CN105524148B - 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明的重组蛋白可用于制备猪支原体肺炎的预防性药物，本发明的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5％，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎；同时本发明的重组蛋白可低成本的大规模生产具有良好的市场前景。

Description

一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种可用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称猪喘气病或猪气喘病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的一种慢性、接触性传染病，通过呼吸道在猪只和猪群之间传播，是猪场最常见的疫病之一。该病通常不引起猪的死亡，但会使其出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞、饲料转化率降低、上市时间延迟。本病一旦传入猪群，很难彻底清除，且该病通常与其他病毒或细菌引起猪呼吸系统疾病综合征（Porcine respiration disease complex, PRDC）。根据流行病学资料，该病广泛分布于包括发达国家在内的世界各地。在我国有超过95%的猪场均为Mhp血清阳性[He Y, Xu MJ, Zhou DH, et a1. Seroprevalence of Mycoplasma hyopneumoniae inpigs in subtropical southern China [J]. Trop Anim Health Prod, 2011, 43 (3):695-698. ]。因此，Mhp是一种在我国广泛存在，长期危害养猪业并造成巨大损失的病原菌之一。
该病用抗菌药物防控必须长期给药，不仅增加了饲养成本也易使感染菌株产生耐药性。目前上市的Mhp疫苗包括灭活苗和弱毒苗。灭活苗能够降低肺部病理损伤，提高日增重，激发机体的体液免疫，但几乎不产生细胞免疫，也不能阻止Mhp感染[Sibila M, BernalR, Torrents D, et al. Effect of sow vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae on sow and piglet colonization and seroconversion, and pig lunglesions at slaughter [J]. Vet Microbiol, 2008,127(1-2): 165-170.]和在猪群间的传播[Meyns T, Dewulf J, de Kruif A, et al. Comparison of transmission ofMycoplasma hyopneumoniae in vaccinated and non-vaccinated populations [J].Vaccine, 2006, 24(49-50): 7081-7186./Villarreal I, Meyns T, Dewulf J, et al.The effect of vaccination on the transmission of Mycoplasma hyopneumoniae inpigs under field conditions [J]. Vet J, 2011, 188(1): 48-52.]。我国江苏省农科院研发了猪支原体肺炎弱毒活疫苗(168株)。该疫苗能有效激发机体的细胞免疫和局部粘膜免疫[周勇岐, 赵永前. 猪支原体肺炎(168株)活疫苗的作用机理与应用[J]. 中国牧业通讯, 2008, 10: 49-52]。但需要采用肺内注射的方式，操作难度大，因此这种疫苗推广难度大。Mhp苛刻的培养条件和培养时容易被其他细菌和支原体污染也使得上述两种疫苗成本较高。因此，研发新型、有效、低成本的基因工程亚单位Mhp疫苗就成为防治猪支原体肺炎的重要手段。
Mhp进入猪呼吸道后通过和呼吸道上皮细胞纤毛的相互作用导致纤毛结构的破坏和功能丧失，最终导致上皮细胞死亡。Mhp和纤毛相互作用的第一步是对宿主上皮细胞纤毛的黏附。因此，黏附因子在Mhp的致病过程中有决定性作用。Mhp107是Mhp的一个保守蛋白，存在于已测序的所有Mhp中。mhp107基因在168菌株中全长3102 bp，编码1033个氨基酸，在第219-222、1663-1665和2887-2889位处有编码色氨酸（Trp）的密码子TGA。Mhp107蛋白分子量为120 kDa，能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合肝磷脂。肝磷脂能抑制Mhp对猪呼吸道上皮细胞的黏附。Mhp107与肝磷脂的结合进一步促进了Mhp对纤毛的黏附。Mhp107蛋白C端还能与上皮细胞的纤连蛋白结合，纤连蛋白的主要作用是促进伤口的愈合。Mhp107蛋白C端与纤连蛋白的结合促进了Mhp对宿主细胞的损伤[Seymour LM, Falconer L,Deutscher AT, et al. Mhp107 is a member of the multifunctional adhesin familyof Mycoplasma hyopneumoniae [J]. J Biol Chem, 2011, 286 (12): 10097-10104.]。因此，Mhp107-C片段在Mhp的致病中扮演重要角色，阻断Mhp107-C的功能可能会有效降低Mhp对猪的致病。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防猪支原体肺炎的疫苗。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
在根据本发明的一个实施方案中，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:8。
本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
