CN105524148A - 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105524148A
CN105524148A CN201610080055.7A CN201610080055A CN105524148A CN 105524148 A CN105524148 A CN 105524148A CN 201610080055 A CN201610080055 A CN 201610080055A CN 105524148 A CN105524148 A CN 105524148A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mhp107
recombinant protein
obtains
albumen
mhp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610080055.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105524148B (zh
Inventor
丁红雷
付启欢
王博
王豪举
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN201610080055.7A priority Critical patent/CN105524148B/zh
Publication of CN105524148A publication Critical patent/CN105524148A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105524148B publication Critical patent/CN105524148B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ？ID？NO：1。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。本发明的重组蛋白可用于制备猪支原体肺炎的预防性药物，本发明的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5％，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎；同时本发明的重组蛋白可低成本的大规模生产具有良好的市场前景。

Description

一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种可用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
猪支原体肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)又称猪喘气病或猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的一种慢性、接触性传染病，通过呼吸道在猪只和猪群之间传播，是猪场最常见的疫病之一。该病通常不引起猪的死亡，但会使其出现发热、咳嗽、呼吸困难等症状，造成食欲减退、生长阻滞、饲料转化率降低、上市时间延迟。本病一旦传入猪群，很难彻底清除，且该病通常与其他病毒或细菌引起猪呼吸系统疾病综合征(Porcinerespirationdiseasecomplex，PRDC)。根据流行病学资料，该病广泛分布于包括发达国家在内的世界各地。在我国有超过95％的猪场均为Mhp血清阳性[HeY，XuMJ，ZhouDH，etal.SeroprevalenceofMycoplasmahyopneumoniaeinpigsinsubtropicalsouthernChina[J].TropAnimHealthProd，2011，43(3)：695-698.]。因此，Mhp是一种在我国广泛存在，长期危害养猪业并造成巨大损失的病原菌之一。
该病用抗菌药物防控必须长期给药，不仅增加了饲养成本也易使感染菌株产生耐药性。目前上市的Mhp疫苗包括灭活苗和弱毒苗。灭活苗能够降低肺部病理损伤，提高日增重，激发机体的体液免疫，但几乎不产生细胞免疫，也不能阻止Mhp感染[SibilaM，BernalR，TorrentsD，etal.EffectofsowvaccinationagainstMycoplasmahyopneumoniaeonsowandpigletcolonizationandseroconversion，andpiglunglesionsatslaughter[J].VetMicrobiol，2008，127(1-2)：165-170.]和在猪群间的传播[MeynsT，DewulfJ，deKruifA，etal.ComparisonoftransmissionofMycoplasmahyopneumoniaeinvaccinatedandnon-vaccinatedpopulations[J].Vaccine，2006，24(49-50)：7081-7186./VillarrealI，MeynsT，DewulfJ，etal.TheeffectofvaccinationonthetransmissionofMycoplasmahyopneumoniaeinpigsunderfieldconditions[J].VetJ，2011，188(1)：48-52.]。我国江苏省农科院研发了猪支原体肺炎弱毒活疫苗(168株)。该疫苗能有效激发机体的细胞免疫和局部粘膜免疫[周勇岐，赵永前.猪支原体肺炎(168株)活疫苗的作用机理与应用[J].中国牧业通讯，2008，10：49-52]。但需要采用肺内注射的方式，操作难度大，因此这种疫苗推广难度大。Mhp苛刻的培养条件和培养时容易被其他细菌和支原体污染也使得上述两种疫苗成本较高。因此，研发新型、有效、低成本的基因工程亚单位Mhp疫苗就成为防治猪支原体肺炎的重要手段。
