ES2650395T3 - Kits de diagnóstico y métodos de inmunoensayo para el diagnóstico y la diferenciación de virus de la fiebre porcina africana (ASFV) y virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) - Google Patents

Abstract

Una tira inmunocromatográfica que comprende (i) una almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de muestra recibe la muestra que va a analizarse, (ii) una almohadilla de conjugado (2), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de conjugado comprende - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina 10 africana (ASFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-ASFV, y/o - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del 15 mismo, reconocido por el anticuerpo anti-CSFV, y - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control, (iii) una almohadilla de detección de señal (3), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de conjugado (2), en la que dicha almohadilla de detección de señal comprende - al menos una zona de detección de señal, seleccionada del grupo que consiste en: - una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV, y - una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV, en la que dicha zona de detección de señal anti-ASFV (6) y zona de detección de señal anti-CSFV (5) son zonas de detección de señal diferentes, y - una zona de control (7), que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un 40 reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y, (iv) una almohadilla absorbente (4), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de detección de señal (3) en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende o comprenden la proteína VP72 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti-SFV, y en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV comprende o comprenden la proteína E2 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti-CSFV.

Description

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DESCRIPCION

Kits de diagnóstico y métodos de inmunoensayo para el diagnóstico y la diferenciación de virus de la fiebre porcina africana (ASFV) y virus de la fiebre porcina clásica (CSFV).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a kits y a métodos para el diagnóstico de infección por virus de la fiebre porcina africana (ASFV) o por virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) en un sujeto. Los métodos de la invención se basan en la determinación de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en una muestra de sangre o suero de un sujeto que es candidato a tener infección por dichos virus. Los kits y métodos de la invención también permiten el diagnóstico y la diferenciación simultáneos entre infección por ASFV y por CSFV.

Antecedentes de la invención

La fiebre porcina africana (ASF) es una enfermedad infecciosa de cerdos domésticos y salvajes de todas las razas y edades, provocada por un virus que produce una gama de síndromes. La enfermedad aguda se caracteriza por fiebre alta, hemorragias en el sistema reticuloendotelial y una alta tasa de mortalidad. Se ha mostrado que las garrapatas blandas del género Ornithodoros, especialmente O. moubata y O. erraticus, son tanto reservorios como vectores de transmisión del virus de ASF (ASFV).

ASFV es el único miembro de la familia Asfarviridae, género Asfivirus. ASFV es un virus de ADN con envuelta icosaédrico, grande, complejo, que muestra muchas características comunes con las familias tanto de iridovirus como de poxvirus. Este virus está clasificado actualmente como el único miembro de la familia Asfarviridae. Se han identificado al menos 28 proteínas estructurales en partículas de virus intracelulares (200 nm). Se han identificado más de cien proteínas infecciosas en macrófagos porcinos infectados, y al menos 50 de ellas reaccionan con sueros de cerdos infectados o recuperados. Se ha logrado el análisis completo de las secuencias de varias cepas de ASFV. Diferentes cepas de ASFV varían en cuanto a su capacidad para provocar la enfermedad, pero en la actualidad solo hay un serotipo reconocido del virus detectable mediante pruebas con anticuerpos.

La epidemiología molecular de la enfermedad se investiga mediante secuenciación del extremo C-terminal del gen de VP72, que se diferencia en hasta 22 genotipos diferentes. Se ha confirmado la secuencia de genoma completo del gen de p54 como un método de genotipado adicional valioso para estudios epidemiológicos moleculares. Se obtiene una distinción potenciada mediante análisis de la región variable central (CVR) dentro del gen de B602L, descrita como el locus más variable para distinguir entre aislados estrechamente relacionados e identificar subgrupos de virus dentro de varios de los 22 genotipos.

ASFV produce una gama de síndromes que varían de enfermedad peraguda, aguda a crónica y portadores de virus aparentemente sanos. Los cerdos son la única especie animal doméstica que experimenta infección natural por ASFV. Los cerdos salvajes y jabalís europeos también son propensos a la enfermedad, mostrando signos clínicos y tasas de mortalidad similares a los observados en cerdos domésticos. En cambio, los cerdos salvajes africanos tales como los jabalís verrugosos (Phacochoerus aethiopicus), potamóqueros rojos (Potamochoerus porcus) y cerdos gigantes del bosque (Hylochoerus meinertzhageni) son resistentes a la enfermedad y muestran pocos o ningún signo clínico. Estas especies de cerdo salvaje actúan como huéspedes de reservorio de ASFV en África.

El periodo de incubación en la naturaleza es habitualmente de 4-19 días. Las cepas más virulentas producen enfermedad hemorrágica peraguda o aguda caracterizada por fiebre alta, pérdida de apetito, hemorragias en la piel y en órganos internos y muerte en 4-10 días, algunas veces incluso antes de que se observen los primeros signos clínicos. Las tasas de mortalidad pueden ser de hasta el 100 %. Las cepas menos virulentas producen signos clínicos leves (fiebre ligera, reducción del apetito y depresión) que pueden confundirse fácilmente con otras afecciones en los cerdos y pueden no conducir a una sospecha de ASF. Las cepas poco virulentas, no hemoadsorbentes, producen ocasionalmente infección principalmente no hemorrágica subclínica y seroconversión, pero algunos animales pueden desarrollar lesiones diferenciadas en los pulmones o en la piel en zonas por encima de salientes óseos y otras zonas sometidas a traumatismo. Los animales que se han recuperado de infecciones o bien agudas o bien crónicas pueden quedar infectados de manera persistente, actuando como portadores del virus. Todavía no se entiende bien la base biológica para la persistencia de ASFV. Los cerdos portadores de ASFV recuperados y los cerdos salvajes con infección persistente constituyen los mayores problemas para controlar la enfermedad. El reconocimiento serológico de cerdos portadores ha sido vital para el éxito de programas de erradicación.

En países libres de ASFV, pero en los que se sospecha su presencia, el diagnóstico de laboratorio debe dirigirse al aislamiento del virus llevando a cabo simultáneamente la inoculación de cultivos de médula ósea o leucocitos porcinos, la detección de antígeno en frotis o secciones de criostato de tejidos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes (FAT), y mediante la detección de ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que es la técnica más sensible para detectar la presencia del agente en animales con infección persistente y es particularmente útil si las muestras presentadas no son adecuadas para el aislamiento del virus y la detección del

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antígeno porque han experimentado putrefacción. El ASFV puede detectarse mediante PCR a partir de una fase muy temprana de infección en tejidos, muestras de suero y sangre con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Los cerdos recuperados de infecciones agudas o crónicas muestran habitualmente una viremia durante varias semanas haciendo que la prueba de PCR sea una herramienta muy útil para la detección de ADN de ASFV en cerdos infectados por cepas poco o moderadamente virulentas.

Dado que no hay ninguna vacuna disponible, la presencia de anticuerpos contra ASFV es indicativa de una infección previa y, dado que los anticuerpos se producen a partir de la primera semana de infección y persisten durante largos periodos, son un buen marcador para el diagnóstico de la enfermedad. La aparición temprana (de 7 a 10 días tras la infección) y la posterior persistencia a largo plazo de anticuerpos hace que las técnicas de detección de anticuerpos, tales como ensayo ELISA, prueba de inmunotransferencia o IFA (anticuerpos fluorescentes indirectos), sean muy útiles en el diagnóstico de las formas subagudas y crónicas de la enfermedad.

