CN110093357B

CN110093357B - 猪流行性腹泻病毒多表位抗原、编码基因、制备方法及应用

Info

Publication number: CN110093357B
Application number: CN201910306949.7A
Authority: CN
Inventors: 刘文俊; 杨培洁; 邓汝森; 周德荣; 黄运茂; 田允波
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: CN110093357A

Abstract

本发明提供了一种编码猪流行性腹泻病毒多表位抗原的基因，以及一种猪流行性腹泻病毒多表位抗原，还提供了上述猪流行性腹泻病毒多表位抗原的制备方法。本发明具有以下优点和有益效果：1)上述猪流行性腹泻病毒多表位抗原是的利用诺如病毒P颗粒嵌合猪流行性腹泻病毒多表位抗原，充分还原了病原的天然结构蛋白，仅表达主要的病毒表面抗原蛋白，明显地避免了许多无关抗原诱发的非特异免疫反应和毒力返强等问题；2)上述制备方法制作成本低、耗时短和安全；3)制得的猪流行性腹泻病毒多表位抗原具备良好的生物活性和反应原性。

Description

猪流行性腹泻病毒多表位抗原、编码基因、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性肠道传染病，以呕吐和水样腹泻为主要特征，各年龄段和各品种的猪均易感，对幼龄仔猪致死率高；PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，病毒核酸为正义单链RNA，基因组全长约28kb，主要结构蛋白为纤突糖蛋白(S蛋白)、小膜蛋白(E蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。

该病于1978年在英国首次被报道，后世界各国均有发现。中国于1980年首次报道该病。2010年下半年，PED在中国各地再次大规模暴发，且临床症状较之前严重，仔猪病死率达100％，仅中国南部10省就有过百万头仔猪发病死亡，给养猪业带来重大损失。腹泻流行期间，多数发病猪场都采取了各种防治措施，如选用中国已商品化的PEDV/PGEV二联腹泻苗或国外引进的弱毒疫苗进行疫苗接种，使用各类抗生素或中药制剂对病猪进行药物治疗，采集病猪粪便经处理后进行反饲治疗等，但防治效果均不理想。其次，PEDV与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌等肠道感染疾病的临床症状和病理变猪流行性腹泻(Porcineepidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性动物传染病，可引起各种年龄猪呕吐、腹泻、脱水等临床症状，1周龄内仔猪的发病率和死亡率高达100％。1971年，英格兰的架子猪和育肥猪中首次爆发PED，1973年，中国上海的猪场爆发了猪病毒性腹泻，随后在日本、韩国、泰国等地相继爆发PED。病在临床症状上与TGE相似，所有日龄的猪只均能产生剧烈腹泻和稀水样粪便的症状，成年猪一般不会死亡，而乳猪的死亡率在超过了50％。2006年，PEDV-M基因的遗传衍化分析表明：中国PEDV流行毒株与欧洲、韩国和日本的毒株亲缘性较小。2010年起，PED持续给中国养猪业造成巨大的经济损失。

PED的预防措施有：PED灭活苗、PED弱毒苗、亚单位疫苗和乳酸杆菌疫苗。PEDV的免疫主要依靠SIgA的黏膜免疫，研究表明，母源SIgA的免疫作用对哺乳仔猪抵抗PEDV的感染起到主要作用，而血液的中和抗体不对仔猪起到明显的保护作用。所以，如何刺激动物机体产生高效价的分泌型IgA抗体，是疫苗免疫以及PED防治的关键。在实际生产中，针对暴发PED的猪场，采集发病仔猪的肠道制备组织灭活苗对全群母猪紧急肌肉注射免疫，对PED有确切的免疫效果，但是组织灭活苗存在制作成本高，制作周期长，抗原含量不确切，抗原成分复杂等缺点不适合常规猪场免疫。另外，鉴于细胞灭活苗的免疫效果不理想，且弱毒活疫苗可能会转变成野毒株而造成毒力返强的情况，所以养猪行业内急需一种更加稳定、高效、实惠的新型疫苗。研究至今，新型疫苗包括了乳酸杆菌疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等。其中，亚单位疫苗具有完整生物体的天然成分，而且仅表达主要的病毒表面抗原蛋白，明显地避免了许多无关抗原诱发的非特异免疫反应和毒力返强等问题，则以基因工程为技术支持的亚单位疫苗研究具有广阔的前景。因此，研制PED亚单位疫苗成为预防PED流行的优先选择。

发明内容

本发明旨在提供一种安全、稳定且具有高免疫原性的猪流行性腹泻病毒多表位抗原，以满足研制PED亚单位疫苗的需求。

本发明所采取的技术方案是：

提供了一种编码猪流行性腹泻病毒多表位抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID№.1或SEQ ID№.2所示。

提供了一种猪流行性腹泻病毒多表位抗原，其氨基酸序列如SEQID№.3或SEQ ID№.4所示。

还提供了上述猪流行性腹泻病毒多表位抗原的制备方法。具体包括步骤：

1)合成含有如SEQ ID№.1所示核苷酸序列的目的基因克隆载体；

2)将目的基因克隆载体转化入感受态细胞构建原核克隆菌，进行扩增培养，随后抽提质粒并进行双酶切，获得酶切产物；

3)对步骤2的酶切产物进行纯化；

4)将纯化后的酶切产物与经双酶切的原核表达载体连接，得到目的基因表达载体；

5)将目的基因表达载体转化入感受态细胞构建原核表达菌；

6)原核表达菌的重组蛋白诱导表达及表达产物的纯化，获得猪流行性腹泻病毒多表位抗原。

其中，步骤4所述原核表达载体是由pGEX-4T-1载体嵌入编码诺如病毒P颗粒的基因序列而成，其核苷酸序列如SEQ ID№.7所示。该编码诺如病毒P颗粒的基因序列具有酶切位点SpeⅠ和ClaⅠ，所述酶切产物通过酶切位点SpeⅠ和ClaⅠ与pGEX-4T-1载体连接。

