CN115160411A - 一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一系列ASFV感染诱导猪体产生高水平抗体的优势抗原，包括p30蛋白、p54蛋白、KP177R蛋白、E199L蛋白,E184L蛋白,B475蛋白，E120R蛋白、A104R蛋白、A137R蛋白、K145R蛋白、CP312R蛋白、p12‑p17‑p10蛋白和I73R‑B169L蛋白中的一种或多种，并通过原核表达的抗原蛋白，建立一种灵敏性高、特异性强、成本低的ASFV抗体ELISA检测试剂盒，为我国ASFV防控提供一种准确可靠、低成本的血清学检测技术。同时上述蛋白在ASFV亚单位疫苗制备中的应用，上述蛋白能与ASFV阳性猪血清发生不同程度的抗原抗体反应，显示具有刺激宿主产生抗体的功能，具有广阔的市场前景。

Description

一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及间接ELISA方法的建立。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染猪引起的一种烈性、高度接触性传染病，病死率可高达100％，是危害世界养猪业的一种重要传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病。随着ASFV流行时间延长，自2020年下半年以来，我国非洲猪瘟流行出现新情况，即出现非洲猪瘟病毒低毒力流行株。ASFV低毒力株感染严重迟缓育肥猪生长，引致种猪繁殖障碍，且感染潜伏期长，临床症状早期不易觉察，可在猪群中悄无声息传播，晚期可出现关节炎、皮肤坏死等典型症状，危害严重，防控难度大。ASF已成为我国各猪场全力防控的首要疫病，我国已将其列为一类动物疫病，亟需有效的技术方法和防控措施来控制ASFV在我国流行。
ASFV是一种有囊膜、线性双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。其病毒粒子结构较为复杂，由内至外分五层组成：含病毒基因组的类核(nucleoid)、内核心壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(capsid)和外囊膜(outerenvelope)。ASFV基因组全长为170-194kbp，由中央保守区和两端可变区组成，编码151-167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。目前，ASFV 基因组编码蛋白的数量与功能还不完全明确。通过质谱分析，在体外培养的细胞中，可以检测到94种病毒蛋白的表达。而成熟的病毒粒子，则发现多达68种病毒蛋白，其中未知功能蛋白达20多种。在已知功能的病毒蛋白中，不仅存在许多结构蛋白，也存在大量参与核苷酸代谢、病毒转录与复制的病毒蛋白，还存在一些与宿主细胞互作从而调控宿主的免疫反应和抑制细胞凋亡等功能蛋白。
目前，ASFV尚无有效疫苗和药物可供使用，检测技术在ASFV防控中发挥着重要作用。自从ASFV在我国流行以来，我国在其病原核酸检测技术上取得了显著成绩，已有7种荧光PCR、1种微流控荧光PCR和1种Lamp检测试剂盒获农村农业部批准应用于ASFV检测。这些技术在控制我国ASFV疫情，特别是ASFV强毒株流行中，发挥了重要作用。然而随着ASFV低毒株在我国流行，由于其感染临床症状不易觉察，且生猪感染后排毒滴度低、间隙性排毒，病原核酸检测存在不足。而低毒株感染猪，可产生稳定的抗体，且持续时间长，是感染然检测的重要靶标。在抗体检测技术中，ELISA灵敏性高，可批量检测临床样品，得到广泛应用。目前，我国虽然有数种非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒，但试剂盒的灵敏性和特异性存在欠缺，不及国外同类产品，我国非洲猪瘟抗体检测试剂市场主要由外国产品占据。但进口非洲猪瘟抗体检测试剂盒售价昂贵，这阻碍了广大猪场利用ASFV抗体检测技术对低毒株感染的监测，不利用我国ASF防控。因此，开发一种灵敏性高、特异性强、成本低的ASFV抗体ELISA检测试剂盒，能显著促进我国对ASFV的防控。
鉴于ASFV编码病毒蛋白种类多，且存在大量蛋白功能不明确。本发明通过原核表达系统，制备ASFV主要结构蛋白以及高表达蛋白，包被ELISA板，通过间接ELISA方法筛选与ASFV阳性猪血清呈强反应的优势抗原，并以筛选出的优势抗原为包被蛋白，建立一种ASFV抗体间接ELISA检测方法，为我国ASFV 防控提供一种准确可靠、低成本的血清学检测技术。
发明内容
本发明的目的筛选出ASFV感染诱导猪体产生高水平抗体的优势抗原，并通过原核表达的抗原蛋白，建立一种灵敏性高、特异性强、成本低的ASFV抗体 ELISA检测试剂盒，为我国ASFV防控提供一种准确可靠、低成本的血清学检测技术。
此外，本发明还提供了一种优势蛋白的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明通过分析48种ASFV主要结构蛋白和高表达蛋白的疏水性、跨膜区和抗原性，优化并合成48种蛋白的胞外区或强抗原性肽段基因，并克隆经原核表达载体pCold I中，经16℃诱导表达，纯化制备了34种独立表达的病毒蛋白和2种融合形式表达蛋白。以上述纯化蛋白作为包被抗原，通过ASFV阳性猪血清ELISA筛选，确定p30、p54和KP177R为优势抗原，其中以p30蛋白为最优抗原，与阳性ASFV猪血清反应水平高，不同样品间差异性小。以纯化p30为包被抗原，通过抗原包被量、包被缓冲液及包被温度等各种条件优化，确立了ELISA 各项参数：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液、37℃包被1h；5％脱脂乳为封闭液、37℃封闭时间1h；检测血清作1:40倍稀释，37℃孵育1h；酶标二抗稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min，建立了p30抗体间接ELISA方法。经灵敏性和特异性检测，该ELISA法灵敏性高，特异性强，达到国外同类试剂盒的检测水平。
