CN105198971A - 一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗 - Google Patents

一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，公开了一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗。本发明合成多肽氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。本发明针对HA2抗原区中的颈部区设计一种新型仅包含15个氨基酸的具有免疫原性的合成多肽，其同时具有T/B细胞表位，能够诱导体液免疫，结合包括H1、H2、H3、H5、H7在内的多种亚型流感病毒，同时对H3亚型各种毒株均具有中和活性，相比同样针对该抗原区的其他合成多肽，本发明合成多肽活性最高，具有高效价、高保守性和广谱性，具有作为各亚型流感病毒疫苗的巨大优势。

Description

一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体的说是涉及一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗。
背景技术
流感病毒大爆发是迄今为止对人类生产生活影响最大的流行性疾病之一。上世纪爆发的三次大流感流行，都是由流感病毒引起的，造成了数千万人口死亡，给人类健康和经济造成了巨大危害和损失。据WHO统计，全球每年约有10亿人感染流感病毒，50-100万人死于流感。不同流感病毒亚型的划分是基于红细胞凝集素HA和神经氨酸酶的序列，现阶段在人群中传播的主要流感病毒亚型为甲型H1N1，H3N2以及乙型流感病毒。
阻止流感最有效方法就是接种疫苗，现阶段针对流感病毒的上市疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗，每种疫苗均含有甲1亚型、甲3亚型和乙型3种流感灭活病毒或抗原组份，但是流感病毒传播广泛，复杂多变，疫苗需要不断更新，且WHO的预测准确性有限。
所以高保守性、特异功能性表位疫苗应运而生，而国内已有的相关流感病毒多肽疫苗产品专利大多针对NA及M2e区域，如：申请号CN200810232851、CN200810071174以及CN200810071174。但针对流感病毒表面蛋白HA的表位疫苗研究不足。
HA蛋白是流感病毒表面主要的包膜糖蛋白，在感染细胞过程中，其作用主要表现为结合宿主细胞受体，介导胞吞作用及膜融合过程。HA是流感病毒主要抗原区并且包含大多数中和抗体结合位点。并且由于宿主免疫压力的存在，HA是流感病毒免疫逃逸的主要突变点，其抗原转变也是造成流感病毒大流行的主要原因。早期对HA抗原区域的研究表明，HA抗原区域包含着大量的中和抗体结合位点，而在这之中，针对流感病毒HA1的中和抗体直接抑制病毒与宿主细胞受体的结合，从而达到抑制病毒对宿主细胞的感染。但由于宿主体内的免疫压力，HA1通过极高的突变率及糖基化位点来进行免疫逃逸。所以针对HA1的疫苗保护效果不甚良好。
最近，更多的研究者将疫苗的研究重点转移到HA2上。并且已经分离得到了识别HA2颈部区域的多种具有广谱中和活性的抗体。如单克隆抗体CR6261通过结合HA能够中和group1内的大多数病毒，包括H1、H5、H9、H2，但其对group2无中和作用。单克隆抗体CR8020能够中和大部分group2病毒，包括能够感染人的H3和H7亚型病毒(7-8)。但是，这些单克隆抗体的获得是从个别愈后患者(或动物)筛选得到，具有很大的偶然性，不具备重现性，且造价昂贵。另外一个不足就是，这些单克隆抗体属于被动免疫，虽然这种免疫力效应快，但维持时间短。一般用于治疗，或在特殊情况下用于紧急预防。相对于由机体自身产生抗体，使机体不再担心被病毒感染的主动免疫来说，其仍然略显不足。
