之间，在SimA和IL-1β基因之间加入一段linker序列(GGGS)2，所述卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I序列如SEQ ID NO.3所示，所述卵形鲳鲹的IL-1β基因序列如SEQ ID NO.6所示。
2.权利要求1所述海豚链球菌DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法为将卵形鲳鲹源海豚链球菌的SimA I基因和卵形鲳鲹的IL-1β基因连接于载体pcDNA3.1+上的EcoR I/Xba I之间，获得pcDNA3.1(+)-SimA I-IL-1β质粒，即为卵形鲳鲹源海豚链球菌DNA疫苗。
3.权利要求1所述的海豚链球菌DNA疫苗在制备预防卵形鲳鲹源海豚链球菌病药物中的应用。
4.权利要求1所述海豚链球菌DNA疫苗在制造用作载体或者佐剂药物中的应用。
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