CN111781363A - 一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用，属于兽医生物诊断制品领域。该试纸条包括底板，底板上依次设有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体，检测线靠近样品垫一侧设置；质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白，质控线靠近所述吸水垫一侧设置。本发明的样本稀释液含有量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V；R10和P30V的序列如SEQ ID NO:2和4所示。本发明试纸条配合样本稀释液，可用于非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的快速、高特异性、高灵敏度的定性检测。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析 试纸条及其应用

技术领域

本发明属于兽医生物诊断制品技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒黏 膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病， 是我国一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告动物疫病。

ASFV是一种复杂的、有囊膜的、双股DNA病毒，直径170～190kb，具有 末端交联和反转重复区，其编码151-167种蛋白，成熟的病毒粒子包含有约50 多种结构蛋白。

ASFV主要经呼吸道和消化道途径侵入猪体，猪体应答感染，除了血清中产 生特异性的IgG抗体外，在呼吸道与消化道黏膜还可产生特异性的sIgA抗体。 sIgA抗体主要存在于呼吸道分泌液、唾液、泪液、乳汁、胃肠分泌液和泌尿生 殖道分泌液中，是机体黏膜免疫的主要抗体，也是病原体侵入后最先产生的免疫 反应，常用作疾病感染早期诊断的检测指标。

目前针对ASFV防控尚无有效的商品化疫苗，因此疫情防控的监测与诊断变 得至关重要。传统的诊断检测非洲猪瘟病毒抗体的方法有间接免疫荧光(IFA)、 和酶联免疫法(ELISA)。其中IFA的敏感性偏低，需要荧光操作人员和荧光显 微镜，成本高昂，限制了在现场快速检测中的应用。ELISA以抗原抗体特异性反 应为原理检测动物具有非洲猪瘟病毒抗体，具有灵敏度高，特异性强等优点，但 操作较为繁琐，耗时较长，加之需要酶标仪、恒温箱等设备，在基层养殖场难以 展开实时检测。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒黏 膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条，可用于非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的 快速、高特异性、高灵敏度的定性检测。

本发明的第二个目的是提供配合上述检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量 子点微球免疫层析试纸条的样本稀释液。

本发明的第三个目的是提供一种以非诊断为目的的，采用所述量子点微球免 疫层析试纸条和所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的方法，该方法 操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境 下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉的荧光检测仪，可以及时的， 方便的，在现场得到结果。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条，包括 底板，所述底板上依次设有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜 上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体，所述 检测线靠近所述样品垫一侧设置；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化 蛋白，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置。

在本发明中，所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白是将兔抗非洲猪瘟重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10高免血清采用protein G纯化试剂盒纯化后所得蛋 白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤 细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCC NO：C201526。

在本发明中，所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有牛血清白蛋白和 Tween-20的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后所得。

本发明还提供配合所述试纸条使用的样本稀释液，含有量子点微球标记的重 组多肽串联蛋白R10和量子点微球标记的重组蛋白P30V；所述重组多肽串联蛋 白R10的序列如SEQ ID NO:2；所述重组蛋白P30V的序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，将量子点微球分别与重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V 偶联，分别得到量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和量子点微球标记的 重组蛋白P30V；然后将量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白 P30V按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述 非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有BSA和的Tween-20的PBS缓冲液按照体积 比1:28-32混合，得到样本稀释液。

在本发明中，所述量子点微球与重组多肽串联蛋白R10的质量比为5-7:1， 所述量子点微球与重组蛋白P30V的质量比为5-7:1；所述PBS缓冲液含有 0.05-0.15％的BSA和0.2％的Tween-20的PBS缓冲液。

本发明还提供一种以非诊断为目的的采用所述量子点微球免疫层析试纸条 和所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的方法，将拭子样品加入样 本稀释液中孵育后，滴加在所述试纸条的样品垫上，反应后，采用紫外光发射器 检测C线和T线。

在本发明中，检测样品为拭子样品或黏膜样品。

在本发明中，所述拭子样品包括口拭子、鼻拭子或肛拭子，所述黏膜样品为 肺泡灌洗液。

采用非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条配合样本稀 释液，检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体时，样品中的黏膜sIgA抗体首先与样本稀 释液中的量子点微球标记的重组蛋白P30V、量子点微球标记的重组多肽串联蛋 白R10结合得到黏膜sIgA抗体-量子点复合物，滴加至样品垫后，层析至硝酸纤维 素膜时，黏膜sIgA抗体-量子点复合物与检测线上的鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体结 合从而被固定在检测线处，多余的量子点微球标记的重组蛋白P30V、量子点微 球标记的重组多肽串联蛋白R10层析至质控线处与非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋 白反应，并被固定在了质控线上。这样，可以通过365nm的紫外光发射器可以检 测到固定在检测线处的非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

