CN113588946A - 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法 - Google Patents

一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包括依次连接的标签载体氨基酸、猪肺炎支原体P46蛋白氨基酸、间隔蛋白氨基酸和猪肺炎支原体P36蛋白氨基酸。利用本发明所提供的重组蛋白能够作为包被抗原，进而建立一种操作简单、成本低、能有效鉴别阴阳性血清的间接ELISA检测方法，经检测该方法符合率高，且具有良好的特异性和重复性，为猪肺炎支原体的综合防治提供新思路和新方法。

Description

一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白和方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白、利用该重组蛋白进行间接ELISA检测的方法以及试剂盒。
背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方流行性肺炎(SwineEnzootic Pneumonia)的主要病原体，其诱发的疾病又称为猪支原体肺炎(MycoplasmaPneumoniaeof Swine，MPS)、猪气喘病，是猪呼吸道病综合征(Porcine RespiratoryDisease Complex，PRDC)的主要原发性病之一，该病属于一种慢性呼吸系统疾病，其主要特点是发病率高、死亡率低，难以治愈，继而造成饲料转化率降低及其他继发性疾病。猪气喘病的感染可以在全世界范围内发生，属于养猪业较为常见的传染病，给养猪业造成重大经济损失。
现阶段，有效预防控制猪支原体肺炎的关键措施是疫苗接种，此方法对于猪肺炎支原体感染所造成的肺部病变的减轻以及日增重和饲料转化率的增高方面具有较为显著的效果，并且对于同圈猪感染的控制和母猪带菌率的降低具有非常重要的作用。目前广泛应用的猪肺炎支原体的疫苗类型为灭活疫苗，利用ELISA、荧光定量等方法可以对灭活疫苗进行体外检测，以此替代动物试验的评价手段，能够缩短检测周期、节约成本，并且更加符合动物福利要求。由于感染猪肺炎支原体之后会出现其他继发性感染，从而给养殖业造成较为严重的经济损失，因此及时对猪群进行猪肺炎支原体的检测和诊断尤为重要。
随着生物学技术的日趋完善，利用分子克隆技术将编码猪肺炎支原体蛋白质的基因克隆到原核表达载体上，表达其融合蛋白，通过免疫学筛选方法检测获得其中免疫原性强的特异性抗原蛋白，分离编码抗原蛋白的基因，目前研究的较多的蛋白是P97、P110、P65、P46和P36蛋白等。然而，目前的猪肺炎支原体商品化的抗体检测试剂盒仍是主要依赖进口，并且检测结果容易受操作、环境、材料等因素影响，其灵敏性和特异性难以保证。因此，针对猪肺炎支原体抗体的间接ELISA检测方法仍有待改善。
发明内容
为了解决上述问题，本发明旨在提供一种能够作为包被抗原应用于猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的重组蛋白、利用该重组蛋白进行间接ELISA检测的方法以及试剂盒，以对猪肺炎支原体的综合防治提供快速、高效、灵敏度高且特异性好的血清学检测方法。
一方面，本发明提供了一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包括依次连接的标签载体氨基酸、猪肺炎支原体P46蛋白氨基酸、间隔蛋白氨基酸和猪肺炎支原体P36蛋白氨基酸。
优选的，所述标签载体氨基酸可以是表达载体pET30a的氨基酸；所述间隔蛋白包括但不限于酶切位点序列、柔性蛋白序列等。更优选的，柔性蛋白序列可以是linker蛋白序列。
进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
在如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中，第1-50个氨基酸为表达载体pET30a上的氨基酸，作为标签使用；第51-154个氨基酸为猪肺炎支原体P46蛋白的抗原表位富集区；第155-169个氨基酸为柔性蛋白linker；第170-300个氨基酸为猪肺炎支原体P36蛋白的抗原表位富集区；第301-308个氨基酸为表达载体pET30a上的氨基酸，作为标签使用。
可以理解的是，为便于叙述，在本申请中将如SEQ ID No.1所示的重组蛋白简称为Mhp-P46-P36。
进一步地，所述重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中，编码表面膜蛋白P46的基因片段的序列如SEQ ID No.2序列中第151-462位所示，编码浆蛋白P36的基因片段的序列如SEQ ID No.2序列中第508-900位所示，酶切位点是如SEQ ID No.2序列中第145-150位和901-906位。间隔序列为柔性蛋白linker，其编码基因片段如SEQ ID No.2序列中第463-507位所示。其余序列为表达载体pET30a的编码序列。
另一方面，本申请还提供了一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法，所述检测方法利用上述重组蛋白作为包被抗原。
在一种实施方式中，本申请提供的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法的具体步骤可以是现有的间接ELISA检测方法的步骤，其中包被抗原使用本申请提供的重组蛋白即可。
在优选的实施方式中，上述间接ELISA检测方法具体包括以下步骤：
步骤1)：将所述重组蛋白用碳酸包被液稀释至一定浓度作为包被抗原加入酶标板中，1～5℃条件下包被过夜；
步骤2)：次日倒掉包被液，洗涤，加入封闭液进行封闭，置于37℃温箱中封闭1-3h；
步骤3)：洗涤，加入待检血清作为一抗，置于37℃温箱中孵育0.5-2h；