为了能够解决主动免疫的问题，有研究人员通过模拟HA2全蛋白三维构象来作为免疫原进行疫苗的制备，然而这种方法并不能保证其百分百保证所合成多肽与HA2三维构象一致，致使所制成疫苗不具备免疫原性。同时，工作量大、成本高也是该方法的一大弊端。也有研究人员考虑采用相对低廉和简单的全病毒进行疫苗的制备，但是HA2在天然病毒中不暴露，利用全病毒作为免疫原诱导的抗体无法识别HA2，通过全病毒无法诱导出针对HA2的中和抗体。此外，全病毒免疫处理方式极其复杂，成本相对合成肽疫苗也是比较高的。因此，如何能够针对流感病毒HA2研制出一种广谱、简单有效的合成多肽疫苗是当务之急。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗，使所述合成多肽针对流感病毒HA2抗原区，且简单有效，具有高效价、广谱性和保守性，能够应用于流感疫苗的制备中，特别是针对H3亚型流感病毒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种合成多肽，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示(以下简称P6)。
本发明针对HA2抗原区中的颈部区设计一种新型的具有免疫原性合成多肽，该多肽只包含15个氨基酸，设计简单成本低廉。经过检测，本发明合成多肽同时具有Th2细胞表位和B细胞表位，表明本发明合成多肽能够促进体液免疫，所诱导抗体具有较高效价。此外，将本发明所述合成多肽与1968-2014年10763株H3亚型菌株HA2氨基酸序列比对分析，本发明所述合成多肽氨基酸序列与对比菌株相比具有高达97％以上的保守性。
为了验证本发明合成多肽与HA蛋白的结合活性以及血凝抑制活性，本发明选取同样针对HA2抗原区中的颈部区且经过比对保守型在97％以上的其他5个合成多肽(以下简称P1-P5)进行对比检测，其氨基酸序列如SEQIDNO:2-6所示；其中，分别为P1针对HA2中76-90位氨基酸序列、P2针对HA2中86-100位氨基酸序列、P3针对HA2中96-110位氨基酸序列、P4针对HA2中106-120位氨基酸序列、P5针对HA2中116-130位氨基酸序列。
将6个合成多肽以KLH载体疫苗、多分支肽疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗的形式制成具体疫苗进行相关检测。在抗体分型试验中，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测各合成多肽免后血清对A/Brisbane/10/2007(H3)HA蛋白的结合活性，结果显示，同时包含B/Th2细胞表位的本发明合成多肽免疫原免后血清结合活性最高，说明本发明合成多肽具有高效价，而其余合成多肽极其显著的低于本发明结合活性；同时检测上述合成多肽免后血清对A/California/04/2009(H1N1)HA蛋白、A/Canada/720/2005(H2N2)HA蛋白、A/Anhui/1/2005(H5N1)HA蛋白、A/Netherlands/219/03(H7N7)HA蛋白的交叉结合活性，结果显示，本发明合成多肽对1、2、5、7各亚型病毒HA蛋白交叉结合活性最高，也表明了本发明合成多肽具有广谱性；此外，通过抗体分型试验，检测出本发明合成多肽免后血清中抗体成分主要为IgG，表明所设计免疫原成功的促进了体液免疫，这是能够作为主动免疫疫苗的基础。
并且，通过微中和与RT-qPCR联用试验，本发明合成多肽免疫后血清对A/17/Perth/09/87(H3)病毒,A/Wisconsin/67/2005(H3)病毒、A/17/Texsa/2012/30(H3)病毒都具有一定中和活性，再次表明了本发明合成多肽具有高度保守性。
在与全病毒免疫的对比试验中，本发明从正反两个方面验证了以全病毒免疫无法获得针对HA2的抗体，而通过本发明所述合成多肽能够诱导产生针对HA2的抗体。
基于上述多种有益效果，本发明提供SEQIDNO:1所示氨基酸序列的合成多肽在制备抗流感病毒疫苗中的应用。
作为优选，所述流感病毒为H1、H2、H3、H5或H7亚型流感病毒。
本发明还提供一种抗流感病毒多肽疫苗，其包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的合成多肽。
作为优选，所述多肽疫苗为KLH载体疫苗、多分支肽疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗。更优选地，所述多分支肽为四分支肽或八分支肽。
上述KLH载体疫苗、多分支肽疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗为本领域常规的疫苗制剂形式，在获知本发明所述合成多肽后，均可以按照本领域常规方法或经由试剂公司制备获得。
例如，所述KLH载体疫苗的制备方法可参照如下：