La epidemiología de ASFV es compleja produciéndose diferentes patrones epidemiológicos de infección en África y en Europa. ASF se produce mediante ciclos de transmisión que implican a cerdos domésticos, jabalís, cerdos africanos salvajes y garrapatas blandas. En regiones en las que están presentes garrapatas de cuerpo blando de Ornithodorus, la detección de ASFV en estos reservorios de infección contribuye a un mejor entendimiento de la epidemiología de la enfermedad. Esto resulta de principal importancia en el establecimiento de programas eficaces de control y erradicación.

Las técnicas de diagnóstico de ASFV incluyen la prueba de hemoadsorción (HAD), prueba de anticuerpos fluorescentes (FAT), reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las pruebas serológicas incluyen ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos y prueba de inmunotransferencia.

HAD se basa en el hecho de que los eritrocitos porcinos se adherirán a la superficie de células de macrófagos o monocitos porcinos infectadas por ASFV y de que la mayoría de los aislados de virus producen este fenómeno de hemoadsorción. Un resultado positivo en la prueba de hAd es definitivo para determinar la presencia de ASFV. Se ha aislado un número muy pequeño de virus “no hemoadsorbentes”, la mayoría de los cuales son avirulentos, pero algunos sí que producen aSf aguda típica. La prueba se lleva a cabo inoculando suspensiones de sangre o tejido de cerdos sospechosos en cultivos de leucocitos primarios, o en cultivos de células de macrófagos alveolares, y también preparando cultivos de leucocitos a partir de la sangre de cerdos inoculados en el laboratorio o a partir de la sangre de cerdos sospechosos recogida en el diagnóstico en campo.

La detección de antígeno mediante FAT puede usarse como método adicional para detectar antígeno en tejidos de cerdos sospechosos en el campo o de aquellos inoculados en el laboratorio. Una FAT positiva más signos clínicos y lesiones apropiadas pueden proporcionar un diagnóstico supuesto de ASFV. También puede usarse para detectar antígeno de ASFV en cultivos de leucocitos en los que no se observa HAD y por tanto puede identificar cepas no hemoadsorbentes del virus. También distingue entre el CPE (efecto citopático) producido por ASFV y el producido por otros virus, tales como virus de la enfermedad de Aujeszky o un inóculo citotóxico. Sin embargo, es importante observar que en enfermedad subaguda y crónica, la FAT tiene una sensibilidad significativamente reducida.

Se han desarrollado técnicas de PCR, usando cebadores a partir de una región altamente conservada del genoma, para detectar e identificar una amplia gama de aislados pertenecientes a todos los genotipos de virus conocidos, incluyendo tanto virus no hemoadsorbentes como aislados de baja virulencia. Las técnicas de PCR son particularmente útiles para identificar ADN de virus en tejidos porcinos que no son adecuados para el aislamiento de virus o la detección de antígeno porque han experimentado putrefacción, o cuando hay un buen motivo para creer que pueden haberse inactivado los virus antes de recibir las muestras en el laboratorio.

Los anticuerpos persisten en cerdos recuperados durante largos periodos tras la infección, algunas veces durante toda la vida, y hay varias pruebas disponibles para detectar estos anticuerpos, aunque solo unas pocas de ellas se han desarrollado para su uso rutinario en laboratorios de diagnóstico. La usada más habitualmente es el ensayo ELISA, que es adecuado para examinar o bien suero o bien fluido a partir de los tejidos. En casos críticos deben llevarse a cabo pruebas confirmatorias de muestras positivas mediante ensayo ELISA usando una prueba alternativa, tal como la prueba de IFA, tinción mediante inmunoperoxidasa o inmunotransferencia. Habitualmente no se detectan anticuerpos en cerdos infectados por ASFV virulento ya que mueren antes de producirlos. Los anticuerpos se producen en cerdos infectados por virus de ASF poco o moderadamente virulentos, pero éstos no son anticuerpos completamente neutralizantes.

Cuando el ASFV es endémico, la confirmación de casos sospechados de enfermedad se realiza mejor usando una prueba serológica convencional (ELISA), combinada con una prueba serológica alternativa (IFA) o una prueba de detección de antígeno. En algunos países, más del 95 % de los casos positivos se han identificado usando una combinación de pruebas de IFA y FAT.

La prueba de anticuerpos fluorescentes indirectos debe usarse como prueba confirmatoria para sueros de zonas que están libres de ASFV y son positivos en el ensayo ELISA, y para sueros de zonas endémicas que proporcionan un

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resultado inconcluso en el ensayo ELISA.

La prueba de inmunotransferencia debe usarse como alternativa a la prueba de IFA para confirmar resultados equívocos con sueros individuales. La prueba de inmunotransferencia es muy específica y permite una interpretación más fácil y más objetiva de los resultados y un mejor reconocimiento de muestras débilmente positivas.

La ASF no puede diferenciarse de la fiebre porcina clásica (CSF) mediante examen ni clínico ni de autopsia, y ambas enfermedades deben considerarse en los diagnósticos diferenciales de cualquier síndrome hemorrágico febril agudo de cerdos. Las septicemias bacterianas también pueden confundirse con ASF y CSF. Son esenciales pruebas de laboratorio para distinguir entre estas enfermedades.

Los síntomas clínicos de ASF son muy similares a la fiebre porcina clásica (CSF), y se necesita distinguir las dos enfermedades mediante diagnóstico en laboratorio, habitualmente realizado mediante ensayo ELISA o mediante aislamiento del virus a partir de sangre, ganglios linfáticos, bazo o suero de cerdos infectados.

La CSF, también conocida como cólera porcina, es una enfermedad grave de cerdos provocada por el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) de la familia Flaviviridae, género Pestivirus. La CSF es una enfermedad altamente contagiosa, que provoca grandes pérdidas en poblaciones de cerdos casi en todo el mundo, y con el potencial para una rápida propagación. La enfermedad se produce en muchas regiones de Asia, América Central y Sudamérica y partes de Europa y África. Los brotes pueden provocar grandes pérdidas en la producción porcina y dificultar gravemente el comercio internacional de animales y productos de animales. Las consecuencias socioeconómicas de los brotes de CSF son graves. El conocimiento y la vigilancia son indispensables para la detección temprana de brotes y la implementación inmediata de medidas de control es esencial para prevenir una propagación adicional. Con este objetivo, un requisito absoluto son métodos de diagnóstico fiables y detallados.

El diagnóstico de CSF puede basarse en signos clínicos en el campo y hallazgos patológicos macroscópicos, la detección indirecta del virus mediante métodos serológicos y la detección directa del virus mediante aislamiento del virus, detección de antígeno y ácido nucleico.

Los signos clínicos y patológicos de la CSF son bastante variables y pueden confundirse con otras enfermedades porcinas. La intensidad de los signos depende principalmente de la edad del animal y de la virulencia del virus.