步骤4)：洗涤，加入酶标二抗，置于37℃温箱中孵育0.5-2h；
步骤5)：洗涤，加入显色液，室温闭光显色；
步骤6)：加入硫酸终止液停止反应，在酶标仪上读取OD450nm值。
可选的，所述洗涤得步骤包括：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。
进一步地，所述重组蛋白的抗原包被浓度为10μg/ml；和/或，
血清稀释度为1:40倍稀释。
进一步地，使用1％BSA作为封闭液；和/或，
待检血清作用时间为1h。
进一步地，使用HRP酶标记的葡萄球菌A蛋白为酶标二抗，所述酶标二抗的稀释倍数为1:4000；和/或，
所述酶标二抗的作用时间为60min；和/或，
显色时间为15min。
进一步地，结果判定的方法为：当待检血清OD450nm＞0.385时，即判定为阳性。
另一方面，本申请还提供了上述重组蛋白在制备猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测试剂盒中的应用。
另一方面，本申请还提供了一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被板，所述包被板为包被有上述重组蛋白的酶标板。
优选的，所述试剂盒中：
包被板为：包被有所述重组蛋白的酶标板；
酶结合物工作液为：使用1％BSA溶液稀释4000倍的阳性HRP酶标记的葡萄球菌A蛋白；
阳性对照物为：猪肺炎支原体抗体阳性血清；
阴性对照物为：猪肺炎支原体抗体阴性血清；
样品稀释液为：1％BSA；
洗涤液为：PBST；
显色液为：TMB显色液；
终止液为：2mol/L的硫酸溶液。
通过本发明能够带来如下有益效果：
1、本发明所提供的重组蛋白Mhp-P46-P36，能够作为包被抗原，为猪肺炎支原体疫苗的免疫检测和免疫程序的优化提供了理论依据；
2、利用本发明所提供的重组蛋白Mhp-P46-P36能够建立一种操作简单、成本低、能有效鉴别阴阳性血清的间接ELISA检测方法，经检测该方法符合率高，且具有良好的特异性和重复性，为猪肺炎支原体的综合防治提供新思路和新方法；
3、本发明还提供了利用重组蛋白Mhp-P46-P36且适用于本申请提供的检测方法的猪肺炎支原体抗体检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性好且检测时间短，操作容易且稳定性强，特异性地适用于猪肺炎支原体抗体的临床大规模检测和流行病学调查。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为P36蛋白的跨膜区分析结果图；
图2为P46蛋白的跨膜区分析结果图；
图3为P46蛋白的信号肽分析结果图；
图4为P36蛋白的B细胞表位分析结果图；
图5为P46蛋白的B细胞表位分析结果图；
图6为重组蛋白Mhp-P46-P36的微量诱导表达结果图，图中：1：未诱导，2：小体积诱导-1，3：小体积诱导-2，4：小体积诱导-3；
图7为重组蛋白Mhp-P46-P36的大量诱导表达结果图，图中：1：未诱导，2：上清，3：沉淀；
图8为重组蛋白Mhp-P46-P36的纯化结果图，图中：1：上清，2：纯化后；
图9为重组蛋白Mhp-P46-P36的蛋白浓度标准曲线图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本申请发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 pET-30a(+)-P46-P36质粒的构建
在NCBI数据库中获得，猪肺炎支原体P36蛋白(GenBank:MG813457.1)和P46蛋白(GenBank:AY496283.1)的氨基酸序列，使用跨膜区分析工具(参见网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线进行跨膜区分析；使用信号肽分析工具(参见网址：http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)在线进行信号肽分析；使用DNAstar和B细胞表位富集区分析工具(参见网址：https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABCsubmission.html)在线分析B细胞表位富集区。
所得结果见图1-图5，分析图中结果可知，胞浆蛋白P36无跨膜区和信号肽，B细胞表位富集区集中在氨基酸60-90位、205-230位、280-300位。膜蛋白P46氨基酸的第9-31位为跨膜区，20-40位为预测的信号肽区，B细胞表位富集区集中在氨基酸30-100位、140-200位、320-405位。
综合分析，P36蛋白选取编码37-168位氨基酸的基因序列，为了提高其蛋白表达量，进行了相应的密码子优化。优化前后的具体序列如下：
Upper line:p36优化前,from 4to 388
Lower line:p36优化后,from 4to 388
p36优化前:p36优化后identity＝72.73％(280/385)gap＝0.00％(0/385)
Figure BDA0003179975100000061
Figure BDA0003179975100000071
综合分析，P46蛋白选取编码31-134位氨基酸的基因序列，为了提高其蛋白表达量，进行了相应的密码子优化。优化前后的具体序列如下：
Upper line:p46优化后,from 1to 309
Lower line:p46优化前,from 1to 309
p46优化后:p46优化前identity＝75.73％(234/309)gap＝0.00％(0/309)
Figure BDA0003179975100000072
Figure BDA0003179975100000081
选择常规的柔性蛋白linker(甘氨酸+丝氨酸)，最终构建如下编码基因序列：
ATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCTGTGGGCAAACAGAATCTGGAAGTACTTCAGACAGCAAACCGCAAGCGGAGACGCTCAAGCACAAGGTTAGCAATGATTCGATCCGTATTGCGCTGACCGATCCGGATAACCCGCGTTGGATTTCGGCGCAGAAGGACATCATCAGCTATGTTGATGAAACCGAGGCGGCAACCAGCACCATCACGAAAAACCAGGATGCGCAAAACAACTGGTTGACCCAGCAAGCGAATCTGTCCCCGGCACCAAAAGGTTTCATCATCGCTCCGGAAAATGGTTCAGGTGTTGGTACTGCTGTGAACACCATTGCAGACGGTGGTGGCGGCAGCGGGGGTGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGTAGTCCGGACTTCGCGGACGGAAACGCGTTTGACTTTGAAGATGCCTCTGCGAGCCTGCCATTTCCGATTAGCGTTAGCAGATACGAGTATAAAGACCTGAAGGACGCTGACTTCATCGTGATCACGGCTGGTCGTCCGCAAAAGCCGGGTGAGACTCGTCTGGAATTAGTTGCCGACAACATTCGCATCATCCGCGAAATTGCATTGAAGGTGAAAGAGAGCGGCTTCAGCGGCATTAGCATTATCGTGGCGAATCCGGTGGACATCATTACCCGTGCATACCGCGATGCCTCCGGCTTCTCTGATCAGAAGGTCATCGGCTCCGGCACCGTTCTGGATACCGCGCGTCTGCAGTTTGCGATTGCCAAACGTGCTAAAGTGTCCCCGAACAGCGTCCTCGAGCACCACCACC ACCACCACTGA
上述序列共762bp，在序列表中如SEQ ID No.2所示。其中，编码表面膜蛋白P46的基因片段的序列如上述序列中第151-462位所示，编码浆蛋白P36的基因片段的序列如上述序列中第508-900位所示，酶切位点是上述序列中第145-150位和901-906位。间隔序列为柔性蛋白linker，其编码基因序列如上述序列中第463-507位所示。该序列由基因合成公司合成，并构建进pET-30a表达载体中，提供给本实验使用。
实施例2：重组蛋白Mhp-P46-P36的原核表达与纯化方法
本实施例提供了重组蛋白Mhp-P46-P36的原核表达与纯化方法，其中，基于实施例1提供的编码基因序列，预计该重组蛋白的氨基酸序列结果如下所示：
Figure BDA0003179975100000091
其中，第1-50个氨基酸为表达载体pET30a上的，作为标签使用；第51-154个氨基酸为猪肺炎支原体P46蛋白的抗原表位富集区；第155-169个氨基酸为柔性蛋白linker；第170-300个氨基酸为猪肺炎支原体P36蛋白的抗原表位富集区；第301-308个氨基酸为表达载体pET30a上的，作为标签使用。上述氨基酸序列在序列表中如SEQ ID No.1所示。
上述重组蛋白的原核表达与纯化方法包括以下步骤：
步骤一、重组质粒的转化
将重组质粒pET-30a(+)-P36-P46转化至E.coli BL21(大肠杆菌)感受态细胞中：取保存在-80℃的一管E.coli BL21感受态细胞，将10μL连接产物加入其中，混匀后冰浴30min，继而在42℃水浴中热激90s，完成后立即冰浴3-5min，向其中加入LB液体培养基500μL，37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养1h。取出培养后的菌液，室温下12000rpm离心2min，吸取400μL上清液弃去，将剩余液体与菌体吹吸混匀，吸取100μL接种到Kan+LB固体培养基，37℃过夜培养，获得重组菌。
步骤二、重组菌的小体积诱导表达
取重组菌的单菌落接种于5mLKan+LB液体培养基中，做三组平行对照，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养至OD600nm为0.6-0.8时，向其中加入5μL 1mMIPTG，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养4-5h后取出。取100μL菌液至EP管中，室温下12000rpm离心2min收集菌体，将上清吸出移入到另一个EP管中，在沉淀中加入80μL PBS洗涤后再用80μLPBS垂悬菌体，在上清和沉淀中分别加入20μL SDS-PAGE Loading Buffer，吹吸混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色：将凝胶放入适量的考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于摇床上缓慢摇动，室温下染色，当染色液中几乎看不清凝胶时即可判定为染色充分，此时，倒出染色液，加入适量从脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶，置于摇床上，室温下脱色，期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色达到预期效果，根据染色结果分析蛋白诱导表达的情况，所得结果如图6所示。
如图6所示，将重组菌经IPTG进行小体积诱导后，以12000rpm的转速室温离心2min后取沉淀菌体进行SDS-PAGE电泳，其中，重组蛋白Mhp-P46-P36的预计大小为32.7kDa，考马斯亮蓝染色结果显示该重组蛋白的大小约为37kDa，与预计结果相符，说明该蛋白表达正确。
步骤三、重组菌的大体积诱导表达