Mhp进入猪呼吸道后通过和呼吸道上皮细胞纤毛的相互作用导致纤毛结构的破坏和功能丧失，最终导致上皮细胞死亡。Mhp和纤毛相互作用的第一步是对宿主上皮细胞纤毛的黏附。因此，黏附因子在Mhp的致病过程中有决定性作用。Mhp107是Mhp的一个保守蛋白，存在于已测序的所有Mhp中。mhp107基因在168菌株中全长3102bp，编码1033个氨基酸，在第219-222、1663-1665和2887-2889位处有编码色氨酸(Trp)的密码子TGA。Mhp107蛋白分子量为120kDa，能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合肝磷脂。肝磷脂能抑制Mhp对猪呼吸道上皮细胞的黏附。Mhp107与肝磷脂的结合进一步促进了Mhp对纤毛的黏附。Mhp107蛋白C端还能与上皮细胞的纤连蛋白结合，纤连蛋白的主要作用是促进伤口的愈合。Mhp107蛋白C端与纤连蛋白的结合促进了Mhp对宿主细胞的损伤[SeymourLM，FalconerL，DeutscherAT，etal.Mhp107isamemberofthemultifunctionaladhesinfamilyofMycoplasmahyopneumoniae[J].JBiolChem，2011，286(12)：10097-10104.]。因此，Mhp107-C片段在Mhp的致病中扮演重要角色，阻断Mhp107-C的功能可能会有效降低Mhp对猪的致病。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预防猪支原体肺炎的疫苗。
为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：1。
在根据本发明的一个实施方案中，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：8。
本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
1)通过PCR扩增Mhp168菌株mhp107基因的第1666～3099位的核苷酸序列；
2)将步骤1)得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列；
3)将步骤2)得到的重组蛋白Mhp107-C的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载体；
4)将步骤3)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白Mhp107-C。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述的PCR扩增的引物为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；优选地，所述PCR的反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min40s，30cycles；72℃延伸6min。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：
a)将步骤1)得到的核苷酸序列连接到pMDTM19-T载体，得到pMDTM19-mhp107-C重组质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，培养并诱导表达；
b)提取pMDTM19-mhp107-C重组质粒，并以所述pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以SEQIDNO：6和SEQIDNO：7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhp107-C的编码序列mhp107-CM；优选地，所述PCR的反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性1min30s，60℃退火1min30s，72℃延伸4min30s，20cycles；72℃延伸10min；
c)将上述PCR产物经DpnI消化、胶回收后，转化宿主菌培养，提取质粒，选取经鉴定序列正确的载体即为pMDTM19-Mhp107-CM载体；
d)将步骤c)得到的pMDTM19-Mhp107-CM载体以BamHI和NotI双酶切得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列。
在根据本发明的一个实施方案中，在步骤a)中，所述步骤1)得到的核苷酸序列与pMD19TM-T载体的摩尔比为3∶1，连接反应体系如下：mhp107-C4.5μL，pMDTM19-T载体0.5μL，SolutionI5μL。16℃连接1h。
在根据本发明的一个实施方案中，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤4)中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和PreScissionProtease酶实现的。
进一步地，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地连接编码如上所述的重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
本发明还提供了上述重组蛋白在制备用于预防猪支原体肺炎的药物中的应用；更优选地，所述药物为用于预防猪支原体肺炎的亚单位疫苗。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
本发明的猪肺炎支原体的重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5％，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎；同时本发明的重组蛋白可低成本的大规模生产具有良好的市场前景。
附图说明
图1所示为对Mhp107蛋白信号肽进行生物信息学分析的结果示意图，图中显示1-34位氨基酸是信号肽序列。
图2所示为Mhp107蛋白跨膜区生物信息学分析结果示意图，图中显示18-35、626-627、745-748位氨基酸为跨膜区。
图3所示为mhp107-C基因片段PCR扩增结果；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准(DNAMarker)；泳道1、2为扩增基因片段。电泳条带位于1200-2000bp之间，扩增片段与预期片段大小1437bp一致。800-1200bp之间的片段为非特异性扩增。
图4重组质粒pMDTM19-mhp107-C酶切鉴定；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准(DNAMarker)；泳道1、2为质粒pMDTM19-mhp107-C酶切结果。酶切后的质粒为2692bp，目的基因片段为1437bp，与预期结果相符。