1.本发明提供的检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试 纸条，量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，使用量子点微 球作为标记物制作的试纸条批次间差异较小；

2.本发明提供的非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条 的制备方法，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的市场 前景和较大的经济收益。

3.由于黏膜抗体的产生早于血清抗体，因此采用本发明量子点微球免疫层 析试纸条和样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体，可用于非洲猪瘟感染的 早期检测，且采用本发明试纸条和样本稀释液检测，快速，特异性强，灵敏度高， 稳定性好。

4.本发明的检测方法操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各 种现场、基层实验室等环境下的检测；结合较荧光显微镜和酶标仪价格更为低廉 的紫外光发射器，可以及时的，方便的，在现场得到结果。

5.检测拭子样品和黏膜样品，较血清样品，采样方便，减少了采样时对猪 的应激反应，更加有力于动物福利和生物安全。

附图说明

图1是本发明实施例1重组多肽串联蛋白R10的表达鉴定图，其中泳道1 是纯化后的重组多肽串联蛋白R10，泳道2是纯化后的重组多肽串联蛋白R10 和非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。

图2是本发明实施例1重组蛋白P30V的表达鉴定图，其中泳道1是纯化后 的重组蛋白P30V，泳道2是纯化后的重组蛋白P30V和非洲猪瘟抗体阳性参考 口拭子的Western-bloting鉴定，M为蛋白maker。

图3是本发明实施例所述的早期检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析 试纸条的结构示意图。其中，1-检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球 免疫层析试纸条，2-底板，3-样品垫、4-硝酸纤维素膜，7-吸水垫，5-检测线， 6-质控线。

图4是本发明实施例所述的早期检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析 试纸条的剖面图。

图5是本发明实施例所述的早期检测非洲猪瘟抗体的量子点微球免疫层析 试纸条的俯视图。

图6是非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白的SDS-PAGE鉴定图，其中泳道1是非 洲猪瘟阳性血清纯化蛋白，M为蛋白maker。

图7敏感性图。

图8特异性图，其中ASFV是非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子、PRRS是猪繁 殖呼吸综合症病毒黏膜抗体阳性样品，PEDV是猪流行性腹泻病毒黏膜抗体阳性 样品，APP是猪胸膜肺炎放线杆菌黏膜抗体阳性样品，PCV是猪圆环病毒黏膜 抗体阳性样品，SIV是猪流感病毒黏膜抗体阳性样品。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的优选实施方式进行详细说明。此外 需要理解的是，以下的实施例仅是为了对本发明作进一步说明，帮助理解。而不 是用于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围不受任何实施例形式上的限 制。下述实施例中所使用的的实验方法如无特殊说明，皆为常规方法。

本发明中：MES、EDC、NHS、Tween-20、蔗糖、弗氏完全佐剂、硫柳汞购 自Sigma；Tris-HCl、BSA购自Thermo Fisher；羊抗猪IgA酶标抗体购自Bethyl公 司产品，(货号A100-102p)；鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体(专利号： ZL201510239712.3，抗猪SC蛋白单克隆抗体分泌杂交瘤细胞株4H11，保藏号为： CCTCC NO：C201526)由江苏省农业科学院提供；玻璃纤维膜购Ahlstrom；硝 酸纤维素膜购自Sartorius；超声波仪购自Bandelin；吸水滤纸和底板购自上海金 标生物科技有限公司；protein G纯化试剂盒购自南京金斯瑞生物科技有限公司； 量子点微球(产品编号为FM610C，水合粒径是120nm)购自北京纳晶生物科技 有限公司。

0.02M、pH 7.0的MES缓冲液配制方法：将4.265g MES溶于1L的双蒸水 中，再调节pH至7.0。

PBS缓冲液(浓度为0.01M、pH7.4)配制方法：将3g的Na₂HPO₄.12H₂O、 0.2g的KH₂PO₄、8g的NaCl和0.2g的KCl溶于1L的双蒸水中，再调节pH至 7.4。