La serología se usa de manera rutinaria para el diagnóstico y la vigilancia y siempre que se sospeche que puede estar presente CSFV en una población de cerdos. Los anticuerpos pueden detectarse por primera vez 2-3 semanas tras la infección y persisten durante toda la vida en animales que sobreviven. Los anticuerpos son un buen indicador de que puede haber estado presente una infección por CSFV en la piara. Las pruebas usadas más habitualmente para la detección de anticuerpos son pruebas de neutralización de virus (VNT) y ensayo ELISA. Sin embargo, la VNT requiere mucho trabajo y mucho tiempo, ya que se basa en tecnología de cultivo celular. Además, no puede automatizarse, por tanto no es adecuada para el análisis en masa de muestras. El ensayo ELISA se usa ampliamente para examinar para detectar anticuerpos durante y después de brotes, para monitorizar para detectar infecciones por CSFV en jabalís, y para someter a prueba la cobertura de inmunización de jabalís tras la vacunación. Sin embargo, en general, una sensibilidad superior del ensayo ELISA va asociada a una especificidad inferior, ya que hay reacciones cruzadas con anticuerpos inducidos por otros Pestivirus. Se desarrollaron anticuerpos disponibles comercialmente para ensayo ELISA como pruebas complementarias para vacunas de marcador de subunidad basadas en glucoproteína e2, pero tienen limitaciones en cuanto a su especificidad y/o sensibilidad. Se ha desarrollado un ensayo ELISA competitivo basándose en una proteína recombinante E2 truncada de la cepa Alfort/187 del CSFV y un anticuerpo monoclonal específico M1669 (Clavijo A et al. 2001 J Vet Diagn Invest 13: 357360). También se han desarrollado tiras inmunocromatográficas para la detección de anticuerpos anti-CSFV (Li X et al. 2012 J Virol Methods 180(1-2): 32-37).

Xuewu et al. (Marzo de 2012), vol. 180, p. 32-37 desvela una tira inmunocromatográfica para la detección de anticuerpos contra la glucoproteína E2 del virus de la fiebre porcina clásica. En la solicitud de patente china CN103293306 (septiembre de 2013) se desvela un a tira de ensayo inmunocromatográfico para la detección de anticuerpos contra el antígeno p54 del virus de la fiebre porcina africana.

Debido al impacto económico de ASFV y CSFV sobre la mortalidad y la morbilidad porcina, y a las implicaciones de la enfermedad sobre el comercio, un diagnóstico diferencial temprano de estas enfermedades resulta de gran valor. Adicionalmente, las medidas preventivas que deben adoptarse para ASF y para CSF son bastante diferentes. La página web de la Organización Mundial de Sanidad Animal proporciona fotografías en color para ayudar a los productores y a los médicos a identificar signos clínicos y lesiones macroscópicas asociadas con CSFV y con ASFV. Sin embargo, la ASF y la CSF tienen similitudes clínicas y patológicas, lo que dificulta el diagnóstico diferencial.

Por tanto, a la vista del estado de la técnica, todavía existe una necesidad de desarrollar un método para un diagnóstico fácil, rápido y fiable de infecciones provocadas por ASFV y/o por CSFV. Ventajosamente, dicho método debe tener al menos fiabilidad tan alta como la de los métodos descritos hasta ahora para diagnosticar infecciones

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provocadas por ASFV y/o por CSFV, debe permitir la distinción (diagnóstico diferencial) entre ASFV y CSFV de una manera sencilla y fácil, y debe poder realizarse directamente en el campo. El diagnóstico fácil, rápido y fiable y la identificación de una infección por ASFV o por CSFV es necesario con el fin de adoptar medidas preventivas convenientes en cada caso.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado un método inmunocromatográfico adecuado para la detección en una muestra de un sujeto de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV.

Por tanto, en un aspecto, la invención se refiere a una tira inmunocromatográfica como en la reivindicación 1 que comprende

(1) una almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de muestra recibe la muestra que va a analizarse,

(ii) una almohadilla de conjugado (2), acoplada a o que solapa parcialmente la almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de conjugado comprende

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina africana (ASFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-ASFV, y/o

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-CSFV, y

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control,

(iii) una almohadilla de detección de señal (3), acoplada a o que solapa parcialmente la almohadilla de conjugado

(2) , en la que dicha almohadilla de detección de señal comprende

- al menos una zona de detección de señal, seleccionada del grupo que consiste en:

• una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV, y/o

• una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV, en la que dichas zona de detección de señal anti-ASFV y zona de detección de señal anti-CSFV son zonas de detección de señal diferentes, y

- una zona de control (7), que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti- CSFV en la muestra,

y,

(iv) una almohadilla absorbente (4), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de detección de señal

(3) en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti- ASFV comprende o comprenden la proteína VP72 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV y en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV comprende o comprenden la proteína E2 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti-CSFV.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende al menos una tira inmunocromatográfica tal como se describió anteriormente.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de la tira inmunocromatográfica proporcionada por la invención, o del kit proporcionado por la invención, para detectar anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en una muestra, o para diagnosticar una infección provocada por ASFV y/o por CSFV, o para distinguir entre ASFV y CSFV como agente causante de una infección en un sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en un sujeto, en el que dicho método de inmunoensayo se realiza por medio de la tira inmunocromatográfica anteriormente mencionada proporcionada por la invención, comprendiendo dicho método

(i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

(ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a

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dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, y

(iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y/o la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inmunoensayo para distinguir entre el agente causante de una infección en un sujeto, en el que dicho agente causante se selecciona del grupo que consiste en ASFV, CSFV y combinaciones de los mismos, realizándose dicho método de inmunoensayo por medio de la tira inmunocromatográfica anteriormente mencionada proporcionada por la invención, comprendiendo dicho método

(i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

(ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, y

(iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une

específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho

sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-ASFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es ASFV; y/o

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho

sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-CSFV es indicativa de que el agente causante de dicha

infección es CSFV.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 muestra un esquema de una tira inmunocromatográfica según la invención. La tira comprende una almohadilla de muestra (1), una almohadilla de conjugado (2), una almohadilla de detección de señal (3) y una almohadilla absorbente (4). La almohadilla de detección de señal comprende una zona de detección de señal anti- CSFV (5), una zona de detección de señal anti-ASFV (6) y una zona de control (7). En una realización particular, la almohadilla de detección de señal es una membrana de nitrocelulosa. Los elementos adicionales, opcionales de la tira incluyen un adhesivo protector (8) y un soporte (9), tal como un plástico de soporte.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado una prueba basada en inmunocromatografía que puede detectar la presencia en una muestra de un sujeto de anticuerpos anti-ASFV y/o anti-CSFV específicos.

1. Definiciones

El término “analito”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto cuya presencia o ausencia en una muestra de un sujeto debe determinarse por medio de la tira inmunocromatográfica de la invención. En el contexto de la invención, el analito es un anticuerpo, en particular un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en anticuerpo anti-ASFV y anticuerpo anti-CSFV.

La frase “almohadilla absorbente”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de tiras inmunocromatográficas, también conocida como mecha o almohadilla de mecha, se refiere a una almohadilla que extrae fluido de la membrana para permitir que el flujo capilar de la membrana siga fluyendo en la dirección apropiada y a la velocidad apropiada. Los materiales adecuados para una almohadilla absorbente incluyen láminas de fibra de celulosa.

El término “anticuerpo” (abreviado como Ac, también conocido como inmunoglobulina, abreviado como Ig), tal como

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se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno, que se une específicamente (inmunorreacciona) con un antígeno, tal como, por ejemplo, una proteína. Hay 5 isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).

