CN111518222B - 牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗 - Google Patents

牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗，涉及分子生物学技术领域。该牛轮状病毒融合蛋白含有VP6片段，VP6片段含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，且如下（a）~（c）中至少一个loop区替换为来源于牛冠状病毒的抗原表位和/或来源于大肠杆菌的抗原表位：（a）第168‑177位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.1；（b）第194‑205位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.2；（c）第296‑316位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.3。该牛轮状病毒融合蛋白中含有多种抗原表位，免疫宿主后能使宿主产生多种抗体。

Description

牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗。
背景技术
犊牛腹泻是养牛场最常见的临床疾病之一，常见于出生7-15天的犊牛，有很高的发病率和死亡率，不仅给养牛场造成重大经济损失，而且影响犊牛的生长发育和成年后的泌乳性能。在病原因素中，牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV），牛冠状病毒和产毒素型大肠杆菌是引起犊牛腹泻最主要的三大病原，其中BRV引起的犊牛腹泻发生率最高，约占犊牛腹泻病例的46%。
牛轮状病毒感染后，临床上以萎顿、厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征。牛冠状病毒是引起新生犊牛腹泻的另一主要病原体之一，临床上以出血性腹泻为主要特征，病牛精神沉郁，吃奶减少或停止，严重的可出现发热、脱水和血液浓缩等特征，少数可发生死亡。牛大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌所引起的传染病，主要侵害犊牛。当新生牛犊抵抗力不足或发生消化障碍时，便可趁机引起发病。犊牛发病潜伏期很短，病牛常以下痢、败血症等形式出现，体温可升至40℃，病程延长则出现肺炎、关节炎等症状。致病性大肠杆菌引发的犊牛腹泻一年四季均可发生，多发于冬春舍饲时期。牛发病时呈地方流行性或散发性，给全世界的养殖行业带来极大的危害。
犊牛腹泻中存在着交叉感染的问题，当轮状病毒感染后，更利于其他病原体如致病性大肠杆菌的附着和混合感染，导致犊牛发生的腹泻更严重，死亡率更高，当有冠状病毒混合感染时，病情更加严重，发病犊牛的死亡率可高达50%-100%。由于腹泻的交叉感染和反复发作原因的存在，病原体极难净化，疫苗免疫成了防治犊牛腹泻的重要手段。目前市场上没有商业化的成熟的可防控多种病原体引起的犊牛腹泻的疫苗存在。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种牛轮状病毒融合蛋白，该牛轮状病毒融合蛋白中含有多种抗原表位，免疫宿主后能使宿主产生多种抗体。
本发明的第二目的在于提供由上述牛轮状病毒融合蛋白组装得到的病毒样颗粒。
本发明的第三目的在于提供一种犊牛腹泻多联疫苗。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种牛轮状病毒融合蛋白，所述牛轮状病毒融合蛋白含有VP6片段，所述VP6片段含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，且所述如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中如下（a）~（c）中至少一个loop区替换为来源于牛冠状病毒的抗原表位和/或来源于大肠杆菌的抗原表位的片段：
（a）第168-177位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（b）第194-205位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（c）第296-316位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述VP6片段中，（a）~（c）中至少一个loop区替换为如下（d）~（f）中至少一个抗原表位；
（d）氨基酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.11所示的冠状病毒抗原表位；
（e）氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的大肠杆菌K88抗原表位；
（f）氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的大肠杆菌K99抗原表位。
优选地，所述VP6片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13所示。
优选地，所述牛轮状病毒融合蛋白还含有VP2片段、VP4片段和VP7片段中的至少一种；
优选地，所述牛轮状病毒融合蛋白含有所述VP6片段和VP2片段。
根据本发明的一个方面，本发明提供了编码所述牛轮状病毒融合蛋白的核酸。
优选地，编码所述VP6片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.15所示。
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述牛轮状病毒融合蛋白组装得到的病毒样颗粒。
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述病毒样颗粒的制备方法，包括在宿主中表达编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因；
优选地，所述宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或哺乳动物细胞，优选包括酵母；
优选地，所述宿主包括经过选择压力筛选后得到的单克隆；
优选地，先将编码部分所述牛轮状病毒融合蛋白的基因导入宿主，筛选出高表达的单克隆，再导入编码其余部分所述牛轮状病毒融合蛋白的基因；
优选地，所述制备方法包诱导宿主表达所述牛轮状病毒融合蛋白，裂解宿主提取上清，然后采用硫酸铵沉淀法和层析方法纯化，获得病毒样颗粒。
根据本发明的一个方面，本发明提供了表达所述牛轮状病毒融合蛋白，或所述病毒样颗粒的宿主。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种犊牛腹泻多联疫苗，该犊牛腹泻多联疫苗包含所述牛轮状病毒融合蛋白、所述核酸或所述病毒样颗粒；
优选地，所述牛腹泻多联疫苗包括所述病毒样颗粒和佐剂，佐剂优选包括ISA206佐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的牛轮状病毒融合蛋白，通过在将VP6片段的loop区替换为来源于牛冠状病毒的抗原表位和/或来源于大肠杆菌的抗原表位的片段，使牛轮状病毒融合蛋白不仅含有牛轮状病毒抗原，还含有牛冠状病毒抗原和大肠杆菌的抗原中的至少一种，作为免疫原免疫动物后可针对多种病原体使动物产生较强的免疫保护，具有制备多联疫苗的应用价值。
本发明提供的病毒样颗粒通过遗传工程技术将编码牛轮状病毒融合蛋白的基因利用外源表达系统在经过可溶性表达后形成，将牛冠状病毒和/或大肠杆菌的主要的抗原表位展示到嵌合病毒样颗粒的表面，对牛轮状病毒、牛冠状病毒和/或致病性大肠杆菌均具有很好的免疫原性，以该病毒样颗粒作为免疫原免疫动物后可针对该多种病原体使动物产生较强的免疫保护。
本发明提供的犊牛腹泻多联疫苗将来源于多种病原的能够诱导机体产生特异性抗体的抗原嵌合起来制备的多联疫苗，扩大了疾病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。且该犊牛腹泻多联疫苗为利用基因工程技术制备多联亚单位疫苗，具有不存在散毒、毒力返强等特点，可用于怀孕的母牛和新出生的犊牛，能够快速服务于市场，有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备得到的VP6-S-K88/K99融合蛋白SDS-PAGE检测结果；
图2为本发明实施例1制备得到的VP6-S-K88/K99融合蛋白Western blot检测结果；
图3为由VP6-S-K88/K99融合蛋白组装成的病毒样颗粒的电镜图；
图4为实施例2制备得到的VP2-VP6融合蛋白；
图5为由VP2-N93-VP6-S-K88/K99融合蛋白组装成的病毒样颗粒的电镜图；
图6为实施例4制备得到的VP6-S-K88/K99-test1和VP6-S-K88/K99-test2融合蛋白SDS-PAGE检测结果；
图7为实施例4制备得到的X33-VP6-S-K88/K99-test1工程菌菌株和X33-VP6-S-K88/K99-test2工程菌菌株裂解SDS-PAGE检测结果；
