CN112375125B

CN112375125B - 一种多肽及其在预防鸡传染性法氏囊病中的应用

Info

Publication number: CN112375125B
Application number: CN202011322122.4A
Authority: CN
Inventors: 任桂萍; 郭笑辰; 孙文影; 尹杰超
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-11-23
Filing date: 2020-11-23
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-11-23
Also published as: CN112375125A

Abstract

本发明公开了一种多肽及其在预防鸡传染性法氏囊病中的应用。本发明提供的多肽可以作为中和表位疫苗；中和表位疫苗如下(a)：(a)由序列1第1‑195位氨基酸残基组成的蛋白质；本发明提供的多肽，即中和表位疫苗，具有抗原性强、诱导机体产生更高的中和抗体、预防效果好、无病原传播等优点，将在IBD的预防史上开辟了一个新的局面。

Description

一种多肽及其在预防鸡传染性法氏囊病中的应用

技术领域

本发明涉及一种多肽以及该多肽作为疫苗在预防鸡传染性法氏囊病中的应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害3-12周龄的雏鸡和青年鸡，损伤鸡的中枢免疫器官——法氏囊，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前在全球范围内均有分布，是养禽业最重要疾病之一，并且因免疫失败而造成的经济损失巨大。

目前，疫苗接种是预防IBD的主要手段，但所有的疫苗均会对接种鸡的法氏囊造成不同程度的损伤，导致免疫抑制，从而可增强机体对其它病原体的易感性并且降低对其它疫苗的反应性。VP2是IBDV的主要结构蛋白，为病毒的宿主保护性抗原，可以诱导产生保护性的中和抗体。因此，利用基因工程技术获得密集且具有保护性的中和表位蛋白十分重要，能够从根本上清除了病原的传播，且蛋白分子量小，产量高。本发明是将本实验已鉴定的VP2蛋白的保护性抗原表位进行串联，制备亚单位疫苗，从而获得安全、有效的中和表位疫苗，为有效预防IBD奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种多肽以及该多肽作为中和表位疫苗在预防鸡传染性法氏囊病中的应用。该疫苗免疫鸡群后，14天产生较高的抗体水平，28天抗体水平达到高峰，且56天仍保持高的抗体水平。在中和抗体水平上，中和表位疫苗组高于VP2全长蛋白组。表明中和表位疫苗不仅能起到长效的保护效果，刺激机体产生更高的中和抗体水平，并能从根本上清除了病原的传播。

所述的鸡传染性法氏囊病中和表位疫苗及其基因组核苷酸序列和蛋白质序列为本发明的保护范围。

本发明构建的多肽，即鸡传染性法氏囊病中和表位疫苗，其为VP2基因(GenBank序列号为No.JN106051)中选取4段中和表位串连在一起进行表达获得的蛋白；

所述中和表位疫苗为如下(a)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-195位氨基酸残基组成的蛋白质；

编码所述中和表位疫苗的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因中，编码所述中和表位疫苗的DNA分子为如下(1)：(1)序列表的序列2自5’末端第1-585位核苷酸所示的DNA分子。

含有以上所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述的鸡传染性法氏囊病中和表位疫苗的相关制剂为本发明保护的范围。

所述的多肽和多肽的基因在预防鸡传染性法氏囊病方面的应用为本发明保护的范围。

本发明构建的鸡传染性法氏囊病中和表位疫苗可视为基因工程改造后的亚单位疫苗，其相应制剂，如：冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等，均属本专利保护范围。

本发明提供了一种多肽，即中和表位疫苗，可以刺激鸡体内产生更高的中和抗体水平，起到更好的保护效果，提高攻毒保护效率，且具有抗原性强、工业化生产质量可控、产量高，避免了传播病原等优点。

附图说明

图1为中和表位疫苗的构建DNA胶图谱。M为分子量Marker，1泳道为中和表位疫苗的基因片段。

图2为中和表位疫苗的SDS-PAGE图谱。M为分子量Marker，1泳道为中和表位疫苗的蛋白分子。

图3为实验SPF鸡免疫中和表位疫苗、VP2全长蛋白、IBDV B87中等毒力疫苗株、商品化基因工程亚单位疫苗后不同时间点抗体效价。

图4为实验SPF鸡免疫中和表位疫苗、VP2全长蛋白、IBDV B87中等毒力疫苗株、商品化基因工程亚单位疫苗后不同时间点抗体中和活性。

具体实施方案：

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：中和表位疫苗的构建和鉴定

根据选取的4段中和表位疫苗基因设计引物，以VP2基因为模板，利用overlap PCR的方法将4段中和表位疫苗基因连在一起，采用凝胶回收试剂盒回收中和表位疫苗基因片段，将中和表位疫苗基因片段与pET27b载体相连，构建为表达载体重组质粒。