El término “antígeno”, tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier molécula o fragmento molecular de la misma que se reconoce por un anticuerpo; el término incluye cualquier molécula o fragmento molecular de la misma que, cuando se introduce en el organismo, induce una respuesta inmunitaria específica (es decir humoral o celular) por parte del sistema inmunitario. Los antígenos tienen la capacidad de unirse al sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. En el contexto de la invención, los antígenos están relacionados con antígenos, o fragmentos de los mismos, reconocidos por un anticuerpo anti-ASFV y que se unen a dicho anticuerpo anti-ASFV, así como con antígenos, o fragmentos de los mismos, reconocidos por un anticuerpo anti-CSFV, y que se unen a dicho anticuerpo anti-CSFV.

El término “ASFV” o “virus de la fiebre porcina africana” se refiere a un virus de ADN bicatenario, grande, que se replica en el citoplasma de células infectadas, y es el único miembro de la familia Asfarviridae. Corresponde al n.° de taxonomía del GenBank 10497. ASFV es el único virus con un genoma de ADN transmitido por artrópodos, y es el agente causante de fiebre porcina africana (ASF). El virus provoca una fiebre hemorrágica con altas tasas de mortalidad en cerdos, pero infecta de manera persistente a sus huéspedes naturales, jabalís verrugosos, potamóqueros rojos y garrapatas blandas del género Ornithodoros, sin signos de enfermedad. El genoma del virus comprende entre 170 y 192 kilobases (kb), con una región central conservada de aproximadamente 125 kb y extremos variables. Estas regiones variables codifican para cinco familias de múltiples genes que están implicadas directamente en la variabilidad del genoma del virus. Se han identificado al menos 28 proteínas estructurales en partículas de virus intracelulares (200 nm). Se han identificado más de cien proteínas infecciosas en macrófagos porcinos infectados, y al menos 50 de ellas reaccionan con sueros de cerdos infectados o recuperados. Tal como se usa en el presente documento, el término ASFV comprende cualquier cepa de ASFV, independientemente de su origen, por ejemplo, cepa española España 75 (E75), una cepa altamente virulenta, cepa española BA71, correspondiente a una cepa de ASFV aislada en Badajoz en 1971 y adaptada a la línea celular vero (V) estable derivada de riñón de mono; dicha cepa (BA71) es apatogénica y está completamente secuenciada (número de registro de NCBI U18466, publicada el 22 de abril de 1995) (Yanez RJ et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology. 1 de abril de 1995; 208(1):249-78), etc.

La frase “disolución tampón” o simplemente “tampón”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una disolución acuosa que consiste en una mezcla de un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado. En particular, un tampón fisiológico emula las condiciones fisiológicas, por ejemplo tiene un pH ligeramente alcalino, que oscila entre 7,4 y 8,0, y una concentración de sal isotónica, por ejemplo de entre el 0,7 y el 1,1 % de sal (por ejemplo NaCl), preferentemente de aproximadamente el 0,9 % de sal (por ejemplo NaCl). Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen solución salina tamponada con Tris, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y similares.

La frase “reactivo de captura” tal como se usa en el presente documento en el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, se refiere a un reactivo específico de analito que puede inmovilizarse sobre el sustrato, particularmente sobre la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, más particularmente en la zona de detección de la almohadilla de detección de señal, y puede unirse específicamente al analito, o a un reactivo específico de analito, o a un complejo de un analito con un reactivo específico de analito. En una realización preferida, el reactivo de captura es un reactivo de captura inmovilizado. En el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, el reactivo de captura se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, y se selecciona del grupo que consiste en un antígeno que se une a un anticuerpo anti-ASFV, o un fragmento de dicho antígeno que puede unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV. En una realización particular, el reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende la proteína VP72 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV. En otra realización no exclusiva, el reactivo de captura se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, y se selecciona del grupo que consiste en un antígeno que se une a un anticuerpo anti- CSFV, o un fragmento de dicho antígeno que puede unirse a dicho anticuerpo anti-CSFV. En una realización particular, el reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV comprende la proteína E2 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-CSFV. En una realización particular, el reactivo de captura está situado en una zona de control de la almohadilla de detección de señal de la tira según la invención, en la que dicho reactivo de captura puede unirse específicamente a un reactivo de control. En una realización particular, el reactivo de captura está deshidratado o en forma seca.

La frase “almohadilla de conjugado”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de tiras inmunocromatográficas, se refiere a una almohadilla usada para inmovilizar y liberar el reactivo detector, tal como un reactivo detector coloidal o un reactivo detector de látex, una vez que la muestra ha pasado sobre dicha almohadilla, suministrando uniformemente la muestra y el reactivo detector a la almohadilla de detección de señal (zona de reacción). El material que comprende la almohadilla de conjugado debe humectarse uniformemente para aceptar el conjugado en el interior de la matriz de la membrana. En una realización particular, el material de la almohadilla de

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conjugado es un material poroso. Además, la almohadilla de conjugado no debe dañar, inactivar o impedir la liberación del conjugado una vez secado. Hay almohadillas de conjugado disponibles comercialmente que incluyen, sin limitación, almohadillas de conjugación de Pall Corporation, Millipore, GE Healthcare, Ahlstrom o Whatman. Los materiales adecuados para una almohadilla de conjugado incluyen, sin limitación, fibra de vidrio, poliéster y rayón.

El término “CSFV” o “virus de la fiebre porcina clásica” se refiere al virus que provoca la fiebre porcina clásica (CSF, cólera porcina o peste porcina), correspondiente al n.° de taxonomía de GenBank 11096. Su genoma se encuentra ubicado en el GenBank con el n.° de registro NC_002657 (12.301 pb, publicado del GenBank el 8 de diciembre de 2008). La CSF es una enfermedad grave de los suidos, que provoca daños económicos, que puede propagarse de una manera epizoótica así como establecer infecciones enzoóticas en poblaciones de cerdos domésticos y salvajes.