Tris-HCl缓冲液(浓度为50mM、pH8.0)配制方法：将7.88g Tris溶于1L的 双蒸水中，再采用盐酸调节pH至8.0。

实施例1制备重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V

1.P54E基因重组载体的构建

参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟P54全基因序列(MH766894， E183L，162222-162776)，设计了重组多肽串联蛋白R10的基因(SEQ ID NO:1)， 重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。重组多肽串联蛋白 R10的基因是符合大肠杆菌嗜性的。采用基因合成的方式(由南京金斯瑞生物科 技有限公司)获得重组多肽串联蛋白R10的基因，将重组多肽串联蛋白R10的 基因插入载体pET-28a(+)的多克隆酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间，得到重组 质粒pET-28a-R10。

通过“热激”法，将重组质粒pET-28a-R10转化E.coli BL21(DE3)感受态 细胞，获得重组菌pET-28a-R10(BL21)。

2.P30V基因重组载体的构建

参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟CP204L基因序列(MH766894， CP204L，124770～125375)，对密码子进行了针对大肠杆菌的嗜性优化，得到 了重组蛋白P30V的基因序列，如SEQ ID NO：3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。采用基因合成的方式(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得重 组蛋白P30V的基因，将该基因序列插入载体pET-21a(+)的多克隆酶切位点 NdeⅠ和XholⅠ之间，得到重组质粒pET-21a-P30V。

通过“热激”法，将重组质粒pET-21a-P30V转化E.coli BL21(DE3)感受 态细胞，获得重组菌pET-21a-P30V(BL21)。

3.重组蛋白的表达及纯化

将重组菌pET-28a-R10(BL21)在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养 基中培养，将pET-21a-P30V(BL21)在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中培养，培养条件均如下：培养温度为37℃、摇床转速为180r/min，待 OD₆₀₀＝0.6～0.8时降温至20℃，30min后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导 表达，然后在20℃培养17小时，收集菌体。用缓冲液洗涤菌体，菌体重悬后加 入PMSF(苯甲基磺酰氟)进行超声波裂解，4℃下10000r/min离心30分钟。 取上清，按照Ni-NTA亲合层析介质(金斯瑞生物科技有限公司产品，Cat.No：L00250)的说明书纯化各重组蛋白。从图1的泳道1可见，纯化后的重组多肽 串联蛋白R10在19KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。从图2的泳道1 可见，重组蛋白P30V在43KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。因此重 组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V成功表达，置于-70℃以下保存备用。

4.重组蛋白的抗原性检测:

将纯化的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V经SDS-PAGE电泳后转 印至NC膜，分别进行Western-bloting检测。用5％脱脂乳封闭过夜后，以体积 比为1:1的非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子和5％脱脂乳混合物作为一抗，2～8℃孵 育12～18小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。用1:20000稀释的羊抗猪IgA酶标 抗体(购自Bethyl公司产品，货号A100-102p)作为二抗，37℃孵育1.0小时。 TBST洗涤5次，5分钟/次。ECL避光显色5min。结果：重组多肽串联蛋白R10 在19KDa左右出现了特异性反应条带(如图1泳道2)；重组蛋白P30V在43KDa 左右出现了特异性反应条带(如图2泳道2)。上述结果说明，重组多肽串联蛋 白R10和重组蛋白P30V均可与非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子发生特异性反应， 具有良好的抗原性。

实施例2本发明样本稀释液的制备

本发明样本稀释液：含有非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。非洲猪瘟病毒双蛋 白-标记物是量子点微球标记的重组蛋白P30V和量子点微球标记的重组多肽串 联蛋白R10的混合物。

本发明样本稀释液的制备方法包括如下步骤：

(1)制备量子点微球标记的重组蛋白P30V

量子点微球的活化：取50μL浓度为1.2μg/μL的量子点微球悬浮液加入至50 μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液中，加入终浓度为10mg/mL的EDC(1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10mg/mL的NHS(N-羟基丁二酰亚胺)， 在37℃摇床中恒温孵育20分钟。再至离心机中10000g离心20分钟，弃上清，加 入50μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到活化的量子点微球。

量子点微球的偶联：在上述活化的量子点微球中，加入10μg重组蛋白P30V (实施例1制备)，于37℃摇床中恒温孵育2小时，将重组蛋白P30V与量子点微 球进行偶联，得到重组蛋白P30V和量子点微球的偶联物。

量子点微球的封闭：在所得重组蛋白P30V和量子点微球的偶联物中，加入2 μL质量百分浓度为10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，在37℃摇床中恒温孵育 15分钟，然后在离心机中10000g离心10分钟，弃上清，加入100μL浓度为0.02M、 pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到量子点微球标记的重组蛋白P30V溶液，置于4℃ 冰箱中保存。