图8为实施例5中由VP6-S-K88/K99-test2融合蛋白组装成的病毒样颗粒的电镜图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种牛轮状病毒融合蛋白，所述牛轮状病毒融合蛋白含有VP6片段，所述VP6片段含有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，且所述如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列中如下（a）~（c）中至少一个loop区替换为来源于牛冠状病毒的抗原表位和/或来源于大肠杆菌的抗原表位的片段；
（a）第168-177位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（b）第194-205位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
（c）第296-316位氨基酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子的外层衣壳由糖蛋白VP7和VP4双层组成，中层由VP6组成，其中VP6蛋白上存在主要的抗原表位区域，并能引发中和抗体活性。VP6蛋白决定了病毒的基因型，并且在不同种属中高度保守，是轮状病毒疫苗研发的主要抗原。牛冠状病毒属于冠状病毒科冠状病毒属的直径约80-120nm的球状粒子病毒颗粒，病毒粒子外包裹着脂肪膜，膜表面的三种糖蛋白中的刺突糖代白（Spike protein，S）是主要的受体结合位点和主要抗原位点。病原性大肠杆菌由菌体（O）抗原173种，表面（K）抗原80种，鞭毛（H）抗原56种，构成许多血清型，其中最常见的血清型为K88和K99。本发明提供的牛轮状病毒融合蛋白含有牛轮状病毒抗原、牛冠状病毒抗原和/或大肠杆菌的抗原，作为免疫原免疫动物后对多种病原体使动物产生较强的免疫保护，具有制备多联疫苗的应用价值。
需要说明的是：来源于同种病原的抗原表位可以包括多种抗原表位，具体的实例包括但不限于同一病原体中位于不同蛋白或结构域的，具有不同序列的抗原表位；或相同病原体，但是不同亚型的具有同源性的同一抗原表位；或相同病原体，但是不同亚型中的位于不同蛋白或结构域的，具有不同序列的抗原表位等。例如，来源于大肠杆菌的抗原表位包括来源于致病性大肠杆菌主要B细胞表位的K88抗原表位和K99抗原表位。（a）~（c）中至少一个loop区被其他抗原表位替换，具体的实例包括但不限于（a）、（b）或（c）其中一个被替换；（a）和（b）被替换；（c）和（b）被替换；（a）和（c）被替换；或（a）、（b）和（c）均被替换等。不同loop区替换的抗原表位可以相同也可以不同，具体的实例包括但不限于（a）、（b）和（c）均被替为来源于牛冠状病毒的抗原表位或均被替换为来源于大肠杆菌的抗原表位；或（a）和（b）被来源于大肠杆菌的抗原表位替换，（c）被来源于牛冠状病毒的抗原表位替换。
在一些优选的实施方式中，牛轮状病毒融合蛋白中的VP6片段中，（a）~（c）中至少一个loop区替换为如下（d）~（f）中至少一个抗原表位：
（d）氨基酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.11所示的冠状病毒抗原表位；
（e）氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的大肠杆菌K88抗原表位；
（f）氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的大肠杆菌K99抗原表位。
在一些可选的的实施方式中所述VP6片段中，将VP6片段的第168-177位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的大肠杆菌K88抗原表位；将VP6片段的第194-205位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的大肠杆菌K99抗原表位；将VP6片段的第296-316位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的冠状病毒抗原表位。替换后得到的VP6片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一些可选的实施方式中，将VP6片段的第168-177位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的大肠杆菌K99抗原表位；将VP6片段的第194-205位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的大肠杆菌K88抗原表位；将VP6片段的第296-316位氨基酸残基替换为氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的冠状病毒抗原表位。替换后得到的VP6片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在一些优选的实施方式中，所述牛轮状病毒融合蛋白还可以含有VP2片段、VP4片段和VP7片段中的至少一种，所述牛轮状病毒融合蛋白优选由VP6片段和VP2片段组成。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述牛轮状病毒融合蛋白的。其中“核酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
本发明提供的牛轮状病毒融合蛋白可以由嵌合基因表达得到，也可以将编码牛轮状病毒融合蛋白不同区域的多条核酸导入宿主细胞后共表达得到，因此本发明提供的编码上述牛轮状病毒融合蛋白的核酸可以为含有嵌合基因的独立的一个核酸分子，也可以为含有独立的编码所述牛轮状病毒融合蛋白各部分基因的成套的多个核酸分子，例如分别编码所述VP6片段，和编码所述VP2片段、VP4片段和VP7片段中至少一种的核酸组成的成套的核酸。可以理解的是所述核酸还可以含有编码启动子、增强子、标签和载体等其他功能单元的片段，本发明对此不作限制。优选地，编码所述牛轮状病毒融合蛋白的核酸经密码子优化，所述核酸中编码所述VP6蛋白片段部分的核酸序列优选如SEQ ID NO.9所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的VP6片段；或优选如SEQ ID NO.9所示15所述，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的VP6片段。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了由所述牛轮状病毒融合蛋白组装得到的病毒样颗粒。VLP由病毒一种或几种结构蛋白自主装配形成，在大小、形态和组成上模拟天然病毒粒子，不含病毒基因组、不具感染性，在免疫原性和抗原稳定性和生产制造上都具有优势。VLP结合了全病毒和亚单位抗原的最佳优点。通过遗传工程技术将编码牛轮状病毒融合蛋白的基因利用外源表达系统在经过可溶性表达后可形成嵌合病毒样颗粒，将牛冠状病毒和/或大肠杆菌的主要的抗原表位展示到嵌合病毒样颗粒的表面，对牛轮状病毒、牛冠状病毒和/或致病性大肠杆菌均具有很好的免疫原性，以该VLP作为免疫原免疫动物后可针对该多种病原体使动物产生较强的免疫保护。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述病毒样颗粒的制备方法，该方法包括在宿主中表达编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因。编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因可以位于同一核酸片段，也可以位于不同的核酸片段，位于不同核酸片段的基因在宿主共表达，以使宿主表达病毒样颗粒。编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因优选先经过稀有密码子优化。
所述宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物或哺乳动物细胞，优选包括酵母，酵母表达系统可进行翻译后修饰，如糖基化或磷酸化，同时提高了目的蛋白的表达量，降低了生产成本。同时，能够表达编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因的宿主优选经过选择压力的筛选后得到的单克隆，以提高宿主表达蛋白的量，优选以高浓度抗生素作为筛选压力。当编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因位于不同的核酸片段时，可以先将编码部分所述牛轮状病毒融合蛋白的基因导入宿主中，然后筛选出高表达的单克隆后，再将编码其余部分牛轮状病毒融合蛋白的基因导入单克隆，以进一步提高目的蛋白的表达量。