La frase “reactivo detector”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, se refiere a un reactivo usado para una visualización de una señal relacionada con la formación de un inmunocomplejo. En una realización particular, el reactivo detector está deshidratado o en forma seca. Según la invención, el reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por un anticuerpo, y una etiqueta detectable adecuada para la detección (incluyendo, por ejemplo, partículas coloreadas (en el intervalo nanométrico o micrométrico) (el antígeno puede unirse a dichas partículas o el antígeno puede recubrir, total o parcialmente, dichas partículas). En una realización particular, el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende la proteína VP72 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV. En una realización particular, el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV comprende la proteína E2 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV. En una realización particular, los reactivos detectores adecuados según la invención comprenden, además de un antígeno o fragmento del mismo, una partícula, en los que dicha partícula está dentro del intervalo nanométrico (desde 1 nm hasta 1000 nm) o micrométrico (desde 1 pm hasta 1000 pm). En una realización particular, la partícula está dentro del intervalo nanométrico. Se requiere que estas partículas sean una población monodispersa con una forma constante. En una realización particular, la partícula tiene una forma sustancialmente esférica incluyendo, sin limitación, una microesfera y una nanoesfera. Las partículas comprendidas por el reactivo detector según la invención incluyen, sin limitación, microesferas y nanoesferas tales como perlas de látex, partículas de metal coloidal tales como partículas de oro coloidal, conjugados enzimáticos, bolsas de colorante, partículas fluorescentes, partículas magnéticas, y similares. También se requiere que estas partículas se muevan a través de la estructura de poros retorcida del soporte (normalmente una membrana) de la almohadilla de detección de señal. En una realización particular, el antígeno o fragmento del mismo comprendido por el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención está unido a, recubre totalmente o recubre parcialmente una partícula, preferentemente seleccionada del grupo que comprende microesferas y nanoesferas, en la que dichas partículas se seleccionan del grupo que comprende partículas de látex y partículas de oro coloidal. En una realización más particular, el antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector está unido a, recubre totalmente o recubre parcialmente partículas de látex. En una realización más particular, las partículas están coloreadas (lo que en una realización particular constituye la etiqueta del reactivo detector ya que permite la identificación del inmunocomplejo formado). Un antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV según la invención puede estar unido a dichas partículas, o alternativamente, puede recubrir, total o parcialmente, dichas partículas coloreadas; dichas partículas coloreadas pueden tener el mismo color que, o un color distinto de, el de las partículas coloreadas a las que está unido un antígeno o fragmento del mismo de un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, o las que recubre total o parcialmente según la invención. En una realización, las partículas están deshidratadas o en forma seca. En una realización más particular, las partículas se reconstituyen en contacto con la muestra y/o en contacto con una disolución tampón. En una realización particular de la tira inmunocromatográfica de la invención, los reactivos detectores son móviles y están incrustados en un material poroso.

El término “proteína E2”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoproteína de la envuelta estructural de CSFV, que está anclada a la envuelta mediante su extremo carboxilo. Está presente como homodímero unido mediante puentes disulfuro sobre la superficie de viriones de CSFV, así como dimerizada con E1. La secuencia de aminoácidos de la proteína E2 está ubicada en la base de datos de proteínas del NCBI con el número de registro AEA40488.1 (373 aa, publicado el 17 de agosto de 2011).

El término “inmunoensayo”, tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier técnica de inmunoensayo basada en la formación o el uso de inmunocomplejos, es decir, que resultan de la conjugación de anticuerpos y antígenos, como referencias de cuantificación de un analito determinado (sustancia que está examinándose), que puede ser el anticuerpo o el antígeno, usando para la medición una molécula como marcador que produce una señal detectable en respuesta a una unión específica. En una realización particular, el analito cuya presencia debe determinarse en una muestra de un sujeto es un anticuerpo, más particularmente un anticuerpo anti-ASFV o un anticuerpo anti-CSFV.

El experto en la materia conoce que pueden usarse muchos marcadores diferentes en un inmunoensayo; los ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos marcadores incluyen elementos radiactivos (por ejemplo, azufre, yodo, etc.), enzimas (por ejemplo, peroxidasa, glucosidasa, fosfatasa alcalina, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, p-

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galactosidasa, p-glucosidasa, p-glucuronidasa, etc.), compuestos o colorantes fluorescentes (por ejemplo fluoresceína, rodamina, etc.), compuestos fosforescentes o quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, acridinio, fenantridinio, rutenio, luminol, etc.), partículas magnéticas o de látex, oro coloidal, partículas de plata o selenio, quelatos de metales, coenzimas, etc., así como partículas coloreadas. Por tanto, el complejo formado puede detectarse o visualizarse mediante cualquier técnica adecuada, dependiendo del marcador elegido, conocida por los expertos en la técnica, usando dispositivos apropiados, por ejemplo, usando técnicas radiactivas, colorimétricas, fluorimétricas, (quimio)luminiscentes, etc., todas conocidas por los expertos en la técnica. De manera ilustrativa, cuando el marcador es una enzima, la detección del complejo (antígeno-anticuerpo)/marcador puede llevarse a cabo poniendo en contacto dicho complejo con un sustrato adecuado y, opcionalmente, con activadores y/o agentes de amplificación enzimáticos apropiados. En una realización particular, las partículas coloreadas a las que está unido el antígeno, o que están recubriendo el antígeno, constituyen el marcador presente en el reactivo detector.

El término “tira inmunocromatográfica” o simplemente “tira”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una tira reactiva de diagnóstico in vitro basada en los principios de la inmunocromatografía, en la que se forma un complejo entre una partícula de detector que está libre en la corriente de muestra y un reactivo de captura que está unido a la membrana (en la línea de prueba, o zona de detección de señal, de tal membrana comprendida por una almohadilla de detección de señal). Las tiras inmunocromatográficas incluyen las tiras para someter a ensayo la presencia/ausencia de un analito en una muestra, ensayos semicuantitativos y cuantitativos. En el contexto de la presente invención, la tira inmunocromatográfica descrita en el presente documento es para la detección de la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anti-CSFV. En una realización alternativa, la tira inmunocromatográfica de la invención puede usarse en un ensayo semicuantitativo o cuantitativo, en el que se determina la concentración de los anticuerpos anti-ASFV y/o anti-CSFV en una muestra, por medio de un lector de tira, con el fin de cuantificar la intensidad de las líneas de prueba, y una curva patrón para determinar la concentración, como reconoce el experto.

Por “flujo lateral”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, quiere decirse un flujo de fluido en un material en el que los componentes que están disueltos en la muestra se transportan esencialmente mediante capilaridad con una velocidad sustancialmente igual y un flujo lateral intacto a través del material.

El término “microesferas”, también conocidas como micropartículas, se refiere a pequeñas partículas esféricas, con diámetros en el intervalo micrométrico, normalmente de desde 1 Cm hasta 1.000 Cm. Hay microesferas disponibles comercialmente de diversos materiales naturales y sintéticos, tales como microesferas de vidrio, microesferas poliméricas y microesferas cerámicas. En una realización particular, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende microesferas. En una realización particular, dichas microesferas son microesferas de látex. En una realización más particular, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica proporcionada por la invención comprende microesferas coloreadas. Las microesferas pueden estar deshidratadas o en forma seca. Dichas microesferas se reconstituyen en contacto con la muestra y/o en contacto con una disolución tampón.

Por “móvil”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, quiere decirse que no está fijado al material poroso de modo que cuando un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV en la almohadilla de conjugado y/o cuando un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV en la almohadilla de conjugado, si la muestra de prueba contiene anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV de interés, se forma un complejo entre dichos anticuerpos anti- ASFV y dicho reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y/o entre dichos anticuerpos anti-CSFV y dicho reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en el que dicho(s) complejo(s) puede(n) moverse hacia arriba a través de la tira mediante flujo lateral.

El término “nanoesfera”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a partículas esféricas pequeñas, con diámetros en el intervalo nanométrico, normalmente de desde 1 nm hasta 1000 nm. En el contexto de la invención, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende nanoesferas. En una realización particular, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende nanoesferas. En una realización particular, dichas nanoesferas son nanoesferas de látex. En una realización más particular, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende nanoesferas coloreadas. En una realización más particular, el reactivo detector de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende nanoesferas, en el que dichas nanoesferas se seleccionan del grupo que comprende nanopartículas de látex coloreadas y nanopartículas de oro coloidal. Las nanoesferas pueden estar deshidratadas o en forma seca. Dichas nanoesferas se reconstituyen en contacto con la muestra y/o en contacto con una disolución tampón.