1）通过PCR扩增Mhp168菌株mhp107基因的第1666~3099位的核苷酸序列；
2）将步骤1）得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列；
3）将步骤2）得到的重组蛋白Mhp107-C的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载体；
4）将步骤3）得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白Mhp107-C。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1）中所述的PCR扩增的引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；优选地，所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min；98ºC变性1 min，50ºC退火1 min，72ºC延伸1min 40 s，30 cycles；72ºC 延伸6 min。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤2）是通过包括下述步骤的方法实现的：
a）将步骤1）得到的核苷酸序列连接到pMDTM19-T载体，得到pMDTM19-mhp107-C重组质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，培养；
b）提取pMDTM19-mhp107-C重组质粒，并以所述pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhp107-C的编码序列mhp107-CM；优选地，所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min； 98ºC 变性1 min 30 s，60ºC退火1 min 30 s，72℃延伸4 min 30 s，20 cycles；72ºC延伸10 min；
c）将上述PCR产物经DpnI消化、胶回收后，转化宿主菌培养，提取质粒，选取经鉴定序列正确的载体即为pMDTM19-Mhp107-CM载体；
d）将步骤c）得到的pMDTM19-Mhp107-CM载体以BamHI和NotI双酶切得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤a）中，所述步骤1）得到的核苷酸序列与pMD19TM-T载体的摩尔比为3:1，连接反应体系如下：mhp107-C 4.5μL，pMDTM19-T载体0.5μL，Solution I 5μL。16℃连接1h。
在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤4）中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和PreScission Protease 酶实现的。
进一步地，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地连接编码如上所述的重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
本发明还提供了上述重组蛋白在制备用于预防猪支原体肺炎的药物中的应用；更优选地，所述药物为用于预防猪支原体肺炎的亚单位疫苗。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
本发明的猪肺炎支原体的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5%，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎；同时本发明的重组蛋白可低成本的大规模生产具有良好的市场前景。
附图说明
图1 所示为对Mhp107蛋白信号肽进行生物信息学分析的结果示意图，图中显示1-34位氨基酸是信号肽序列。
图2所示为Mhp107蛋白跨膜区生物信息学分析结果示意图，图中显示18-35、626-627、745-748位氨基酸为跨膜区。
图3所示为 mhp107-C基因片段PCR扩增结果；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准（DNA Marker）；泳道1、2为扩增基因片段。电泳条带位于1200-2000 bp之间，扩增片段与预期片段大小1437 bp一致。800-1200 bp之间的片段为非特异性扩增。
图4 重组质粒pMDTM19-mhp107-C酶切鉴定；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准（DNAMarker）；泳道1、2为质粒pMDTM19-mhp107-C酶切结果。酶切后的质粒为2692 bp，目的基因片段为1437 bp，与预期结果相符。
图5为重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C酶切鉴定；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准（DNA Marker）；泳道1为质粒pGEX-6P-2-mhp107-C，泳道2为质粒pGEX-6P-2-mhp107-C酶切结果。pGEX-6P-2-mhp107-C为6422 bp；酶切后的质粒为4985 bp，目的基因片段为1437 bp，与预期结果相符。
图6为重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C中mhp107-C基因片段测序结果
图7为重组菌XL-1 Blue-Mhp107-C中Mhp107-C蛋白的表达与纯化结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道1为纯化后带GST标签重组蛋白，泳道2、3、4为经PreScission Protease 酶酶切后Mhp107-C蛋白，泳道5为PreScission Protease 酶酶切后剩余带GST标签重组蛋白。带GST标签重组蛋白分子量为81.5 kDa，Mhp107-C蛋白分子量为55.5 kDa，GST蛋白分子量为26 kDa。所得蛋白大小与预期相符。