在一些可选的实施方式中，以酵母作为宿主细胞为例，所述制备方法包括基因制备、重组载体构建、细胞转染、高效表达菌株的筛选和重组蛋白获取的步骤，具体的包括：先将获得的载体线性化后电转酵母感受态细胞，对融合蛋白进行表达，纯化获得融合蛋白，然后选择合适的缓冲液对纯化后的融合蛋白进行类病毒颗粒组装，并利用电镜鉴定组装效果。载体优选使用pPIC3.5K载体。线性化载体电转至酵母感受态细胞后，优选直接涂在高抗生素浓度平板上，利用较高的选择压力选择高表达单克隆菌株。电转优选采用多次电转，即在第一次高表达菌株的基础上，再次整合进含有其他部分目的蛋白基因的表达载体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了表达所述牛轮状病毒融合蛋白，或表达所述病毒样颗粒的宿主。本发明提供的宿主是将编码所述牛轮状病毒融合蛋白的核酸导入宿主后得到的重组细胞或重组微生物，在一些优选的实施方式中，所述核酸是通过载体导入宿主的，所述宿主优选包括酵母，所述载体优选使用pPIC3.5K。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种犊牛腹泻多联疫苗，所述疫苗包含所述牛轮状病毒融合蛋白，编码所述牛轮状病毒融合蛋白的核酸，或所述病毒样颗粒。将牛轮状病毒，以及牛冠状病毒和/或大肠杆菌多种病原诱导机体产生特异性抗体的抗原嵌合起来制备的多联疫苗，扩大了疾病防控范围，节省了劳力，提高了工作效率。且该犊牛腹泻多联疫苗为利用基因工程技术制备多联亚单位疫苗，具有不存在散毒、毒力返强等特点，可用于怀孕的母牛和新出生的犊牛，能够快速服务于市场，有广阔的应用前景。
在一些优选的实施方式中，所述牛腹泻多联疫苗由牛轮状病毒融合蛋白组装得到的病毒样颗粒和佐剂。以病毒样颗粒作为免疫原，抗原高度集中，且嵌合抗原表位具有一定的空间结构，具有较好的免疫效果。佐剂可选择本领域常规的佐剂，本发明对此不作限制，优选使用ISA206佐剂。
下面结合优选实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。
实施例1
通过毕赤酵母表达系统表达融合蛋白：
通过结构生物学的手段，对牛轮状病毒VP6蛋白结构进行分析，将牛冠状病毒和致病性大肠杆菌的抗原表位嵌合到牛轮状病毒VP6蛋白骨架上，序列命名为VP6-S-K88/K99，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；
融合蛋白VP6-S-K88/K99进行毕赤酵母表达系统密码子优化，核苷酸序列如SEQID NO.9所示。
并通过基因工程的手段，合成编码VP6-S-K88/K99融合蛋白基因，将目的基因与pPIC3.5k质粒分别通过Bam HI和AgeI双酶切（酶切体系：1μg质粒，1μL Bam HI，1μL Age I，5μL CutSmart，ddH2O补齐至50μL；37℃孵育1h），通过1%琼脂糖凝胶回收目的条带（AxyprepDNA凝胶回收试剂盒 AP-GX-250），分别测浓度之后，通过T4 DNA连接酶（NEB，M0202）把载体与基因相连，连接体系与E.Coli DH5α感受态细胞混合后在冰上孵育30分钟后于42℃放置90s，之后立即放置冰中2min，直接涂于0.1mg/mL氨苄青霉素平板，37℃培养16h，挑取单克隆至2mL LB培养基中培养16h，通过Axgen试剂盒（AP-MN-P-50）抽提质粒，质粒经Pml I酶切鉴定（酶切体系：500ng质粒，0.5μL Pme I，2μL CutSmart，ddH2O补齐至20μL；37℃孵育0.5h）和测序（ABI3700），筛选出阳性重组菌株DH5α- pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99，进行扩大培养，通过试剂盒（NucleoBond Xtra Midi Plus, 740421.50）大量提取质粒，命名为pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99。
将pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99质粒利用Pme I限制性内切酶（NEB：R0560L）进行线性化酶切后（酶切体系： 20μg质粒，10μL Pme I，25μL CutSmart，ddH2O补齐至250μL；37℃孵育2h），通过乙醇沉淀回收线性表达质粒（具体步骤：往酶切体系中加入25μL 3mol/L pH5.2乙酸钠，充分混匀后加入550μL无水乙醇，充分混匀后置于-20℃，1h，12000g，4℃离心10分钟，小心移尽上清，加入750μL 4℃预冷的70%乙醇，12000g，4℃离心10分钟，小心移尽上清并开盖使液体挥发至干，加入20μL ddH2O溶解DNA），对其纯度和浓度进行测定。
制备毕赤酵母X33菌株电转化感受态细胞（制备步骤：1.取X33菌株接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；2.取100~500μL的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；3.将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4.按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；），并将5μg线性化的pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99载体与95μL该感受态细胞混合放置0.1mm电击杯中后电转（电转条件：1200V 5.0ms），电转后的菌液直接涂1mg/mL G418抗生素平板进行筛选。
将平板上长出的单克隆菌株摇菌培养扩增表达，经发酵后的菌体进行破碎和SDS-PAGE检测和Western blot检测，检测结果呈阳性的菌株即为可表达VP6-S-K88/K99融合蛋白的毕赤酵母X33-VP6-S-K88/K99工程菌。SDS-PAGE检测结果如图1所示，其中1、2、3均为实验组；Western blot检测结果如图2所示，其中，C为对照组（X33原始菌株），1为实验组。
取所述X33-VP6-S-K88/K99工程菌于BMGY培养基中，30℃培养24h进行活化；取活化的培养菌液按1：400的比例接种于BMGY培养基中进行发酵，30℃培养到OD=1时更换到等体积BMMY培养基中诱导表达，每24h补加一次甲醇使甲醇终浓度为0.5%，诱导表达72h后3000 g离心10min收集菌体。
实施例2
通过毕赤酵母表达系统表达多层嵌合VLP颗粒：
通过基因工程的手段，合成编码VP2-N93蛋白基因，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。将目的基因与pPICZ A载体分别通过Bst BI和Age I双酶切（酶切体系： 1μg质粒，1μLBst BI，1μL Age I，5μL CutSmart，ddH2O补齐至50μL；37℃孵育1h），通过1%琼脂糖凝胶回收目的条带（Axyprep DNA凝胶回收试剂盒 AP-GX-250），分别测浓度之后，通过T4 DNA连接酶（NEB，M0202）把载体与基因相连，连接体系与E.Coli DH5α感受态细胞混合后在冰上孵育30分钟后于42℃放置90s，之后立即放置冰中2min，直接涂于0.1mg/mL氨苄青霉素平板，37℃培养16h，挑取单克隆至2mL LB培养基中培养16h，通过Axgen试剂盒（AP-MN-P-50）抽提质粒，质粒经Sal I酶切鉴定（酶切体系：500ng质粒，0.5μL Sal I，2μL CutSmart，ddH2O补齐至20μL；37℃孵育0.5h）和测序（ABI3700），筛选出阳性重组菌株DH5α- pPICZ A-VP2-N93，进行扩大培养，通过试剂盒（NucleoBond Xtra Midi Plus, 740421.50）大量提取质粒，命名为pPICZ A-VP2-N93。
将pPICZ A-VP2-N93质粒利用Pme I限制性内切酶（NEB：R0560）进行线性化酶切后（酶切体系： 20μg质粒，10μL Pme I，25μL CutSmart，ddH2O补齐至250μL；37℃孵育2h），通过乙醇沉淀回收线性表达质粒（具体步骤：往酶切体系中加入25μL 3mol/L pH5.2乙酸钠，充分混匀后加入550μL无水乙醇，充分混匀后置于-20℃1h，12000g 4℃离心10分钟，小心移尽上清，加入750μL 4℃预冷的70%乙醇，12000g 4℃离心10分钟，小心移尽上清并开盖使液体挥发至干，加入20μL ddH2O溶解DNA），对其纯度和浓度进行测定。
制备毕赤酵母X33-VP6-S-K88/K99菌株电转化感受态细胞（制备步骤：1.取X33-VP6-S-K88/K99菌株接种至含有5ml YPD培养基的50mL三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；2.取100~500μL的培养物接种至含有500mL新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；3.将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4.按步骤3离心，用250mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.按步骤3离心，用20mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3离心，用1mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL；），并将5μg线性化的pPICZ A-VP2-N93载体与95μL该感受态细胞混合放置0.1mm电击杯中后电转（电转条件：1200V 5.0ms），电转后的菌液直接涂高浓度Zeocin抗生素（2mg/ml）平板进行筛选。
