CN113354743A - 一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用，本发明利用多表位抗原融合（MEFA）技术，分别以引起仔猪腹泻的ETEC菌株的优势表达菌毛F4和F18菌毛的黏附素亚单位FaeG和FedF为骨架，构建了靶向引起断奶仔猪腹泻ETEC菌株表达的5种菌毛黏附素的FaeG‑FedF‑FasA‑FanC‑Fim41a MEFA蛋白，作为预防ETEC感染引起的新生仔猪和断奶仔猪腹泻的有效、广谱疫苗。

Description

一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用，具体涉及到B细胞抗原表位的预测，多表位融合抗原的构建技术和细菌病原学中黏附素与其受体相互作用受到高效价黏附素抗体的有效阻断，属于生物技术应用领域。
背景技术
多表位融合抗原（Multiepitope fusion antigen，MEFA）技术是基于电脑生物学和结构生物学相结合的一种新型疫苗构建技术和平台，是将来源于不同种属的菌株或者同一菌株中表达的不同毒力因子的中和（阻断）抗原表位，利用电脑生物学和结构生物学技术整合至一个抗原中，并最大限度的模拟抗原表位本身的免疫原性，旨在构建具有广泛保护力的新型多价表位疫苗。该技术平台实施过程中，通常将一种无毒性、免疫原性强、具有多个分隔开的连续的抗原表位、且二级结构稳定的毒力因子作为MEFA构建的骨架蛋白，利用相关软件对其它预构建MEFA异质性毒力因子的B细胞抗原表位进行预测，然后选择其中免疫原性最强的中和（阻断）抗原表位分别替代骨架蛋白中免疫原性较弱的抗原表位，以构建包含多病原或者多毒力因子的多表位融合抗原。基于MEFA技术平台设计的表位疫苗可以将多个不同来源的表位抗原整合在一起，从而使该疫苗对异源病原体具有广泛保护性，这使传统的表位疫苗的理念更新和焕然一新。值得注意的是MEFA技术利用免疫原性强、具有多个分隔开的连续的抗原表位、并且二级结构稳定的蛋白作为骨架蛋白，然后用其他毒力因子免疫原性强的表位替换骨架蛋白中暴露与表面的表位，这样确保构建的MEFA蛋白具有与结构蛋白相似的稳定的结构，同时保证插入的表位仍然位于MEFA蛋白的表面，而且能够诱导针对各个表位抗原的特异性抗体产生。MEFA技术与其他疫苗构建技术相比具有诸多优势。
产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是致新生仔猪和断奶仔猪腹泻的主要细菌性病原菌，给全球养猪业生产造成了巨大的经济损失。ETEC主要表达两类毒力因子：菌毛黏附素和肠毒素。菌毛黏附素包括F4、F5、F6、F18和F41菌毛黏附素，其中F4和F18为优势表达的菌毛黏附素。多年来，复合抗生素结合ETEC K88（F4）和K99（F5）二价基因工程苗或自家菌体灭活苗用于预防和临床治疗。但是由于ETEC表达菌毛黏附素的异质性使得菌毛黏附素抗原之间缺乏交叉保护；另外大量复合抗生素的长期使用，导致多种、多重耐药性ETEC菌株不断产生和水平传播扩散，造成抗生素低效和在动物体内的大量畜积。因此，研发一种同时包含ETEC表达的5种菌毛黏附素的广谱、多价的新型疫苗刻不容缓。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用，有效克服ETEC菌毛异质性导致菌毛黏附素抗原之间缺乏交叉保护，对表达不同菌毛黏附素的猪源ETEC感染具有广泛的保护力。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，包括如下步骤：
对猪源ETEC表达的菌毛黏附素进行B细胞抗原表位预测；
构建MEFA蛋白：将靶向猪源ETEC 表达的F4菌毛黏附素的主要结构亚单位FaeG和F18菌毛黏附素次要结构亚单位FedF蛋白作为菌毛黏附素MEFA蛋白骨架，将猪源ETEC表达的其他菌毛黏附素的主要结构亚单位替代B细胞免疫原性弱的抗原表位，构建MEFA蛋白并进行结构预测，其中FaeG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，FedF氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
构建重组质粒：以质粒和/或扩增产物为扩增模板，扩增并得到MEFA蛋白基因，所述MEFA蛋白基因连接到pET-28α(+)质粒得到重组质粒；
MEFA蛋白基因表达：将构建的重组质粒转化至BL21感受态细胞，经培养、提取和纯化，得到MEFA蛋白。
结合第一方面，进一步的，所述其他菌毛黏附素包括F5菌毛黏附素的主要结构亚单位FanC， F6菌毛黏附素的主要结构亚单位FasA，F41菌毛的主要结构亚单位Fim41a中的任意一种或多种，其中FanC氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，FasA氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，Fim41a氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，所述MEFA蛋白基因包括：基因序列如SEQ ID NO.10所示的FaeG-Fim41A-FanC-FasA嵌合基因，基因序列如SEQ ID NO.11所示的FedF-FasA-F41-FanC嵌合基因，基因序列如SEQ ID NO.12所示的FaeG-FedF-F41-FanC-FasA嵌合基因。