La frase “material poroso”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material que puede permitir el flujo lateral a través del mismo. Los ejemplos de materiales porosos adecuados incluyen, sin limitación, acrilonitrilo, algodón, fibra de vidrio, nitrato de celulosa, combinaciones de nitrocelulosa y poliéster o celulosa, nailon (poliamidas), papel, rayón y materiales similares. La expresión “tira que incluye un material poroso” se refiere a cualquier elemento en forma de una tira alargada que contiene un material poroso. En una realización particular de la tira inmunocromatográfica de la invención, los reactivos detectores son móviles y están incrustados en un material

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poroso.

El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la invención, se refiere a cualquier muestra, preferentemente una muestra biológica, que puede contener anticuerpos, particularmente a cualquier muestra que se sospecha que contiene anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV obtenida del sujeto que está estudiándose (a menos que se indique lo contrario). Las muestras adecuadas recogidas de un sujeto para su uso en la presente invención incluyen cualquier fluido biológico y, en particular, sangre, suero, plasma, linfa, saliva, células de sangre periférica o células de tejido, suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, mucosidad, sudor, leche o extractos cerebrales. El tejido corporal puede comprender tejido del timo, ganglio linfático, bazo, médula ósea o amígdala. Las muestras preferidas comprenden una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma, una muestra de jugo de carne y una muestra de saliva obtenida de dicho sujeto. En una realización particular, la muestra es una muestra de sangre. En una realización particular, dicha muestra de sangre comprende sangre periférica. La frase “sangre periférica” se refiere al volumen de sangre que circula lejos del corazón, es decir, sangre que fluye a través del cuerpo de un sujeto. La muestra de sangre puede obtenerse mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. El término “suero”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al componente de la sangre que resulta tras la coagulación de la sangre y eliminación del coágulo resultante. Los métodos para obtener muestras de sangre de un sujeto se recogen ampliamente en el estado de la técnica así como métodos para obtener suero a partir de muestras de sangre.

La frase “almohadilla de muestra”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de tiras inmunocromatográficas, se refiere a una almohadilla en la que se aplica la muestra de fluido al dispositivo de flujo lateral. Por tanto, la almohadilla de muestra comprende un área o una zona para recibir la muestra (también conocida como zona de recepción). En una realización particular, la almohadilla de muestra también puede comprender una segunda zona (zona de conjugado) que comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y/o al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV. En el caso de que la almohadilla de muestra (que comprende la zona de recepción), y la almohadilla de conjugado (que comprende la zona de conjugado), sean diferentes, deben estar en contacto mediante un material poroso de modo que la muestra puede fluir mediante capilaridad desde la zona de recepción de la almohadilla de muestra hasta la zona de conjugado de la almohadilla de conjugado. En una realización particular, la zona de recepción está comprendida por una almohadilla de muestra y la zona de conjugado está comprendida por una almohadilla de conjugado, en la que la almohadilla de muestra y las almohadillas de conjugado son almohadillas diferentes. En una realización alternativa particular, la almohadilla de muestra comprende tanto una zona de recepción como una zona de conjugado. En una realización particular, la muestra se carga con una disolución de arrastre para facilitar la disolución de los reactivos detectores en la zona de conjugado de la almohadilla de conjugado y el flujo lateral. En una realización alternativa particular, la almohadilla de muestra (que comprende la zona de recepción) y la almohadilla de conjugado (que comprende la zona de conjugado) son almohadillas diferentes, que se solapan parcialmente.

La frase “almohadilla de detección de señal”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de la tira inmunocromatográfica de la invención, se refiere a una membrana que comprende al menos una zona de detección de señal (también conocida como línea de prueba), en la que dicha zona de detección de señal comprende un reactivo de captura que se une específicamente a un analito. En una realización particular, la membrana de la zona de detección de señal comprende dos zonas de detección de señal: una primera zona de detección de señal que comprende un primer reactivo de captura para un primer analito, y una segunda zona de detección de señal que comprende un segundo reactivo de captura para un segundo analito. En una realización preferida, la zona de detección de señal comprende también una zona de control (también conocida as línea de control), en la que dicha zona de control comprende un reactivo de captura que se une específicamente a un reactivo de control, para la confirmación de la migración a lo largo de la tira inmunocromatográfica independientemente de la presencia de un analito particular en la muestra analizada por medio de dicha tira. En una realización particular, la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende tanto una zona de detección de señal como una zona de control. En una realización más particular, la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende una primera zona de detección de señal, una segunda zona de detección de señal y una zona de control.

El término “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal que tiene un sistema inmunitario, preferentemente mamíferos, y susceptible de tener infección por ASFV o por CSFV, por ejemplo, suidos (por ejemplo cerdos, etc.).

La frase “proteína VP72”, tal como se usa en el presente documento, también conocida como p72, se refiere a una proteína de la cápside viral de ASFV, que representa aproximadamente el 32 % del contenido total en proteínas de las partículas de virus. La secuencia de aminoácidos de la proteína VP72 está ubicada en la base de datos de proteínas del NCBI con el número de registro AAM47167.1 (138 aa, publicada el 4 de junio de 2002).

2. Tira inmunocromatográfica de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado una prueba basada en inmunocromatografía que puede

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detectar la presencia en una muestra de un sujeto de anticuerpos anti-ASFV o anti-CSFV específicos. La tira inmunocromatográfica desarrollada por los inventores implica un formato fácil de usar, un tiempo muy corto para obtener el resultado de la prueba, estabilidad a largo plazo y es relativamente económica; además, permite obtener los resultados de la prueba en un tiempo muy corto y realizar pruebas en el campo, con una buena sensibilidad (un parámetro que mide la proporción de positivos reales que se identifican correctamente como tales, como la capacidad de dicha prueba de identificar resultados positivos) y especificidad (parámetro que mide la proporción de negativos que se identifican correctamente como tales, como la capacidad de dicha prueba de identificar resultados negativos) (véanse las tablas 2 y 3 en la sección de ejemplos).

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a una tira inmunocromatográfica, denominada “tira inmunocromatográfica de la invención” a continuación en el presente documento, que comprende:

(i) una almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de muestra recibe la muestra que va a analizarse,

(ii) una almohadilla de conjugado (2), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de conjugado comprende

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina africana (ASFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-ASFV, y/o

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-CSFV, y

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control,

(iii) una almohadilla de detección de señal (3), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de conjugado (2), en la que dicha almohadilla de detección de señal comprende

- al menos una zona de detección de señal, seleccionada del grupo que consiste en:

• una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia o la ausencia de

anticuerpos anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un

reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo,

reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV, y/o

• una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia o la ausencia de

anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un

reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo,

reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV, y

- una zona de control (7), que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti- CSFV en la muestra,

y,

(iv) una almohadilla absorbente (4), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de detección de señal (3).

En una realización particular, la tira inmunocromatográfica de la invención permite la determinación simultánea de anticuerpos anti-ASFV y anti-CSFV específicos en una muestra. Por tanto en una realización particular, la invención se refiere a una tira inmunocromatográfica que comprende

(i) una almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de muestra recibe la muestra que va a analizarse,

(ii) una almohadilla de conjugado (2), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de conjugado comprende

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina africana (ASFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-ASFV,

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-CSFV, y

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control, en la que dicho reactivo detector es móvil y está incrustado en un material poroso,

(iii) una almohadilla de detección de señal (3), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de conjugado (2), en la que dicha almohadilla de detección de señal comprende

- una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV,

- una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia o la ausencia de

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anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV, y

- una zona de control (7), que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti- CSFV en la muestra,

y,

(iv) una almohadilla absorbente (4), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de detección de señal (3).