图8为 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与小鼠抗血清的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道MS为Mhp107-C蛋白与小鼠抗血清反应结果。Mhp107-C蛋白能与小鼠抗血清反应，说明Mhp107-C蛋白具有良好的反应原性。
图9 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清1的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P1为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清1反应结果。在Mhp猪阳性血清1中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图10 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清2的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P2为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清2反应结果。在Mhp猪阳性血清中2能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图11 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清3的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P3为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清3反应结果。在Mhp猪阳性血清3中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图12 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清4的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P4为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清4反应结果。在Mhp猪阳性血清4中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图13 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清5的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P5为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清5反应结果。在Mhp猪阳性血清5中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图14 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清6的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P6为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清6反应结果。在Mhp猪阳性血清6中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图15 Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清7的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P7为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清7反应结果。在Mhp猪阳性血清中没有检测到Mhp107-C抗体，说明感染该猪的Mhp中Mhp107蛋白没有在菌体表面充分暴露。
图16为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清8的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道P8为Mhp107-C蛋白与猪Mhp阳性血清8反应结果。在Mhp猪阳性血清8中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图17为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与8份混合Mhp猪阳性血清的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道PM为Mhp107-C蛋白与8份混合Mhp猪阳性血清反应结果。在混合Mhp猪阳性血清中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应，Mhp107-C蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。