进一步的，所述FaeG-Fim41A-FanC-FasA嵌合基因以质粒p1908为扩增模板，使用基因序列如SEQ ID NO.6所示的引物MEFA-F1和基因序列如SEQ ID NO.7所示的引物MEFA-R1进行PCR扩增。
进一步的，所述FedF-FasA-F41-FanC嵌合基因以质粒p1909为扩增模板使用基因序列如SEQ ID NO.8所示的引物MEFA-F2和基因序列如SEQ ID NO.9所示的引物MEFA-R2进行PCR扩增。
进一步的，所述FaeG-FedF-F41-FanC-FasA嵌合基因以FaeG-Fim41A-FanC-FasA和FedF-FasA-F41-FanC PCR产物混合作为扩增模板，使用引物MEFA-F1和MEFA-R2进行PCR扩增。
第二方面，本发明提供一种仔猪腹泻多表位抗原，由前述任一项的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种疫苗，包括药学上可接受的载体和免疫量的权利要求7所述的一种仔猪腹泻多表位抗原。
进一步的，所述一种仔猪腹泻多表位抗原或所述的疫苗在制备预防和/或治疗ETEC菌株导致的仔猪腹泻疾病的药物中的应用，利用MEFA技术构建同时包含猪源ETEC菌株表达的5种菌毛粘附素亚单位B细胞表位的多表位疫苗，该新型表位疫苗能有同时预防表达F4、F5、F6、F18和F41菌毛的ETEC菌株感染引起的新生仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
本方法提供的一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用，该疫苗能有效克服ETEC菌毛异质性导致ETEC不同菌株之间缺乏交叉保护，对表达不同菌毛的猪源ETEC感染具有广泛的保护力，可以作为预防ETEC感染引起的仔猪腹泻疫苗的有效、广谱疫苗。
附图说明
图1是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗融合抗原的构建示意图；
图2 是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗嵌合基因的PCR后凝胶电泳图；
图3是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗的SDS-PAGE和Western blot图；
图4是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗间接ELISA检测菌毛黏附素特异性IgG抗体滴度图；
图5是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗免疫小鼠血清对ETEC菌株黏附仔猪肠道上皮细胞的抑制结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明专利为创新性利用MEFA技术平台，以引起仔猪腹泻的ETEC F4菌毛黏附素主要亚单位FaeG和F18菌毛黏附素的次要亚单位FedF为骨架，构建同时包含F5菌毛黏附素主要结构蛋白FanC、F6菌毛黏附素主要结构亚单位FasA和F41菌毛黏附素主要结构亚单位Fim41a免疫原性最强抗原表位的靶向菌毛黏附素的新型5价表位苗。
实施例1：
制备靶向猪源ETEC 5种菌毛黏附素MEFA蛋白，具体步骤如下：
（1）FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白的构建和结构预测
利用在线B细胞抗原表位预测网站对猪源ETEC表达的优势F4菌毛黏附素的主要结构亚单位FaeG和F18菌毛黏附素次要结构亚单位FedF，以及F5菌毛黏附素的主要结构亚单位FanC， F6菌毛黏附素的主要结构亚单位FasA，F41菌毛的主要结构亚单位Fim41a的B细胞抗原表位进行在线预测。
如图1是所示为本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗融合抗原的构建示意图，分别以FaeG（SEQ ID NO.1）、FedF（SEQ ID NO.2）蛋白作为骨架，然后将其中3个免疫原性较弱的抗原表位分别用FanC（SEQ ID NO.3）、FasA（SEQ ID NO.4）和Fim41a（SEQ ID NO.5）免疫原性最强的抗原表位进行替代，构建同时包含5种菌毛黏附素的FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白。
根据5种菌毛黏附素的FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白氨基酸序列，以F4菌毛黏附素主要结构亚基FaeG（c2j6gA）作为初始模板，利用Phyre2门户网站进行建模，预测和分析。在所建立的蛋白模型库中，依据可信度、线性覆盖范围和同源百分比（>90%）等参数进行打分，将得分最高的作为最终的MEFA蛋白模型。