本发明中ELISA法使用的包被抗原p30蛋白，是从36种ASFV蛋白中以 ASFV阳性猪血清中筛选出的。其与不同ASFV阳性猪血清反应水平高，差异性小，是36种筛选ASFV蛋白中的最优抗原。
本发明中使用的包被抗原p30蛋白，是p30基因克隆于原核表单载体pCold I，经低温(16℃)诱导、包涵体变性、His柱纯化以及透析复性而制备的。
本发明中使用的包被抗原p30蛋白，经复性缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1％甘氨酸，5％甘油，0.2％PEG 3350，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽)透析复性后，具备良好的生物活性，与不同ASFV阳性猪血清均能高水平亲和作用，是一种优异的ELISA诊断抗原。
附图说明
图1纯化制备的ASFV原核表达蛋白，其中，A:M:蛋白marker；1:p30蛋白；B: M:蛋白marker；1:H171R蛋白；C:M:蛋白marker；1:CP312R蛋白；D:M:蛋白 marker；1:E199L蛋白；E:M:蛋白marker；1:p54蛋白；F:M:蛋白marker；1:C257L 蛋白；G:M:蛋白marker；1:A137R蛋白；H:M:蛋白marker；1:E120R蛋白；I:M: 蛋白marker；1:p72蛋白；J:M:蛋白marker；1:KP177R蛋白；K:M:蛋白marker；1: I177L蛋白；L:M:蛋白marker；1:E146L蛋白；
图2重组蛋白的SDS-PAGE分析，其中，A:M:蛋白marker；1:K196R蛋白； B:M:蛋白marker；1:F317L蛋白；C:M:蛋白marker；1:CP717R蛋白；D:M:蛋白 marker；1:B475L蛋白；E:M:蛋白marker；1:A104R蛋白；F:M:蛋白marker；1: B602L蛋白；G:M:蛋白marker；1:EP152R蛋白；H:M:蛋白marker；1:E248R蛋白； I:M:蛋白marker；1:E184L蛋白；J:M:蛋白marker；1:I73R-B169L蛋白；K:M:蛋白marker；1:H240R蛋白；L:M:蛋白marker；1:M1249L蛋白；
图3重组蛋白的SDS-PAGE分析，其中，A:M:蛋白marker；1:B125R蛋白；B: M:蛋白marker；1:C129R蛋白；C:M:蛋白marker；1:K421R蛋白；D:M:蛋白 marker；1:A151R蛋白；E:M:蛋白marker；1:EP153R蛋白；F:M:蛋白marker；1: K205R蛋白；G:M:蛋白marker；1:K145R蛋白；H:M:蛋白marker；1:E423R蛋白； I:M:蛋白marker；1:CD2V蛋白；J:M:蛋白marker；1:p15蛋白；K:M:蛋白marker；1: p34蛋白；L:M:蛋白marker；1:p12(p17-p10)蛋白
图4：ASFV阳性、阴性猪血清与纯化蛋白的ELISA筛选结果，其中， A.B.C.D.E.F分别为36个纯化蛋白与11份ASFV阳性猪血清和5份阴性猪血清的ELISA反应水平
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
ASFV在我国流行，给我国养猪业造成了惨重的经济损失，已成为威胁我国养猪业健康发展的主要传染病之一。而ASFV低毒力株在我国流行，则需要大量准确可靠的血清学诊断试剂盒可供使用。本发明通过原核表达系统制备ASFV主要结构蛋白以及高表达蛋白，通过间接ELISA方法筛选出与ASFV阳性猪血清呈强反应的优势抗原p30，并以原核表达的p30蛋白为包被蛋白，通过ELISA条件优化，建立一种ASFV p30抗体间接ELISA检测方法，确定了ELISA各项参数：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液、37℃包被1h； 5％脱脂乳为封闭液、37℃封闭时间1h；检测血清作1:40倍稀释，37℃孵育1h；酶标二抗稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min。该方法特异性强，与常见猪病原PRRSV、PRV、CSFV等阳性猪血清均不反应。该方法灵敏性高，ASFV阳性猪血清1:1280稀释后检测仍呈现阳性结果。该方法成本低，以原核表达制备高活性p30蛋白作为包被抗原，降低了ELISA试剂盒的制作成本。本发明涉及的ELISA方法，为我国ASFV防控提供一种准确可靠、低成本的血清学检测技术。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
下面通过实施例，具体阐述本发明。
在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下:
BL21感受态细胞，购自Takara公司；ASFV基因序列，委托通用生物系统 (安徽)有限公司合成，并分别克隆入pCold I载体中；His标签蛋白纯化试剂盒，购自Bio-Works公司。
其它试剂：质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司；IPTG、BSA和TMB，购自碧云天生物科技公司；脱脂乳，购自美国BD公司；考马斯亮蓝R-250，购自 Biosharp公司；HRP标记羊抗猪，sigma公司；ELISA酶标板，购自深圳市金灿华实业有限公司。