另外，步骤5所述目的基因表达载体经过PCR鉴定、重组质粒双酶切鉴定、重组质粒测序鉴定或其组合后，再进行转化。所述PCR鉴定的反应体系中包含如SEQ ID№.5所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID№.6所示核苷酸序列的下游引物。

进一步，步骤2所述的感受态细胞为DH5α；步骤5所述的感受态细胞为BL21。

制得的猪流行性腹泻病毒多表位抗原可应用于制备亚单位疫苗。

PEDV-S刺突蛋白是在病毒表面介导病毒进入天然宿主中的I型糖蛋白多肽，其可分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)结构域。S1蛋白含有多个中和表位，是开发抗PEDV有效疫苗的免疫优势区。PEDV-S1具有抗原表位区域aa499-638(namely theCO-26Kequivalent,COE)和线性表位S1D6、S1D5。本技术方案将以PEDV-S1的三个抗原表位作为PED多表位抗原的主要抗原决定簇，以充分提高PED多表位抗原的免疫原性与反应原性。并且，诺如病毒P颗粒(NoV-P-particle)是由NoV衣壳蛋白的突出(P)结构域的24个拷贝形成的亚病毒颗粒，其容易制备，非常稳定且具有高免疫原性。每个P结构域有三个表面环，其已被证明可用于外来抗原呈递。因此，P颗粒被认为是针对许多传染性疾病如NoV，轮状病毒和流感病毒疫苗开发的优秀平台。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1)上述猪流行性腹泻病毒多表位抗原是的利用诺如病毒P颗粒嵌合猪流行性腹泻病毒多表位抗原，充分还原了病原的天然结构蛋白，仅表达主要的病毒表面抗原蛋白，明显地避免了许多无关抗原诱发的非特异免疫反应和毒力返强等问题；

2)上述制备方法制作成本低、耗时短和安全；

3)制得的猪流行性腹泻病毒多表位抗原具备良好的生物活性和反应原性。

附图说明

图1为ppGEX-PEDV-SE表达产物SDS-PAGE鉴定结果图；

图2为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白Western-blotting检测结果图；

图3为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白浓度梯度诱导的SDS-PAGE结果图；

图4为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白时间梯度诱导的SDS-PAGE结果图；

图5为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白可溶性SDS-PAGE检测；

图6为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白可溶性Western-blotting检测结果图；

图7为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白纯化的SDS-PAGE检测图；

图8为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白纯化的GST检测图；

图9为ppGEX-PEDV-SE重组蛋白纯化的PE DV阳性血清Western-blotting检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例中所用的引物由上海生物工程有限公司合成；感受态细胞BL21(DE3)、DH5α购自TIANGEN公司；表达载体：空载体pGEX-4T-1购自鼎国昌盛生物技术有限责任公司；含三个抗原表位COE、S1D6、S1D5的PEDV-S1载体(简称PEDV-SE-PUC57)甘油菌由生工生物工程(上海)股份有限公司构建；含P-particle的pGEX-4T-1(简称ppGEX-4T-1)甘油菌由南方医科大学提供；以免疫流行性腹泻病毒CV777疫苗的猪血清作为阳性血清。

实施例一、PEDV-S1抗原表位基因的设计

根据PEDV-S1具有的抗原表位区域aa499-638(namely the CO-26K equivalent,COE)、线性表位S1D5、S1D6均能诱导机体产生中和抗体，则由GenBank公布的PEDV-S1(GenBank:JX501322.1)序列，选取PEDV-S1的COE、S1D5和S1D6三个抗原表位基因结合两段柔性多肽基因作为此多表位抗原的主要抗原表位基因(简称PEDV-SE)，再由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成为PEDV-SE-PUC57甘油菌。

实施例二、目的基因PEDV-SE与表达载体ppGEX-4T-1的纯化

1、PEDV-SE-PUC57甘油菌和ppGEX-4T-1甘油菌扩增与质粒的抽取

(1)将PEDV-SE-PUC57甘油菌和ppGEX-4T-1甘油菌于Amp培养基平皿上平板划线，于37℃培养箱内培养12-16h；

(2)分别挑取单个菌落接种于含100μg/mLAmp的5mLLB肉汤中，于37℃恒温摇床中200rpm培养16-20h；

(3)PEDV-SE-PUC57甘油菌和ppGEX-4T-1甘油菌的质粒抽取，步骤如下：

(A)将5mL菌液分装于5支离心管中，10,000×g离心1min。

(B)倒出培养基，各加入250μLSolution I，吹打混匀。

(C)加250μL SolutionII后轻轻晃动管子2-3min；处理过程中避免剧烈混合，因为这会剪切染色体DNA而导致更低的质粒纯度；且不要让裂解反应进行超过5min；储存溶液II在不使用时应密封，以避免空气中的二氧化碳的酸化。

(D)加入350μL SolutionⅢ。立即倒置数次，直到絮状白色沉淀形式，避免局部沉淀。

(E)最大速度(>13,000g)离心10min。一个致密的白色颗粒将形成。

(F)将HiBind DNA Mini Column插入2mL收集管中。将步骤(E)中所得的上清液小心地吸入瓶中，避免吸取颗粒和细胞碎片。以最大速度离心1min。

(G)弃去滤液，重新使用收集管。加入500μL HBC Buffer，以最大速度离心1min。

(H)弃去滤液并重新使用收集管。加入700μLDNAWash Buffer，最高速度离心1min。

(I)弃滤液，以最大速度将空HiBind DNA Mini Column离心2min。在洗脱前干燥HiBind DNA Mini Column基质很重要，因为残留乙醇可能会干扰后续的操作。

(J)于1.5mL微量离心管中放入HiBind DNA Mini Column。

(K)于柱膜中心加入30μL无菌去离子水。从HiBind DNA MiniColumn中洗脱DNA的效率是依赖PH的。如果使用无菌去离子水，应确保pH值在8.5左右。

(L)在室温下静置1min，最高速度离心1min。第一次约70％的结合DNA被洗脱，而第二次洗脱后残留的DNA都会被洗脱下来，但是浓度较低。

2、将PEDV-SE-PUC57和ppGEX-4T-1质粒转化入感受态细胞DH5α

(1)取-80℃的100μL DH5α感受态细胞，冰上融化后，加入PEDV-SE-PUC57质粒或ppGEX-4T-1质粒5μL，混匀，冰浴30min。

(2)42℃水浴90s，再放冰上2min。

(3)加入400μLLB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养45min，恢复质粒抗性。

(4)4℃、4000rpm离心5min，弃上清400μL，将剩余菌液涂于氨苄平板，37℃培养30min(平皿正放)，菌液吸收完全后将平皿倒置培养约12h，直至肉眼可见单菌落为止。

3、将PEDV-SE-PUC57和ppGEX-4T-1的DH5α细胞进行抽提质粒与双酶切

(1)挑取PEDV-SE-PUC57和ppGEX-4T-1的DH5α的单个菌落分别接种于含100μg/mLAmp的5mLLB肉汤中，在37℃恒温摇床中200rpm培养16-20h后，进行抽提质粒，通过Epoch微孔板分光光度计，测得ppGEX-4T-1质粒浓度321.1μg/mL，PEDV-SE-PUC57质粒浓度511.4μg/mL。

(2)对PEDV-SE-PUC57和ppGEX-4T-1质粒(均含ClaⅠ和SpeⅠ酶切位点)分别进行双酶切，体系如表1。

表1双酶切体系

其中，x·321.1μg/mL≦1μg y·511.4μg/mL≦1μg

x≦3.1μL y≦2.0μL

以上各做5管，共100μL，于37℃水浴锅反应4h以上。

4、将PEDV-SE-PUC57和ppGEX-4T-1的酶切产物进行纯化

先取5μL酶切产物与loading buffer混匀后，进行琼脂糖凝胶电泳，若在紫外下目的条带明显时，可证明酶切成功，后将剩余酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后进行胶回收，具体步骤如下：

(1)先称量1.5mL干净离心管的重量，后将凝胶装于其中，确定凝胶的重量。假设凝胶密度为1g/mL，凝胶的体积由下式得出如下：质量0.3g的凝胶片则具有0.3mL的体积。

(2)混合1：1的结合缓冲液(XP2)，在50-60℃环境下直到凝胶完全融化。每2-3min摇动一次。

(3)将

DNA Mini Column置于2mL收集管中。

(4)将步骤(2)中不超过700μL的DNA琼脂糖溶液添加到

DNA MiniColumn。

(5)在室温下10,000×g离心1min。丢弃滤液并重新使用收集管。

(6)重复步骤(4)和(5)。

(7)加入300μL结合缓冲液(XP2)。在室温下以最大速度(≥13,000g)离心1min。丢弃滤液并重新使用收集管。加入700μL SPW洗涤缓冲液。室温下以最大速度离心1min，丢弃滤液并重新使用收集管。

(8)将空的HiBind DNA Mini Column以最大速度离心2min至干燥。注意：洗脱前将HiBind DNA Mini Column基质干燥很重要，因为残留乙醇可能会干扰下述操作。

(9)将HiBind DNA Mini Column转移到干净的1.5mL微量离心管中。将15-30μL洗脱缓冲液或去离子水直接加入色谱柱中心膜。注意：从HiBind DNA Mini Column中洗脱DNA的效率是依赖于pH值的。如果用去离子水洗脱DNA，应确保pH值在8.5左右。

(10)在室温下静置2min。以最大速度离心1min。注意：第一次约70％的结合DNA被洗脱，而第二次洗脱后残留的DNA都会被洗脱下来，但是浓度较低。最后将DNA保存在-20℃。通过Epoch微孔板分光光度计，测得ppGEX-4T-1载体浓度42.58μg/mL，PEDV-SE目的基因浓度40.12μg/mL。

实施例三、PEDV-SE嵌合ppGEX-4T-1表达载体的构建

1、将PEDV-SE和ppGEX-4T-1的酶切产物进行连接

取实施例二中的PEDV-SE目的基因片段(510bp)与ppGEX-4T-1表达载体(5915bp)的酶切产物，连接体系如表2；其中目的基因物质的量：ppGEX-4T-1物质的量＝10：1，目的基因物质的量为0.3pmol，表达载体物质的量为0.03pmol。测得的PEDV-SE目的片段浓度为40.12μg/mL，ppGEX-4T-1载体测得浓度为42.58μg/mL。由于1pmol1000bpDNA为0.66μg。则1pmol510bp目的片段为0.337μg，1pmol5915bp左右载体为3.90μg。