（2）pET-28α(+)-FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a重组质粒的构建
以质粒p1908为扩增模板，利用引物MEFA-F1（SEQ ID NO.6）和MEFA-R1（SEQ IDNO.7）PCR扩增FaeG-Fim41A-FanC-FasA嵌合基因（SEQ ID NO.10）；以质粒p1909为扩增模板，利用引物MEFA-F2（SEQ ID NO.8）和MEFA-R2（SEQ ID NO.9） PCR扩增FedF-FasA-F41- FanC嵌合基因（SEQ ID NO.11），PCR产物使用DNA凝胶试剂盒回收纯化。并再次以回收纯化的FaeG-Fim41A-FanC-FasA和FedF-FasA-F41-FanC PCR产物混合作为扩增模板，以引物MEFA-F1和MEFA-R2利用SOE-PCR扩增FaeG-FedF-F41-FanC-FasA嵌合基因（SEQ ID NO.12），图2为本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a嵌合基因的PCR扩增图，1. DNA Marker; 2. FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a gene。PCR产物利用DNA凝胶试剂盒回收纯化。PCR产物以BamHI和SalI内切酶双酶切后，与用同样内切酶酶切的pET-28α(+)质粒连接，构建pET-28α(+)-FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a重组表达质粒。
（3）FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白的原核表达和纯化
将构建正确的pET28α(+)-FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a重组质粒电转化至BL21（DE3）感受态细胞，然后涂布卡那霉素的LB平板，于37℃细菌恒温培养箱中过夜培养。从过夜培养的卡那霉素的LB平板上挑取单个阳性克隆，加入至5 ml含卡那霉素的2×YT培养基中，37℃摇床中过夜培养。第二天，将2ml过夜培养的种子液加入200 ml新鲜的2×YT培养基中，并加入200 μL卡那霉素，37℃摇床中培养至OD600约为0.6。 然后加入IPTG至终浓度为1mM，并且继续诱导培养4 h。 4℃，12 000rpm×10min， 离心收集菌体，菌体放置于-70℃备用。
图3是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41aMEFA蛋白的SDS-PAGE和Western blot图。A.FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a多表位融合抗原蛋白的SDS-PAGE电泳图，目的蛋白大小约为70KDa。B. FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a多表位融合抗原蛋白的Western blot图，一抗为鼠源抗FaeG、FedF、FanC、FasA和Fim41a多抗血清。
MEFA蛋白的提取和纯化根据Purification of His-tag proteins （MACHEREY-NAGEL，德国）试剂盒的说明书进行操作。纯化的MEFA蛋白利用SDS-PAGE和免疫印迹进行验证，蛋白最终浓度采用BCA进行测定。
实施例2：
评估FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白作为预防仔猪腹泻疫苗候选蛋白：
（1）免疫原性评价：将原核表达和纯化的FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白与弗氏完全佐剂按1:1的比例充分乳化，然后免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠16只，每只小鼠皮下免疫100 μl（包含50 μg抗原）。首次免疫后，每间隔两周加强免疫一次，一共免疫3次，其中第二次和第三次免疫时抗原剂量不变，但是佐剂采用弗氏不完全佐剂。另外16只老鼠只注射100 μl无菌的PBS作为对照组。分别在小鼠免疫前尾部采血，第3次免疫后第14天无痛颈椎处死老鼠后眼球采血，血清放于-70℃冰箱待用。采用间接ELISA方法检测小鼠血清中相应菌毛黏附素亚单位特异性IgG抗体滴度。
如图4所示，为本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗间接ELISA检测菌毛黏附素特异性IgG抗体滴度图。FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41a MEFA蛋白皮下免疫8周龄雌性BALB/c小鼠，首次免疫后，每间隔两周加强免疫一次，一共免疫3次，第3次免疫后第14天无痛颈椎处死老鼠后眼球采血并分离所得到的免疫血清进行间接ELISA试验，检测anti-FaeG、anti-FedF、anti-FanC、anti-FasA和anti-Fim41a的抗体滴度水平，其中免疫PBS组为阴性对照组。