合成多肽在C-端合成一个Cys，将20mgSMCC(这是联接40条多肽的量)溶于2mlDMF。将0.8mlKLH加入到25ml圆底烧瓶中，补加1×PBS(pH7.2)使蛋白终浓度为15mg/ml。将溶解好的SMCC溶液缓慢滴加到120mgKLH蛋白体系中，室温搅拌反应1h。用1L1×PBS(PH7.4)溶液于4℃下透析6小时，除去游离的SMCC。将透析后的KLH蛋白倒入50ml离心管中，通过离心管的刻度确定其体积，根据反应前加入的KLH蛋白的量来计算透析后蛋白的浓度，然后根据其浓度将2.5mgKLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。
举例说明：反应前加入KLH蛋白的量为120mg，透析后的KLH蛋白体积为20ml，那么透析后的KLH蛋白浓度为6mg/ml，应取出2.5/6＝417μlKLH-SMCC溶液转移到5ml离心管中。将3.0mg多肽用0.6ml1×PBS(pH7.2)溶液溶解(这里多称量出0.5mg多肽是用来做ELISA检测的，取出100μl即可)。
检测多肽随交联好的抗原一起寄出，浓度为5mg/ml。用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重新质控。Ellman试剂是用来检测游离巯基的，如果检测液显黄色说明多肽的Cys的巯基大部分以游离态存在；如果检测液不显黄色则说明多肽Cys中的巯基已经被氧化形成二聚体或多聚体。将多肽液滴加到KLH-SMCC管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4小时。用Ellman试剂检测多肽中的巯基：在96孔板中加入100μlEllman试剂储备液，再加入10μl教练后的多肽溶液，用Nano分光光度计在λ＝412nm下测定紫外吸收值。OD值<0.03说明多肽和KLH蛋白交联率已达到80％以上；OD值>0.03则再补加SMCC活化好的KLH蛋白继续交联。如果Ellman试剂显黄色说明多肽与KLH蛋白偶联不完全；如果Ellman试剂不显黄色则说明多肽已经全部与KLH蛋白偶联。
所述多分支肽疫苗的制备方法可参照硕士论文《分支肽的合成与蛋白芯片的制作》中2.4部分内容。而所述诺如病毒P颗粒载体疫苗，可将诺如病毒P颗粒与编码本发明合成多肽的基因共同插入原核表达载体PET-28a中，标签为6个His，转化入表达载体BL21感受态内，经过夜诱导，包涵体溶解，蛋白亲和纯化，蛋白复性，即可获得。
由以上技术方案可知，本发明针对HA2抗原区中的颈部区设计一种新型仅包含15个氨基酸的具有免疫原性的合成多肽，其同时具有T/B细胞表位，能够诱导体液免疫，结合包括H1、H2、H3、H5、H7在内的多种亚型流感病毒，同时对H3亚型各种毒株均具有中和活性，相比同样针对该抗原区的其他合成多肽，本发明合成多肽活性最高，具有高效价、高保守性和广谱性，具有作为各亚型流感病毒疫苗的巨大优势。
附图说明
图1所示为P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清对A/Brisbane/10/2007(H3)HA蛋白的结合活性的效价柱形图，纵坐标表示抗体效价；
图2所示为P6-KLH免后血清中抗体分型实验紫外吸收光谱柱形图，横坐标中Pre-sera表示免疫前血清，为对照，Anti-sera表示免疫后血清；
图3所示为P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH免后血清对不同亚型流感病毒株HA蛋白的结合活性紫外吸收光谱柱形图；
图4所示为病毒以及本发明合成多肽免疫原免后血清对HA2多肽和全病毒结合活性的紫外吸收光谱折线图；其中A图为对HA2多肽结合活性，B图为对病毒结合活性，Virusantisera表示全病毒免疫后血清，Viruspresera表示全病毒免疫前血清，即对照，P6-MAP4antisera表示P6-MAP4免疫后血清，P6-MAP4presera表示P6-MAP4免疫前血清，即对照。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的多肽及方法、应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明具体实施方式中所采用的KLH载体疫苗(以下简称P1/P2/P3/P4/P5/P6-KLH)通过上海吉尔生化有限公司制备获得，四分支肽疫苗(以下简称P1/P2/P3/P4/P5/P6-MAP4)通过中肽公司制备获得，诺如病毒P颗粒载体疫苗(以下简称P1/P2/P3/P4/P5/P6-Pparticle)通过吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室构建表达获得。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种合成多肽及其应用和抗流感病毒疫苗进行详细说明。