结果如图1所示，中和表位疫苗基因大小约为580bp，成功构建表达载体重组质粒。

实施例2：中和表位疫苗的表达和纯化

将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。将得到的重组菌接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、120r/min振荡培养至OD_600nm＝0.35；加入IPTG并使其终浓度为0.25mmol/L，37℃、120r/min振荡培养4h。将菌液4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。将菌体沉淀用PBS溶液重悬，加入溶菌酶溶液(购自Amresco)并使溶菌酶的浓度为1mg/mL，4℃放置1h，然后进行超声破碎(25瓦的功率，3min)，4℃、10000g离心30min，收集沉淀。将沉淀用洗液洗3次后，用变性液将沉淀溶解，放于4℃过夜。将变性蛋白滴加于10倍体系的复性液中，放于4℃过夜。将复性的蛋白透析至PBS溶液中，过滤后，分装保存于-70冰箱。

实施例3：中和表位疫苗免疫鸡后抗体效价和抗体中和活性的测定

选14日龄SPF鸡50只随机分为5组，组每10只。第一组每只雏鸡皮下注射中和表位疫苗200μg，第二组每只雏鸡皮下注射VP2全长蛋白疫苗200μg，第三组每只雏鸡口服IBDVB87疫苗200μl，第四组每只雏鸡皮下注射商品化基因工程亚单位疫苗250μL，第五组每只雏鸡皮下注射生理盐水250μL。免疫后每隔7d，各组鸡翅下静脉采血，分离血清。

用IDEXX ELISA试剂盒检测每组鸡的抗体效价。结果见图3。ELISA结果表明，中和表位疫苗组免疫后14d抗体上升到较高水平，且到免疫后56d都处于高抗体水平。可见，中和表位疫苗能刺激机体产生的抗体持续时间长，抗体效价高于其他实验组。

用DF1细胞检测每组鸡的抗体中和活性。将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的血清(血清于56℃水浴灭活30min并过滤除菌)和200TCID₅₀的IBDV病毒液(B87株)等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种4个细胞孔；设置不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5％CO2培养连续观察5天，每天记录细胞生长状态。结果见图4。结果表明，中和表位疫苗组的中和抗体水平高于VP2全长蛋白组及其他实验对照组。

实施例4：攻毒试验

将14日龄SPF鸡随机分为6组，每组10只。免疫后21d，分别对试验鸡进行攻毒保护性试验，选用IBDV经典毒株BC6/85株，以每只口服100BID₅₀剂量进行攻毒。

攻毒96h后，统计每组中鸡的法氏囊病变的只数。结果见表1。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种多肽及其在预防鸡传染性法氏囊病中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 195

<212> PRT

<213> 鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus)

<400> 1

Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg

1 5 10 15

Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr

20 25 30

Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr

35 40 45

Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala Ala Asn Asp Tyr Gln

65 70 75 80

Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser

85 90 95

Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr

100 105 110

Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly

115 120 125

Gly Gln Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala

130 135 140

Val Thr Ile His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Leu Ile Thr

145 150 155 160

Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu Ile

165 170 175

Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg

180 185 190

Glu Tyr Thr

195

<210> 2

<211> 585

<212> DNA

<213> 鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus)

<400> 2

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

ggtggtggtg gttctgatag gcccagagtc tacaccataa ctgcagccaa tgactaccaa 240

ttctcatcac agtaccaagc aggtggagtg acaatcacac tgttctcagc aaacatcgat 300

gccatcacaa gcctcggtgg tggtggttct ataacccagc caatcacatc catcaaactg 360

gagatagtta cctccaaaag tggtggtcag gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt 420

gggagcctag cagtgacgat ccacggtggc ggtggtggtg gttctaagaa cctgatcaca 480

gaatacggcc gatttgaccc aggggccatg aactacacaa aactgatact gagtgagagg 540

gaccgtcttg gcatcaagac cgtgtggcca acaagggagt acacc 585

Claims

1.一种多肽，其为VP2基因中选取4段中和表位串连在一起进行表达获得的蛋白；所述多肽为如下(a)：(a)由序列表中序列1自N末端第1-195位氨基酸残基组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因中，编码所述多肽的DNA分子为如下(1)：(1)由序列表中序列2自5’末端第1-585位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述多肽或权利要求2所述多肽的基因在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(Ⅰ)：(Ⅰ)预防鸡传染性法氏囊病。