获得的靶向猪源ETEC菌毛黏附素的MEFA蛋白，用BALB/c小鼠模型做动物实验，从图中可以看出PBS阴性对照组无特异性IgG抗体产生，而FaeG-FedF-FanC-FasA-Fim41aMEFA蛋白免疫组小鼠血清中能够同时检测到高水平的抗FaeG、FedF、FasA、FanC和Fim41a亚单位的特异性IgG抗体，以上结果表明该MEFA蛋白具有良好的免疫原性，可以同时诱导针对5种菌毛粘附素亚单位的高水平免疫应答反应。
（2）体外仔猪肠道上皮细胞的培养：来源于1天之内未吸乳的仔猪的空肠上皮细胞IPEC-J2用RPMI1640-F12（1:1）培养基加10%胎牛血清（FBS）培养。细胞单层长满后，用0.25%胰酶消化细胞，传代2-3次以后，将细胞接种于24孔细胞培养板，待单层细胞长满时（约3.0×105个/孔）用于下一步的细菌黏附阻断试验。
（3）菌毛特异性抗体体外阻断试验：将F4ac+、F18ac+、F5+、F6+和F41+ ETEC野生株分别于LB无抗性平板上划线，37℃恒温箱中过夜培养。挑取已经于LB平板上活化的相应野生菌株的单菌落接种于无抗LB液体培养基，37℃摇床中过夜培养，次日，按1:100转接至新鲜的无抗LB培养基中，待细菌长至对数生长期（OD600=0.4～0.6）备用。
将上述培养的对数期生长的细菌用高压灭菌的PBS稀释至1.0×107 CFU/mL后（OD600=1.0时约为1.0×109 CFU/mL），取150 μL（1.5×106 CFU）菌液与30 μL各组小鼠血清混合，并用无血清细胞培养基补充至总体积为600 μL。然后将细菌和血清混合液放置于摇床上，室温振荡共孵育30 min。用无菌的PBS将IPEC-J2细胞中死亡的细胞洗掉，并将已经与小鼠血清预先孵育的混合液加入细胞（细菌：细胞=5:1），放置于37℃ CO2细胞培养箱共孵育1 h。用无菌的PBS洗涤3次，将未与细胞黏附的细菌洗掉，然后每孔加入1 mL 0.5%TritonX-100裂解细胞，室温摇床上缓慢振荡裂解30 min。包含黏附细菌的裂解液用PBS按照1:10的比例进行梯度稀释，涂布无抗LB平板，37℃恒温培养箱静置过夜进行单菌落计数，每组设置3个平行孔，实验重复3次。
图5是本发明实施例一种仔猪腹泻多表位疫苗免疫小鼠血清对ETEC菌株黏附仔猪肠道上皮细胞的抑制结果。免疫小鼠血清对表达F4、F5、F6、F18和F41菌毛的ETEC菌株与IPEC-J2细胞粘附抑制结果图，从图中可以看出，来源于PBS免疫组的小鼠血清对表达5种菌毛的ETEC菌株的黏附均无抑制作用，而来源于FaeG-FedF-FasA-FanC-Fim41a MEFA蛋白免疫组小鼠血清在体外能同时显著抑制表达F4、F5、F6、F18以及F41菌毛的ETEC菌株对仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2的粘附，以上结果表明我们构建的多表位疫苗具有广泛的保护力；获得的FaeG-FedF-FasA-FanC-Fim41a MEFA蛋白能同时被抗FaeG、FedF、FasA、FanC和Fim41a亚单位抗体所识别，表明所有菌毛黏附素的B细胞抗原表位仍展呈新构建的MEFA蛋白的表面。
本发明利用结构疫苗学构建了包含ETEC 5种菌毛黏附素的MEFA蛋白，该蛋白免疫小鼠后获得的高效价、特异性黏附素抗体在体外能高效性阻断表达相应菌毛黏附素的ETEC菌株对仔猪肠道上皮细胞的黏附。本发明制备的靶向猪源ETEC菌毛黏附素的新型5价表位疫苗，能有效克服ETEC菌毛异质性导致菌毛黏附素抗原之间缺乏交叉保护，对表达不同菌毛黏附素的猪源ETEC感染具有广泛的保护力，可以作为预防ETEC感染引起的仔猪腹泻疫苗的候选抗原，
本发明所应用的多表位融合抗原（MEFA）技术是一种结合了电脑生物学和结构生物学的新型结构疫苗学技术，该技术可以应用于新型多联苗和多价疫苗的研发，利用MEFA技术构建的靶向ETEC菌毛黏附素的5价新型疫苗有望成为仔猪腹泻的防控提供新思路和策略。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种仔猪腹泻多表位抗原、疫苗及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
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1 5 10 15
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20 25
<210> 3
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<212> PRT
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1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ala Asn Ile Asn Thr Ser Phe Thr Thr Ala