将平板上长出的单克隆菌株摇菌培养扩增表达，经发酵后的菌体进行破碎和SDS-PAGE检测检测，检测结果呈阳性的菌株即为可共表达VP6-S-K88/K99融合蛋白与VP2-N93蛋白的毕赤酵母X33-VP2-N93-VP6-S-K88/K99工程菌。SDS-PAGE检测结果如图4所示，其中，1为1μg的实验组，2为5μg的实验组。
取所述工程菌于BMGY培养基中，30℃培养24h进行活化；取活化的培养菌液按1：400的比例接种于BMGY培养基中进行发酵，30℃培养到OD=1时更换到等体积BMMY培养基中诱导表达，每24h补加一次甲醇使甲醇终浓度为0.5%，诱导表达72h后3000 g离心10min收集菌体。
实施例3
VP6-S-K88/K99融合蛋白和VP2-N93-VP6-S-K88/K99融合蛋白的纯化和VLP的组装：
向X33-VP6-S-K88/K99工程菌与X33-VP2-N93-VP6-S-K88/K99工程菌的菌体中分别按照质量体积比为1：10的比例加入buffer A（20mM HEPES，300mM NaCl，pH 7.3），利用高压破碎法（1800bar）将菌体破碎；
将所述的破碎后的细胞分别于4℃，12000rpm离心60min，离心上清先用30%硫酸铵在4℃条件下沉淀1h后，沉淀再次用buffer A重悬进行粗纯。
将上述的纯化后的目的蛋白分别利用凝胶过滤层析进行二次纯化，收集目的蛋白。将VP6-S-K88/K99目的蛋白换至buffer B（50mM 柠檬酸钠，300mM NaCl，pH 4.82）中后4℃放置进行组装，用电镜检测其颗粒大小和均一度，结果如图3所示。VP2-N93-VP6-S-K88/K99目的蛋白用电镜检测其颗粒大小和均一度，结果如图5所示。
实施例4
通过毕赤酵母表达系统表达融合蛋白：
通过结构生物学的手段，对牛轮状病毒VP6蛋白结构进行分析，将牛冠状病毒和致病性大肠杆菌的抗原表位嵌合到牛轮状病毒VP6蛋白骨架上，设计了2条序列，分别命名为VP6-S-K88/K99-test1、VP6-S-K88/K99-test2，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13所示；
融合蛋白VP6-S-K88/K99-test1、VP6-S-K88/K99-test2分别进行毕赤酵母表达系统密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。
并通过基因工程的手段，合成编码VP6-S-K88/K99-test1和VP6-S-K88/K99-test2融合蛋白基因，将目的基因与pPIC3.5k质粒分别通过Bam HI和Age I双酶切（酶切体系： 1μg质粒，1μL Bam HI，1μL Age I，5μL CutSmart，ddH2O补齐至50μL；37℃孵育1h），通过1%琼脂糖凝胶回收目的条带（Axyprep DNA凝胶回收试剂盒 AP-GX-250），分别测浓度之后，通过T4 DNA连接酶（NEB，M0202）把载体与基因相连，连接体系与E.Coli DH5α感受态细胞混合后在冰上孵育30分钟后于42℃放置90s，之后立即放置冰中2 min，直接涂于0.1 mg/mL氨苄青霉素平板，37℃培养16h，挑取单克隆至2mL LB培养基中培养16h，通过Axgen试剂盒（AP-MN-P-50）抽提质粒，质粒经Pml I酶切鉴定（酶切体系：500ng质粒，0.5μL Pme I，2μLCutSmart，ddH2O补齐至20μL；37℃孵育0.5h）和测序（ABI3700），筛选出阳性重组菌株DH5α-pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test1、DH5α- pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test2，进行扩大培养，通过试剂盒（NucleoBond Xtra Midi Plus, 740421.50）大量提取质粒，分别命名为pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test1、pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test2。
将pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test1、pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test2质粒分别利用Pme I限制性内切酶（NEB：R0560）进行线性化酶切后（酶切体系： 20μg质粒，10μL Pme I，25μL CutSmart，ddH2O补齐至250μL；37℃孵育2h），乙醇沉淀回收线性表达质粒（具体步骤：往酶切体系中加入25μL 3mol/L pH5.2乙酸钠，充分混匀后加入550μL无水乙醇，充分混匀后置于-20℃，1h，12000g，4℃离心10分钟，小心移尽上清，加入750μL，4℃预冷的70%乙醇，12000g，4℃离心10分钟，小心移尽上清并开盖使液体挥发至干，加入20μL ddH2O溶解DNA），对其纯度和浓度进行测定。
制备毕赤酵母X33菌株电转化感受态细胞（制备步骤：1.取X33菌株接种至含有5mLYPD培养基的50mL三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；2.取100~500μL的培养物接种至含有500mL新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；3.将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4.按步骤3离心，用250mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；5.按步骤3离心，用20mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3离心，用1mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL；），并将5μg线性化的pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test1、pPIC3.5K-VP6-S-K88/K99-test2载体分别与95μL该感受态细胞混合放置0.1mm电击杯中后电转（电转条件：1200V 5.0ms），电转后的菌液直接涂1mg/mL G418抗生素平板进行筛选。
将平板上长出的单克隆菌株摇菌培养扩增表达，经发酵后的菌体进行破碎和SDS-PAGE检测和Western blot检测，检测结果呈阳性的菌株分别为可表达VP6-S-K88/K99-test1融合蛋白的毕赤酵母X33-VP6-S-K88/K99-test1工程菌和可表达VP6-S-K88/K99-test2融合蛋白的毕赤酵母X33-VP6-S-K88/K99-test2工程菌。SDS-PAGE检测结果如图6所示，其中1-5为VP6-S-K88/K99-test1的实验组，6-11为VP6-S-K88/K99-test2的实验组，12为对照组（X33原始菌株）。
取所述X33-VP6-S-K88/K99-test1与X33-VP6-S-K88/K99-test2工程菌分别于BMGY培养基中，30℃培养24h进行活化；取活化的培养菌液按1：400的比例接种于BMGY培养基中进行发酵，30℃培养到OD=1时更换到等体积BMMY培养基中诱导表达，每24h补加一次甲醇使甲醇终浓度为0.5%，诱导表达72h后3000 g离心10min收集菌体。
实施例5
VP6-S-K88/K99-test1融合蛋白和VP6-S-K88/K99-test2融合蛋白的纯化和VLP的组装：
向X33-VP6-S-K88/K99-test1工程菌、X33-VP6-S-K88/K99-test2工程菌的菌体和X33-X（对照组）工程菌株中分别按照质量体积比为1：10的比例加入buffer A（20mM HEPES，300mM NaCl，pH 7.3），利用高压破碎法（1800bar）将菌体破碎；
将所述的破碎后的细胞分别于4℃，12000rpm离心60min，取离心上清和离心沉淀进行SDS-PAGE鉴定，SDS-PAGE检测结果如图7所示，其中1为对照组(X33-X)上清，2为对照组(X33-X)沉淀，3为VP6-S-K88/K99-test1的实验组上清，4为VP6-S-K88/K99-test1的实验组沉淀，5为VP6-S-K88/K99-test2的实验组上清，6为VP6-S-K88/K99-test2的实验组沉淀。
其中，VP6-S-K88/K99-test1大部分以不可溶形式存在，不符合预期，未进行纯化与电镜观察实验。
其中，VP6-S-K88/K99-test2的离心上清先用30%硫酸铵在4℃条件下沉淀1h后，沉淀再次用buffer A重悬进行粗纯。