La tira inmunocromatográfica de la invención comprende varios elementos, concretamente una almohadilla de muestra (1), una almohadilla de conjugado (2), una almohadilla de detección de señal (3) y una almohadilla absorbente (4). Tal como conoce el experto, los elementos que comprende una tira inmunocromatográfica están dispuestos en un orden particular, de modo que es posible realizar la inmunocromatografía a lo largo de la tira. En una realización particular, la almohadilla de muestra está ubicada en un extremo de la tira inmunocromatográfica, seguida por la almohadilla de conjugado, seguida por la almohadilla de detección de señal, y seguida por la almohadilla absorbente, que está ubicada preferentemente en el extremo opuesto de la tira inmunocromatográfica con respecto a la almohadilla de muestra. Como reconoce el experto, las almohadillas comprendidas por la tira inmunocromatográfica están dispuestas en un orden secuencial, en el que una almohadilla está acoplada a la almohadilla siguiente o en el que una almohadilla y la almohadilla siguiente se solapan parcialmente. Pueden contemplarse disposiciones alternativas de los elementos de la tira, siempre que tales disposiciones permitan que se desarrolle la inmunocromatografía. Aunque no se requiere, la zona de control de la almohadilla de detección de señal está ubicada normalmente aguas arriba de la zona de detección comprendida por la almohadilla de detección de señal.

2.1 Almohadilla de muestra (1)

La tira inmunocromatográfica de la invención comprende una almohadilla de muestra (1). Este elemento recibe la muestra que va a analizarse, y controla la distribución uniforme y controlada de dicha muestra sobre la almohadilla de conjugado. Una función adicional que puede cumplir la almohadilla de muestra (1) es controlar la velocidad a la que entra líquido en la almohadilla de conjugado, impidiendo inundar el dispositivo. Cuando se impregna una almohadilla de muestra (1) con componentes tales como proteínas (incluyendo, sin limitación, albúmina), detergentes (incluyendo, sin limitación, SDS (dodecilsulfato de sodio) o Tween® 20 (polisorbato 20)), potenciadores de la viscosidad y sales tampón, la almohadilla de muestra también puede usarse para aumentar la viscosidad de la muestra (modular las propiedades de flujo), para potenciar la capacidad de la muestra para solubilizar el reactivo detector, para impedir que el conjugado y el analito se unan de manera no específica a cualquiera de los materiales aguas abajo y/o para modificar la naturaleza química de la muestra de modo que sea compatible con la formación de inmunocomplejos en la línea de prueba.

Las diferencias en el pH y la concentración iónica pueden desplazar la especificidad y la sensibilidad de reactivos de captura y detectores y fomentar diversos grados de unión no específica de reactivos detectores debido a cambios en las densidades de carga. Añadir una concentración relativamente alta de sales tampón a la almohadilla de muestra (por ejemplo, mediante tratamiento previo con tampón borato 1,0 M, pH 9,5) puede minimizar la variación controlando el pH y la concentración iónica de la disolución que surge de la almohadilla de muestra.

En una realización particular, la almohadilla de muestra (1) puede tratarse previamente sumergiéndola en un tampón específico que contiene una mezcla de una disolución compuesta por proteínas solubles, tensioactivos/detergentes y otros polímeros, lo que permite un flujo constante e impide la unión no específica de componentes de la muestra a la almohadilla.

Los materiales adecuados para una almohadilla de muestra (1) según la invención incluyen, sin limitación, mallas tejidas (también conocidas como tamices) y filtros de celulosa.

Las mallas tejidas son normalmente adecuadas para distribuir el volumen de muestra uniformemente a lo largo de la almohadilla de conjugado. También tienen normalmente buena resistencia a la tracción y se manipulan bien, incluso cuando están húmedas. Las mallas pueden tener volúmenes de lecho muy bajos, lo que significa que retienen muy poco volumen de muestra, normalmente 1-2 pl/cm2. Por otro lado, no resulta práctico tratarlas con la intención de cargarlas con suficientes solutos como para modificar el contenido en proteína, pH, concentración iónica o viscosidad de la muestra de prueba.

Los filtros de celulosa tienen propiedades que son casi las opuestas a las mallas tejidas. Son gruesos (de más de (>) 250 pm), débiles y relativamente económicos. Los filtros de celulosa también tienen grandes volúmenes de lecho (de más de (>) 25 pl/cm2). El papel puede ser muy difícil de manipular, especialmente cuando está húmedo. Los filtros celulósicos son los materiales más comúnmente usados para preparar la almohadilla de muestra. Los filtros de

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celulosa son preferibles en esta aplicación basándose en su gran volumen de lecho, lo que permite cargarlos con una amplia red de agentes de bloqueo, agentes de liberación de reactivo detector, modificadores del pH y de la concentración iónica, y potenciadores de la viscosidad. Cuando se usan filtros de celulosa, debe tenerse cuidado para garantizar un contacto suficiente y constante con el material de almohadilla de conjugado subyacente. No lograr alcanzar un buen contacto y una compresión adecuada puede conducir a una transferencia interrumpida o no constante de fluido al interior de la almohadilla de conjugado.

En una realización particular, la almohadilla de muestra (1) de la tira inmunocromatográfica de la invención está compuesta por una combinación de fibras naturales y sintéticas, sin limitación, rayón, celulosa y fibra de vidrio. Tales fibras combinadas están disponibles comercialmente incluyendo, sin limitación, membranas de Cytosep® (Pall Corporation) para la separación de plasma a partir de sangre completa tal como fibra de vidrio A/D (Gf A/D), membrana de separación de plasma Vivid™, o Gf/AVA.

Tal como se indicó anteriormente, la almohadilla de muestra (1) recibe la muestra que va a analizarse mediante la tira inmunocromatográfica de la invención, con el fin de determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti- ASFV y/o la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-CSFV. Las muestras adecuadas para su análisis por medio de la tira inmunocromatográfica de la invención son aquellas susceptibles de comprender dichos anticuerpos, como las seleccionadas del grupo que comprende sangre, suero, plasma, jugos de carne y saliva. En una realización particular, la muestra para su análisis se selecciona del grupo que comprende sangre completa, suero y plasma. El experto conoce métodos para obtener una muestra de sangre, una muestra de suero o una muestra de plasma.

En una realización particular, el sujeto es un animal susceptible de tener infección por ASFV o por CSFV. En una realización más particular, el sujeto es un suido.

En una realización particular, la almohadilla de muestra (1) y la almohadilla de conjugado (2) se materializan de tal manera que ambas almohadillas constituyen una única almohadilla que comprende tanto una región para recibir la muestra que va a analizarse como una región que comprende al menos un reactivo detector. En una realización alternativa preferida, la almohadilla de muestra (1) y la almohadilla de conjugado (2) son almohadillas diferentes. En una realización particular, la almohadilla de muestra (1) y la almohadilla de conjugado (2) están acopladas. En una realización alternativa particular, tal como se muestra en la figura 1, la almohadilla de muestra (1) solapa parcialmente la almohadilla de conjugado (2).