图5为重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C酶切鉴定；其中，泳道M为DNA核苷酸大小标准(DNAMarker)；泳道1为质粒pGEX-6P-2-mhp107-C，泳道2为质粒pGEX-6P-2-mhp107-C酶切结果。pGEX-6P-2-mhp107-C为6422bp；酶切后的质粒为4985bp，目的基因片段为1437bp，与预期结果相符。
图6为重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C中mhp107-C基因片段测序结果
图7为重组菌XL-1Blue-Mhp107-C中Mhp107-C蛋白的表达与纯化结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道1为纯化后带GST标签重组蛋白，泳道2、3、4为经PreScissionProtease酶酶切后Mhp107-C蛋白，泳道5为PreScissionProtease酶酶切后剩余带GST标签重组蛋白。带GST标签重组蛋白分子量为81.5kDa，Mhp107-C蛋白分子量为55.5kDa，GST蛋白分子量为26kDa。所得蛋白大小与预期相符。
图8为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与小鼠抗血清的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道MS为Mhp107-C蛋白与小鼠抗血清反应结果。Mhp107-C蛋白能与小鼠抗血清反应，说明Mhp107-C蛋白具有良好的反应原性。
图9Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清1的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P1为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清1反应结果。在Mhp猪阳性血清1中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图10Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清2的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P2为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清2反应结果。在Mhp猪阳性血清中2能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图11Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清3的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P3为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清3反应结果。在Mhp猪阳性血清3中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图12Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清4的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P4为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清4反应结果。在Mhp猪阳性血清4中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图13Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清5的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P5为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清5反应结果。在Mhp猪阳性血清5中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图14Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清6的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P6为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清6反应结果。在Mhp猪阳性血清6中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图15Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清7的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P7为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清7反应结果。在Mhp猪阳性血清中没有检测到Mhp107-C抗体，说明感染该猪的Mhp中Mhp107蛋白没有在菌体表面充分暴露。
图16为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阳性血清8的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道P8为Mhp107-C蛋白与猪Mhp阳性血清8反应结果。在Mhp猪阳性血清8中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应。
图17为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与8份混合Mhp猪阳性血清的反应；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道PM为Mhp107-C蛋白与8份混合Mhp猪阳性血清反应结果。在混合Mhp猪阳性血清中能检测到Mhp107-C抗体，说明Mhp107-C蛋白能刺激猪产生免疫反应，Mhp107-C蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。