将上述的纯化后的目的蛋白分别利用凝胶过滤层析进行二次纯化，收集目的蛋白。将VP6-S-K88/K99-test2目的蛋白换至buffer B（50mM 柠檬酸钠，300mM NaCl，pH4.82）中后4℃放置进行组装，用电镜检测其颗粒大小和均一度，结果如图8所示。
效果例1
制备抗犊牛腹泻联苗及抗体评估：
疫苗制备：
将如上所述VP6-S-K88/K99 VLP使用PBS溶液稀释成不同的浓度，将稀释后的融合蛋白溶液与SEPPIC ISA206佐剂按抗原组分与佐剂1:1比例混合在一起，终浓度100μg/mL。按照《中国兽药典》（现行版）附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
小鼠免疫：
将6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组，每组10只，共2组，其中一组不进行疫苗注射（对照组），另一组为实验组，注射制备的VLP疫苗，剂量为0.1mL/只（抗原蛋白含量10μg）。免疫前两天颌下静脉采血100μL，作为免疫前对照。取得的血置于1.5mL EP管中，于37℃水浴放置1h，4℃放置2h，3000rpm，4℃离心3min，分离上清，分装后放于-20℃保存。首免后21天，采血100μL，分离血清，方法同上；然后进行二次免疫，免疫剂量0.1mL/只（抗原蛋白含量10μg）。二免后14天，采血100μL，分离血清，方法同上。
牛轮状病毒抗体检测：
（1）牛轮状病毒检测方法建立
将分离到的牛轮状病毒用50mM pH 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μL/孔，4℃过夜。次日弃去包被液，用PBST洗涤3次，200μL/孔。加入2%牛血清白蛋白（BSA）作为封闭液，100μL/孔，37℃1h。弃去封闭液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白（BSA）分别按比例稀释后加入酶标板中，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入用1%牛血清白蛋白（BSA）按1：2500稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，100μL/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤5次后加入TMB显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min，然后加入2mol/L H2SO4终止反应，100μL/孔。在酶标仪上读OD450nm值。
（2）牛轮状病毒抗体检测
小鼠二免后14日，所有免疫组小鼠抗体水平均转阳（S/N值>2.1），说明制备疫苗能够诱导小鼠产生抗牛轮状病毒特异性抗体，具体检测结果如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
大肠杆菌K88、K99小鼠攻毒实验：
（1）攻毒用菌液制备
试验用攻毒菌株K88、K99购自中国兽医药品监察所，攻毒前，取复壮的大肠杆菌标准株，分别接种至50mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃，200rmp条件下培养16~20小时，菌液浓度为1×108 CFU/L。用无菌的LB液体培养基将菌液稀释1000倍，2种菌液体积等比例混合，4℃保存备用。
（2）攻毒
上述免疫小鼠，二免后15天，对照组中5只小鼠，腹腔注射0.2mL无菌生理盐水；另外5只小鼠腹腔注射0.2mL上述制备的攻毒用菌液。免疫实验组10只小鼠，腹腔注射0.2mL攻毒用菌液。攻毒后，每3小时观察一次，记录小鼠腹泻和死亡等情况。
（3）结果
攻毒后3小时，对照组中攻毒小鼠开始死亡，攻毒后45小时，对照组中攻毒小鼠5只全部死亡。注射生理盐水小鼠，5只在注射后48小时，全部存活。免疫组小鼠，攻毒后48小时，9只存活，均健康，1只在攻毒后24小时腹泻后，死亡。试验结果显示，制备疫苗对致病性大肠杆菌的免疫组保护率为90%。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物(上海)有限公司
<120> 牛轮状病毒融合蛋白和犊牛腹泻多联疫苗
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 牛轮状病毒（Rotavirus）
<400> 1
Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu Met
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 牛轮状病毒（Rotavirus）
<400> 2
Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 牛轮状病毒（Rotavirus）
<400> 3
Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala
1 5 10 15
Gln Pro Phe Glu His
20
<210> 4
<211> 397
<212> PRT
<213> 牛轮状病毒（Rotavirus）
<400> 4
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Leu Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr
65 70 75 80
Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Gly Ile Asn
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Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
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Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile
275 280 285
Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Ala Ala Leu Phe Pro Asn Ala Gln Pro Phe Glu His His Ala Thr Ile
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys
385 390 395
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 牛冠状病毒（Coronaviridae）
<400> 5
Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr Val
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 6
Asn Pro Asp Gly Glu Thr Asn Lys Lys Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 7
Lys Asp Asp Arg Ala Pro Ser Asn Gly Gly
1 5 10
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<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
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Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
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Gln Phe Asn Gln Met Leu Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr
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Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr
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Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys
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Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Gly Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
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Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