实施例1：抗原表位和保守性检测
通过序列比对分析进行序列保守性评估，序列比对数据库由1968-2014年10763株H3N2亚型病毒的HA2序列构成。应用软件为ClustalWv1.4和MEGA5.0，并综合1、2、3、5、7、B亚型病毒HA2序列进行保守性评估。比对结果显示本发明所述合成多肽与1、2、3、5、7各亚型病毒HA2同样具备一定保守性，保守性高达97％以上。
同时，通过综合分析疫苗可及性、柔曲度、亲水性，在IEDB网站进行B/T细胞表位检测，结果显示，本发明所述合成多肽同时具有B/T细胞表位。
实施例2：合成多肽免后血清对流感病毒株HA蛋白的结合活性及抗体分型
动物免疫：免疫对象为4-6周龄的BALB/c雌鼠，免疫周期为两周，免疫原为P1-P6偶联KLH载体。免疫剂量为20ug/只，免疫佐剂为弗氏佐剂(北京鼎国)1:1体积混合，每次免疫前取血。进行四次免疫。
A/Brisbane/10/2007(H3)HA蛋白与包被液混合(终浓度5-10μg/mL)包被于96孔板内，4℃过夜，1％BSA/PBS于37℃封闭1h。PBST洗涤3次，一免后血清作为一抗，PBST稀释，首稀释度为1:200，5倍梯度稀释，37℃孵育1.5h。PBST洗涤3次，二抗加入羊抗鼠分型抗体，以PBST1:1000稀释，室温孵育1h，PBST洗涤3次，加入AP标记羊三抗，以PBST1:1000稀释，室温孵育30min，PBST洗涤3次，加入1mg/mLPNPP/碱性磷酸酶buffer混合液显色，于OD405处检测紫外吸收光。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测各组免后血清对A/Brisbane/10/2007(H3)HA蛋白的结合活性(图1)，结果显示，包含B/T细胞表位的P6免疫原免后血清结合活性最高。
同时，通过抗体分型实验，检测出P6免后血清中抗体成分主要为IgG(图2)，表明本发明所涉及的免疫原成功的促进了体液免疫，同时具有B细胞表位以及Th2细胞表位。
实施例3：合成多肽免后血清对不同亚型流感病毒株HA蛋白的结合活性
动物免疫：免疫对象为4-6周龄的BALB/c雌鼠，免疫周期为两周，免疫原为P1-P6偶联KLH载体。免疫剂量为20ug/只，免疫佐剂为弗氏佐剂(北京鼎国)1:1体积混合，每次免疫前取血。进行四次免疫。
分别将A/Brisbane/10/2007(H3)HA蛋白、A/California/04/2009(H1N1)HA蛋白、A/Canada/720/2005(H2N2)HA蛋白、A/Anhui/1/2005(H5N1)HA蛋白、A/Netherlands/219/03(H7N7)HA蛋白与包被液混合(终浓度5-10μg/mL)包被于96孔板内，4℃过夜，1％BSA/PBS于37℃封闭1h。PBST洗涤3次，一免后血清作为一抗，PBST稀释，首稀释度为1:200，5倍梯度稀释，37℃孵育1.5h。PBST洗涤3次，二抗为HRP标记鼠二抗,PBST稀释,稀释度为1:3000，37℃孵育45min，PBST洗涤3次，加入TMB底物显色，于OD450处检测紫外吸收光。
图3结果显示，本发明合成多肽P6对1、2、5、7各亚型病毒HA蛋白交叉结合活性最高。
实施例4：微中和与RT-PCR联用实验
流感病毒株：A/17/Perth/09/87(H3)病毒,A/Wisconsin/67/2005(H3)病毒、A/17/Texsa/2012/30(H3)；
血清：P6-KLH免后血清、P6-MAP4免后血清、A/17/Perth/16/2009(H3N2)全病毒免后血清；
动物免疫参见实施例1；其中，全病毒免后血清为6只小鼠鼻粘膜免疫A/17/Perth/16/2009(H3N2)病毒，每2周免疫一次，第三次免疫后2周获得的抗体血清。
将MDCK细胞以10000个每孔培养于96孔板内，培养基为10％FBS的DMEM，培养条件为37℃/5％CO2。待细胞伸展完全后以HANK’s缓冲液(sigma)洗涤2次，加入病毒血清混合液(不同稀释度血清与200TCID50病毒混合于感染培养基，感染培养基7.5％BSA/PBS与DMEM混合比例为1:39，37℃共孵育1h)，将混合液加入细胞孔中，37℃/5％CO2条件下培养2h。HANK’s缓冲液(sigma)洗涤3次，加入感染培养基，于34℃/5％CO2条件下培养48h。
将微中和实验的细胞板，每个副孔取100μL上清，共200μL，取140μL用作RT-PCR实验。RT-PCR实验用OneStepPrimeScriptRT-PCRKit(TaKaRa)完成，引物与Taqman探针序列见表1。
表1RT-PCR引物与Taqman探针序列
通过微中和与RT-qPCR联用实验，可知免疫后血清对A/17/Perth/09/87(H3)病毒,A/Wisconsin/67/2005(H3)病毒、A/17/Texsa/2012/30(H3)病毒都具有有效的中和活性(表2)。
由于采用全病毒免后血清针对的是多表位中和反应，与本发明合成多肽特异性针对HA2区域表位的中和反应无对比性，故未进行相关的微中和试验。
同时，对比全病毒免后血清的HAI试验结果以及本发明合成多肽免后血清的HAI结果可知，本发明合成多肽的免疫后抗体血清中和途径并未通过保守性较差的血凝抑制途径来实现，从侧面证明了本发明的合成多肽的保守型相对要高。
表2P6对不同毒株的血凝抑制活性及中和活性检测
注：HAI表示血凝抑制试验结果；MN表示微中和试验结果；ND表示未进行该项试验；上角标N表示无显著差异，*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005，均与免疫前血清相比。
实施例5：全病毒与合成多肽免疫原免后血清结合活性检测
动物免疫：免疫对象为4-6周龄的BALB/c雌鼠，免疫周期为两周，免疫原为A/17/Perth/09/87(H3)全病毒和P6-MAP4。A/17/Perth/09/87(H3)病毒为鼻粘膜免疫，免疫剂量为20000TCID50/只，P6-MAP4为皮下免疫免疫剂量为20μg/只，免疫佐剂为弗氏佐剂(北京鼎国)1:1体积混合，每次免疫前取血。进行四次免疫。
分别将A/17/Perth/09/87(H3)病毒、A/17/Perth/09/87(H3)HA2多肽与包被液混合(终浓度5-10μg/mL)包被于96孔板内，4℃过夜，1％BSA/PBS于37℃封闭1h。PBST洗涤3次，一免后血清作为一抗，PBST稀释，首稀释度为1:200，5倍梯度稀释，37℃孵育1.5h。PBST洗涤3次，二抗为HRP标记鼠二抗,PBST稀释,稀释度为1:3000，37℃孵育45min，PBST洗涤3次，加入TMB底物显色，于OD450处检测紫外吸收光。结果见图4。
图4中A图为病毒以及本发明合成多肽免疫原免后血清对HA2多肽结合活性检测结果，结果从正面验证了以全病毒为免疫原无法诱导出能够结合HA2的有效抗体，而本发明所述合成多肽免后血清则成功诱导出抗体；
图4中B图为病毒以及本发明合成多肽免疫原免后血清对病毒结合活性检测结果，结果从反面验证了以全病毒为免疫原的免后血清能够诱导产生抗体与之结合，但是本发明合成多肽诱导产生的抗体是针对在天然病毒中不暴露的HA2，故无法与之相结合。只有当天然病毒实际侵入机体，并在机体内发生变构暴露出HA2结合位点才能与之结合。
两方面的结果表明HA2在天然病毒中不暴露，无法通过全毒主动免疫获得。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种合成多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
2.SEQIDNO:1所示氨基酸序列的合成多肽在制备抗流感病毒疫苗中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述流感病毒为H1、H2、H3、H5或H7亚型流感病毒。
4.一种抗流感病毒多肽疫苗，其特征在于，包含SEQIDNO:1所示氨基酸序列的合成多肽。
5.根据权利要求4所述多肽疫苗，其特征在于，所述多肽疫苗为KLH载体疫苗、多分支肽疫苗或诺如病毒P颗粒载体疫苗。
6.权利要求5所述多肽疫苗，其特征在于，所述多分支肽为四分支肽或八分支肽。
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