表2连接体系

PEDV-SE目的基因需要加入的体积为x，可列下式

40.12μg/mL·x＝0.337μg/pmol×0.3pmol

x≈2.52μL；

ppGEX-4T-1载体需加入的体积为y，可列下式

42.58μg/mL·y＝3.90μg/pmol×0.03pmol

y≈2.75μL。

分别将上述试剂加样，将反应体系置于基因扩增仪16℃过夜(12-16h)。

2、连接产物转化

转化方式与实施例二的步骤2相同，将产物转化入感受态细胞DH5α中，涂布于终浓度0.1mg/mL Amp的平皿，37℃培养12-16h。

3、ppGEX-PEDV-SE重组质粒鉴定

根据由生物工程公司合成的PEDV-S1的COE、S1D5和S1D6三个抗原表位基因结合两段柔性多肽基因设计引物。猪流行性腹泻病毒引物扩增区域包含S1蛋白主要的抗原表位区：扩增长度为510bp，引物序列如下：

上游引物F1：5’-AGTGTTACTTTGCCATCATTTA-3’(SEQ ID№.5)；

下游引物F2：5’-ATCTTGACTTGGCCAGACTGT-3’(SEQ ID№.6)。

(1)菌落PCR鉴定：从步骤2的平皿随机挑取数个培养板上的单菌落，PCR反应体系如表3。反应条件为：94℃预变性2min；94℃热变性30s、50℃30s、72℃1min，共30个循环；72℃5min终延伸。

表3PCR反应体系

PCR结束后，1.0％琼脂糖凝胶上，120V电泳30min，于凝胶成像仪上进行分析。

(2)重组质粒ppGEX-PEDV-SE双酶切鉴定：将步骤2的平皿鉴定为阳性克隆的单个菌落挑出，接种于5mL(Amp)LB液体培养基中，37℃、220rpmin振摇20h，提取阳性克隆菌液的质粒，将提取的重组质粒利用分光光度计测得浓度为250μg/mL，做好标记，一部分在-80℃保存，另一部分进行双酶切鉴定，体系见表4：

表4双酶切反应体系

其中，ppGEX-PEDV-SE质粒：x·250μg/mL≦1μg，x≦4μL

37℃水浴4h后，产物混合Loading Buffer，于1％琼脂糖凝胶上120V电泳30min。

4、ppGEX-PEDV-SE重组质粒的测序

将双酶切鉴定中抽提得到的阳性重组质粒取15-20μL送Sangon Biotech公司进行测序，测序结果与GenBank已发表的PEDV-S1三个抗原表位基因进行比较。

5、原核表达菌ppGEX-PEDV-SE及空白对照的构建

取pGEX-4T-1空载体质粒和经重组质粒的测序确认的ppGEX-PEDV-SE阳性质粒转化到BL21感受态细胞中，构建原核表达菌，转化步骤如下：

(1)从-80℃取出保存好的重组质粒、pGEX-4T-1和BL21感受态细胞放于冰上融化。

(2)分别加5μL重组质粒、pGEX-4T-1到感受态细胞，轻轻吹匀，冰浴30min。

(3)将步骤(2)中混合液分别涂布在0.1mg/mLAmp的LB固体培养基上，作好记号。

(4)37℃培养箱正放培养30min待完全吸收后，倒放培养12h。

实施例四、重组蛋白的诱导表达、SDS-PAGE与Western-blotting

1、重组蛋白的诱导表达

挑取原核表达菌ppGEX-PEDV-SE及空白对照的单菌落，利用IPTG进行诱导，步骤如下：

(1)分别挑取试验组和空载体对照组的单菌落接种于含终浓度为0.1mg/mL Amp的5mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。

(2)按1：50加入到终浓度为0.1mg/mL Amp的5mL LB液体培养基中，每一种质粒做2管，一管进行诱导，另一管进行未诱导用来作为对照组；37℃、200rpm振荡培养约3h，菌液OD600为0.6-0.8。

(3)向菌液中加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃、200rpm振荡培养2h，诱导表达。

(4)用1.5mL离心管收集菌体1mL，12000rpm离心1min。

(5)弃上清，用100μL PBS洗涤沉淀，再12000rpm离心1min。

(6)弃上清，加入100μL1％SDS，吹散菌体至混匀状态，1000rpm离心10s，用金属浴或水浴锅100℃加热5-10min，室温冷却5min，12000rpm离心5-10min，收集60μL上清(即蛋白样品)，取10μL进行全菌蛋白浓度的测定，其余于-20℃保存备用。

(7)经软件DNAStar 7.1分析，目的基因(包括GST标签)表达的蛋白分子量约为79kD。

2、全菌蛋白浓度的测定

使用Pierce^TMBCA蛋白分析试剂盒进行全菌蛋白浓度的测定，具体步骤如下：

(1)制备稀释的牛血清白蛋白(BSA)标准

蛋白标准品配制，其中稀释液为蛋白溶解液，配方见表5。

表5蛋白标准浓度配制

(2)制备BCA工作试剂(WR)

A.使用以下公式确定所需WR的总体积：

(#标准+#未知数)×(#重复数)×(每个样品WR的体积)＝需要的总体积WR

例如：对于3个未知样品和每个样品重复2次的标准试管程序：

(9个标准品+3个未知物)×(2个重复)×(2mL)＝需要48mLWR

B.通过将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B(50:1，试剂A:B)混合来制备WR。

例如，将50mL试剂A与1mL试剂B混合。

(3)检测操作：移取25μL的每个标准品或未知样品到96孔酶标板中(工作范围＝20-2000μg/mL)，做3个重复，向每个孔中加入200μLWR，并在平板摇床上彻底混合平板30秒，盖上盖板，37℃孵育30min。将平板冷却至室温。在读板仪上测量562nm处的吸光度。