取步骤二中诱导表达情况好的菌液按2％的比例转接于200mLKan+LB液体培养基中，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养至OD600nm为0.6-0.8时，向其中加入200μLIPTG，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养4-5h后取出。
用Beckman离心管收集培养好的菌液，用低温离心机在10℃以8000rpm离心10min，用20mL PBS重悬菌体沉淀，并再次在10℃以8000rpm离心10min，再次重悬菌体沉淀，反复清洗3次。用20mL PBS重悬离心收集的菌体，在4℃冰浴条件下超声破碎所收集的菌体，以400W的功率超声4s后暂停4s，超声至少90个循环使溶液变清亮，超声完成后室温下以12000rpm离心30min，使上清和沉淀分离，用20mL的PBS重悬菌体沉淀。
取上清和沉淀各20μL于1.5mL的离心管中，与SDS-PAGE Loading Buffer混合后，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色，根据染色结果分析重组蛋白Mhp-P46-P36诱导表达的情况，所得结果如图7所示。
由图7可知，小体积表达成功后，将重组菌经IPTG进行大体积诱导，以8000rpm的转速低温离心10min后取沉淀菌体，用PBS重悬后进行超声破碎，将菌体上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色结果显示该重组蛋白的大小约为37kDa，与预计结果相符，说明该蛋白表达正确，且存在于上清中。
步骤四、重组蛋白Mhp-P46-P36的纯化
取表达重组蛋白Mhp-P46-P36的菌种，接种于Kan+LB液体培养基中，于37℃摇床中以120r/min的转速过夜震荡培养进行复苏。取复苏后的菌液按照2％的比例转接于200mLKan+LB液体培养基中，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养至OD600nm为0.6-0.8时，向其中加入200μL IPTG，于37℃摇床中以220r/min的转速震荡培养4-5h后取出。
用Beckman离心管收集培养好的菌液，用低温离心机在10℃以8000rpm离心10min，用PBS重悬菌体沉淀，并再次在10℃以8000rpm离心10min，再次重悬菌体沉淀，反复清洗3次。用20mL PBS重悬离心收集的菌体，在4℃冰浴条件下超声破碎所收集的菌体，以400W的功率超声4s后暂停4s，超声完成后室温下以12000rpm离心30min，使上清和沉淀分离，收集上清，并用0.1μm孔径的滤膜过滤上清样品。
连接蛋白纯化装置，用5倍柱体积的去离子水冲洗去镍柱内的乙醇，用5倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，流速为1mL/min，将处理好的待纯化样品以1mL/min的流速上样，用5-10倍柱体积Binding Buffer洗涤柱子，用10-20倍柱体积的Elution Buffer洗脱纯化后的蛋白，用EP管收集洗脱的样品，用5倍柱体积的Binding Buffer洗涤柱子，再用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，用5倍柱体积20％乙醇洗涤柱子，将洗涤好的柱子放在4℃保存。纯化后的蛋白加入蛋白酶抑制剂之后放在-20℃保存。
重组蛋白的纯化结果如图8所示，由图8可以看出，将大体积表达的菌液用亲和层析法进行纯化，在预期的大小左右出现了目的条带，且无杂蛋白，说明纯化效果较好。
采用上述方法获得的重组蛋白Mhp-P46-P36的蛋白浓度测定：
采用BCA法测定蛋白浓度：根据标准品和待测样品的数量，将适量Reagent A和Reagent B按50:1的比例混合，制成BCA工作液。将BSA Protein Standard进行倍比稀释，获得终浓度分别为0μL/mL、100μL/mL、200μL/mL、400μL/mL和800μL/mL的BSA标准品，分别取20μLBSA标准品和待测样品加入96孔板孔，样品和标准品分别做一个重复，向各孔中加入200μLBCA工作液，混合均匀后用封板膜封好，于37℃温箱中放置30min，取出后使其自然冷却至室温，使用酶标仪测定562nm波长下的吸光值，根据蛋白标准品浓度和吸光值，制作蛋白浓度标准曲线，根据蛋白浓度标准曲线和样品稀释倍计算样品的蛋白浓度，所得结果如图9所示。
由图9可知，根据蛋白标准品浓度和吸光值，得到蛋白浓度标准曲线y＝1115.1x-113.02，R2＝0.997，10倍稀释后的蛋白浓度原始数据平均值为0.456μg/mL，代入方程可知原始蛋白浓度为3959μg/mL。
实施例3利用重组蛋白Mhp-P46-P36进行猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法的建立与优化
本实施例建立了利用实施例1制得的重组蛋白Mhp-P46-P36进行猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法，并进行优化。其中，先利用商品化的IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒对来自滨州某集团生猪养殖场的52份血清进行检测，筛选出符合条件的阴阳性血清，再利用已知的阴阳性血清进行ELISA检测方法的优化。
其中，针对猪肺炎支原体抗体的间接ELISA检测方法具体包括以下步骤：
步骤1)：将纯化所得的重组蛋白Mhp-P46-P36用碳酸包被液(CBS)稀释至一定浓度作为包被抗原加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃条件下包被过夜。
步骤2)：次日倒掉包被液，用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入5％脱脂乳封闭，300μL/孔，37℃温箱中封闭2h。