实施案例1.非洲猪瘟主要病毒蛋白的表达与制备
1.1非洲猪瘟主要病毒蛋白基因原核表达序列
根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染细胞的蛋白组学数据(Keβler C,Forth JH,Keil GM,Mettenleiter TC,Blome S,Karger A.Theintracellular proteome of African swine fever virus.Sci Rep.2018,8(1):14714.doi: 10.1038/s41598-018-32985-z.)和病毒粒子蛋白组学数据(Alejo A,Matamoros T, Guerra M1,Andrés G.A Proteomic Atlas of the African Swine FeverVirus Particle.J Virol.,2018,92(23).pii:e01293-18)，以我国流行的ASFV基因II型SY18株 (GenBank:MH766894)和Pig/HLJ/2018(GenBank:MK333180)为基准，针对病毒 33种主要结构蛋白(CD2v,p17,p12,B438L,p72,M1249L,H240R,E120R,p54, E199L,E248R,H108R,KP177R,p30,p150,E423R,p37,p34,p14,p35,p15,p10, A104R,I177L,B169L,EP84R,B117L,EP152R,C257L,K421R,C717R,CP123L, F317L)和16种细胞高表达蛋白(K145R,A137R,I73R,C129R,CP312R,285L, B475L,E184L,K205R,A151R,H171R,B602L,EP153R,K196R,B125R,E146L), 利用ProtScale、TMHMM和SignalP分析蛋白的疏水性、跨膜区和信号肽，利用 ABCpred预测蛋白的16肽抗原表位，并利用DNAStar分析病毒蛋白抗原性，结合大肠杆菌表达外源基因的特点，大病毒蛋白选择抗原性强、亲水性高的区段进行表达，膜蛋白选择去掉信号肽的胞外区表达，小蛋白进行融合表达。根据大肠杆菌密码子偏嗜性，对表达的ASFV基因序列进行优化。表达的病毒各基因序列如序列表所示(其中，实施例中克隆了43个序列，其中有36个序列表达出蛋白，另7个序列未表达)。
1.2表达非洲猪瘟病毒蛋白重组质粒的构建
为了利用pCold I载体表达上述病毒序列，在各序列5’末端添加Nde I核酸内切酶识别序列，在3’末端添加Xba I核酸内切酶识别序列。委托通用生物系统(安徽)有限公司合成病毒基因序列，并分别克隆入pCold I载体中，经酶切分析和序列测定，证实各重组表达质粒构建成功。
1.3非洲猪瘟病毒蛋白表达检测
将各重组表达质粒转化BL21感受态：取1μL质粒(50ng DNA)加入50μL BL21 感受态中，混合后冰上静置30min，再置于42℃水浴锅中热激90s，随后立即冰浴3min。在超净台中加入1mL SOC培养基,37℃恒温摇床内以220rpm振荡培养1h。各转化菌分别取100μL涂布到LB固体培养基上(氨苄抗性)，37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。
在各重组菌转化平板上挑取单菌落，在37℃恒温摇床内以220rpm振荡培养过夜。将过夜摇培养的菌液按1：100的比例转接至一个新的试管(含5ml新鲜带有氨苄抗性的LB培养基)中，随后37℃恒温摇床培养3-4小时左右，测OD600 值。OD600在0.5-0.6之间时，诱导组按1：1000的比例加入诱导剂IPTG(终浓度1mM)，16℃摇床以200rpm诱导培养16-20小时，未诱导组不加IPTG，在相同条件下培养。以6000rpm离心5min收集诱导培养后菌体，并以1mLPBS 重悬沉淀菌体。将装有菌液的离心管置于冰上，在超声破碎仪中，以200W、超 3S、停3S条件超声5min。超声好的菌液在4℃下6000rpm离心5min，分别收集上清和沉淀。沉淀物以1mL PBS洗涤1次，4℃下6000rpm离心5min，沉淀以 1mL PBS重悬。上清和沉淀分别取40μl于1.5mL EP管中，加入10μl 5×Loading Buffer,沸水煮样10min，冷却后10000rpm离心2min，取10μL样品进行 SDS-PAGE，随后进行考马斯亮蓝染色。蛋白电泳结果显示，36种病毒蛋白成功表达，其中4种蛋白呈现可溶性表达(p54、A104R、I73R-B169L、A137R、p15)，其余32种蛋白为包涵体表达。
1.4非洲猪瘟病毒蛋白制备
将平板上的重组菌单菌落，挑取至装有5mL LB液体(含氨苄100μg/mL) 的试管中，在37℃恒温摇床37℃恒温摇床培养过夜。将过夜培养的菌液按1： 100的比例转接至一个装有200mL LB液体(含氨苄100μg/mL)的烧瓶中，37℃恒温摇床培养3-4小时左右，当OD600达到0.5-0.6之间时，加入IPTG至1mM， 16℃摇床以200rpm诱导培养16-20小时，6000rpm离心5min沉淀菌体。用30ml PBS重悬菌体洗涤一次，4℃，6000rpm离心5min，弃上清。再用30mlPBS重悬，并加入溶菌酶至1mg/ml，DNase I 4μl(1:5000稀释)，4℃放置1h左右。根据蛋白呈可溶性或包涵体方式表达，选择下列具体方法进行纯化。
1.4.1可溶性表达蛋白的纯化
(1)将样品置于冰上，300W、超3s、停3s，超声破碎20-30min至液体透亮。将超声的样品在4℃以1500g离心20min，保存上清。
(2)根据His标签蛋白纯化试剂盒说明书，平衡纯化凝胶。将1.5ml平衡后的凝胶加入超声后的上清中，置于4℃冰箱中旋转混合过夜。