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Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Asn Pro Asp Gly Glu Thr Asn Lys Lys
165 170 175
Gly Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Lys Asp Asp Arg Ala Pro Ser Asn Gly Gly Gln Gln Phe Glu His
195 200 205
Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu
210 215 220
Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp
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Gly Ala Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn
245 250 255
Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln
260 265 270
Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu
275 280 285
Ser Phe Gln Leu Met Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Phe Glu Pro
290 295 300
Phe Thr Val His Ala Thr Ile Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala
305 310 315 320
Val Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn
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Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe
340 345 350
Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser
355 360 365
Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser
370 375 380
Met Leu Val Lys
385
<210> 9
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggatgttt tatactcttt gtcaaaaact ttgaaagatg ctagagataa gattgtcgag 60
ggcacactgt attccaacgt ttcagacctt attcaacagt tcaaccaaat gttaatcacg 120
atgaacggca acgagtttca aaccggcggt atcggtaatc tacctattag gaactggaac 180
tttgatttcg gtttgcttgg cacaacgttg ttgaatctgg atgccaatta tgtggaaact 240
gctcgtaata cgatagatta ttttgttgat tttgtggata acgtatgcat ggatgaaatg 300
gtcagggagt cacagaggaa cggtattgct ccacaatctg actctcttcg taaacttagt 360
ggcataaagt tcaaaggaat caacttcgat aattcatccg aatatattga gaactggaac 420
ctgcagaata gaaggcaaag gacaggtttt acgtttcaca agccaaacat ttttccctac 480
tccgcttcat ttaccctgaa taatccagac ggagaaacga acaagaaggg tggtacaatg 540
tggctaaacg ccggttcaga gattcaagtc gcaggcttta aggacgacag agccccctcc 600
aacggcggac aacagttcga acacatagtt caactacgta gagtgcttac gactgctacg 660
attaccctgc tgcccgacgc tgaaaggttc tctttccctc gtgtcataaa cagtgcagat 720
ggtgctacca cgtggtactt taaccccgtt atactgcgtc ccaacaatgt cgaggtcgag 780
ttcctactaa acggtcagat cattaatacg taccaagcca ggtttggcac tataatagca 840
cgtaatttcg atactattag actgtctttt cagctaatgg gtggctccac taccggctac 900
cgttttacta attttgagcc tttcacagtc ggcggaggct cacatgcaac catcggtcta 960
accctaagga tcgaatctgc agtctgcgaa tcagtgctag ctgatgcttc agagactatg 1020
ctagccaacg taaccagtgt acgtcaggaa tatgcaattc ccgttggccc agtgtttcca 1080
cctggtatga actggactga cctgatcact aactattctc ctagtaggga ggataactta 1140
caaagagtct tcaccgtagc cagtattcgt agtatgttgg ttaaataa 1188
<210> 10
<211> 788
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Pro Lys Glu Ser Ile Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Glu Asp Ile Arg Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Thr Lys Leu Phe Arg
20 25 30
Ile Phe Glu Pro Arg Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala Asn Gly Glu Lys
35 40 45
Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys Asp Thr Leu Pro
50 55 60
Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn Leu Tyr Asp Gln
65 70 75 80
Val Leu Thr Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Met Ala Val
85 90 95
Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val Asp Ser Glu Thr
100 105 110
Ala Ser Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu Thr Glu Gly Ala
115 120 125
Val Arg Arg Phe Ile Ala Glu Met Arg Gln Arg Val Gln Ala Asp Arg
130 135 140
Asn Val Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile Asp Tyr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Glu Tyr Phe Leu Gln His Gln Leu Val Glu Pro Leu Asn Asn Asp
165 170 175
Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn Asp Val Asn Tyr
180 185 190
Ile Leu Asn Met Asp Arg Asn Leu Pro Ser Thr Ala Arg Tyr Ile Arg
195 200 205
Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp Asn Phe Glu Ser
210 215 220
Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu Ala Arg Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Asp Leu Lys Glu Leu Val Ser Thr Glu Ala Gln Ile Gln Lys
245 250 255
Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu Thr Ile Gln Ser Glu Thr
260 265 270
Gln Phe Leu Thr Gly Ile Asn Ser Gln Ala Ala Asn Asp Cys Phe Lys
275 280 285
Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg Thr Met Ser Leu Asp Phe
290 295 300
Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser Gly Met Trp Leu Leu Thr
305 310 315 320
Val Val Pro Asn Asp Met Phe Ile Arg Glu Ser Leu Val Ala Cys Gln
325 330 335
Leu Ala Ile Val Asn Thr Ile Ile Tyr Pro Ala Phe Gly Met Gln Arg
340 345 350
Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr Pro Phe Gln Ile Ala Glu
355 360 365
Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn Trp Leu His Phe Val Asn
370 375 380
His Asn Gln Phe Arg Gln Val Val Ile Asp Gly Val Leu Asn Gln Val
385 390 395 400
Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly His Val Ile Asn Gln Leu Met Glu
405 410 415
Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe Pro Thr Met Pro Val Asp
420 425 430
Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu Leu Leu Ser Asn Arg Leu
435 440 445
Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Asn Tyr Glu Thr
450 455 460
Leu Met Ala Cys Val Thr Met Asn Met Gln His Val Gln Thr Leu Thr
465 470 475 480
Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Cys Met Leu Ile
485 490 495
Gly Asn Ala Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln Thr Leu Phe His Tyr Tyr
500 505 510
Asn Val Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr Asn Glu Arg Ile Asn Asp
515 520 525
Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg Leu Asn Leu Tyr Gln Lys
530 535 540
Lys Met Lys Ala Ile Val Glu Asp Phe Leu Lys Arg Leu His Ile Phe
545 550 555 560
Asp Val Ala Arg Val Pro Asp Asp Gln Met Tyr Arg Leu Arg Asp Arg
565 570 575
Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Val Arg Arg Leu Asp Ile Phe Asn Leu
580 585 590
Ile Leu Met Asn Met Asp Gln Ile Glu Arg Ala Ser Asp Lys Ile Ala
595 600 605
Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met Gln Leu Glu Arg Asp Glu
610 615 620
Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn Leu Asp Gly Phe Gln Gln
625 630 635 640
Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly Asp Tyr Ala Gln Ile Thr
645 650 655
Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala Leu Val Gly Ala Leu Pro
660 665 670
Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu Ile Ala Lys Leu Asp Ala
675 680 685
Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg Lys Val Asp Thr Leu Arg
690 695 700
Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser Asn Asp Phe Tyr Leu Val
705 710 715 720
Ala Asn Tyr Asp Trp Val Pro Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Lys Gln
725 730 735
Val Pro Gln Gln Phe Asp Phe Arg Asn Ser Met His Met Leu Ala Ser
740 745 750
Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala
755 760 765
Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala Phe Asp Asn Met Arg Ile
770 775 780
Met Asn Glu Leu
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<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 牛冠状病毒（Coronaviridae）
<400> 11
Gly Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr
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Val Gly Gly Gly Ser
20
<210> 12
<211> 395
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Leu Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Ile Arg Asn Trp Asn Phe Asp Phe Gly
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65 70 75 80
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Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln
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Ser Asp Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Gly Ile Asn
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Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Gly Gly Ser Thr Thr Gly Tyr Arg Phe
165 170 175
Thr Asn Phe Glu Pro Phe Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Thr Met Trp
180 185 190
Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asn Pro Asp Gly
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Glu Thr Asn Lys Lys Gly Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg
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Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg
225 230 235 240
Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp
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Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe
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Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr
275 280 285
Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met
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Lys Asp Asp Arg Ala Pro Ser Asn Gly Gly His Ala Thr Ile Gly Leu
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe
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<211> 395
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<213> 人工序列
<400> 13
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cctttcacgg tgggtggcgg atcaggtact atgtggttaa acgctggatc agaaatacaa 600
gtagcaggct ttaatcccga cggagagact aacaagaaag gccaacaatt cgaacatata 660
gttcagttac gtagagttct tacaacagct actataactc tattacctga cgccgagcgt 720
ttcagtttcc ccagagtaat taacagtgct gacggagcaa ctacttggta ttttaacccc 780
gttattctaa ggccaaacaa tgtggaggta gagtttcttc taaatggtca aatcatcaac 840
acgtaccagg ccagattcgg tactataatt gcaagaaact tcgatacgat aaggctatca 900
tttcagctga tgaaggacga cagggctccc tctaacggcg gtcacgctac catcggactt 960
accctaagga tcgaatccgc tgtgtgtgag tccgttcttg cagatgcttc agagacgatg 1020
ctggctaatg taacttccgt cagacaagaa tatgctattc cagttggtcc cgttttcccc 1080
cccggaatga actggacgga cctgataaca aattattcac caagtagaga ggacaatcta 1140
caaagggtct ttaccgttgc atccataagg tccatgctag taaaa 1185
<210> 15
<211> 1185
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atggacgttc tgtactcctt gtctaaaact ctgaaggacg caagggataa gatcgtagaa 60
ggtacattat attcaaatgt gtccgatttg attcaacagt tcaatcaaat gttgattacg 120
atgaatggta atgagttcca aacaggagga atcggtaatt tgcctatccg taactggaat 180
ttcgactttg gcttgcttgg tactaccctt ctaaacttgg atgcaaacta tgtcgaaacg 240
gcaaggaata cgatcgacta cttcgttgat ttcgttgata atgtttgtat ggatgagatg 300
gtgagggaat ctcaacgtaa tggcattgct ccccaatctg acagtctgag aaagttgtct 360
ggtatcaagt ttaaaggcat aaactttgac aactcttccg agtacataga gaattggaac 420
ttgcagaata ggcgtcagag gactggcttt actttccata aaccaaacat attcccttat 480
tccgcctcat tcacgctgaa taaggacgac agggccccca gtaatggagg cggtacaatg 540
tggctaaacg caggatcaga gatccaggtc gcaggcttta atcccgatgg tgagactaat 600
aaaaaaggac aacaattcga acatatagta caactgagac gtgtgctgac tacagctacc 660
ataacccttt tgcccgatgc tgagagattc tctttcccaa gggttattaa ctccgccgac 720
ggagccacca cgtggtactt caatccagtt atccttaggc ctaacaacgt tgaggttgaa 780
ttcttgttaa acggacaaat catcaatacc tatcaggctc gtttcggtac tatcatagca 840
cgtaacttcg atactatcag acttagtttc cagctgatgg gtggttccac tacgggttac 900
cgttttacta atttcgagcc ttttacagta ggaggcggct cccacgctac cattggtcta 960
acgttgcgta tagaaagtgc tgtatgtgag tctgttttgg ccgatgcttc cgaaacaatg 1020
ttggcaaatg taacttccgt aagacaagaa tacgctatac ctgttggacc tgtttttcct 1080
cctggcatga actggaccga cttgatcacg aattactccc ccagtagaga agacaatttg 1140
caaagagtct tcaccgtagc tagtatccgt tcaatgctag ttaaa 1185

Claims (14)

1.一种牛轮状病毒融合蛋白，其特征在于，所述牛轮状病毒融合蛋白为VP6片段，所述VP6片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.编码权利要求1所述的牛轮状病毒融合蛋白的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，编码所述VP6片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.9。
4.权利要求1所述的牛轮状病毒融合蛋白组装得到的病毒样颗粒。
5.权利要求4所述的病毒样颗粒的制备方法，包括在宿主中表达编码所述牛轮状病毒融合蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主为酵母。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主包括经过选择压力筛选后得到的单克隆。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，先将编码部分所述牛轮状病毒融合蛋白的基因导入宿主，筛选出高表达的单克隆，再导入编码其余部分所述牛轮状病毒融合蛋白的基因。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包诱导宿主表达所述牛轮状病毒融合蛋白，裂解宿主提取上清，然后采用硫酸铵沉淀法和层析方法纯化，获得病毒样颗粒。
11.表达权利要求1所述的牛轮状病毒融合蛋白或权利要求4所述病毒样颗粒的宿主；
所述宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
12.犊牛腹泻多联疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的牛轮状病毒融合蛋白、权利要求2或3所述的核酸或权利要求4所述的病毒样颗粒。
13.根据权利要求12所述的犊牛腹泻多联疫苗，其特征在于，所述牛腹泻多联疫苗包括权利要求4所述的病毒样颗粒和佐剂。
14.根据权利要求13所述的犊牛腹泻多联疫苗，其特征在于，所述佐剂包括ISA206佐剂。
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