20 25 30
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<211> 30
<212> PRT
<213> Amino Acid Sequence
<400> 4
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<212> PRT
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<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagcgtcgac ttactggatt tcgaaaacga tcggaac 37
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcacctact acggacccgg acctggtcgt ctgaaatac 39
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtatttcaga cgaccaggtc cgggtccgta gtaggtgat 39
<210> 10
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaaaaaaa ccctgatcgc tctggctatc gctgcttctg ctgcttctgg tatggctcac 60
gcttggatga ccggtgacgt tatggctgct gactggaccg aaggtcagcc gggtgacatc 120
atcaaatggg aatgggaagt tggtaccggt ctgaacggtt tcggtaacgt tctgaacgac 180
ctgaccaacg gtggtaccaa actgaccatc accgttaccg gtaacaaacc gatcctgctg 240
ggtcgtacca aagaagcttt cgctaccccg gttatcaacg ttggtaacgg ttctggtggt 300
gctaacatca acatcccgca gatcgctttc accgactacg aaggtgcttc tgttgaactg 360
cgtaaaccgg acggtggtac caacaaaggt ctggcttact tcgttctgcc gatgaaaaac 420
gctggtggta ccaaagttgg ttctgttaaa gttaacgctt cttacgctgg tgttctgggt 480
cgtggtggtg ttacctctgc tgacggtgaa ctgctgtctc tgttcgctga cggtctgtct 540
tctatcttct acggtggtct gccgcgtggt tctgaactgt ctgctggttc tgctgctgct 600
gctcgtacca aactgttcgg ttctctgtct cgtgacgaca tcctgggtca gatccagcgt 660
gttaacgcta acatcacctc tctggttgac gttgctggtc tggctgctcc ggctgaaaac 720
aacacctctc aggctaacgt ttctgctgct tacgctctgg gtatcgctaa cggtcagacc 780
atcgaagcta ccttcaacca ggctgttacc acctctaccc agtggtctgc tccgctgaac 840
gttgctatca cctactacta a 861
<210> 11
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcgtctga aatacatcct gatcatcccg ctgctgctga tctctctgtc tgttttcgct 60
tctaccctgc aggttgacaa atctgtttct tacgactgga tcaactcttc tgcttcttct 120
gctcaggtta ccggtaccct gctggctggt aacaacaaca ccggttctga caccaaatac 180
ctggttccgg cttctaacga cacctctgct tctggtatgc cggctctgta cacctggcag 240
cacaaaatct acaacgttaa cttcatcccg tcttcttctg gtaccctgac ctgccaggct 300
ggtaccatcc tggtttggaa aggtggtcgt gaaacccagt acgctctgga atgccgtgtt 360
tctatccacc actcttcttg ggacgacctg tctcacccga actacacctc tgctgacaaa 420
gcttcttacc tgtcttacgg ttctggtgtt tctgctggtg gtaccgcttg cggtaccaaa 480