(3)将过夜结合的凝胶液移入亲和层析柱中，滤出液体。然后用2ml结合缓冲液清洗亲和层析柱，清洗两次。
(4)加入含20mM咪唑的洗涤缓冲液进行洗涤，每次加入2ml，洗涤10次。
(5)以10mL含300mM咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集，1mL/管。
(6)以SDS-PAGE分析蛋白纯度，并以浓缩柱离心浓缩。
1.4.2包涵体蛋白的纯化
(1)将样品置于冰上超声破碎，300W，超3s、停3s，工作20min。将超声的样品在4℃以1500g离心20min，弃上清，保留沉淀。
(2)以30mL包涵体洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl,2mM EDTA,100mM NaCl, 0.5％TritonX-100(v/v),2M尿素，pH 7.5)重悬，150W，超3s、停3s，超声3min， 4℃、1500g离心10min，弃上清。
(3)以20mL包涵体溶解缓冲液(8M尿素，100mM Tris-HCl，10mMβ-巯基乙醇，2mMEDTA，2mM脱氧胆酸钠)重悬沉淀，室温放置30min，4℃、 1500g离心30min，保留上清。
(4)根据His标签蛋白纯化试剂盒说明书，平衡纯化凝胶。将1.5ml平衡后的凝胶加入包涵体溶解上清，置于4℃冰箱中旋转混合过夜。
(5)将过夜结合的凝胶液移入亲和层析柱中，滤出液体。然后用2ml含8M 尿素结合缓冲液清洗亲和层析柱，清洗两次。
(6)加入含20mM咪唑和8M尿素的洗涤缓冲液进行洗涤，每次加入2ml，洗涤10次。
(7)以10mL含300mM咪唑和8M尿素的洗脱缓冲液进行洗脱，分管收集， 1mL/管。
(8)以SDS-PAGE分析蛋白纯度，并将纯化蛋白放入透析袋中依次经过含6M、4M、2M尿素的复性缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1％甘氨酸，5％甘油，0.2％PEG 3350，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽)和PBS逐步透析复性。
(9)将装有复性的蛋白液的透析袋置于PEG 20000中浓缩。
经过纯化，如图1所示，34种独立表达病毒蛋白(p30，H171R，CP312R， E199L，p54，C257L，A137R，E120R，p72，KP177R，I177L，E146L，K196，F317L，CP717R，B475L，A104，B602L，EP152R，E248R，E184L，H240R， M1249L，B125R，C129R，K421R，A151R，EP153R，K205R，K145R，E423R， CD2V，p15，p34)和两种融合形式表达蛋白(I73R-B169L和p12-p17-p10)获得较高纯度制备。
实施案例2.ASFV优势抗原的筛选
为了鉴定原核表达ASFV蛋白的抗原活性，将纯化的病毒蛋白包被ELISA 板，通过间接ELISA方法检测与ASFV抗体阳性猪血清的反应水平，筛选ASFV 的优势抗原。
2.1间接ELISA抗原包被
以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各纯化蛋白的浓度，以0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)分别将各纯化蛋白稀释至浓度为1μg/mL。一种病毒蛋白包被 1板ELISA条孔，每孔100μL稀释蛋白液，4℃包被过夜。将包被完的ELISA 孔以PBST洗涤3次后，按每孔150μL加入封闭液(含5％脱脂乳的PBST)， 37℃封闭1h。将封闭后ELISA孔以PBST洗涤3次，甩去洗涤液，室温干燥后，装入封闭袋中，-35℃保存备用。
2.2优势抗原筛选
将本实验室保藏的10份ASFV阳性猪血清和5份阴性猪血清分别以抗体稀释液(含5％脱脂乳的PBST)作1:100倍稀释，以实例2.1中包被的各ASFV 病毒蛋白为检测抗原，进行间接ELISA检测。将包被好的ELISA板取出，恢复至室温，每种病毒蛋白包被ELISA板加不同稀释血清各3孔，每孔100μL。37℃孵育1h后，以PBST洗涤ELISA孔3次，然后每孔加入100μL1:10000稀释 HRP标记的家兔抗猪IgG抗体(sigma)。37℃孵育1h后，用PBST洗涤3次，每孔加入100μl TMB底物溶液，37℃孵育15min，每孔加入50μL终止液(2 mol/L H2SO4)终止反应，酶标仪读取OD450值。
不同病毒蛋白与检测血清反应的ELISA检测值如图3所示，所有制备的病毒蛋白与ASFV阴性猪血清的OD值均低于0.25；13种病毒蛋白(E146L、M1249L、 EP152R、C717R、I177L、EP153R、E248R、F317L、H240R、E423R、K196R、 p72、K421R)不与阳性血清反应，与所有阳性血清反应的OD值均低于0.5；4种病毒蛋白(CD2v、C257R、H171R、p15)仅与1-2份阳性血清呈弱阳反应(OD值在0.5-1.0间)，与其它血清的OD值则低于0.5；9种病毒蛋白(B602L、C129R、K145R、A151R、E184L、B125R、CP312R、p34和A137R)和2种融合蛋白 (p12-p17-p10和I73R-B169L)仅与1-3份阳性血清呈强阳性反应(OD值在1.0 以上)，但与大部分阳性血清的OD值均低于0.5；5种病毒蛋白(K205R、E199L、 A104R、B475L和E120R)与3份以上阳性血清呈强阳性反应(OD值在1.0以上)，但也有部分阳性血清反应较弱(OD值在0.5-1.0间)，甚至与部分阳性血清不反应(OD值在0.5以下)；3种病毒蛋白(p30、p54和KP177R)与所有阳性血清均呈强阳性反应(OD值在1.0及以上)，特别是p30蛋白，其与所有阳性血清均呈高水平反应，不同阳性样品间差异性小。这表明，p30、p54和KP177R是ASFV 感染中的三种优势抗原，尤其是p30蛋白，在不同感染猪只中均能诱导产生高水平抗体，适宜作为ASFV抗体检测靶标。上述结果也表明，本发明中通过原核表达制备的p30蛋白，生物活性高，能与ASFV感染产生的抗体高水平结合，适合于作为检测p30抗体的抗原。此外，制备的重组蛋白K205R、E199L,E184L,B475， E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L能与 ASFV阳性猪血清起不同程度反应，显示其可以刺激机体产生免疫反应。