图18为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清1的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道N1为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清1反应结果。在Mhp猪阴性血清1中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图19为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清2的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道N2为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清2反应结果。在Mhp猪阴性血清2中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图20为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清3的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道N3为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清3反应结果。在Mhp阴性猪血清3中没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图21为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清4的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道N4为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清4反应结果。在Mhp阴性猪血清中4没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图22为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清5的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道N5为Mhp107-C蛋白与Mhp猪阴性血清5反应结果。在Mhp阴性猪血清中5没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
图23为Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与5份混合Mhp猪阴性血清的反应结果；其中，泳道M为蛋白分子量标准(蛋白Marker)；泳道NM为Mhp107-C蛋白与5份混合Mhp阴性猪血清反应结果。在5份Mhp阴性猪血清中均没有检测到Mhp107-C抗体，与预期结果一致。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
材料的准备
1.猪肺炎支原体168菌株：购自江苏省农业科学院。
2.HSDNApolymerase、ExTaqDNApolymerase、pMDTM19-T载体、BamHI、NotI、DpnI：购自宝生物(大连)有限公司。
3.细菌基因组DNA提取试剂盒、核酸Marker：购自天根生化科技(北京)有限公司。
4.胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：购自美国Omega公司。
5.T4DNAligase、蛋白Marker、HRP标记羊抗猪IgG二抗：购自ThermoFisher科技公司。
6.Glutathione-Sepharose4B、PrescissionProtease购于瑞典GE公司。
7.BCA蛋白浓度测定试剂盒：购自碧云天生物技术研究所。
8.清洁级Balb/c小鼠：购自重庆市中药研究院。
9.猪肺炎支原体抗体检测试剂盒：购自美国IDEXX公司。
实施例1Mhp107蛋白片段的筛选
从GenBank(CP002274)获得Mhp168菌株Mhp107蛋白的氨基酸序列，LipoP1.0软件预测Mhp107蛋白的信号肽序列为SEQIDNO：3MQANLIGRFIKNKKAILVLASTFAGLILFTTSVG，被SpI酶切割(附图1)。DAS软件预测Mhp107蛋白的跨膜区为18-35、626-627、745-748位氨基酸(附图2)。根据文献报道，Mhp107蛋白C端能够与上皮细胞纤毛黏附，还能够特异性结合宿主呼吸道上皮细胞肝磷脂和纤连蛋白。因此选择mhp107基因1666bp-3099bp核苷酸作为扩增片段，同时对部分核苷酸序列进行突变，在扩增时为了保证蛋白顺利表达，在片段之前加ATG起始密码子。扩增的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。
SEQIDNO：2
ATGTCTGGTAAGACATACTTACCTAGTTTAACAGAAATTGCAAATTTTCGATTAAATCAACAAAAAATTGATATAAATTCACAAAATCAAGAGCAAAAAATTGAACTAAAAACACTACATTCACAAAGTTTTTTTATAAATCCTTCGGATGTAACAGCTTTTTTTGCTGATTTAATTCAGAAAAAACCAAGCCAAATAGCAAATAGTTTTTTCTTAATTGCAAAGGCTTTTGGACTTTTAAATCAAAATCGGACTGCTTCGCAAATTTTTGATAACCTGGATGGAGAAAATATCTTTGAAACTAGTTCAAAAATTCATTTTGATAATAAAACTACAAATATTTTAAGTTTTAATAATCATTTCGCTGATTTTTATAATCAAGGGTTTTTTTCATCCCTTTTTCTTCCAAAATCAATAAAAGATAAATTCAATAATCTAAAAAGCAAGTCAATTTCTGATGTAATTAGTATTTTAGAAGACCAAGAACTTTTTAAAGAAACGGCTAGAAAATTTACAAGACAACAAATTGAGGAAAACCTAAAATCAAGTATTAAATTCACAACATTGGCCGACCTTCTTTTAGCTTTTTATTATAAGGCTAGTCAACTTGATAATTTTTTAGGGTGAACAAAATTAGATACCAATTTAGATTATCAAATTGTGTTTCAAAAAGAAAATGAAATTTCAAAAGCTCGTTATGATTCTGAAATTCAGAAGCTAAAAAAACCCGAATTAAATTCCTTAGAAAAACAGGAAAACTTAAATAAAAATTCTGAAATTCAACCAGAATCTAAAAATTTAGACTCTGATAATAACATAAAAAAATCAATAAATGGAAATTTAGAAAAAGATAATACTTATAATGCCAATGTTGATAATGAATATCTAACATTAAATTTTTACTATATTATTGGTGATTCTAGTCAGAAAAAATTTTTCTTTCAAAGTCCAATTCAAAAAATTTTAATAAATTTCTCAACTCAAAAAATTGATGAAAATTCTAAAATACAAGAAAAATTCGATAAGATAGTTGAAAGTGTTCCGGCTGATTTGTTAAATTATAGTGTCAGTGAAGAAAATTTTAAAAAAATTAAGGAAAAATTAACAAATAAGCATTCACCTGAACCAAAAAATAATGACAATAATAACGATTTAGATTTATATTTTAAAGAAACTTCCATAAATATTGATAAAATTAGTTCTTATTTTAAAGAACAATTTCCCAAAGTGGAGACAAAATTTTTACTTGAACCAAGTTTTGAAAGCTCACTAAATACGGATAAACTAACCTTTTTAATAAGTTTTTATCTTAATAAGAAGGATAAAAATCCCAAAAATTTAAAAGCTGATAATAAAAATAATGAAAATAGCCAGATAAATCCAATTATTGCAAGGCAGAAATTAAAAATTATAATAACAAAAAATTCTAAAAATTAA
实施例2重组质粒pMDTM19-mhp107-C的构建
1.猪肺炎支原体168株基因组的提取：
按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
2.引物设计合成
用PrimerPremier5.0软件设计和分析评价，上下游引物5′端分别引入限制性内切酶BamHI和NotI酶切位点。由上海Invitrogen公司合成，序列如下：
mhp107C-F：(SEQIDNO：4)
5′-GGATCCATGTCTGGTAAGACATACTTACCTAGTTTAACA-3′(BamHI)mhp107C-R：(SEQIDNO：5)
5′-GCGGCCGCTTAATTTTTAGAATTTTTTGTTATTATAATTT-3′(NotI)
3.目的基因的PCR扩增
以Mhp168菌株基因组DNA为模板，以mhp107C-F和mhp107C-R为引物扩增mhp107-C基因片段。采用如下的PCR体系和反应条件。
PCR扩增反应体系
PCR反应条件：
98℃预变性5min；98℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min40s，30cycles；72℃延伸6min。PCR完成后在反应体系中加入0.25μLExTaqDNA聚合酶和2μLdNTPs，振荡混匀简短离心后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳观察结果(附图3)。
4.PCR产物的回收
灌制可上样25mL的1.5％琼脂糖凝胶，将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示条带迁移至适当位置时停止电泳。
通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重。
按照胶回收试剂盒说明书进行PCR产物回收。
5.mhp107-C连接pMDTM19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。
通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3∶1的原则，设计连接反应体系如下：mhp107-C4.5μL，pMDTM19-T载体0.5μL，SolutionI5μL。16℃连接1h。
参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌DH5α感受态菌。
参照《精编分子生物学实验指南》将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。
6.Amp+LB平板筛选转化成功重组菌
挑取Amp+LB平板单克隆接种Amp+LB液体培养基，37℃180rpm摇床培养6h。取2mL菌液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和NotI双酶切鉴定。反应体系：重组质粒7.5μL，BamHI0.5pL，NotI0.5μL，10×Kbuffer0.5μL，1％BSA1μL。37℃水浴1h，琼脂糖凝胶电泳观察结果(附图4)。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序正确的质粒命名为pMDTM19-mhp107-C。
实施例3重组质粒pMDTM19-mhp107-C点突变
1.突变引物设计合成
为了将mhp107-C基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA突变为色氨酸密码子TGG，以pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，用PrimerPremier5.0软件设计突变引物，由上海Invitrogen公司合成。突变引物序列：
mhp107CT-F：(SEQIDNO：6)
5′-AACTTGATAATTTTTTAGGGTGGACAAAATTAGATACCAATTTAG-3′
mhp107CT-R：(SEQIDNO：7)
5′-CTAAATTGGTATCTAATTTTGTCCACCCTAAAAAATTATCAAGTT-3′
2.目的基因的突变PCR
以pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以mhp107CT-F和mhp107CT-R为引物进行突变PCR。采用如下的PCR体系和反应条件。
PCR扩增反应体系
反应条件：98℃预变性5min；98℃变性1min30s，60℃退火1min30s，72℃延伸4min30s，20cycles；72℃延伸10min。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。该PCR产物为包含突变后的mhp107-C基因及pMDTM19-T载体的闭环质粒，与pMDTM19-mhp107-C的不同在于mhp107-C基因片段编码的第209位氨基酸终止子TGA变为色氨酸密码子TGG。
3.DpnI消化PCR产物
向PCR产物中加入2μLDpnI和5.8μL10×TBuffer，37℃水浴3h。胶回收试剂盒回收经DpnI消化的产物。
4.DpnI消化PCR产物的转化及阳性重组子的筛选
参照《精编分子生物学实验指南》制备大肠杆菌XL-1Blue感受态菌。
将上述经回收PCR产物参照《精编分子生物学实验指南》转化大肠杆菌XL-1Blue感受态菌。
5.Amp+LB平板筛选转化成功重组菌
挑取Amp+LB平板单克隆接种Amp+LB液体培养基，37℃180rpm摇床培养6h。取2mL菌液按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒。用BamHI和NotI双酶切鉴定。反应体系和反应条件同实施例2。酶切鉴定正确的质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。测序正确的质粒命名为pMDTM19-mhp107-CM。
实施例4重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C与重组菌XL-1Blue-Mhp107-C的构建
1.重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C的构建
重组质粒pMDTM19-mhp107-CM和载体pGEX-6P-2经BamHI和NotI双酶切。反应体系：重组质粒/载体37.5μL，BamHI2.5μL，NotI2.5μL，10×Kbuffer2.5μL，1％BSA5μL。37℃水浴4h。酶切后的mhp107-C和pGEX-6P-2经胶回收试剂盒回收。
通过紫外分光光度计检测回收产物的产量，按外源片段与载体物质的量之比为3∶1的原则，设计连接反应体系如下：mhp107-C3μL，pGEX-6P-2载体5.5μL，T4ligase0.5μL，T4ligasebuffer1μL。22℃连接1h。
参照《精编分子生物学实验指南》将连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态。
阳性重组子的筛选与鉴定参照实施例2。酶切测序正确的重组质粒命名为pGEX-6P-2-mhp107-C，重组菌命名为XL-1Blue-Mhp107-C。pGEX-6P-2-mhp107-C酶切鉴定图片见附图5，重组质粒pGEX-6P-2-mhp107-C中mhp107-C基因片段测序结果见附图6，本发明的Mhp107蛋白的重组蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示，氨基酸序列为SEQIDNO：1。
实施例5Mhp107-C蛋白的表达与纯化
重组菌XL-1Blue-Mhp107-C经37℃220rpm培养至OD600为07-0.9时经1mmol/LIPTG诱导4h。离心弃上清后加入原菌液体积1/20PBS，超声波破菌。破菌产物与谷胱甘肽Beads室温结合1～2h。经PBST和PBS洗涤后，部分结合产物经PreScissionProtease酶室温酶切5h，4℃10000rpm离心1min，分离酶切上清和沉淀。原结合产物、酶切后离心上清、酶切后沉淀加入适量SDS-PAGE上样缓冲液，105℃煮沸10min。
参照《精编分子生物学实验指南》配置12％SDS-PAGE凝胶。电泳观察蛋白表达和纯化情况。结果见附图7。
实施例6Mhp107-C蛋白免疫小鼠产生抗血清
纯化的Mhp107-C蛋白浓度用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定，调整蛋白浓度为2mg/mL。0.5mL蛋白与0.5mL弗氏完全佐剂研磨为油包水状乳剂，腹股沟和前肢腋窝皮下免疫5只7周龄Balb/c小鼠(每只0.2mL)，21、28d免疫0.5mL纯化蛋白与0.5mL弗氏不完全佐剂研磨为油包水状乳剂(每只0.2mL)，35d免疫0.5mL纯化蛋白(每只0.1mL)。42d时ELISA和Westernblotting检测小鼠血液抗体效价。ELISA结果显示抗体效价为1∶10000。Westernblotting结果显示当抗体1∶1000稀释时，能与Mhp107-C蛋白反应(附图8)。
Westernblotting步骤：
将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE，整齐的切下待转移部位的凝胶，浸泡于电转缓冲液中。剪取6张同样大小的滤纸(面积较凝胶块略大)，同两张海绵一起浸泡于缓冲液中；取一块滤纸同样大小的PVDF膜，在100％甲醇溶液中浸泡10s后，再浸入转移缓冲液中3min。
电转与封闭：电转“三明治”顺序如：正极(白色)/海绵/3层滤纸/硝酸纤维膜/GE胶/3层滤纸/海绵/负极(黑色)。将“三明治”夹子放入预装有电转膜缓冲液的电泳槽中，加盖，接通电源，恒压75V，50min；转膜后的PVDF膜用去离子水冲洗一下，放入封闭液中温育30min，洗涤液冲洗膜3次，每次5min。
加入一抗(用封闭液1∶1000稀释)后4℃过夜，洗膜3次，每次5min；加入1∶10000稀释的二抗，温育1h，洗膜3次，每次5min；ECL显色观察结果。
实施例7Mhp107-C蛋白与猪Mhp阳性血清和阴性血清反应