步骤3)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入待检血清作为一抗，100μL/孔，37℃温箱中孵育1h。
步骤4)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入酶标二抗抗体，100μL/孔，37℃温箱中孵育1h。
步骤5)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入显色液，100μL/孔，室温闭光显色15min。
步骤6)：加入2M H2SO4终止液停止反应，50μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm值。
利用已知结果的阴阳性血清样本对上述检测方法进行优化，具体过程如下：
1、最适抗原包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将纯化所得的重组蛋白Mhp-P46-P36用碳酸包被液(CBS)分别按照25、50、100、200、400、800、1600依次倍比稀释，阴阳性血清分别按照1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320进行倍比稀释，按照上述步骤构成方阵，按照前述间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值。其中，P值指阳性血清吸光度值，N值指阴性血清吸光度值，根据P/N值大小选择最适抗原包被浓度和最佳血清稀释度，所得结果见表1。
表1
Figure BDA0003179975100000131
Figure BDA0003179975100000141
表1为矩阵实验的结果，综合考虑使用成本和抗体滴度值，选定该检测方法中的最适抗原包被浓度为10μg/mL，最佳血清稀释度为1:40。
2、最佳封闭液的确定
按已确定的最适抗原包被浓度包被酶标板，100μL/孔，4℃条件下包被过夜，次日倒掉包被液，用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干，分别加入1％BSA(牛血清白蛋白)、3％BSA、5％BSA、5％鸡血清、5％脱脂奶粉，300μL/孔，于37℃温箱中封闭2h，按照前述间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值，根据P/N值大小选择最佳封闭液，所得结果如表2所示。
表2
封闭液 阴性血清OD<sub>450nm</sub> 阳性血清OD<sub>450nm</sub> P/N值
1％BSA 0.293 0.823 2.813
3％BSA 0.237 0.444 1.876
5％BSA 0.221 0.391 1.773
5％鸡血清 0.412 0.921 2.234
5％脱脂奶粉 0.467 1.110 2.378
由表2中结果可知，在按照上述确定的最适抗原包被浓度和最佳血清稀释度进行间接ELISA检测的条件下，当以1％BSA作为封闭液时，P/N值最大，因此，确定1％BSA为最佳封闭液。
3、最佳血清作用时间的确定
按照上述筛选出来的条件，用已确定的最佳封闭液按照最佳稀释度稀释阴阳性血清，分别于37℃温箱中孵育30min、60min、90min并按照前述间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值，根据P/N值大小选择最佳血清作用时间，所得结果如表3所示。
表3
血清作用时间 阴性血清OD<sub>450nm</sub> 阳性血清OD<sub>450nm</sub> P/N值
30min 0.278 0.503 1.682
60min 0.373 0.715 1.916
90min 0.459 0.790 1.722
由表3中的结果可知，在按照上述确定的条件进行间接ELISA检测以及用1％BSA稀释阴阳性血清的条件下，当待检血清作用时间为1h时，P/N值最大，因此，确定1h为最佳血清作用时间。
4、最佳酶标二抗工作浓度的确定
按照上述筛选出来的条件，以葡萄球菌A蛋白(HRP)为酶标二抗，将酶标二抗用已确定的最佳封闭液按1:2000、1:4000、1:8000、1:10000进行倍比稀释，100μL/孔，按照前述间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值，根据P/N值大小选择最佳酶标二抗工作浓度，所得结果如表4所示。
表4
酶标二抗工作浓度 阴性血清OD<sub>450nm</sub> 阳性血清OD<sub>450nm</sub> P/N值
1:2000 0.502 0.986 1.963
1:4000 0.381 0.791 2.073
1:8000 0.283 0.493 1.743
1:10000 0.213 0.419 1.967
由表4中的结果可知，在按照上述确定的条件进行间接ELISA检测的条件下，当酶标二抗稀释倍数为1:4000时，P/N值最大，因此，确定1:4000为最佳酶标二抗工作浓度。
5、最佳酶标二抗作用时间的确定
按照上述筛选出来的条件，加入最佳稀释度的酶标二抗，分别于30min、60min、90min三个时间后结束反应，按照间接ELISA的基本操作程序进行后续操作，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值，根据P/N值大小选择最佳酶标二抗作用时间，所得结果见表5。
表5
酶标二抗作用时间 阴性血清OD<sub>450nm</sub> 阳性血清OD<sub>450nm</sub> P/N值
30min 0.313 0.580 1.853
60min 0.357 0.752 2.106
90min 0.420 0.872 2.076
由表5中的结果可知，在按照上述确定的条件进行间接ELISA检测的条件下，综合考虑时间成本和抗体滴度值，确定60min为最佳酶标二抗作用时间。
6、最佳显色时间(底物作用时间)的确定