图18 为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清1的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道N1为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清1反应结果。在Mhp猪阴性血清1中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图19为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清2的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道N2为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清2反应结果。在Mhp猪阴性血清2中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图20为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清3的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道N3为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清3反应结果。在Mhp阴性猪血清3中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图21为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清4的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道N4为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清4反应结果。在Mhp阴性猪血清中4没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图22为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清5的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道N5为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清5反应结果。在Mhp阴性猪血清中5没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图23为Western blotting检测Mhp107-C蛋白与5份混合Mhp猪阴性血清的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准（蛋白Marker）；泳道NM为Mhp107-C蛋白与5份混合Mhp阴性猪血清反应结果。在5份Mhp阴性猪血清中均没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料的准备
1. 猪肺炎支原体168菌株：购自江苏省农业科学院。
2. PrimeSTAR® HS DNA polymerase、Ex Taq DNA polymerase、pMDTM19-T载体、BamHI、NotI、DpnI：购自宝生物（大连）有限公司。
3. 细菌基因组DNA提取试剂盒、核酸Marker：购自天根生化科技（北京）有限公司。
4. 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：购自美国Omega公司。
5. T4 DNA ligase、蛋白Marker、HRP标记羊抗猪IgG二抗：购自Thermo Fisher科技公司。
6. Glutathione-Sepharose 4B、Prescission Protease购于瑞典GE公司。
7. BCA蛋白浓度测定试剂盒：购自碧云天生物技术研究所。
8. 清洁级Balb/c小鼠：购自重庆市中药研究院。
9. 猪肺炎支原体抗体检测试剂盒：购自美国IDEXX公司。
实施例1 Mhp107蛋白片段的筛选
从GenBank（CP002274）获得Mhp 168菌株Mhp107蛋白的氨基酸序列，LipoP1.0 软件预测Mhp107蛋白的信号肽序列为SEQ ID NO:3 MQANLIGRFIKNKKAILVLASTFAGLILFTTSVG，被SpI酶切割（附图1）。DAS软件预测Mhp107蛋白的跨膜区为18-35、626-627、745-748位氨基酸（附图2）。根据文献报道，Mhp107蛋白C端能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合宿主呼吸道上皮细胞肝磷脂和纤连蛋白。因此选择mhp107基因1666 bp-3099 bp核苷酸作为扩增片段，同时对部分核苷酸序列进行突变，在扩增时为了保证蛋白顺利表达，在片段之前加ATG起始密码子。扩增的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO :2
ATGTCTGGTAAGACATACTTACCTAGTTTAACAGAAATTGCAAATTTTCGATTAAATCAACAAAAAATTGATATAAATTCACAAAATCAAGAGCAAAAAATTGAACTAAAAACACTACATTCACAAAGTTTTTTTATAAATCCTTCGGATGTAACAGCTTTTTTTGCTGATTTAATTCAGAAAAAACCAAGCCAAATAGCAAATAGTTTTTTCTTAATTGCAAAGGCTTTTGGACTTTTAAATCAAAATCGGACTGCTTCGCAAATTTTTGATAACCTGGATGGAGAAAATATCTTTGAAACTAGTTCAAAAATTCATTTTGATAATAAAACTACAAATATTTTAAGTTTTAATAATCATTTCGCTGATTTTTATAATCAAGGGTTTTTTTCATCCCTTTTTCTTCCAAAATCAATAAAAGATAAATTCAATAATCTAAAAAGCAAGTCAATTTCTGATGTAATTAGTATTTTAGAAGACCAAGAACTTTTTAAAGAAACGGCTAGAAAATTTACAAGACAACAAATTGAGGAAAACCTAAAATCAAGTATTAAATTCACAACATTGGCCGACCTTCTTTTAGCTTTTTATTATAAGGCTAGTCAACTTGATAATTTTTTAGGGTGAACAAAATTAGATACCAATTTAGATTATCAAATTGTGTTTCAAAAAGAAAATGAAATTTCAAAAGCTCGTTATGATTCTGAAATTCAGAAGCTAAAAAAACCCGAATTAAATTCCTTAGAAAAACAGGAAAACTTAAATAAAAATTCTGAAATTCAACCAGAATCTAAAAATTTAGACTCTGATAATAACATAAAAAAATCAATAAATGGAAATTTAGAAAAAGATAATACTTATAATGCCAATGTTGATAATGAATATCTAACATTAAATTTTTACTATATTATTGGTGATTCTAGTCAGAAAAAATTTTTCTTTCAAAGTCCAATTCAAAAAATTTTAATAAATTTCTCAACTCAAAAAATTGATGAAAATTCTAAAATACAAGAAAAATTCGATAAGATAGTTGAAAGTGTTCCGGCTGATTTGTTAAATTATAGTGTCAGTGAAGAAAATTTTAAAAAAATTAAGGAAAAATTAACAAATAAGCATTCACCTGAACCAAAAAATAATGACAATAATAACGATTTAGATTTATATTTTAAAGAAACTTCCATAAATATTGATAAAATTAGTTCTTATTTTAAAGAACAATTTCCCAAAGTGGAGACAAAATTTTTACTTGAACCAAGTTTTGAAAGCTCACTAAATACGGATAAACTAACCTTTTTAATAAGTTTTTATCTTAATAAGAAGGATAAAAATCCCAAAAATTTAAAAGCTGATAATAAAAATAATGAAAATAGCCAGATAAATCCAATTATTGCAAGGCAGAAATTAAAAATTATAATAACAAAAAATTCTAAAAATTAA
实施例2 重组质粒pMDTM19-mhp107-C的构建
1. 猪肺炎支原体168株基因组的提取：
按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
2. 引物设计合成
用 Primer Premier 5.0软件设计和分析评价，上下游引物5'端分别引入限制性内切酶 BamHI和NotI酶切位点。由上海Invitrogen 公司合成，序列如下：
mhp107C-F：（SEQ ID NO:4）
5'-GGATCCATGTCTGGTAAGACATACTTACCTAGTTTAACA-3'（BamH I）
mhp107 C-R：（SEQ ID NO:5）
5'-GCGGCCGCTTAATTTTTAGAATTTTTTGTTATTATAATTT-3'（NotI）
3. 目的基因的 PCR 扩增
以Mhp 168菌株基因组DNA为模板，以mhp107C-F 和mhp107C-R为引物扩增mhp107- C基因片段。采用如下的PCR体系和反应条件。
PCR 扩增反应体系
PrimeSTAR<sup>®</sup> HS DNA polymerase 2.5 μL
DNA模板 2 μL
mhp107 C-F（25 pmol/μL） 4 μL
mhp107 C-R（25 pmol/μL） 4 μL
dNTPs（2.5 mmol/L each） 4 μL
5×PCR buffer 10 μL
ddH<sub>2</sub>O 23.5 μL
Total volume 50 μL
PCR反应条件：
98ºC预变性5 min；98ºC变性1 min，50ºC退火1 min，72ºC延伸1min 40 s，30cycles；72ºC 延伸6 min。PCR 完成后在反应体系中加入0.25 μL Ex Taq DNA 聚合酶和2μL dNTPs，振荡混匀简短离心后72℃延伸 10 min。琼脂糖凝胶电泳观察结果（附图3）。
4. PCR产物的回收
灌制可上样25 mL 的1.5%琼脂糖凝胶，将 PCR 扩增产物加入电泳上样孔中，指示条带迁移至适当位置时停止电泳。
通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 mL 离心管中，称重。
按照胶回收试剂盒说明书进行PCR产物回收。
5. mhp107-C连接pMDTM19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。
通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3:1的原则，设计连接反应体系如下：mhp107-C 4.5 μL，pMDTM19-T载体0.5 μL，Solution I 5μL。16℃连接1h。
参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌DH5α感受态菌。
参照《精编分子生物学实验指南》将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。
6. Amp+ LB平板筛选转化成功重组菌
挑取Amp+ LB平板单克隆接种Amp+ LB液体培养基，37℃180 rpm 摇床培养6 h。取2mL菌液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和NotI双酶切鉴定。反应体系：重组质粒7.5 μL，BamHI 0.5 μL，NotI 0.5 μL，10×K buffer 0.5 μL，1% BSA 1 μL。37℃水浴1h，琼脂糖凝胶电泳观察结果（附图4）。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。测序正确的质粒命名为pMDTM19-mhp107-C。
实施例3 重组质粒pMDTM19-mhp107-C点突变
1. 突变引物设计合成
为了将mhp107-C基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA突变为色氨酸密码子TGG，以 pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，用Primer Premier 5.0 软件设计突变引物，由上海 Invitrogen 公司合成。突变引物序列：
mhp107CT-F：（SEQ ID NO:6）
5'-AACTTGATAATTTTTTAGGGTGGACAAAATTAGATACCAATTTAG-3'
mhp107CT-R：（SEQ ID NO:7）
5'-CTAAATTGGTATCTAATTTTGTCCACCCTAAAAAATTATCAAGTT-3'
2. 目的基因的突变PCR
以pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以mhp107CT-F和mhp107CT-R为引物进行突变 PCR。采用如下的PCR体系和反应条件。
PCR 扩增反应体系
PrimeSTAR<sup>®</sup> HS DNA polymerase 2.5 μL
pMD<sup>TM</sup>19-mhp107-C重组质粒 1 μL
mhp107CT-F（25 pmol/μL） 4 μL
mhp107CT-R（25 pmol/μL） 4 μL
dNTPs（2.5 mmol/L each） 4 μL
5×PCR buffer 10 μL
ddH<sub>2</sub>O 24.5 μL
Total volume 50 μL
反应条件：98ºC预变性5 min； 98ºC 变性1 min 30 s， 60ºC退火1 min 30 s，72℃延伸4 min 30 s，20 cycles；72ºC延伸10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。该PCR产物为包含突变后的mhp107-C基因及pMDTM19-T载体的闭环质粒，与pMDTM19-mhp107-C的不同在于mhp107-C基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA变为色氨酸密码子TGG。
3. DpnI消化PCR 产物
向 PCR 产物中加入2 μL Dpn I和5.8 μL 10×T Buffer，37℃水浴3h。胶回收试剂盒回收经DpnI消化的产物。
4. DpnI消化PCR 产物的转化及阳性重组子的筛选
参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌XL-1 Blue感受态菌。
将上述经回收PCR产物参照《精编分子生物学实验指南》转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态菌。
5. Amp+ LB平板筛选转化成功重组菌
挑取Amp+ LB平板单克隆接种Amp+ LB液体培养基，37℃180 rpm 摇床培养6h。取2mL菌液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和NotI双酶切鉴定。反应体系和反应条件同实施例2。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。测序正确的质粒命名为pMDTM19-mhp107-CM。
实施例4重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C与重组菌XL-1 Blue-Mhp107-C的构建
1. 重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C的构建
重组质粒pMDTM19-mhp107-CM和载体pGEX-6P-2经BamHI和NotI双酶切。反应体系：重组质粒/载体37.5μL，BamHI 2.5μL，NotI 2.5μL，10×K buffer 2.5μL，1% BSA 5 μL。37℃水浴4h。酶切后的mhp107-C和pGEX-6P-2经胶回收试剂盒回收。
通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3:1的原则，设计连接反应体系如下：mhp107-C 3μL，pGEX-6P-2载体5.5μL，T4 ligase 0.5 μL，T4 ligase buffer 1μL。22℃连接 1h。
参照《精编分子生物学实验指南》将连接产物转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态。
阳性重组子的筛选与鉴定参照实施例2。酶切测序正确的重组质粒命名为pGEX-6P-2-mhp107-C，重组菌命名为XL-1 Blue-Mhp107-C。pGEX-6P-2-mhp107-C酶切鉴定图片见附图5，重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C中mhp107-C基因片段测序结果见附图6，本发明的Mhp107蛋白的重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
实施例5 Mhp107-C蛋白的表达与纯化
重组菌XL-1 Blue-Mhp107-C经37℃220 rpm培养至OD600为07-0.9时经1 mmol/LIPTG诱导4h。离心弃上清后加入原菌液体积1/20 PBS，超声波破菌。破菌产物与谷胱甘肽Beads室温结合1~2h。经PBST和PBS洗涤后，部分结合产物经PreScission Protease酶室温酶切5h，4℃10 000 rpm 离心1 min，分离酶切上清和沉淀。原结合产物、酶切后离心上清、酶切后沉淀加入适量SDS-PAGE上样缓冲液，105℃煮沸 10 min。
参照《精编分子生物学实验指南》配置12% SDS-PAGE凝胶。电泳观察蛋白表达和纯化情况。结果见附图7。
实施例6Mhp107-C蛋白免疫小鼠产生抗血清
纯化的Mhp107-C蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，调整蛋白浓度为2 mg/mL。0.5 mL蛋白与0.5 mL弗氏完全佐剂研磨为油包水状乳剂，腹股沟和前肢腋窝皮下免疫5只7周龄Balb/c小鼠（每只0.2 mL），21、28 d免疫0.5 mL纯化蛋白与0.5 mL弗氏不完全佐剂研磨为油包水状乳剂（每只0.2 mL），35d免疫0.5 mL纯化蛋白（每只0.1 mL）。42 d时ELISA和Western blotting检测小鼠血液抗体效价。ELISA结果显示抗体效价为1:10000。Westernblotting结果显示当抗体1:1000稀释时，能与Mhp107-C蛋白反应（附图8）。
Western blotting步骤：
将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE，整齐的切下待转移部位的凝胶，浸泡于电转缓冲液中。剪取6张同样大小的滤纸（面积较凝胶块略大），同两张海绵一起浸泡于缓冲液中；取一块滤纸同样大小的PVDF膜，在100%甲醇溶液中浸泡10s后，再浸入转移缓冲液中3 min。