aaatgccgtt tcaccggttt cgaaatctct ctgcgtatcc cgccgaacgc tcagacctac 540
ccgctgtctt ctggtgacct gaaaggttct ttctctctga ccaacaaaga agttaactgg 600
tctgcttcta tctacgttcc ggctatcgct aaatcttacc gtctggacac ctctatcacc 660
ctgccggaca ccgttaacct gaaacagaac caggctaccc cggtttacta caccttctct 720
cagctgaaaa aagacgaccg tgctccgtct aacggtggtt acaaaaacgt taaactgacc 780
atcggtccga tccagtctaa aaccaccgct ctgtacgttc agccggacgc taccggttct 840
tggtacgacc tgtctaaatc tatcaccatg accgttgtta aatcttctat gctgaacttc 900
aaaggtatca acgctaaacc gggtaacgtt accctgtctg ttccgatcgt tttcgaaatc 960
cagtaa 966
<210> 12
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaaaaaaa ccctgatcgc tctggctatc gctgcttctg ctgcttctgg tatggctcac 60
gcttggatga ccggtgacgt tatggctgct gactggaccg aaggtcagcc gggtgacatc 120
atcaaatggg aatgggaagt tggtaccggt ctgaacggtt tcggtaacgt tctgaacgac 180
ctgaccaacg gtggtaccaa actgaccatc accgttaccg gtaacaaacc gatcctgctg 240
ggtcgtacca aagaagcttt cgctaccccg gttatcaacg ttggtaacgg ttctggtggt 300
gctaacatca acatcccgca gatcgctttc accgactacg aaggtgcttc tgttgaactg 360
cgtaaaccgg acggtggtac caacaaaggt ctggcttact tcgttctgcc gatgaaaaac 420
gctggtggta ccaaagttgg ttctgttaaa gttaacgctt cttacgctgg tgttctgggt 480
cgtggtggtg ttacctctgc tgacggtgaa ctgctgtctc tgttcgctga cggtctgtct 540
tctatcttct acggtggtct gccgcgtggt tctgaactgt ctgctggttc tgctgctgct 600
gctcgtacca aactgttcgg ttctctgtct cgtgacgaca tcctgggtca gatccagcgt 660
gttaacgcta acatcacctc tctggttgac gttgctggtc tggctgctcc ggctgaaaac 720
aacacctctc aggctaacgt ttctgctgct tacgctctgg gtatcgctaa cggtcagacc 780
atcgaagcta ccttcaacca ggctgttacc acctctaccc agtggtctgc tccgctgaac 840
gttgctatca cctactacgg acccggacct ggtcgtctga aatacatcct gatcatcccg 900
ctgctgctga tctctctgtc tgttttcgct tctaccctgc aggttgacaa atctgtttct 960
tacgactgga tcaactcttc tgcttcttct gctcaggtta ccggtaccct gctggctggt 1020
aacaacaaca ccggttctga caccaaatac ctggttccgg cttctaacga cacctctgct 1080
tctggtatgc cggctctgta cacctggcag cacaaaatct acaacgttaa cttcatcccg 1140
tcttcttctg gtaccctgac ctgccaggct ggtaccatcc tggtttggaa aggtggtcgt 1200
gaaacccagt acgctctgga atgccgtgtt tctatccacc actcttcttg ggacgacctg 1260
tctcacccga actacacctc tgctgacaaa gcttcttacc tgtcttacgg ttctggtgtt 1320
tctgctggtg gtaccgcttg cggtaccaaa aaatgccgtt tcaccggttt cgaaatctct 1380