(4)标准曲线绘制与蛋白浓度计算：所有个体标准和未知样本重复应从562nm测量值中减去空白标准品平均562nm吸光度测量值。以吸光值为y值，蛋白浓度为x值，绘制每个BSA标准空白校正的562nm测量值与其对应的标准曲线。作散点图，添加趋势线，得标准曲线方程及相关系数。根据方程，以蛋白样品的562nm吸光度就可求出样品浓度。

3、重组蛋白SDS-PAGE检测

(1)准备：先自来水洗干净玻璃板，后用酒精擦拭玻璃板，晾干后将玻璃板装在专用的板架上。

(2)检漏：加入ddH₂O到两夹层玻璃板中，2-3分种后观察水面情况，确定无渗漏现象，倒去ddH₂O并利用干净滤纸吸干残留水分。

(3)10％分离胶配制(配方如表6所示)：于烧杯中依次加入ddH₂O、30％Acr-Bis、下层胶缓冲液(4×)、10％过硫酸铵和TEMED，用移液枪将上述液体吹匀，吹匀过程中尽量不产生气泡，而后将上述混合液迅速用移液枪加入两玻璃板夹层，高度在3-4cm，以便留出灌注浓缩胶所需的空间。同时以乙醇封顶，保持液面的平行。

(4)5％浓缩胶配制(配方如表7所示)：大概在30min后分离胶凝固，则将上层的乙醇倒掉，并用滤纸将其夹层吸干，于烧杯中依次加入ddH₂O、30％Acr-Bis、下层胶缓冲液(4×)、10％过硫酸铵(Ammonium Persulfate,APS)和TEMED，用移液枪将上述液体吹匀，尽量不产生气泡。加入上述混合液溶液，高度在1-1.5cm，不能产生气泡，立刻垂直插入梳子，室温放置至胶凝固，约30min。

(5)装槽：待浓缩胶凝固完全，小心拔出梳子，取出制好的聚丙烯酰胺凝胶玻璃板，将其放进电泳槽中并固定好。

(6)上样：取测定好浓度的蛋白样品10μL与2μL 6×SDS蛋白上样缓冲液混匀后，于沸水浴5-10min，室温冷却5min。在电泳槽中加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液，拔掉梳子，后用移液枪吹打胶孔，以清除胶孔内的无关杂质。将处理好的样品加到样孔中，每孔上样量为10ug，并加入5μL蛋白Marker作为对照。

(7)电泳：接通电源，80V电泳30min，待溴酚蓝染料前沿进入分离胶后，将电压调为120V，继续电泳50min左右或等溴酚蓝前带将要到达分离胶底部时为止。

(8)染色：先用100mL去离子水，摇床上摇动洗涤凝胶5min，共洗涤3-5次，可以达到去除凝胶中的SDS等杂质的作用；弃掉去离子水，加入考马斯亮蓝快速染色液，染色10-30min。

(9)脱色：回收染色液，加100mL去离子水，在摇床上摇动脱色。每隔5-15min换掉液体，继续在摇床上脱色。通常脱色30-120min即可获得背景很低的凝胶染色效果。检测结果如图1所示，图中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1为未诱导的pGEX-4T-1，泳道2为诱导的pGEX-4T-1，泳道3为未诱导的ppGEX-PEDV-SE，泳道4为诱导的ppGEX-PEDV-SE。图中泳道2所显示pGEX-4T-1被诱导后表达的蛋白分子量分别约为26kD，泳道4所显示ppGEX-PEDV-SE被诱导后表达的蛋白分子量分别约为79kD，而未诱导的均无明显条带。

4、重组蛋白Western-blotting分析

(1)电泳：表达的目的蛋白作为样品按上述方法进行SDS-PAGE电泳试验，电泳结束前预先剪取大小合适的PVDF膜1张和同该膜一样大的滤纸6张。PVDF膜先于甲醇中浸泡10min激活，后于电转缓冲液泡10min；滤纸和海绵在电转缓冲液中稍作浸泡。

(2)转膜：待电泳结束，切取所需凝胶部分于电转缓冲液泡10min，按照负极板-纱布-3层滤纸-膜-分离胶-3层滤纸-纱布-正极板的顺序放妥，在放置期间应该使用用玻棒赶尽滤纸、胶和膜之间可能存在的气泡，否则，在显色时可见膜上有气泡印迹。将上述的转膜板放入电转糟，加入电转缓冲液至膜上沿所在的位置，恒流200mA，电转60min。

(3)洗膜：将转膜结束后的PVDF膜用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。

(4)封闭：把洗毕的膜浸泡在5％脱脂奶粉封闭液，室温摇床80rpm振摇2h或在4℃过夜；洗膜：取出封闭完成的PVDF膜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min。

(5)一抗温育：将GST单抗用TBST作1：10000比例稀释，与PVDF膜在室温作用1h或4℃过夜。

(6)洗膜：取出PVDF膜，用TBST洗涤4次，每次5min。

(7)二抗温育：用TBST对兔抗鼠IgG多抗作1：80000稀释，将PVDF浸泡于其中，室温作用0.5-1h。

(8)洗膜：取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，每次5min；接着用TBS洗涤2次，每次10min。