电转与封闭：电转“三明治”顺序如：正极（白色）/海绵/3层滤纸/硝酸纤维膜/GE胶/3层滤纸/海绵/负极（黑色）。将“三明治”夹子放入预装有电转膜缓冲液的电泳槽中，加盖，接通电源，恒压75V，50 min；转膜后的PVDF膜用去离子水冲洗一下，放入封闭液中温育30 min，洗涤液冲洗膜3次，每次5min。
加入一抗（用封闭液1:1000稀释）后4℃过夜，洗膜3次，每次5 min；加入1:10000稀释的二抗，温育1 h，洗膜3次，每次5 min；ECL显色观察结果。
实施例7 Mhp107-C蛋白与猪Mhp阳性血清和阴性血清反应
采集200-400日龄猪血清50份，猪肺炎支原体抗体检测试剂盒测定Mhp抗体，操作步骤按照说明书进行。选择8份Mhp猪阳性血清和5份Mhp猪阴性血清。Western blotting检测Mhp107-C蛋白与8份Mhp猪阳性血清、5份Mhp猪阴性血清的免疫反应性。包括Mhp107-C蛋白逐个与Mhp阳性血清反应、Mhp107-C蛋白与混合的8份Mhp猪阳性血清反应、Mhp107-C蛋白逐个与Mhp猪阴性血清反应、Mhp107-C蛋白与混合的5份Mhp猪阴性血清反应。猪血清用PBS1:200稀释，HRP标记羊抗猪IgG二抗用PBS 1:10000稀释。操作方法参照实施例6。结果显示Mhp107-C蛋白不能与Mhp猪阴性血清反应，能与7份Mhp猪阳性血清和混合血清反应，不能与Mhp猪阳性血清7反应，说明Mhp107-C能刺激大部分猪产生免疫反应，具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5%，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎。结果见附图9-附图23。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (13)

1. 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2. 如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQID NO:8。
3.如权利要求1或2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1）通过PCR扩增Mhp168菌株mhp107基因的第1666~3099位的核苷酸序列，所述的PCR扩增的引物为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；
2）将步骤1）得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列；
3）将步骤2）得到的重组蛋白Mhp107-C的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载体；
4）将步骤3）得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白Mhp107-C。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min；98ºC变性1 min，50ºC退火1 min，72ºC延伸1min 40 s，30 cycles；72ºC 延伸6min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）是通过包括下述步骤的方法实现的：
a）将步骤1）得到的核苷酸序列连接到pMDTM19-T载体，得到pMDTM19-mhp107-C重组质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，培养；
b）提取pMDTM19-mhp107-C重组质粒，并以所述pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以SEQID NO:6和SEQ ID NO:7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhp107-C的编码序列mhp107-CM；
c）将上述PCR产物经DpnI消化、胶回收后，转化宿主菌培养后，提取质粒，选取经鉴定序列正确的载体即为pMDTM19-Mhp107-CM载体；
d）将步骤c）得到的pMDTM19-Mhp107-CM载体以BamHI和NotI双酶切得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤a）中，所述步骤1）得到的核苷酸序列与pMD19TM-T载体的摩尔比为3:1，连接反应体系如下：mhp107-C 4.5μL，pMDTM19-T载体0.5μL，Solution I 5μL，16℃连接1h。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤b）中，所述PCR的反应条件为：98ºC预变性5 min； 98ºC 变性1 min 30 s， 60ºC退火1 min 30 s，72℃延伸4 min 30 s，20cycles；72ºC延伸10 min。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
9. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4）中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和PreScission Protease 酶实现的。
10.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地连接编码如权利要求1或2所述的重组蛋白的核苷酸序列形成。
11.如权利要求10所述的载体，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
12.如权利要求1或2所述的重组蛋白在制备用于预防猪支原体肺炎的药物中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物为用于预防猪支原体肺炎的亚单位疫苗。
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