按照上述筛选出来的条件，各孔加入底物混匀后，室温避光显色，分别于10min、15min、20min后加入50μL 2M H2SO4终止液停止反应，阴阳性血清各做两个重复，测出OD450nm后取平均值，根据P/N值大小选择最佳显色时间，所得结果见表6。
表6
显色时间 阴性血清OD<sub>450nm</sub> 阳性血清OD<sub>450nm</sub> P/N值
10min 0.303 0.531 1.750
15min 0.338 0.767 2.268
20min 0.381 0.789 2.068
由表6的结果可知，在按照上述确定的条件进行间接ELISA检测的条件下，当显色时间为15min时，P/N值最大，因此，确定15min为最佳显色时间。
7、阴阳性临界值的确定
随机选取30份阴性血清按照上述已经确定的最佳反应条件进行间接ELISA试验，每个血清做两组重复，测出OD450nm，计算出30份血清OD450nm的平均值(X)和标准方差(SD)，以X+3SD作为阴阳性临界值，当OD450nm＞X+3SD时，即可判定为阳性，所得结果见表7。
表7
Figure BDA0003179975100000161
Figure BDA0003179975100000171
由表7中的数据可以计算出30份阴性血清OD450nm的平均值(X)和标准方差(SD)，即X＝0.246，SD＝0.046，由此确定待检血清OD450nm＞0.385时，即可判定为阳性。
因此，经过优化后的利用重组蛋白Mhp-P46-P36进行猪肺炎支原体抗体的间接ELISA检测方法具体包括以下步骤：
步骤1)：将纯化所得的重组蛋白Mhp-P46-P36用碳酸包被液(CBS)稀释至10μg/mL，作为包被抗原加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃条件下包被过夜。
步骤2)：次日倒掉包被液，用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入1％BSA封闭，300μL/孔，37℃温箱中封闭2h。
步骤3)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入待检血清作为一抗，100μL/孔，37℃温箱中孵育1h，血清稀释度为1:40，待检血清作用时间为1h。
步骤4)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。使用葡萄球菌A蛋白为酶标二抗，稀释倍数为1:4000，加入酶标二抗抗体，100μL/孔，37℃温箱中孵育1h。
步骤5)：用PBST洗涤3次，3min/次，倒空，用滤纸吸干。加入显色液，100μL/孔，室温闭光显色15min。
步骤6)：加入2M H2SO4终止液停止反应，50μL/孔，在酶标仪上读取OD450nm值。
步骤7)：结果判定：当待检血清OD450nm＞0.385时，即判定为阳性，否则为阴性。
进一步，该实施例还提供了一种可适用于上述优化后的ELISA检测方法的试剂盒，该试剂盒中设有：
包被板，所述包被板为包被有上述重组蛋白的酶标板；
酶结合物工作液为使用1％BSA溶液稀释4000倍的阳性HRP酶标记的葡萄球菌A蛋白；
阳性对照物为猪肺炎支原体抗体阳性血清，阴性对照物为猪肺炎支原体抗体阴性血清；
样品稀释液为：1％BSA；
洗涤液为：PBST；
显色液为：单组分TMB；
终止液为：2mol/L的硫酸溶液
实施例4重复性实验
该实施例针对上述实施例2优化后的间接ELISA间接方法进行批内重复和批间重复实验。
1、批内重复试验
取同一批次的ELISA酶标板，按照上述已经建立的间接ELISA检测方法对已知的阴、阳性猪血清各3份进行检测，每份样品平行设立5个重复，测出OD450nm后，计算变异系数。所得结果见表8，变异系数的计算公式如下：
变异系数(CV)＝[标准差(SD)/平均值(MN)]×100％。
表8
血清 重复1 重复2 重复3 重复4 重复5 重复平均值 标准差 变异系数
阳性血清1 0.773 0.766 0.786 0.790 0.759 0.775 0.013 1.69％
阳性血清2 0.752 0.763 0.745 0.766 0.734 0.752 0.013 1.75％
阳性血清3 0.767 0.779 0.759 0.779 0.752 0.767 0.012 1.57％
阴性血清1 0.233 0.246 0.226 0.248 0.218 0.234 0.013 5.49％
阴性血清2 0.272 0.255 0.266 0.288 0.282 0.273 0.013 4.78％
阴性血清3 0.252 0.264 0.244 0.266 0.239 0.253 0.012 4.71％
由表8的结果可知，批内重复试验的变异系数小于7％，表明同一样个样本在同一批次的酶标板内变异系数小，因此上述检测方法具有良好的重复性。
2、批间重复试验
取不同批次的ELISA酶标板，按照上述已经建立的间接ELISA检测方法对已知的阴阳性猪血清各3份进行检测，每份样品平行设立3个重复，测出OD450nm后，计算变异系数。所得结果见表9，变异系数的计算公式如下：
变异系数(CV)＝[标准差(SD)/平均值(MN)]×100％。
表9
血清 第一批 第二批 第三批 平均值 标准差 变异系数
阳性血清1 0.767 0.780 0.752 0.766 0.014 1.83％
阳性血清2 0.752 0.766 0.733 0.750 0.017 2.21％
阳性血清3 0.791 0.808 0.776 0.792 0.016 2.02％
阴性血清1 0.256 0.269 0.241 0.255 0.014 5.49％
阴性血清2 0.283 0.297 0.264 0.281 0.017 5.89％
阴性血清3 0.271 0.288 0.256 0.272 0.016 5.89％
如表9的结果可知，批间重复试验的变异系数小于7％，表明同一样个样本在不同批次的酶标板内变异系数小，因此上述检测方法具有良好的重复性。
实施例5特异性检测实验
该实施例针对上述实施例2优化后的间接ELISA间接方法进行特异性检测实验。该实验分别将含有猪瘟阳性抗体、猪伪狂犬阳性抗体、猪鼻支原体阳性抗体、猪絮状支原体阳性抗体、猪蓝耳病阳性抗体和猪圆环病毒阳性抗体的血清作为待测样本，利用实施例2提供的检测方法进行检测，所得结果见表10。
表10
Figure BDA0003179975100000191
由表10中的结果可知，实施例2提供的检测方法对除猪肺炎支原体抗体以外的其他多数猪类疾病抗体的检测结果，均在临界值以下，判定为阴性。因此，可以确认实施例2提供的检测方法，针对猪肺炎支原体抗体的检测具有很好的特异性。
实施例6反应原性的比较
以上述实施例提供的重组蛋白Mhp-P46-P36为实验组，另外构建三组重组蛋白为对照组，分别为D1组：Mhp-P36-P46(与本发明表达的蛋白片段一致，但基因序列片段的连接顺序有差异)；D2组：Mhp-P36(编码P36蛋白的基因序列选择150-300位)；D3组：Mhp-P46(编码P46蛋白的基因序列选择第200-400位)；D4组：Mhp-P46-P36(编码P36蛋白的基因序列选择150-300位，编码P46蛋白的基因序列选择第200-400位)。将上述五组重组蛋白分别使用相同的蛋白浓度，用碳酸包被液(CBS)稀释至10μg/mL，作为包被抗原加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃条件下包被过夜。使用标准的阳性血清按照实施例3的步骤进行ELISA试验，评价蛋白的反应原性。
表11
Figure BDA0003179975100000201
由表11中的结果可知，更换包被抗原后按照实施例3提供的检测方法评价该蛋白的反应原性，根据OD450nm测得的数值大小显示可知，实验组提供的重组蛋白Mhp-p46-36蛋白的反应原性最好。
实施例7临床样品的检测
利用实施例2提供的优化的间接ELISA检测方法对来自滨州某集团生猪养殖场的52份待检血清进行检测，并与商品化的IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒的检测结果进行比较，所得结果见表12。
表12
Figure BDA0003179975100000202
由表12的结果可知，采用实施例2提供的间接ELISA检测方法对来自滨州某集团生猪养殖场的52份血清进行检测，测出的阳性样品为34份，阴性样品为18份，阳性率65.4％；用IDEXX猪肺炎支原体抗体检测试剂盒进行检测，测出的阳性样品为41份，阴性样品为11份，阳性率78.8％，两者相符的结果为37个，符合率为72.5％，说明本申请提供的利用重组蛋白Mhp-P46-P36进行猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有很高的准确率。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
序列表
<120> 一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白
<141> 2021-07-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Glu Thr His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Ala
1 5 10 15
Gly Ser Gly Met Glu Thr Leu Gly Thr Ala Ala Ala Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gly His Met Glu Thr Ala Ser Pro Ala Leu Gly Thr Ala Ala Ala Ala
35 40 45
Leu Ala Met Glu Thr Ala Ala Ile Gly Ser Cys Gly Gly Thr Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Thr Ser Ala Ser Leu Pro Gly Ala Gly Thr Leu Leu His Leu
65 70 75 80
Val Ser Ala Ala Ser Ile Ala Ile Ala Leu Thr Ala Pro Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Thr Ile Ser Ala Gly Leu Ala Ile Ile Ser Thr Val Ala Gly Thr
100 105 110
Gly Ala Ala Thr Ser Thr Ile Thr Leu Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Thr Leu Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ser Pro Ala Pro Leu Gly Pro Ile
130 135 140
Ile Ala Pro Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Thr Ala Val Ala Thr Ile
145 150 155 160
Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Ala Ser
180 185 190
Ala Ser Leu Pro Pro Pro Ile Ser Val Ser Ala Thr Gly Thr Leu Ala
195 200 205
Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ile Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gly Leu
210 215 220
Pro Gly Gly Thr Ala Leu Gly Leu Val Ala Ala Ala Ile Ala Ile Ile
225 230 235 240
Ala Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Gly Ser Gly Pro Ser Gly Ile Ser
245 250 255
Ile Ile Val Ala Ala Pro Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Thr Ala Ala
260 265 270
Ala Ser Gly Pro Ser Ala Gly Leu Val Ile Gly Ser Gly Thr Val Leu
275 280 285
Ala Thr Ala Ala Leu Gly Pro Ala Ile Ala Leu Ala Ala Leu Val Ser
290 295 300
Pro Ala Ser Val Leu Gly His His His His His His
305 310 315
<210> 2
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc tgtgggcaaa cagaatctgg aagtacttca 180
gacagcaaac cgcaagcgga gacgctcaag cacaaggtta gcaatgattc gatccgtatt 240
gcgctgaccg atccggataa cccgcgttgg atttcggcgc agaaggacat catcagctat 300
gttgatgaaa ccgaggcggc aaccagcacc atcacgaaaa accaggatgc gcaaaacaac 360
tggttgaccc agcaagcgaa tctgtccccg gcaccaaaag gtttcatcat cgctccggaa 420
aatggttcag gtgttggtac tgctgtgaac accattgcag acggtggtgg cggcagcggg 480
ggtggtggct ctggcggtgg cggtagtccg gacttcgcgg acggaaacgc gtttgacttt 540
gaagatgcct ctgcgagcct gccatttccg attagcgtta gcagatacga gtataaagac 600
ctgaaggacg ctgacttcat cgtgatcacg gctggtcgtc cgcaaaagcc gggtgagact 660
cgtctggaat tagttgccga caacattcgc atcatccgcg aaattgcatt gaaggtgaaa 720
gagagcggct tcagcggcat tagcattatc gtggcgaatc cggtggacat cattacccgt 780
gcataccgcg atgcctccgg cttctctgat cagaaggtca tcggctccgg caccgttctg 840
gataccgcgc gtctgcagtt tgcgattgcc aaacgtgcta aagtgtcccc gaacagcgtc 900
ctcgagcacc accaccacca ccactga 927

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包括依次连接的标签载体氨基酸、猪肺炎支原体P46蛋白氨基酸、间隔蛋白氨基酸和猪肺炎支原体P36蛋白氨基酸。
2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测用的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于，所述检测方法利用如权利要求1-3任一所述的重组蛋白作为包被抗原。
5.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于，所述重组蛋白的抗原包被浓度为10μg/ml；和/或，
血清稀释度为1:40倍稀释。
6.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于，使用1％BSA作为封闭液；和/或，
待检血清作用时间为1h。
7.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于，使用葡萄球菌A蛋白作为酶标二抗，所述酶标二抗的稀释倍数为1:4000；和/或，
所述酶标二抗的作用时间为60min；和/或，
显色时间为15min。
8.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于，结果判定的方法为：当待检血清OD450nm＞0.385时，即判定为阳性。
9.如权利要求1-3任一所述的重组蛋白在制备猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测试剂盒中的应用。
10.一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，包括包被板，其特征在于，所述包被板为包被有如权利要求1-3任一所述的重组蛋白的酶标板；
优选的，所述试剂盒中：
包被板为：包被有所述重组蛋白的酶标板；
酶结合物工作液为：使用1％BSA溶液稀释4000倍的阳性HRP酶标记的葡萄球菌A蛋白；
阳性对照物为：猪肺炎支原体抗体阳性血清；
阴性对照物为：猪肺炎支原体抗体阴性血清；
样品稀释液为：1％BSA；
洗涤液为：PBST；
显色液为：TMB显色液；
终止液为：2mol/L的硫酸溶液。
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