(9)显色：取出PVDF膜于ECL溶液中浸泡1-2min，即可在暗处发出蓝色荧光。

(10)拍照：将PVDF膜放于化学发光成像系统中进行曝光、拍照，结果如图2所示，并保存图片。图2中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1为未诱导的pGEX-4T-1，泳道2为诱导的pGEX-4T-1，泳道3为未诱导的ppGEX-PEDV-SE，泳道4为诱导的ppGEX-PEDV-SE。pGEX-4T-1空载体在26kD处出现一目的条带，ppGEX-PEDV-SE重组蛋白在79kD左右处出现一目的条带，而未经诱导者无条带，表明重组蛋白得到了成功表达。

5、诱导表达条件优化

①IPTG浓度优化：步骤同2.2.4，将IPTG诱导剂加至终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3.0、3.5、4.0mmol/L。结果如图3所示，图中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1～9分别对应上述0～4.0mmol/L的浓度，优选的IPTG浓度为1.0mmol/L。

②诱导时间优化：步骤同2.2.4，将IPTG终浓度改为上述优化的最适浓度，诱导时间分别为0、1、2、3、4、5、6h。结果如图4所示，图中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1～7分别对应上述0～6h的时长，优选的诱导时间为2h。

6、重组蛋白可溶性分析

在如前所述的最佳诱导条件下，中等体积(200mL)培养重组菌。将诱导表达的重组菌4℃、12000rpm离心10min，收集菌体，用PBS洗涤2-3次，用PBS(10％原培养基体积)重悬菌体。于冰浴条件下，超声波裂解细菌，200-300W，开3s，关3秒，6min，裂解至菌液变清亮，12000rpm离心10min，分离上清和包涵体。通过SDS-PAGE和Western-blotting分析蛋白的可溶性，并由凝胶图像处理系统分析上清样品中所含目的蛋白的比例。

其中，重组蛋白可溶性SDS-PAGE检测结果如图5所示；重组蛋白可溶性Western-blotting检测结果如图6所示；图5和图6中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1为菌体破碎上清，泳道2为菌体破碎沉淀。从图5可以看出上清和沉淀均有出现目的蛋白，表明重组蛋白能以可溶的形式进行表达。经凝胶图像处理系统分析，可知菌体破碎上清中目的蛋白占上清总蛋白的13.1％。虽然上清目的蛋白较少，但是其具有杂蛋白较少和蛋白可溶的优点，便于PEDV疫苗的制备。而图6显示上清和沉淀均有出现目的蛋白，虽然上清目的蛋白较少，但是其具有非特异性蛋白较少和蛋白可溶的优点，便于PEDV疫苗的制备。

实施例五、重组蛋白大量表达及纯化

1、重组蛋白大量诱导表达

估算后期蛋白的需要量，诱导量在1L左右。收集菌液至离心管中，4℃4,000g离心20min或4℃15,000g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20℃或-80℃冻存备用。

2、重组蛋白的纯化

(1)重组蛋白大量诱导表达后，先进行PBS按照每克细菌沉淀湿重加入4mL的比例加入裂解缓冲液，重悬菌体。

(2)加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰上放置30min。

(3)冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。

(4)4℃,10000g离心20-30min，收集裂解液上清并置于冰上。取20μL上清留于检测用。

(5)取1mL混合均匀的Beyogold^TMGST-tag Purification Resin，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，加入0.5mL裂解缓冲液以重悬凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，重复1-2次。加入约4mL裂解液上清，4℃水平摇床上摇动60min。

(6)将裂解液和Beyogold^TMGST-tag Purification Resin的混合物装入亲和层析柱空柱管中。在重力作用下使柱内液体流出，收集约20μL流穿液留于检测用。

(7)洗柱5次，每次加入0.5-1mL裂解缓冲液，每次收集约20μL流穿液留于检测用。

(8)洗脱目的蛋白5-10次，每次用0.1mL洗脱缓冲液。将洗脱液收集到离心管中，获得的洗脱液即为纯化的目的蛋白样品。

3、纯化重组蛋白SDS-PAGE

将上述纯化后重组蛋白样品取20μL加入6×SDS-PAGE上样缓冲液4μL，在沸水中煮5-10min，处理样品进行SDS-PAGE，电泳结果如图7所示。

4、纯化重组蛋白Western-blotting检测

(1)重组蛋白的生物活性检测：

A.一抗温育：将鼠抗GST单抗用TBST缓冲液作1：4000稀释，室温作用2h。

B.二抗温育：将兔抗鼠IgG多抗用TBST作1：80000比例稀释，室温作用0.5-1h。

对纯化后的蛋白进行生物活性检测，用GST单抗进行温育后显色。结果如图8所示，图中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1为纯化的重组蛋白，在约79kD处各有一清晰条带，证明纯化的重组蛋白仍具有生物活性。

(2)重组蛋白的反应原性检测：

A.一抗温育：将猪抗PEDV阳性血清作1：5000稀释，室温作用2h。

B.二抗温育：将HRP标记的羊抗猪IgG抗体用TBST缓冲液作1：20000比例稀释，在室温作用0.5-1h。

对纯化后的重组蛋白进行反应原性检测，用PEDV阳性血清进行温育后显色，结果如图9所示，图中泳道M为标准蛋白分子量Marker，泳道1为纯化的重组蛋白，在约79kD处各有一清晰条带，证明纯化的重组蛋白具有良好的反应原性，抗原表位得到了正确的表达。

实施例六、重组蛋白浓度测定

因纯化后的重组蛋白含GSH、DTT等干扰物质，不可用BCA蛋白检测试剂盒测定，所以利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，步骤如下：

1、蛋白标准的准备

按照表8配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/mL蛋白标准品，稀释液同检测样品一致。

表8蛋白标准浓度配制

2、蛋白浓度测定

(1)取10μL蛋白标准于96孔板的样孔中。

(2)取10μL样品到96孔板的样品孔中，做3个重复。

(3)各孔加入300μLG250染色液。

(4)用酶标仪测定A595。

(5)根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度。

SEQUENCE LISTING

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 猪流行性腹泻病毒多表位抗原、编码基因、制备方法及应用

<130> 2019

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 510

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actagtgtta ctttgccatc atttaatgat cattcttttg ttaacattac tgtctctgcg 60

tccttcggtg gtcatagtgg tgccaacctt attgcatctg acactactat caatgggttt 120

agttctttct gtgttgacac tagacaattt accatttcac tgttttataa cgttacaaac 180

agttatggtt atgtgtctaa ctcacaggac agtaattgcc ctttcacctt gcaatctgtt 240

aatgattacc tgtcttttag taaattttgt gtttccacca gccttttggc tagtgcctgt 300

accatagatc tttttggtta ccctgagttt ggtagtggtg ttaagtttac gtccctttac 360

tttcaattca caaagggtga gttgattact ggcacgccta aaccacttga aggtgtcacg 420

gacgttggac caggaccagg atatagtaac ataggtgttt gtaaaggacc aggaccagga 480

cagtctggcc aagtcaagat tgcaatcgat 510

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtccaact caagattccc cattcctttg gaaaagttgt acacgggtcc cagcagtgct 60

tttgttgtcc aaccacaaaa tggcaggtgc acgactgatg gcgtgctctt aggcactacc 120

cagctgtctg ctgtcaatat ctgcaccttc agaggggatg tcacccacat tgcaggcagt 180

catgactata taatgaattt ggcttctcaa aattggaaca attatgaccc aacagaagaa 240

atcccagccc ctctgggaac tccagatttc gtgggaaaga tccaaggcat gctcacccaa 300

accacaagag aggatggctc gacccgcgcc cacaaagcta cagtgagcac tgggagcgtc 360

cacttcactc caaagttggg cagtgttcaa tacaccacta gtgttacttt gccatcattt 420

aatgatcatt cttttgttaa cattactgtc tctgcgtcct tcggtggtca tagtggtgcc 480

aaccttattg catctgacac tactatcaat gggtttagtt ctttctgtgt tgacactaga 540

caatttacca tttcactgtt ttataacgtt acaaacagtt atggttatgt gtctaactca 600

caggacagta attgcccttt caccttgcaa tctgttaatg attacctgtc ttttagtaaa 660

ttttgtgttt ccaccagcct tttggctagt gcctgtacca tagatctttt tggttaccct 720

gagtttggta gtggtgttaa gtttacgtcc ctttactttc aattcacaaa gggtgagttg 780

attactggca cgcctaaacc acttgaaggt gtcacggacg ttggaccagg accaggatat 840

agtaacatag gtgtttgtaa aggaccagga ccaggacagt ctggccaagt caagattgca 900

atcgatatcc tgcaaactgg ccaaaacacg aaattcaccc cagtcggcgt catccaggat 960

ggtaataacc accaaaatga accccagcaa tgggtactcc caaattactc aggtagaact 1020

ggtcataatg tgcacctagc tcctgccgtt gcccccactt tcccaggcga gcaacttctc 1080

ttctttaggt ccactatgcc cgggtgtagc gggtatccca acatgaatct ggattgccta 1140

ctcccccagg aatgggtgca gcacttctac caagaagcag ctccagcaca atctgatgtg 1200

gctctgctga gatttgtgaa tccagacaca ggtagggttc tgtttgagtg caagctccat 1260

aaatcaggct atgtcacagt ggctcacact ggcccgcatg atttggttat cccccccaat 1320

ggttatttta gatttgattc ctgggtcaac cagttctaca cacttgcccc catgggaaat 1380

ggagcggggc gcagacgtgc attatgcgat tgccgtggcg attgcttttg ctaa 1434

<210> 3

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn Ile Thr Val

1 5 10 15

Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile Ala Ser Asp

20 25 30

Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr Arg Gln Phe

35 40 45

Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly Tyr Val Ser

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser Val Asn Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu Leu Ala Ser

85 90 95

Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly Ser Gly Val

100 105 110

Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu Leu Ile Thr

115 120 125

Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp Val Gly Pro Gly Pro

130 135 140

Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Gly Pro Gly Pro Gly Gln Ser

145 150 155 160

Gly Gln Val Lys Ile Ala

165

<210> 4

<211> 477

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Ser Asn Ser Arg Phe Pro Ile Pro Leu Glu Lys Leu Tyr Thr Gly

1 5 10 15

Pro Ser Ser Ala Phe Val Val Gln Pro Gln Asn Gly Arg Cys Thr Thr

20 25 30

Asp Gly Val Leu Leu Gly Thr Thr Gln Leu Ser Ala Val Asn Ile Cys

35 40 45

Thr Phe Arg Gly Asp Val Thr His Ile Ala Gly Ser His Asp Tyr Ile

50 55 60

Met Asn Leu Ala Ser Gln Asn Trp Asn Asn Tyr Asp Pro Thr Glu Glu

65 70 75 80

Ile Pro Ala Pro Leu Gly Thr Pro Asp Phe Val Gly Lys Ile Gln Gly

85 90 95

Met Leu Thr Gln Thr Thr Arg Glu Asp Gly Ser Thr Arg Ala His Lys

100 105 110

Ala Thr Val Ser Thr Gly Ser Val His Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser

115 120 125

Val Gln Tyr Thr Thr Ser Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser

130 135 140

Phe Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ser Phe Gly Gly His Ser Gly Ala

145 150 155 160

Asn Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys

165 170 175

Val Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn

180 185 190

Ser Tyr Gly Tyr Val Ser Asn Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr

195 200 205

Leu Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser

210 215 220

Thr Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro

225 230 235 240

Glu Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr

245 250 255

Lys Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr

260 265 270

Asp Val Gly Pro Gly Pro Gly Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Gly

275 280 285

Pro Gly Pro Gly Gln Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Ile Asp Ile Leu

290 295 300

Gln Thr Gly Gln Asn Thr Lys Phe Thr Pro Val Gly Val Ile Gln Asp

305 310 315 320

Gly Asn Asn His Gln Asn Glu Pro Gln Gln Trp Val Leu Pro Asn Tyr

325 330 335

Ser Gly Arg Thr Gly His Asn Val His Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro

340 345 350

Thr Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Thr Met Pro Gly

355 360 365

Cys Ser Gly Tyr Pro Asn Met Asn Leu Asp Cys Leu Leu Pro Gln Glu

370 375 380

Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ala Ala Pro Ala Gln Ser Asp Val

385 390 395 400

Ala Leu Leu Arg Phe Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu

405 410 415

Cys Lys Leu His Lys Ser Gly Tyr Val Thr Val Ala His Thr Gly Pro

420 425 430

His Asp Leu Val Ile Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Asp Ser Trp

435 440 445

Val Asn Gln Phe Tyr Thr Leu Ala Pro Met Gly Asn Gly Ala Gly Arg

450 455 460

Arg Arg Ala Leu Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys

465 470 475

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agtgttactt tgccatcatt ta 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcttgactt ggccagactg t 21

<210> 7

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtccaact caagattccc cattcctttg gaaaagttgt acacgggtcc cagcagtgct 60

tttgttgtcc aaccacaaaa tggcaggtgc acgactgatg gcgtgctctt aggcactacc 120

cagctgtctg ctgtcaatat ctgcaccttc agaggggatg tcacccacat tgcaggcagt 180

catgactata taatgaattt ggcttctcaa aattggaaca attatgaccc aacagaagaa 240

atcccagccc ctctgggaac tccagatttc gtgggaaaga tccaaggcat gctcacccaa 300

accacaagag aggatggctc gacccgcgcc cacaaagcta cagtgagcac tgggagcgtc 360

cacttcactc caaagttggg cagtgttcaa tacaccacta gtttagatgg tccttatcaa 420

cctactacat ttacaccacc tactgattac tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga 480

gtagtatacg agagtacaaa taatagtgac ttttggactg cagtcattgc tgttgaaccg 540

cacgtcaatc cagtagatag acaatataat gtatttggtg aaaataaaca atttaatgta 600

agaaatgatt cagataaatg gaagttttta gaaatgttta gaggcagtag tcaaaatgac 660

ttttataata gacgtacact aacttctgat actagactcg tgggaatatt aaaatatggt 720

ggaagaatat ggacatttca tggtgaaaca ccgagggcta ctactgatag ctcaaacact 780

gcaaatttga acggtatatc aattacaatt cattcagaat tttatattat tccaaggtcc 840

caagagtcta agtgtaatga atatattaac aacggtctaa tcgatatcct gcaaactggc 900

caaaacacga aattcacccc agtcggcgtc atccaggatg gtaataacca ccaaaatgaa 960

ccccagcaat gggtactccc aaattactca ggtagaactg gtcataatgt gcacctagct 1020

cctgccgttg cccccacttt cccaggcgag caacttctct tctttaggtc cactatgccc 1080

gggtgtagcg ggtatcccaa catgaatctg gattgcctac tcccccagga atgggtgcag 1140

cacttctacc aagaagcagc tccagcacaa tctgatgtgg ctctgctgag atttgtgaat 1200

ccagacacag gtagggttct gtttgagtgc aagctccata aatcaggcta tgtcacagtg 1260

gctcacactg gcccgcatga tttggttatc ccccccaatg gttattttag atttgattcc 1320

tgggtcaacc agttctacac acttgccccc atgggaaatg gagcggggcg cagacgtgca 1380

ttatgcgatt gccgtggcga ttgcttttgc taa 1413

Claims

1.编码猪流行性腹泻病毒多表位抗原的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2。

2.猪流行性腹泻病毒多表位抗原，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.4。

3.猪流行性腹泻病毒多表位抗原的制备方法，其特征在于包括步骤：

1)合成含有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的目的基因克隆载体；

2)将目的基因克隆载体转化入DH5α感受态细胞构建原核克隆菌，进行扩增培养，随后抽提质粒并进行双酶切，获得酶切产物；

3)对步骤2的酶切产物进行纯化；

4)将纯化后的酶切产物与经双酶切的原核表达载体连接，得到目的基因表达载体，所述原核表达载体是由pGEX-4T-1载体嵌入编码猪流行性腹泻多表位抗原诺如病毒P颗粒的基因序列而成；

5)将目的基因表达载体转化入感受态细胞构建原核表达菌，所述目的基因表达载体经过PCR鉴定、重组质粒双酶切鉴定、重组质粒测序鉴定或其组合后，再进行转化，所述PCR鉴定的反应体系中包含如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID No.6所示核苷酸序列的下游引物，所述的感受态细胞为BL21；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体内编码诺如病毒P颗粒的基因序列具有酶切位点SpeⅠ和ClaⅠ，所述酶切产物通过酶切位点SpeⅠ和ClaⅠ与pGEX-4T-1载体连接。

5.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒多表位抗原在制备亚单位疫苗中的应用。