实施案例3.ASFV p30抗体间接ELISA检测方法的建立
实施案例2结果显示，本发明中ASFV p30蛋白是所筛选的36种病毒蛋白中最优的一种抗原蛋白。本实施案例利用制备的p30蛋白建立一种ASFV抗体间接ELISA检测方法。
3.1最佳抗原包被和血清稀释浓度条件优化
用方阵滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，用0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将p30蛋白稀释，按照10ng/孔、20ng/孔、50ng/孔、100ng/孔四个梯度进行包被，每个孔包被100μL，4℃冰箱中包被过夜，包被完成用含有 5‰Tween-20的PBST洗涤3次，每次加入200μL/孔，置于微孔板振荡器3min。将酶标板用5％脱脂乳置于37℃恒温培养箱中封闭1h后，用含有5‰Tween-20 的PBST洗涤3次，每次加入200μL/孔，置于微孔板振荡器3min。而后将ASFV 阳性血清和阴性血清分别稀释成1：10、1：20、1：40、1：80四个梯度，置于37℃恒温培养箱孵育1h，用前面同一方法洗涤三次后，加入HRP标记的兔抗猪IgG抗体37℃孵育1h。最后用PBST洗涤三次后，加入100μL TMD底物显色，室温避光显色15min，再加入50μL 2mol/LH2SO4终止反应，OD450nm 进行读值，根据阳性孔(P)/阴性孔(N)的比值，进行结果判定。在不同抗原包被浓度和不同稀释倍数血清作用下，当每孔抗原蛋白包被量为20ng、血清作 1:40倍稀释时，样品P/N值最高。因此，确定抗原蛋白的包被量为20ng/孔，检测血清的稀释倍数为1:40。
3.2最佳包被液、封闭液及封闭时间条件优化
以3.1中确定的抗原最佳包被浓度以及血清稀释度为基础，将p30蛋白分别以0.05M碳酸盐缓冲液和0.01M磷酸盐缓冲液包被酶标板，用PBST洗涤三次后，分别用5％脱脂乳以及5％BSA进行封闭，37℃分别封闭1h，2h，用PBST 洗涤三次后，血清稀释度按照3.1中所优化的条件1：40的比例进行稀释，按3.1 中方法进行间接ELISA检测，从而确定最佳包被液、封闭液以及封闭时间。相同条件下，0.05M碳酸盐缓冲液的包被效果优于0.01M磷酸盐缓冲液，5％脱脂乳的封闭效果优于5％BSA，1h封闭时间优于2h。因此，确定0.05M碳酸盐缓冲液为本间接ELISA的包被液，5％脱脂乳为封闭液，37℃封闭时间为1h。
3.3最佳包被温度、包被时间及酶标二抗条件优化
以3.2中确定的最佳包被液、封闭液及封闭时间为基础，用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)将p30蛋白稀释，按照20ng/孔进行包被，包被温度及时间分别为4℃过夜，37℃1h，37℃2h，37℃4h，用PBST洗涤三次后，按照最适封闭条件37°封闭1h，洗涤三次，血清稀释度按照5.1中所优化的条件1： 40的比例进行稀释，孵育后洗涤，将酶标二抗分别以5×103、1×104、2×104、4×104四个梯度进行倍比稀释，其他步骤同3.1。结果显示，包被温度为37℃、包被1h时，酶标二抗稀释度为1×104时，P/N值最高。因此，确定本间接ELISA的包被温度为37℃、包被1h时，酶标二抗稀释度为1：1×104。
3.4血清与二抗最佳作用时间条件优化
按照前述所确定的最佳条件，以此为基础来确定血清与酶标二抗的最佳孵育时间。用0.05M碳酸盐包被液(pH 9.6)按照20ng/孔包被p30蛋白，包被的时间和温度为37℃1h。封闭用5％脱脂乳37℃1h。洗涤后检测血清按照1： 40稀释，二抗按照1：1×104稀释，血清和二抗的孵育时间分别为30min、45min、 60min，其他步骤同3.1。检测结果显示，血清与酶标二抗孵育时间都为60min， P/N值最高。因此，确定本间接ELISA的检测血清和二抗的孵育时间均为60min。
3.5显色温度与时间条件优化
基于上述所确定的ELISA条件，进一步摸索加入TMD后的显色温度与时间。将显色温度分别设置为室温和37°，显色时间分别设置为5min、10min、15min。其他步骤按3.1进行Elisa检测。结果显示，在室温下显色10min,P/N值最高。因此，确定本间接ELISA的显色条件为室温下10min。
3.6间接ELISA方法临界值的确立
为了界定本间接ELISA方法的临界值本,按照实例3.1至3.5确立的ELISA 条件，对实验室保存的24份已知背景的ASFV阴性血清样品进行了检测，统计测定的OD450nm值。根据统计学原理，当OD450nm≥X(平均值)+3SD(标准差) 时，可以判定为阳性。OD450nm≤X(平均值)+2SD(标准差)时，可判定为阴性。介于二者之间为可疑。24份样品检测的OD显示，样品的OD450nm平均值(X) 为0.15,SD值为0.048。因此，本间接ELISA的阴性值应≤0.244，阳性值应≥0.294，两者之间为可疑。
3.7特异性试验
按照上述实例3.1至3.6建立的p30蛋白间接ELISA检测方法，检测本实验室保存的常见猪病原PRRSV、SIV、PRV、CSFV、PDCOV、PEDV、ASFV阳性猪血清和ASFV阴性猪血清。检测结果显示，本ELISA方法检测PRRSV、SIV、 PRV、CSFV、PDCOV、PEDV阳性血清均呈阴性结果，仅ASFV阳性血清为阳性结果，显示本ELISA方法具有良好的特异性。
3.8敏感性试验
为了确定本ELISA方法的敏感性，将ASFV阳性血清按照1：40、1：80、 1:160、1：320、1：640、1：1280、1:2560、1：5120八个梯度进行倍比稀释。测定后读取其OD450nm值，从而确定建立的间接ELISA方法血清敏感性。检测结果显示，阳性血清以1：1280稀释后，ELISA结果仍呈阳性，这显示本ELISA 方法具有良好的灵敏性。
3.9符合率实验
将收集的177临床猪血清样品，同时用本发明建立的ELISA方法和商品化的间接ELISA试剂盒(ID.Vet)进行检测，分析二者间的符合率。从检测结构显示，177份样品中，本发明的ELISA和商品化试剂盒均检出了24份阳性样品，且阳性样品完全相同，这显示本发明的ELISA与国外进口p30抗体ELISA试剂盒的符合率达100％。
通过上述实施例，本发明通过原核表达制备了34种独立表达ASFV蛋白和 2种融合形式表达蛋白，通过ASFV阳性猪血清筛选，确定p30、p54和KP177R 为优势抗原，其中以p30蛋白为最优，其抗原活性好，与不同阳性血清样品结合水平高，且差异性小。以纯化p30为包被抗原，建立了p30抗体间接ELISA方法。该ELISA法灵敏性高，特异性强，达到国外同类试剂盒的检测水平，能用于临床中ASFV感染的检测诊断。此外，制备的重组蛋白K205R、E199L,E184L, B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L 能与ASFV阳性猪血清起不同程度反应，显示其可以刺激机体产生免疫反应，可用于制备亚单位疫苗。
＜110＞中国农业科学院上海兽医研究所
＜120＞一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及应用
＜160＞43
<210>1
<211>852
<212>DNA
<213>p35重组蛋白优化密码子
<400>1
ATGGGCAATGATCCGCCGGTTCCGAAACATATTAGCCCGTATACCCCGCGCACCCGCATTGCCATTGAAGTTGAAAAAGCATTTGATGATTGCATGCGCCAGAATTGGTGTAGTGTTAATAATCCGTATCTGGCCAAAAGCGTTAGCCTGCTGAGCTTTCTGAGCCTGAATCATCCGACCGAGTTTATTAAGGTGCTGCCGCTGATTGATTTTGATCCGCTGGTGACCTTTTATCTGCTGCTGGAACCGTATAAAACCCACGGTGACGATTTTCTGATTCCGGAAACCATTCTGTTTGGCCCGACCGGCTGGAATGGCACCGATCTGTATCAGAGCGCAATGCTGGAGTTTAAAAAATTTTTCACCCAGATTACCCGTCAGACCTTTATGGATATTGCAGATAGCGCAACCAAAGAAGTTGATGTGCCGATTTGCTATAGCGATCCGGAAACCGTTCATAGCTATGCCAATCATGTTCGCACCGAAATTCTGCATCATAATGCCGTGAATAAGGTGACCACCCCGAATCTGGTGGTTCAGGCCTATAATGAACTGGAACAGACCAATACCATTCGTCATTATGGTCCGATTTTTCCGGAAAGTACCATTAATGCCCTGCGCTTTTGGAAAAAACTGTGGCAGGATGAACAGCGTTTTGTTATTCATGGCCTGCATCGCACCCTGATGGATCAGCCGACCTATGAAACCAGTGAATTTGCAGAAATTGTGCGCAATCTGCGTTTTAGCCGCCCGGGCAATAATTATATTAATGAACTGAATATCACCAGCCCGGCCATGTATGGCGATAAACATACCACCGGTGACATTGCACCGAATGATCGCTTTGCATAA
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<213>p15重组蛋白优化密码子
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<213>p14重组蛋白优化密码子
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<213>p34重组蛋白优化密码子
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<213>p37重组蛋白优化密码子
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<213>E120R重组蛋白优化密码子
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<213>EP84R-CP123L-H108R重组蛋白优化密码子
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<213>B117L-285L重组蛋白优化密码子
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<213>EP152R重组蛋白优化密码子
<400>1
ATGAGAGCAGATCACGCTAGGAAATACCTGGAGGGCATGTGGCATGGTGATCCGGTGTTTCTGAAACAATCCGGTCTGCAATCTTTTTATTTATACATCCAGCCAGATCACACGTGCTTTTTCAGCATTGTTAATAAGAACGGCGAGAAGCTGATGGAAACCAAAATCCCGTGTACCATTACCAATAAGATCTACATGTTCTTCAAACCGATTTTTGAATTTCATGTTGTTATGGAGGACATCCACAGCTATTTCCCGAAACAATTCAACTTCTTGCTGGACAGCACCGAAGGCAAGCTGATTTTGGAGAACAACCACGTCATCTACGCGGTGCTCTACAAGGACAACTTCGCTACCGCACTGGGTAAAACTGTGGAAAAGTATATCACGCAGAATTAA
<210>39
<211>474
<212>DNA
<213> I177L重组蛋白优化密码子
<400>1
ATGAAGACGCCCTTTAAATGTATAACTACAACGAAGACTCCGGTTCTGTTTATTAAATTCCAGCTGATCGCGGCAGACAACTATCAGGCGATCACCTGGAAGGACGGCATTCTGAACTACGAGAAAATCGACCAACCGACCCCGCTCTACCTGTCGGTGAATGGTCTGATTTTTGATTGCGCTAAACTGCAACCGTTGACCACCAAGTCTAATGTTACCAGCGGTGATAAAGTTGTTCACATCGGCCAAACCTTTGAATATAACAACTTGCTGATGTGGAAGGTGAACGACCAAGGTTTTCTGAATATTAGCGTCACCGGCACGAAGTTCAACTTGATCGCCATCACGGGCAAACTGGGTTTCTATACCGACCCGCCATCCCATCTGATTATTATGCCGCTTAAGTTCTTTCCGGTGCACAAATTCAGCAAGAACGAGCCGAATAAAAAGCAGAAACGTTTTATCTACTTCTAA
<210>40
<211>585
<212>DNA
<213>p30重组蛋白优化密码子
<400>1
Atggattttattttaaatatatccatgaaaatggaggtcatcttcaaaacggatttaagatcatcttcacaagttgtgtttcatgcgggtagcctgtataattggttttctgttgagattatcaatagcggtagaattgttacgaccgctataaaaacattgcttagtactgttaagtatgatattgtgaaatctgctcgtatatatgcagggcaagggtatactgaacatcaggctcaagaagaatggaatatgattctgcatgtgctgtttgaagaggagacggaatcctcagcatcttcggagaacattcatgaaaaaaatgataatgaaaccaatgaatgcacatcctcctttgaaacgttgtttgagcaagagccctcatcggaggtacctaaagactccaagctgtatatgcttgcacaaaagactgtgcaacatattgaacaatatggaaaggcacctgattttaacaaggttattagagcacataattttattcaaaccatttatggaacccctctaaaggaagaagaaaaagaggtggtaagactcatggttattaaacttttaaaaaaaaaataa
<210>41
<211>402
<212>DNA
<213>p54重组蛋白优化密码子
<400>1
AtgTcttcaagaaagaaaaaagctgctgctattgaggaggaagatatacagtttataaatccttatcaagatcagcagtgggtagaagtcactccacaaccaggtacctctaaaccagctggagcgactacagcaagtgtaggcaagccagtcacgggcagaccggcaacaaacagaccagcaacaaacaaaccagttacggacaacccagttacggacagactagtcatggcaactggcgggccggcggccgcacctgcggccgcgagtgctcctgctcatccggctgagccttacacgacagtcactactcagaacactgcttcacaaacaatgtcggctattgaaaatttacgacaaagaaacacctatacgcataaagacctagaaaactccttgtaa
<210>42
<211>525
<212>DNA
<213>CD2v重组蛋白优化密码子
<400>1
AtgAACATCACCAATGATAATAATGACATCAACGGTGTTAGTTGGAATTTCTTTAATAACAGTTTCAACACCCTGGCCACCTGCGGCAAAGCCGGTAATTTTTGCGAATGTAGCAATTATAGCACCAGCATCTATAATATTACCAATAATTGCAGCCTGACCATTTTTCCGCATAATGATGTGTTTGATACCACCTATCAGGTTGTTTGGAATCAGATTATTAACTATACCATCAAGCTGCTGACCCCGGCAACCCCGCCGAATATTACCTATAATTGTACCAATTTCCTGATCACCTGTAAAAAGAATAACGGTACCAATACCAATATCTATCTGAATATTAACGACACCTTCGTGAAATATACCAATGAAAGTATTCTGGAATACAACTGGAATAATAGTAACATTAACAACTTCACCGCCACCTGCATTATTAATAATACCATTAGTACCAGCAACGAAACCACCCTGATTAATTGCACCTATCTGACCCTGAGCAGCAATTATTTTTATACCTTTTTCTAA
<210>43
<211>684
<212>DNA
<213>p72重组蛋白优化密码子
<400>1
atgCCCGAGATCCACAACCTGTTCGTGAAGCGCGTGCGGTTCAGCCTGATCCGCGTGCACAAGACCCAGGTGACCCACACCAACAACAACCACCACGACGAGAAGCTGATGTCCGCCCTGAAGTGGCCCATCGAGTACATGTTCATCGGCCTGAAGCCCACCTGGAACATCAGCGACCAGAACCCACACCAGCACAGGGACTGGCACAAGTTCGGCCACGTGGTGAACGCCATCATGCAGCCAACCCACCACGCCGAGATCAGCTTCCAGGACAGAGACACCGCCCTGCCAGACGCTTGCTCCAGCATCTCCGACATCAGCCCAGTGACCTACCCCATCACCCTGCCAATCATCAAGAACATCTCCGTGACCGCCCACGGCATCAACCTGATCGACAAGTTCCCCAGCAAGTTCTGCTCCAGCTACATCCCATTCCACTACGGCGGCAACGCCATCAAGACCCCAGACGACCCAGGAGCCATGATGATCACCTTCGCCCTGAAGCCAAGGGAGGAGTACCAGCCATCCGGACACATCAACGTGAGCAGGGCCAGAGAGTTCTACATCTCCTGGGACACCGACTACGTGGGCAGCATCACCACCGCTGACCTGGTGGTGTCCGCCAGCGCCATCAACTTCCTGCTGCTGCAGAACGGATCCGCCGTGCTGAGGTACAGCACCtaa

Claims (7)

1.一种非洲猪瘟病毒优势抗原，其特征在于所述非洲猪瘟病毒优势抗原为重组p30蛋白、p54、KP177R中的一个或多个，所述优化重组p30蛋白、p54、KP177R的核苷酸编码序列分别如SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.35所示。
2.如权利要求1中所述的一种非洲猪瘟病毒优势抗原，是其病毒基因的全部或部分序列克隆于原核表达载体pColdI，经低温(16℃)诱导表达，其中p54蛋白呈可溶性表达，经His柱纯化制备，而p30和KP177R蛋白呈包涵体表达，经包涵体变性、His柱纯化以及透析复性而制备，具备良好的生物活性，与ASFV阳性猪血清呈高水平反应，是一种优异的ASFV抗原。
3.如权利要求2中所述的一种非洲猪瘟病毒优势抗原，其中p30和KP177R蛋白的纯化制备中经复性缓冲液(50mM Tris-HCl,100mM NaCl,1％甘氨酸，5％甘油，0.2％PEG 3350，1mM氧化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽)透析复性，其具备良好的生物活性，与ASFV阳性猪血清呈高水平反应，特别是制备的p30蛋白，与不同ASFV阳性猪血清均呈高水平ELISA反应，是一种优异的ELISA诊断抗原。
4.一种ASFV抗体ELISA检测方法，其以权利要求1中所述的p30蛋白、p54、KP177R中的一个或多个为包被抗原，制备及检测参数为：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液、37℃包被1h；5％脱脂乳为封闭液、37℃封闭时间1h；检测血清作1:40倍稀释，37℃孵育1h；酶标二抗稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min。
5.一种非洲猪瘟病毒抗原，其特征在于所述非洲猪瘟病毒抗原为优化重组E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L中的一个或多个，其中重组蛋白p12-p17-p10为ASFV p12、p17、p10三种蛋白胞外区的融合表达物，I73R-B169L为I73R和B169L二种蛋白胞外区的融合表达物，所述优化重组E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L的编码核苷酸序列分别如SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.9所示。
6.如权利要求5所述的一种非洲猪瘟病毒抗原，其中抗原E199L,E184L,B475，E120R、A104R、A137R、K145R、CP312R、p12-p17-p10和I73R-B169L蛋白，是其病毒基因的全部或部分序列经密码子优化后克隆于原核表达载体pColdI，经16℃诱导表达及纯化而制备。
7.权利要求1中的p30蛋白、p54蛋白、KP177R蛋白和权利要求5中的E199L蛋白,E184L蛋白,B475蛋白，E120R蛋白、A104R蛋白、A137R蛋白、K145R蛋白、CP312R蛋白、p12-p17-p10蛋白和I73R-B169L蛋白中的一个或多个在ASFV亚单位疫苗制备中的应用，上述蛋白能与ASFV阳性猪血清发生不同程度的抗原抗体反应，显示具有刺激宿主产生抗体的功能。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115806594A (zh) * 2022-12-08 2023-03-17 江苏农牧科技职业学院 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用
CN116236568A (zh) * 2023-01-30 2023-06-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 非洲猪瘟病毒c717r蛋白作为免疫诱导剂或者佐剂的应用
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