(2)制备量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10

按照本实施例标题(1)中相同方法，将量子点微球与实施例1制备的重组多 肽串联蛋白R10偶联，不同之处在于，将10μg重组蛋白P30V替换为10μg重组多 肽串联蛋白R10，得到量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10溶液。

(3)混合

配置含有0.1％(质量百分浓度)BSA和0.2％(体积百分浓度)Tween-20 的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。将本实施例标题(1)制备的量子点微球标记 的重组蛋白P30V溶液和本实施例标题(2)制备的量子点微球标记的重组多肽 串联蛋白R10溶液以体积比为1:1混匀，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。将 含有0.1％(质量百分浓度)BSA和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、 pH7.4的PBS缓冲液和非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物以体积比为30:1混匀，得到 样本稀释液，于4℃避光保存。

实施例3本发明试纸条的制备

如图3-5，检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条1， 包括底板2，在底板上依次设置样品垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫7。硝酸纤 维素膜4上设有检测线5和质控线6，检测线5靠近样品垫一侧设置，检测线处 包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体；质控线6靠近吸水垫7一侧设置，质控线处 包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白。

1.制备非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白

(1)样品准备

将重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10作为免疫原，背部皮下多点注射 免疫成年新西兰大白兔(1-2Kg/只)，共免疫3次，每次免疫间隔2周。首次免 疫，将含有1.5mg重组蛋白P30V和1.5mg重组多肽串联蛋白R10的溶液1.0ml 与等体积弗氏完全佐剂混合后，进行免疫；后两次使用如下免疫原进行免疫：将 含有1.0mg重组蛋白P30V和1.0mg重组多肽串联蛋白的溶液1.0ml与等体积弗 氏不完全佐剂混合，得到二免和三免所用免疫原。每次免疫剂量为2.0ml，第三 次免疫后7d采血，离心分离，得到非洲猪瘟阳性血清，利用间接ELISA的方法 检测抗体效价。

采用间接ELISA方法检测非洲猪瘟阳性血清针对重组多肽串联蛋白R10的 抗体效价，具体方法如下：用碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)配置含有2μ g/mL重组多肽串联蛋白R10溶液，以每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜； 弃去孔内液体，每孔再用250μL的PBST洗涤3次，每次5min，拍干。每孔加 入200μL含5％脱脂乳的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，于37℃封闭2h， 弃去孔内液体，每孔用250μL PBST洗涤3次，每次5min，拍干。加入10倍梯 度稀释的待检血清，每孔100μL，于37℃孵育1h。弃去孔中液体，每孔用250 μL PBST洗涤3次，每次5min，拍干。用PBS缓冲液(浓度0.01M、pH为7.4) 对HRP-羊抗兔IgG酶标抗体(品牌是BOSTER，货号是BA1054)以稀释度为 1:5000进行稀释，用0.22μm的滤膜过滤，得到稀释后的HRP-羊抗兔IgG酶标 抗体。每孔加入100μL稀释好的HRP-羊抗兔IgG酶标抗体，37℃反应0.5h。 每孔加入100μL底物显色液TMB，37℃避光作用15min；再加入50μL浓度 为2mol/L的硫酸水溶液终止反应。在酶标仪上测定OD₄₅₀读值，按照常规方法 计算效价，结果：非洲猪瘟阳性血清针对重组多肽串联蛋白R10的抗体效价为1： 10⁵。采用上述相同方法检测非洲猪瘟阳性血清针对重组蛋白P30V的抗体效价， 不同之处在于，用碳酸盐缓冲液(浓度0.01M、pH9.6)配置含有2.5μg/mL重 组蛋白P30V的溶液，以每孔100μL包被酶标板。按照常规方法计算，结果： 针对重组蛋白P30V的血清抗体效价为1：4×10⁵。

在生产过程中，非洲猪瘟阳性血清针对重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白 R10的血清抗体效价均大于等于1：10⁵即可。

将Wash Buffer(含有20mM Na₂HPO₄和0.15M NaCl的水溶液，pH7.0)与 非洲猪瘟阳性血清以体积比为1:1混合，得到非洲猪瘟阳性血清稀释液。

(2)采用金斯瑞protein G纯化试剂盒(货号为L00209)从非洲猪瘟阳性 血清中分离蛋白，具体方法如下：

①层析柱填充：在protein G纯化试剂盒中取0.5mL的protein G纯化介质， 加入0.5mL Wash Buffer(同上)，充分摇匀，然后加入到一个预先装有1mL Wash Buffer的层析柱中，让填料自然沉降到柱子底部。加入5mL Wash Buffer到柱中， 让Buffer缓慢的流出，流速大约为1mL/min。