采集200-400日龄猪血清50份，猪肺炎支原体抗体检测试剂盒测定Mhp抗体，操作步骤按照说明书进行。选择8份Mhp猪阳性血清和5份Mhp猪阴性血清。Westernblotting检测Mhp107-C蛋白与8份Mhp猪阳性血清、5份Mhp猪阴性血清的免疫反应性。包括Mhp107-C蛋白逐个与Mhp阳性血清反应、Mhp107-C蛋白与混合的8份Mhp猪阳性血清反应、Mhp107-C蛋白逐个与Mhp猪阴性血清反应、Mhp107-C蛋白与混合的5份Mhp猪阴性血清反应。猪血清用PBS1∶200稀释，HRP标记羊抗猪IgG二抗用PBS1∶10000稀释。操作方法参照实施例6。结果显示Mhp107-C蛋白不能与Mhp猪阴性血清反应，能与7份Mhp猪阳性血清和混合血清反应，不能与Mhp猪阳性血清7反应，说明Mhp107-C能刺激大部分猪产生免疫反应，具有良好的免疫原性和反应原性，免疫保护效果达到87.5％，可以作为一种良好的疫苗预防猪支原体肺炎。结果见附图9-附图23。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：1。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：8。
3.如权利要求1或2所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
1)通过PCR扩增Mhp168菌株mhp107基因的第1666～3099位的核苷酸序列；
2)将步骤1)得到的核苷酸序列中的第627位的A突变为G，得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列；
3)将步骤2)得到的重组蛋白Mhp107-C的编码序列连接到骨架质粒上，得到表达载体；
4)将步骤3)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白Mhp107-C。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的PCR扩增的引物为SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；优选地，所述PCR的反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min40s，30cycles；72℃延伸6min。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：
a)将步骤1)得到的核苷酸序列连接到pMDTM19-T载体，得到pMDTM19-mhp107-C重组质粒，转化宿主菌大肠杆菌DH5α，培养并诱导表达；
b)提取pMDTM19-mhp107-C重组质粒，并以所述pMDTM19-mhp107-C重组质粒为模板，以SEQIDNO：6和SEQIDNO：7为引物进行PCR，得到突变后的重组蛋白Mhp107-C的编码序列mhp107-CM；优选地，所述PCR的反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性1min30s，60℃退火1min30s，72℃延伸4min30s，20cycles；72℃延伸10min；
c)将上述PCR产物经DpnI消化、胶回收后，转化宿主菌培养后，提取质粒，选取经鉴定序列正确的载体即为pMDTM19-Mhp107-CM载体；
d)将步骤c)得到的pMDTM19-Mhp107-CM载体以BamHI和NotI双酶切得到重组蛋白Mhp107-C的编码序列。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，所述步骤1)得到的核苷酸序列与pMD19TM-T载体的摩尔比为3∶1，连接反应体系如下：mhp107-C4.5μL，pMDTM19-T载体0.5μL，SolutionI5μL。16℃连接1h。
7.如权利要求3～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
8.如权利要求3～7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述纯化是通过谷胱甘肽琼脂糖珠和PreScissionProtease酶实现的。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含由骨架质粒可修饰地连接编码如权利要求1或2所述的重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒为pGEX-6P-2。
10.如权利要求1或2所述的重组蛋白在制备用于预防猪支原体肺炎的药物中的应用；优选地，所述药物为用于预防猪支原体肺炎的亚单位疫苗。
CN201610080055.7A 2016-02-04 2016-02-04 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用 Expired - Fee Related CN105524148B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610080055.7A CN105524148B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610080055.7A CN105524148B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105524148A true CN105524148A (zh) 2016-04-27
CN105524148B CN105524148B (zh) 2019-03-01

Family

ID=55766708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610080055.7A Expired - Fee Related CN105524148B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105524148B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588946A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003161A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Iowa State University Research Foundation, Inc. Immunogenic mycoplasma hyopneumoniae polypeptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004003161A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Iowa State University Research Foundation, Inc. Immunogenic mycoplasma hyopneumoniae polypeptides