ctgcgtatcc cgccgaacgc tcagacctac ccgctgtctt ctggtgacct gaaaggttct 1440
ttctctctga ccaacaaaga agttaactgg tctgcttcta tctacgttcc ggctatcgct 1500
aaatcttacc gtctggacac ctctatcacc ctgccggaca ccgttaacct gaaacagaac 1560
caggctaccc cggtttacta caccttctct cagctgaaaa aagacgaccg tgctccgtct 1620
aacggtggtt acaaaaacgt taaactgacc atcggtccga tccagtctaa aaccaccgct 1680
ctgtacgttc agccggacgc taccggttct tggtacgacc tgtctaaatc tatcaccatg 1740
accgttgtta aatcttctat gctgaacttc aaaggtatca acgctaaacc gggtaacgtt 1800
accctgtctg ttccgatcgt tttcgaaatc cagtaa 1836

Claims (9)

1.一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
对猪源ETEC表达的菌毛黏附素进行B细胞抗原表位预测；
构建MEFA蛋白：将靶向猪源ETEC 表达的F4菌毛黏附素的主要结构亚单位FaeG和F18菌毛黏附素次要结构亚单位FedF蛋白作为菌毛黏附素MEFA蛋白骨架，将猪源ETEC表达的其他菌毛黏附素的主要结构亚单位替代B细胞免疫原性弱的抗原表位，构建MEFA蛋白并进行结构预测，其中FaeG氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，FedF氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
构建重组质粒：以质粒和/或扩增产物为扩增模板，扩增并得到MEFA蛋白基因，所述MEFA蛋白基因连接到pET-28α(+)质粒得到重组质粒；
MEFA蛋白基因表达：将构建的重组质粒转化至BL21感受态细胞，经培养、提取和纯化，得到MEFA蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，所述其他菌毛黏附素包括F5菌毛黏附素的主要结构亚单位FanC， F6菌毛黏附素的主要结构亚单位FasA，F41菌毛的主要结构亚单位Fim41a中的任意一种或多种，其中FanC氨基酸序列如SEQID NO.3所示，FasA氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，Fim41a氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，所述MEFA蛋白基因包括：基因序列如SEQ ID NO.10所示的FaeG-Fim41A-FanC-FasA嵌合基因，基因序列如SEQ ID NO.11所示的FedF-FasA-F41-FanC嵌合基因，基因序列如SEQ ID NO.12所示的FaeG-FedF-F41-FanC-FasA嵌合基因。
4.根据权利要求3所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，所述FaeG-Fim41A-FanC-FasA嵌合基因以质粒p1908为扩增模板，使用基因序列如SEQ ID NO.6所示的引物MEFA-F1和基因序列如SEQ ID NO.7所示的引物MEFA-R1进行PCR扩增。
5.根据权利要求3所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，所述FedF-FasA-F41-FanC嵌合基因以质粒p1909为扩增模板使用基因序列如SEQ ID NO.8所示的引物MEFA-F2和基因序列如SEQ ID NO.9所示的引物MEFA-R2进行PCR扩增。
6.根据权利要求3所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法，其特征在于，所述FaeG-FedF-F41-FanC-FasA嵌合基因以FaeG-Fim41A-FanC-FasA和FedF-FasA-F41-FanCPCR产物混合作为扩增模板，使用引物MEFA-F1和MEFA-R2进行PCR扩增。
7.一种仔猪腹泻多表位抗原，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的一种仔猪腹泻多表位抗原的制备方法制备得到。
8.一种疫苗，其特征在于，包括药学上可接受的载体和免疫量的权利要求7所述的一种仔猪腹泻多表位抗原。
9.权利要求7所述的一种仔猪腹泻多表位抗原或权利要求8所述的疫苗在制备预防和/或治疗ETEC菌株导致的仔猪腹泻疾病的药物中的应用。
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