②过柱纯化：在上述层析柱上端缓慢地加入样品(非洲猪瘟阳性血清稀释 液)，样品的流速为0.5mL/min。收集流出液。使用大约30mL的Wash Buffer 洗涤杂质，Wash Buffer流速为2mL/min，或者采用Wash Buffer洗涤到流出液在 紫外检测仪280nm下的吸光值(A280值)稳定为止。洗杂完毕后，加入15mL Elution Buffer(pH为2.5、浓度为0.1M的甘氨酸水溶液)进行洗脱，Elution Buffer 流速为1ml/min，收集洗脱液，加入洗脱液体积1/10的中和Buffer(pH8.5、浓 度为1M的Tris-HCl缓冲液)调节洗脱液的pH到7.4，得到非洲猪瘟阳性血清 的纯化蛋白。

非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白的鉴定结果如图6所示，可以看到纯化蛋白在55kDa(重链)和25kDa(轻链)处分别有一个条带，纯度达到98％。

2.样品垫的制备

用含有3％(质量百分浓度)BSA(牛血清白蛋白)、1％(体积百分浓度) Tween-20的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液，将玻璃纤维膜浸泡处理20min，然 后干燥，得到样品垫。

3.硝酸纤维素膜的制备

(1)采用中国专利ZL201510239712.3中分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂 交瘤细胞株4H11(保藏号为：CCTCC NO：C201526)制备抗猪SC蛋白单克隆 抗体(ZL201510239712.3实施例2标题9)，也就是鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体。 将鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4 的PBS缓冲液稀释至1.0mg/mL，得到检测线溶液。含有3％(质量百分浓度) 蔗糖的PBS缓冲液，是将蔗糖溶解在浓度为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液中所 得。

(2)将非洲猪瘟阳性血清纯化蛋白用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01 M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.5mg/mL，得到质控线溶液。

(3)在硝酸纤维素膜上，用划膜仪喷涂检测线溶液形成T线，喷涂量为1 ug/cm；喷涂质控线溶液形成C线，喷涂量为1ug/cm。喷涂量是指每厘米长的T 线或C线上喷涂的蛋白质量。T线和C线的宽度均是1mm。

(4)过夜干燥，得到喷涂了检测线(T线)和质控线(C线)的硝酸纤维素 膜。

4.试纸条的组装

按照图3-5中试纸条的结构，采用如下方法组装试纸条：在正常湿度和温度 下的洁净操作台上，将处理好的样品垫3、喷涂了检测线和质控线的硝酸纤维素 膜4、吸水垫7(材质为吸水滤纸)依次以2-4mm重叠黏贴在底板2上，然后送入 切条机，得到宽为4±0.5mm的试纸条。挑取完好整齐的试纸条，放入卡壳中， 压盖完成后连同1粒干燥剂放入铝箔袋中密封保存。其中底板2为PVC板。

将本实施例制备的试纸条记为本发明试纸条。

实施例4试纸条定性检测方法及结果判定

1.采用本发明试纸条和本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体 的方法，包括如下步骤：

(1)样品处理：用1根医用脱脂棉签伸入猪口腔，充分吸取口腔液后，放入 含有1mlPBS缓冲液(浓度为0.01M、pH7.4，含0.01％硫柳汞)的EP管中，反复 挤压混匀，所得溶液即为口拭子。将口拭子或口拭子采用PBS缓冲液稀释后所得 的稀释液作为检测样本。

(2)取出本发明试纸条(实施例3制备)，将其放于洁净操作台上。

(3)用1mL巴氏吸管吸取检测样本，以体积比为1:1与本发明样本稀释液混 合，室温(20℃)孵育10min。

(4)孵育完成后，用1mL巴氏吸管吸取3滴(每滴约30微升)，于样品垫 上方，垂直缓慢滴加。

(5)滴加完成后，等待10～15min，判定结果。

2.定性判定结果(目视法)

将反应后的试纸条采用365nm的紫外光发射器的紫外光照射，如果试纸条的 C线显色，T线也显色时，结果判定为阳性，且T线的颜色越深，则样品中的非洲 猪瘟病毒黏膜sIgA抗体效价越高。当试纸条的C线显色，T线不显色时，结果判 定为阴性，样品中无非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体。若试纸条的C线不显色，则该 纸条的检测结果无效。

实施例5试纸条检测的特性

1.试纸条检测时的灵敏度

考察采用本发明试纸条和本发明样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗 体时灵敏度情况。

1)方法

将非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子(采集自非洲猪瘟血清抗体阳性猪的口腔 液)用PBS(浓度0.01M、pH为7.4)按照稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、 1:64、1:128、1:256进行稀释。用本发明样本稀释液配合本发明试纸条，分别对 非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的不同稀释度的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考 口拭子(采集自健康猪的口腔液)进行检测。

2)结果

本发明样本稀释液配合本发明试纸条，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀 释度为1:128的稀释液检测的结果为阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀 释度为1:256的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子检测的结果为阴性，表明 试纸条对非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的检出敏感性可达到1:128(稀释度)。

2.样本稀释液中缓冲液对检测灵敏度的影响

1)对照样本稀释液1和对照样本稀释液2的配制

为了考察样本稀释液中组分对检测结果的影响，将本发明样本稀释液配制时 使用的含有0.1％(质量百分浓度)BSA和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01 M、pH7.4的PBS缓冲液，分别更换成PBS缓冲液(浓度0.01M、pH7.4)和PBST 缓冲液，分别得到对照样本稀释液1和对照样本稀释液2。其中，PBST缓冲液是 含有0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。

2)检测方法

分别采用本发明样本稀释液、对照样本稀释液1或对照样本稀释液2，配合本 发明试纸条，以实施例4中方法检测本实施例标题1中非洲猪瘟抗体阳性参考口拭 子的各稀释度的稀释液。

3)检测结果

在使用PBS缓冲液或PBST缓冲液时，在检测非洲猪瘟阴性参考口拭子时均 出现了假阳性，因此，检测结果无效。采用本发明样本稀释液，对非洲猪瘟抗体 阳性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液检测的结果为阳性，对非洲猪瘟抗体 阳性参考口拭子的稀释度为1:256的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子检测 的结果为阴性，因此检出灵敏度可达1:128(稀释度)。

3.样本稀释液中非洲猪瘟病毒重组蛋白标记物对检测灵敏度的影响

(1)按照本发明实施例2样本稀释液的制备方法，制备对照样本稀释液3 和对照样本稀释液4，不同点仅在于：步骤(3)中含有0.1％(质量百分浓度) BSA和0.2％(体积百分浓度)Tween-20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液与量子 点微球标记的重组蛋白P30V溶液以体积比为30:1混匀，得到对照样本稀释液3； 步骤(3)中将含有0.1％(质量百分浓度)BSA和0.2％(体积百分浓度)Tween-20 的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液与量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10溶 液以体积比为30:1混匀，得到对照样本稀释液4。

(2)将本发明样本稀释液、对照样本稀释液3和对照样本稀释液4分别配 合本发明试纸条，按实施例4中方法对本实施例标题1中非洲猪瘟抗体阳性参考 口拭子的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256的稀释液和 非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子进行检测，进行灵敏度对比试验。具体结果见表1。

表1各种方法对样品检测的结果

由检测结果可以得出：配合本发明试纸条进行检测，采用本发明样本稀释液 时，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液检测结果仍然为 阳性；采用对照样本稀释液3或4时，均对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释 度为1:32的稀释液检测结果为阳性，对非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度 为1:64的稀释液检测结果为阴性。可见样本稀释液中单独使用量子点微球标记 的重组蛋白P30V或量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10时，其灵敏度显著 低于使用非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物。

4.体外孵育温度和时间的影响

将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，对本实施例标题1中非洲猪瘟抗体 阳性参考口拭子的各稀释度的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子进行检测， 考察拭子样品与样本稀释液的孵育温度和孵育时间，对检测结果的影响。结果： 当孵育温度在4～37℃之间，孵育时间在7～20min时结果均成立。选室温(20℃) 作为孵育温度及10min作为孵育时间的最适条件。

5.试纸条特异性的检测

1)检测方法：

将本发明样本稀释液配合本发明试纸条，采用实施例4中方法，检测猪圆环 病毒黏膜抗体阳性样品、猪繁殖呼吸综合症病毒黏膜抗体阳性样品、猪胸膜肺炎 放线杆菌黏膜抗体阳性样品、猪流感病毒黏膜抗体阳性样品、猪流行性腹泻病毒 黏膜抗体阳性样品。

2)检测结果：

判定结果均为阴性，说明本发明试纸条与猪的其他病毒无交叉反应，特异性 良好。

6.稳定性检测

1)检测方法：

将本发明试纸条在放入含有1粒干燥剂的铝箔袋中密封保存后，置于20℃和 37℃下分别保存7日、14日、21日和28日，分别按照本实施例标题1中方法进行灵 敏度的检验，按照本实施例标题5进行特异性的检验。

2)检测结果：

在常温(20℃)和37℃下保存7日、14日、21日和28日的试纸条对非洲 猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液检测结果仍然均为阳性，猪 圆环病毒黏膜抗体阳性样品、猪繁殖呼吸综合症病毒黏膜抗体阳性样品、猪胸膜 肺炎放线杆菌黏膜抗体阳性样品、猪流感病毒黏膜抗体阳性样品和猪流行性腹泻 病毒黏膜抗体阳性样品的检测结果均为阴性，说明本发明试纸条稳定性良好。

实施例6本发明试纸条与胶体金检测试纸的灵敏度对比

1.制备胶体金颗粒：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原，制成20-40nm胶 体金颗粒，具体方法如下：取质量百分浓度为1％的氯金酸水溶液800mL用恒 温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入质量百分浓度为16％的柠檬 酸三钠水溶液1mL，继续搅拌加热5-10min，溶液呈透亮的红色。室温冷却，用 去离子水补足体积至800mL，得到20-40nm胶体金颗粒，4℃保存。

2.非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的制备：取步骤1制备的胶体金颗粒 1mL，在其中加入3.5μL浓度为0.1mol/L的K₂CO₃溶液以调节pH值，然后加 入1.3mg的重组蛋白P30V，混匀后静置5min，加入10μL质量百分浓度为10％ 的聚乙二醇2000溶液，12000rpm离心7min，弃上清，加入100μL复溶液(含 有0.05M三羟甲基氨基甲烷和5％蔗糖的水溶液)，混合均匀，得到胶体金标记 的重组蛋白P30V。采用相同方法，制备胶体金标记的重组多肽串联蛋白R10， 不同之处在于将其中的重组蛋白P30V替换为重组多肽串联蛋白R10。将胶体金标记的重组蛋白P30V和胶体金标记的重组多肽串联蛋白R10以体积比为1:1混 合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物。

3.胶体金垫的制备：将非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物与含有0.3％ BSA、0.5％Tween-20和4％蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液按照体积比为 1:100混合均匀，然后用于浸泡玻璃纤维膜30分钟，37℃干燥30分钟，得到胶 体金垫。胶体金垫制备中，使用的含有0.3％BSA、0.5％Tween-20和4％蔗糖的 0.01M、pH7.4的PBS缓冲液及其与非洲猪瘟病毒双蛋白-胶体金标记物的体积 比均是经过优化的条件。

4.试纸条组装：按照本发明试纸条的组装方法组装胶体金试纸条，不同之 处在于在样品垫和硝酸纤维素膜之间设置一个上述胶体金垫(本实施例标题3 中制备)，得到胶体金试纸条。胶体金试纸条的检测方法：将样品滴加3滴(每 滴约30微升)在样品垫上，直接肉眼观察，当T线、C线均有显色时为阳性； 当C线显色，T线不显色为阴性；当C线不显色时，结果无效。

5.本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度对比试验

对实施例5中非洲猪瘟抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、 1:32、1:64、1:128、1:256的稀释液和非洲猪瘟抗体阴性参考口拭子分别用本发 明试纸条(配合本发明样品稀释液，检测方法同实施例4)与胶体金试纸条进行 检测，检测结果表4所示。

表4本发明试纸条与胶体金试纸条灵敏度的对比

由检测结果可以看出：本发明试纸条与胶体金试纸分别对非洲猪瘟抗体阳性 参考口拭子的不同稀释度的稀释液进行检测，本发明试纸条检测非洲猪瘟抗体阳 性参考口拭子的稀释度为1:128的稀释液时为阳性。胶体金试纸条检测非洲猪瘟 抗体阳性参考口拭子的稀释度为1:4的稀释液时为阳性，检测非洲猪瘟抗体阳性 参考口拭子的稀释度为1:8的稀释液时为阴性，灵敏度显著低于本发明试纸条。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围 下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的 权利要求为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

南京农业大学

<120> 一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用

<130> 20200802

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 399

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 重组多肽串联蛋白R10

<400> 1

caagatcagc aatgggtgga agttaccccg ggcccgggca ccaccgcgag cgtgggcaag 60

ggcccgggcg ttaccgatcg tctggtgatg ggcccgggcc cggcggcggc gccggcggcg 120

gcgagcgcgc cggcgcaccc ggcggagccg tacaccaccg gcccgggcat gagcgcgatt 180

gaaaacctgc gtcaaggccc gggccaagat cagcaatggg tggaagttac cccgggcccg 240

ggcaccaccg cgagcgtggg caagggcccg ggcgttaccg atcgtctggt gatgggcccg 300

ggcccggcgg cggcgccggc ggcggcgagc gcgccggcgc acccggcgga gccgtacacc 360

accggcccgg gcatgagcgc gattgaaaac ctgcgtcaa 399

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 重组多肽串联蛋白R10

<400> 2

Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro Gly Thr Thr Ala

1 5 10 15

Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu Val Met Gly Pro

20 25 30

Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala

35 40 45

Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg

50 55 60

Gln Gly Pro Gly Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gly Pro

65 70 75 80

Gly Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Gly Pro Gly Val Thr Asp Arg Leu

85 90 95

Val Met Gly Pro Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro

100 105 110

Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Pro Gly Met Ser Ala Ile

115 120 125

Glu Asn Leu Arg Gln

130

<210> 3

<211> 582

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 重组蛋白P30V

<400> 3

atggacttca tcctgaacat tagcatgaaa atggaagtga tctttaagac cgacctgcgt 60

agcagcagcc aagtggtttt ccacgcgggt agcctgtaca actggtttag cgtggaaatc 120

attaacagcg gccgtatcgt taccaccgcg attaaaaccc tgctgagcac cgtgaaatat 180

gacatcgtta agagcgcgcg tatttacgcg ggtcagggct ataccgagca ccaggcgcaa 240

gaggaatgga acatgatcct gcacgttctg ttcgaggaag agaccgaaag cagcgcgagc 300

agcgagaaca ttcacgagaa gaacgataac gagaccaacg aatgcaccag cagcttcgag 360

accctgtttg agcaagaacc gagcagcgaa gtgccgaaag acagcaagct gtacatgctg 420

gcgcagaaga ccgttcaaca catcgagcag tatggtaaag cgccggattt caacaaagtg 480

attcgtgcgc acaactttat ccagaccatt tacggcaccc cgctgaaaga agaggaaaag 540

gaagtggttc gtctgatggt tattaagctg ctgaagaaaa ag 582

<210> 4

<211> 194

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 重组蛋白P30V

<400> 4

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Lys

Claims (9)

1.一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体，所述检测线靠近所述样品垫一侧设置；所述质控线处包被有非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置。

2.根据权利要求1所述量子点微球免疫层析试纸条，其特征在于所述非洲猪瘟阳性血清的纯化蛋白采用如下方法制备：将重组蛋白P30V和重组多肽串联蛋白R10免疫兔后所得非洲猪瘟阳性血清，采用protein G纯化试剂盒纯化，得到所述纯化蛋白；所述鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体是由分泌抗猪SC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4H11所制备，所述杂交瘤细胞株4H11的保藏号为：CCTCC NO：C201526。

3.根据权利要求1或2所述量子点微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品垫是将玻璃纤维膜采用含有牛血清白蛋白和Tween-20的Tris-HCl缓冲液浸泡处理后所得。

4.配合权利要求1-3之一所述试纸条使用的样本稀释液，其特征在于含有量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和量子点微球标记的重组蛋白P30V；所述重组多肽串联蛋白R10的序列如SEQ ID NO:2；所述重组蛋白P30V的序列如SEQ ID NO:4所示。

5.根据权利要求4所述样本稀释液，其特征在于将量子点微球分别与重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V偶联，分别得到量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和量子点微球标记的重组蛋白P30V；然后将量子点微球标记的重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白P30V按照体积比为1：0.5-1.5混合，得到非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物；将所述非洲猪瘟病毒双蛋白-标记物与含有BSA和Tween-20的PBS缓冲液按照体积比1:28-32混合，得到样本稀释液。

6.根据权利要求5所述样本稀释液，其特征在于所述量子点微球与重组多肽串联蛋白R10的质量比为5-7:1，所述量子点微球与重组蛋白P30V的质量比为5-7:1；所述PBS缓冲液含有质量百分浓度为0.05-0.15%的BSA和体积百分浓度为0.2%的Tween-20。

7.一种以非诊断为目的的采用权利要求1所述量子点微球免疫层析试纸条和权利要求5所述样本稀释液检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的方法，其特征在于将拭子样品加入样本稀释液中孵育后，滴加在所述试纸条的样品垫上，反应后，采用紫外光发射器检测C线和T线。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于检测样品为拭子样品或黏膜样品。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于所述拭子样品包括口拭子、鼻拭子或肛拭子，所述黏膜样品为肺泡灌洗液。

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