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSTEN Y. CHEN等: ""Evaluation of the immunogenicity of the P97R1 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae as a mucosal vaccine in mice"", 《JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》 *
KENDALL W. KING等: ""Characterization of the gene encoding Mhpl from Mycoplasma hyopneumoniae and examination of Mhp1’s vaccine potential"", 《VACCINE》 *
LISA M. SEYMOUR等: "Mhp107 Is a Member of the Multifunctional Adhesin Family of Mycoplasma hyopneumoniae", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
付启欢等: "猪肺炎支原体Mhp107蛋白的分段原核表达与纯化", 《2015中国猪业科技大会暨2015年学术年会论文集》 *
任冬梅: "猪肺炎支原体168株疫苗候选抗原蛋白Mhp168_116、Mhp168_341、Mhp168_322和Mhp168_549的原核表达及纯化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
周勇岐等: "猪支原体肺炎（168株）活疫苗的作用机理与应用", 《中国牧业通讯》 *
王豪举等: "应用生物信息学方法筛选猪肺炎支原体保护性抗原", 《中国兽医杂志》 *
陈超等: "猪肺炎支原体 p97 C末端基因重组腺病毒的构建及其免疫效果", 《微生物学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588946A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法
CN113588946B (zh) * 2021-07-26 2022-06-10 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105524148B (zh) 2019-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103539842B (zh) 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s10基因编码的重组蛋白、由其制备的多克隆抗体及应用
CN103172749B (zh) 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备
CN102174086B (zh) 一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白和亚单位疫苗
CN107432930B (zh) 一种i群4型禽腺病毒dna疫苗及其制备方法和应用
CN103585625A (zh) 一种猪流行性腹泻重组杆状病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN113943714B (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
CN104292339A (zh) 含sars病毒rbd抗原的重组蛋白及展示rbd蛋白的杆状病毒
Li et al. High yield expression of duck hepatitis A virus VP1 protein in Escherichia coli, and production and characterization of polyclonal antibody
CN105087616B (zh) 一种猪肺炎支原体的融合基因及其制备方法
CN106866796A (zh) 草鱼呼肠孤病毒ⅱ型s9基因编码的重组蛋白及其应用
CN112194710A (zh) 罗非鱼湖病毒s8基因编码的重组蛋白、由其制备的抗体及应用
CN102977194B (zh) 一种鸭坦布苏病毒e蛋白基因及其应用
CN107936123B (zh) 一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN104292338A (zh) 含sars病毒n抗原的重组蛋白及展示n蛋白的杆状病毒
CN105524148A (zh) 一种用作猪肺炎支原体疫苗的重组蛋白及其制备方法和应用
CN104479028B (zh) 牛轮状病毒vp8*亚单位重组嵌合蛋白及其应用
CN115521942B (zh) 一种bvdv表位基因疫苗的构建方法及其应用
CN104152477A (zh) 日本血吸虫重组抗原SjPDI及其制备方法和应用
CN107827986B (zh) 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗
CN102559614A (zh) 一种猪瘟疫苗及其制备方法
CN104593385A (zh) 柔嫩艾美耳球虫配子体抗原gam59基因及其应用
CN110747215A (zh) 一种高效表达猪瘟e2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
CN106110319B (zh) 猪瘟病毒e2基因重组杆状病毒灭活疫苗制备方法
CN106267179A (zh) 一种大肠杆菌外膜蛋白疫苗的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190301

Termination date: 20220204

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee