CN113122514B

CN113122514B - 细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白及其应用

Info

Publication number: CN113122514B
Application number: CN202110466431.7A
Authority: CN
Inventors: 王正荣; 薄新文; 张译元; 县锦文; 张艳艳; 孟季蒙; 孙艳
Original assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Current assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-04-28
Also published as: CN113122514A

Abstract

本发明公开了细粒棘球绦虫3‑羟基酰基‑CoA脱氢酶蛋白及其应用，属于免疫学技术领域。所述细粒棘球绦虫3‑羟基酰基‑CoA脱氢酶蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；该蛋白通过对3‑羟基酰基‑CoA脱氢酶进行原核表达获取，将所得重组蛋白免疫犬，结果发现该蛋白可以明显提高减虫率和抑制细粒棘球绦虫节片生长发育，说明该蛋白可以作为抗细粒棘球绦虫疫苗的候选抗原，为抗细粒棘球绦虫疫苗的研制提供技术支撑和数据支持。

Description

细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，涉及一种细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白。

背景技术

细粒棘球蚴病(Echinococcosis)又称囊型包虫病(cystic echinococcosis,CE)，是由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,E.g)中绦期幼虫寄生于人和动物的肝、肺等器官内而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病。我国包虫病的流行地区主要集中在新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏等地。包虫病给我国畜牧业造成了严重的经济损失，同时也严重危害人类的健康。我国已将该病列为《国家中长期动物疫病防治规划》(2012-2020年)重点防范的动物疫病之一。

免疫预防是控制病原循环链且最有效的防治措施，理想的疫苗是阻止中间宿主感染棘球蚴在体内形成包囊，或者抑制终末宿主感染细粒棘球蚴发展为成虫。细粒棘球绦虫的成虫寄生在犬的小肠中，虫卵成熟后会随犬粪便一起排出体外，因此虫卵是棘球蚴病感染的主要来源。犬是细粒棘球绦虫主要终末宿主，所以研制有效的终末宿主疫苗并对犬进行免疫预防可以阻断虫卵的传播，并且是切断病原的循环和控制棘球蚴病的流行主要措施。

在免疫防治方面，采用囊液粗抗原免疫中间宿主即可产生一定保护力，Eg95重组亚单位疫苗可为羊提供较高保护力(96-100％)，在世界上已得到大范围推广，但包虫病流行区域内中间宿主数量极为庞大，实施免疫工作非常困难。终末宿主犬极易反复感染，感染量大且成虫排卵量较高，因此控制传染源是防治包虫病的关键。我国采用以控制传染源为主的综合性防治策略，表现在实施“犬犬投药，月月驱虫”、对农牧民展开健康教育、病变脏器无害化处理等措施。这些措施尤其是投药驱虫在牧区难以贯彻落实，无主犬和野生食肉动物数量较大，一旦落下一只则后患无穷。因此，积极研制犬用抗细粒棘球绦虫疫苗或许是消灭该病的有效措施。但E.granulosos作为多细胞寄生虫抗原复杂，与宿主相互作用机制尚未完全阐明，目前尚无可用于商业化的终末宿主疫苗。

细粒棘球绦虫基因组序列的发布为在细粒棘球绦虫的生物学、发育、致病机制与宿主之间的相互作用等研究提供了新的研究方向。通过分析感染人的多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、微小膜壳绦虫(Hymenolepismicrostoma)基因组序列，发现绦虫分解代谢是依靠宿主体内的营养物质。脂肪酸代谢在生物体内发挥着重要作用，目前有关脂肪酸代谢酶多集中于植物及鱼类等领域，虽然寄生虫的繁殖生长需要高速率的合成代谢，但由于所需的营养物质由宿主提供，因此大多数寄生虫的合成代谢种类十分有限。目前有关寄生虫的脂肪酸代谢酶的研究鲜有报道，仅在弓形虫(Toxoplasma)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)等寄生虫中有报道。细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶作为脂肪代谢一个相关酶，至今国内外关于细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶尚未见研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白及其应用，以3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白为免疫原免疫动物后，可以明显提高减虫率和抑制细粒棘球绦虫节片生长发育，该蛋白可以作为抗细粒棘球绦虫疫苗的候选抗原，以为抗细粒棘球绦虫疫苗的研制提供技术支撑和数据支持。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种编码所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供包含所述的DNA序列的重组载体。

本发明还提供包含所述的重组载体的宿主菌，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供一种所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白或所述的DNA或所述的重组载体或所述的宿主菌在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用。

本发明还提供一种预防细粒棘球绦虫的疫苗，以所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白为免疫原获取。

优选的是，所述免疫原还包括佐剂Quil A或弗氏佐剂。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过细粒棘球绦虫的原头蚴转录组高通量测序数据文库，筛选出了一个脂肪酸代谢酶通路，并筛选出该通路中的一个主要调控基因-3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因，推测其可能是细粒棘球绦虫中脂肪酸代谢的关键酶之一，在细粒棘球绦虫生长发育中可能发挥着重要作用。然后，通过对3-羟基酰基-CoA脱氢酶进行原核表达以及免疫原性测定，证明其可以作为免疫原免疫动物，且试验结果显示，该蛋白可以明显提高减虫率和抑制细粒棘球绦虫节片生长发育，该蛋白可以作为抗细粒棘球绦虫疫苗的候选抗原，以为抗细粒棘球绦虫疫苗的研制提供技术支撑和数据支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为EGR-03347扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准(DL2000)；1-3：EGR-03347基因；

图2为重组质粒pET-32a-03347酶切鉴定结果；其中，M：DNA分子质量标准(DL2000plus)；1：EGR-03347基因；

图3为重组蛋白的诱导表达；其中，M：蛋白分子量标准；1-2：重组质粒转至BL21IPTG诱导6h、0h的pET32a-03347；3：pET-32a空载体转至BL21 IPTG诱导6h；

图4为重组蛋白的表达形式分析以及SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化结果；其中，a：M，蛋白分子量标准；1，重组蛋白表达后上清；2，重组蛋白表达后沉淀；b：M，蛋白Marker；1-2，纯化重组蛋白EGR-03347；

图5为犬抗体IgG水平变化；**表明p<0.01极显著表达；*表明p<0.05显著表达。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例所用的试验动物、主要试剂材料和设备

1、实验动物

6-8月龄的实验比格犬

2、主要试剂及材料

3、主要仪器设备

实施例1 3-羟基酰基-CoA脱氢酶(EGR-03347)重组蛋白的构建和表达

1、引物设计和合成

利用软件Premier 5.0对EGR-03347的非跨膜区片段设计特异性引物，见表1下划线的酶切位点分别是BamHI和SalI引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 EGR-03347引物序列

2、3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)的扩增

以原头蚴cDNA为模板，PCR扩增EGR-03347基因(如SEQ ID NO：2所示)。

反应体系(20μL)：10μL Mix，8μL ddH₂O，上、下游引物各0.5μL，1μL cDNA模板。

反应程序：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环；延伸72℃10min。

3、PCR产物的回收

将PCR产物以130V，400mA的条件下，于1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像仪中观察电泳条带并在紫外照射下，对目的条带进行切胶并进行胶回收。

结果显示：目的片段大小和预期结果一致都为822bp(见图1)。

4、pMD19-T载体的连接

将胶回收产物连接至克隆载体pMD19-T中，连接反应体系(10μL)：胶回收产物4.5μL，solution I 5μL，pMD19-T vector 0.5μL，反应条件是4℃冰箱过夜连接。

5、连接产物转化

(1)将克隆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱取出置于冰上溶解，待其充分溶解后，将上述连接产物加入DH5α感受态细胞中，吹打混匀，置冰上20min。

(2)20min过后取出置于42℃水浴锅中热激90s，立即转到冰上冰浴5min。

(3)将上述溶液加入1mL不含抗性的LB液体培养基中，混匀放入37℃摇床上，180rpm，1h。

(4)取出溶液，8000rpm，离心3min后弃上清，留200～300μL上清，将沉淀吹打混匀后，用涂布器均匀涂布了LB固体培养基上，放入37℃培养箱过夜培养。

6、菌液PCR

挑取上述过夜培养的单个菌于含Amp的LB液体培养基里，放入37℃摇床上，180rpm，4h。进行菌液PCR。

反应体系(20μL)：10μL Mix，8μL ddH₂O，上、下游引物各0.5μL，1μL菌液。

反应程序：预变性94℃5min；变性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃30s，共35个循环；延伸72℃10min。将PCR产物以130V，400mA的条件下，于1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，并将菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。测序结果由Blast比对。

7、3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)重组表达载体的构建

将克隆得到的pMD19-T-003347的菌液大量培养，根据天根生化科技(北京)有限公司质粒试剂盒提取质粒。所提取得到的重组质粒pMD19-T-03347与pET-32a表达载体按以下体系(见表2)分别进行BamHI和SalI双酶切：

表2

在37℃恒温水浴锅中，反应1h后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，分别回收目的片段及pET-32a载体片段。回收的pET-32a载体片段与目的片段的连接经T4 DNA酶连接，连接体系见表3：

表3

混匀上述成分之后，4℃过夜连接。连接产物转入至DH5α感受态细胞，转化步骤同上述“5、连接产物转化”，于37℃恒温培养箱里过夜培养，次日挑取过夜培养的单个菌于含Amp的液体培养基里，放入37℃摇床上，180rpm，4h。进行菌液PCR，鉴定为阳性菌液扩大培养提取质粒并进行双酶切鉴定(酶切体系同上)，酶切鉴定后将菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pET-32a-03347。

如图2所示，将得到的重组质粒pMD19T-03347与原核表达载体pET-32a经限制性内切酶BamHI、SalI酶切后，构建重组质粒pET32a-03347，经菌液PCR鉴定后将重组酶切质粒的测序进行验证与GenBank中EGR-03347的发表的相关序列基本一致，表明重组表达质粒构建成功。

8、3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)重组蛋白的诱导表达

将构建成功的质粒pET-32a-03347转化至表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落将重组菌接种于含氨苄的LB液体培养基中，放入37℃摇床上，180rpm，4h振荡培养，进行菌液PCR，鉴定为阳性菌液扩大培养提取质粒并进行双酶切鉴定，经酶切鉴定后的菌液扩大培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8之间，加入终浓度为1.0mmol/LIPTG诱导于37℃180r/min振荡培养，分别与0h、6h吸取1mL菌液。

将吸取的1mL菌液放入离心机以8000rpm，离心3min，弃上清，菌体沉淀加入50μL1×PBS吹打混匀，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，于100℃沸水煮10min取出加20μL样品进行SDS-PAGE电泳检测。

如图3所示，与空白对照组相比诱导6h的重组菌液在47KDa处有一条明显条带，pET-32a空载体的重组菌液在17KDa有一条明显条带。

9、3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)重组蛋白的可溶性分析及纯化

1)根据上述实验操作对重组载体进行诱导表达，获得300mL的重组蛋白菌液。

①取300mL诱导表达的菌液，6000rpm，离心10min，弃上清直至菌体沉淀收集完毕。

②所有菌液沉淀合到两管，每管加入15mL的Lysis buffer裂解液，放入4℃冰箱过夜裂解。

③次日将菌体在液氮与42℃水浴锅中反复冻融5次。

④超声破碎直至菌体澄清，超声破碎的条件是功率50w，超声裂解5s，间隙6s，90次/周期，超声裂解1.5h。

⑤超声裂解之后的菌体离心，6000rpm，离心30min，收集上清和沉淀。向沉淀中加入8M尿素，水平摇床室温溶解2h，4℃冰箱保存，将处理好的上清及沉淀跑SDS-PAGE，以确定蛋白的表达形式。

如图4所示，结果显示重组蛋白EGR-03347在沉淀以包涵体的形式表达(图4a)，以亲和层析Ni²⁺纯化表达的蛋白经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示蛋白条带较单一(图4b)。

2)重组蛋白的纯化

经SDS-PAGE检测结果重组蛋白以包涵体的形式存在，使用亲和层析Ni²⁺进行纯化，纯化步骤如下：

②使用Ni柱前，用10mL ddH₂O，2mL 20％乙醇分别过柱6次。

②10mL A液洗柱。

③4mL上述蛋白沉淀原液过Ni柱，关Ni柱，冰浴10min之后弃液体。

④4mL A液洗柱。

⑤8mL B液洗脱蛋白，收集蛋白原液。

⑥重复上述步骤，直至所有蛋白沉淀全部纯化完毕。

⑦纯化完之后，加2mL，0.5M NaOH和10mL ddH₂O洗柱。最后加20％乙醇置于4℃冰箱保存。

3)包涵体的复性及浓缩

①将透析袋减成适当大小长度。

②在NaHCO₃和1mmol/L EDTA中将透析袋煮沸10min。

③用去离子水彻底清洗透析袋。

④在将透析袋放入1mmol/L EDTA中煮沸10min。

⑤用前捡漏透析袋是否漏水，将过柱蛋白加入透析袋中，分别用8M、6M、4M、2M、1M尿素透析8h，在用蔗糖浓缩。

⑥蛋白浓缩完之后，收集蛋白，并通过NanoDrop2000c超微量分光光度计测定蛋白浓度，并于-80℃冰箱保存。

实施例2 3-羟基酰基-CoA脱氢酶基因(EGR-03347)重组蛋白用于犬免疫保护实验

1、实验动物分组

将驱虫和疫苗后6-8月龄的左右的实验犬分为3组，每组3只分别是EGR-03347蛋白免疫组、PBS组、QuilA组，实验前检测每只犬的生理状况，观察一周在进行实验。

2、实验动物免疫

(1)免疫原的制备

实验犬以每只200μg蛋白含量与终浓度为2mg/mL QuilA溶液等体积混合免疫。

(2)免疫方法

EGR-03347组、PBS组、QuilA实验犬按200μg/只，分别颈部皮下两点注射免疫物。免疫3次，每次间隔两周。

3、ELISA检测免疫后犬抗体水平变化

(1)包被：将目的蛋白利用碳酸盐缓冲液CBS稀释浓度至5μg/mL，以每孔200μL加入酶标孔中，4℃包被过夜。次日将孔中液体排净，每孔加入200μL的PBST清洗共3次，每次3min。

(2)封闭：以每孔100μL的封闭液(5％脱脂奶粉)封板，37℃温箱封闭2h，倒掉孔中的液体，加入PBST洗板，清洗3次，每次3min。

(3)一抗孵育：用PBST稀释已收集的犬血清至1：80，每孔加入100μL，每个样品做三个重复，放入37℃温箱孵育1.5h，倒掉孔内液体，用PBST洗三次。

(4)二抗孵育：加入稀释至1：3000的HRP标记的兔抗犬血清，每孔加100μL，放入37℃温箱孵育1.5h，倒掉孔内液体，用PBST洗3次。

(5)显示：每孔加入50μL TMB显色液，37℃温箱孵育15min。

(6)终止：每孔加入50μL ELISA终止液，在酶标仪OD_450nm读数。

4、样品的采集及保存

在第三次免疫一周后，对实验犬人工经口感染原头蚴100000枚，考虑实验操作人员的自身安全在未产卵之前，即感染28d后，对实验犬注射KCl进行安乐死处置，剖检各组实验犬，采集虫体，在显微镜下观察并计数，计算减虫率，并评估虫体发育情况。

5、结果与分析

(1)EGR-03347组的犬经过免疫后，与PBS与佐剂对照组相比抗体水平均发生了变化。如图5所示，ELISA结果显示：随着免疫次数的增加，抗体水平逐渐升高；在第3次加强免疫后抗体水平达到最高值(OD值2.91392)，与对照组相比差异极显著(p<0.01)。而供虫后抗体又逐渐升高，在供虫后28d抗体最高值为(OD值3.2390)与对照组相比差异极显著(p<0.01)。

(2)用生理盐水反复清洗犬小肠黏膜直至黏膜上蠕虫全部脱落，液体澄清肉眼就可见蠕虫为止，将每只犬的虫体量合为一管定容至30mL，取50μL压片并在显微镜下计数，每管蠕虫量做3个生物学重复，取平均值计数结果(见表4和表5)。

表4 EGR-03347与PBS组在感染原头蚴28d后感染蠕虫的数量

表5 EGR-03347与QuilA组在感染原头蚴28d后感染蠕虫的数量

注：减虫率％＝(对照组平均数-实验组平均数)/实验组平均数×100％；P value<0.05说明两组之间差异显著在对照组和实验组中。

结果表明：EGR-03347基因与PBS对照组相比，减虫率为72.34％；与对照组QuilA组相比减虫率为87.19％。这就表明EGR-03347基因在抵制寄生虫的感染具有很好的免疫保护作用。

(3)蠕虫节片发育情况

每管取50μL压片在显微镜下观察各虫体的节片数，计数30条虫体的节片数，每个实验组做3个生物学重复，取平均数计算虫体节片发育情况。如表6所示，计数结果显示rEGR-03347组虫体完整率为16.7％，PBS对照组虫体完整率为70％，QuilA对照组虫体完整率为66.67％。这就表明EGR-03347蛋白在抑制细粒棘球绦虫节片生长发育方面具有重要的作用。

表6各实验组蠕虫节片发育情况

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 新疆农垦科学院

<120> 细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Ala Gly Ala Gly Tyr Asn Val Lys Val Leu Ser Ser Ser Asp

1 5 10 15

Asp Arg Leu Lys Gln Ser Lys Gly Arg Val Ser Gly Val Leu Cys Lys

20 25 30

Leu Ala Lys Asn Lys Ser Gly Gly Phe Ala Asp Ser Ala Met Ala Arg

35 40 45

Ile Lys Phe Thr Thr Asp Ile Thr Thr Ala Val Ser Asp Ser Gln Leu

50 55 60

Val Val Glu Ala Val Thr Glu Asp Leu Gln Ile Lys Arg Ser Leu Phe

65 70 75 80

Gln Ser Val Glu Arg Leu Ala Pro Asn Ser Cys Val Leu Ala Ser Asn

85 90 95

Thr Ser Ala Leu Ser Val Asn Glu Ile Ala Glu Val Leu Ser Arg Lys

100 105 110

Glu Ser Phe Gly Gly Leu His Phe Phe Asn Pro Val Arg Val Met Lys

115 120 125

Leu Val Glu Ile Thr Arg Cys Arg His Thr Ser Glu Asp Thr Leu Lys

130 135 140

Thr Leu Val Ala Phe Ala Glu Ser Leu Gly Lys Thr Val Ile His Cys

145 150 155 160

Lys Asp Thr Pro Gly Phe Ile Val Asn Arg Leu Leu Val Pro Tyr Leu

165 170 175

Leu Glu Ala Ile Glu Met Trp Glu Arg Cys Asp Ala Ser Leu Asp Asp

180 185 190

Ile Glu Thr Ala Met Arg Leu Gly Ala Gly His Pro Met Gly Pro Phe

195 200 205

Glu Leu Ala Asp His Val Gly Leu Asp Thr Leu Leu His Ile Leu Val

210 215 220

His Trp Ala Glu Arg His Pro Glu Glu Arg Ala Phe Arg Leu Asn Ala

225 230 235 240

Thr Val Arg Lys Phe Val Ala His Gly Arg Phe Gly Lys Lys Cys Gly

245 250 255

Tyr Gly Phe Phe Lys Tyr Asp Gln Ser Gly Arg Ile Val Lys Glu Lys

260 265 270

Gln

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcagccg gtgctgggta caatgtcaaa gtgttatcct cgagtgatga tcgcctcaaa 60

caatcaaagg gtcgtgtttc cggggtttta tgtaaattag cgaaaaataa atcaggaggt 120

tttgctgatt cagcaatggc caggataaaa tttactactg acattaccac tgctgtttcg 180

gattctcagt tggttgtcga agcagttact gaagatcttc agattaaacg cagtcttttc 240

caatcagtgg aacgcctagc accaaattcc tgtgtgcttg catcgaacac ttctgcctta 300

tcagtcaacg aaatagccga ggtgctttca aggaaggagt ccttcggtgg actgcacttt 360

tttaatcccg taagagtgat gaaattggtg gagattacta ggtgcagaca cacatctgag 420

gacactctga agacgctagt agcattcgca gagtccctgg gtaagacggt gattcattgc 480

aaagacacac caggcttcat agtgaatcgc cttttggtgc cctacctcct cgaggcgata 540

gagatgtggg agcgttgcga cgcctccctt gacgacatcg agacggcaat gcgccttggt 600

gctggccacc caatgggtcc cttcgagttg gctgaccacg tggggttgga caccctcctg 660

cacattctcg tccactgggc agagcggcat cccgaggagc gtgccttccg actcaacgcc 720

actgtgcgca aatttgtcgc ccacggccga ttcggcaaaa agtgcggtta cggatttttc 780

aagtatgacc aaagtgggcg cattgtcaag gaaaaacagt ga 822

Claims

1.一种细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白的DNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.包含权利要求2所述的DNA序列的重组载体。

4.包含权利要求3所述的重组载体的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

5.一种如权利要求1所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白或权利要求2所述的DNA或权利要求3所述的重组载体或权利要求4所述的宿主菌在制备预防细粒棘球绦虫的疫苗中的应用。

6.一种预防细粒棘球绦虫的疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白，所述细粒棘球绦虫3-羟基酰基-CoA脱氢酶蛋白为疫苗的免疫原。

7.如权利要求6所述的预防细粒棘球绦虫的疫苗，其特征在于，所述免疫原还包括佐剂Quil A或弗氏佐剂。