2.2 Almohadilla de conjugado (2)

Un segundo elemento de la tira inmunocromatográfica según la invención es la almohadilla de conjugado (2).

La almohadilla de conjugado (2) de una tira inmunocromatográfica transfiere uniformemente el reactivo detector y la muestra de prueba sobre la membrana de la almohadilla de detección de señal (3). Cuando la muestra fluye al interior de la almohadilla de conjugado (2), el reactivo detector se solubiliza, se desprende del material de almohadilla y se mueve con el frente de muestra al interior de la membrana de la almohadilla de detección de señal (3). Las funciones adicionales de la almohadilla de conjugado (2) incluyen suministrar el reactivo detector sobre la membrana en un volumen de muestra constante en cada tira reactiva inmunocromatográfica. El volumen de muestra requerido para liberar la partícula de detector al interior de la corriente de muestra determina cuánto analito puede medirse. Solo el analito contenido en el volumen de muestra que migra delante de y con el reactivo detector puede contribuir a la señal. El volumen de muestra que entra en la almohadilla de conjugado y la membrana después de que las partículas de detector se hayan liberado completamente no contribuye a la señal, aunque sí que sirve para reducir el fondo del ensayo. Un analito que pasa sobre la línea de reactivo de captura después de que todos los reactivos detectores hayan migrado más aguas abajo puede unirse a la línea de reactivo de captura pero carecerá de reactivos detectores adicionales para completar el inmunocomplejo. El volumen de muestra realmente analizado en la tira reactiva es igual a la cantidad de muestra requerida para solubilizar los reactivos detectores, no a la cantidad total absorbida por el dispositivo.

Las características del material de almohadilla de conjugado incluyen baja unión no específica (si el reactivo detector o el analito se une a la almohadilla de conjugado, no estará disponible para formar el inmunocomplejo en la línea de prueba, reduciendo así la intensidad de señal y la sensibilidad), características de flujo constante (propiedades de flujo no constante pueden provocar graves problemas de rendimiento; si el material no deposita la muestra uniformemente sobre la membrana, el reactivo detector puede canalizarse sobre la membrana, apareciendo como rayas a medida que la muestra migra hacia arriba por la tira reactiva y, por consiguiente, habrá un desarrollo de señal irregular en las líneas de prueba y de control), volumen de lecho constante (cuando se carga en la almohadilla de conjugado mediante inmersión, la cantidad de reactivo detector en cada tira reactiva depende del volumen de lecho del material; si el volumen de lecho varía significativamente, pueden observarse intensidades de señal variables aunque todos los demás componentes de la tira sean constantes), baja concentración de componentes extraíbles (además de los componentes químicos extraíbles, el material debe estar libre de partículas que puedan obstruir la membrana en la superficie de contacto de almohadilla de conjugado/membrana) y buenas características de manipulación de banda y compresibilidad constante.

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Los materiales porosos adecuados para la almohadilla de conjugado (2) de la tira inmunocromatográfica de la invención incluyen, sin limitación, filtros no tejidos, que se fabrican mediante compresión de fibras previamente hiladas de celulosa, vidrio o plástico (tal como poliéster, polipropileno o polietileno) para dar esteras delgadas. Se especifican por su tamaño de fibra, grosor, peso base, cantidad de componentes extraíbles y velocidad de flujo de aire. En la mayoría de los casos, cuestan considerablemente menos que las membranas. Los materiales habitualmente usados para fabricar almohadillas de conjugado incluyen filtros de fibra de vidrio, filtros de celulosa y filtros de polipropileno o poliéster (hidrófilo) sometido a tratamiento de superficie. En una realización particular, la almohadilla de conjugado (2) de la tira inmunocromatográfica de la invención es una almohadilla de conjugado de fibra de celulosa. Hay fibras de celulosa adecuadas disponibles comercialmente incluyendo, sin limitarse a, material rayón de Ahlstrom.

En una realización particular, la almohadilla de conjugado (2) está ubicada tras la almohadilla de muestra (1). En una realización particular, la almohadilla de conjugado (2) está acoplada a la almohadilla de muestra (1). En una realización particular preferida, tal como se muestra en la figura 1, la almohadilla de conjugado (2) solapa parcialmente la almohadilla de muestra (1). En una realización alternativa, la almohadilla de muestra (1) y la almohadilla de conjugado (2) se materializan de tal manera que constituyen una única almohadilla.

2.3 Reactivo detector de la almohadilla de conjugado

Los reactivos detectores están ubicados en la almohadilla de conjugado (2) de la tira inmunocromatográfica de la invención. Dichos reactivos detectores pueden moverse a lo largo de dicha tira cuando se realiza la inmunocromatografía, es decir, no están fijados al material poroso. Cuando un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV en la almohadilla de conjugado (2) y/o cuando un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV en la almohadilla de conjugado (2), si la muestra de prueba contiene anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV, se forma un complejo entre dichos anticuerpos anti- ASFV y dicho reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y/o entre dichos anticuerpos anti-CSFV y dicho reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, y dichos complejo o complejos pueden moverse a través de la tira hacia arriba mediante flujo lateral.

En una realización, la almohadilla de conjugado (2) según la invención comprende al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno reconocido por el anticuerpo anti-ASFV, o un fragmento del mismo reconocido por dicho anticuerpo anti- ASFV.

En otra realización particular, la almohadilla de conjugado según la invención comprende al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno reconocido por el anticuerpo anti-CSFV o un fragmento del mismo reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV.

En una realización particular preferida, la almohadilla de conjugado según la invención comprende:

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos

un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-

ASFV, y

- al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos

un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-

CSFV.

Los antígenos reconocidos por un anticuerpo anti-ASFV según la invención comprenden todos los elementos de ASFV que se reconocen por un anticuerpo anti-ASFV, que pueden unirse específicamente a dicho anticuerpo anti- ASFV, así como todos los elementos de ASFV que pueden provocar una respuesta inmunitaria por parte del sistema inmunitario de un sujeto infectado por dicho ASFV, e incluyen, sin limitación, proteínas p72 de la cápside de ASFV (VP72, 138 aa, depositada en la base de datos de proteínas del NCBI con el número de registro AAM47167.1 el 4 de junio de 2002), p30 (codificada por el gen E183L, 183 aa, n.° de registro de NCBI NP_042818.1, publicada el 30 de noviembre de 2009) y p54 (codificada por el gen CP204L, 204 aa, n.° de registro de NCBI NP_042786.1, publicada el 30 de noviembre de 2009). En una realización particular, el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende proteína VP72 o un fragmento de la misma reconocido por, y que puede unirse a, dicho anticuerpo anti-ASFV.

De manera similar, los antígenos reconocidos por un anticuerpo anti-CSFV según la invención comprenden todos los elementos de CSFV que pueden unirse específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, así como todos los elementos de CSFV que pueden provocar una respuesta inmunitaria por parte del sistema inmunitario de un sujeto infectado por dicho CSFV incluyendo, sin limitación, proteína E2. En una realización particular, el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV comprende proteína E2 o un fragmento de la misma reconocido por, y que puede unirse a, dicho anticuerpo anti-CSFV. Los fragmentos antigénicos de proteína E2 que se reconocen por un anticuerpo anti-CSFV y que se unen a dicho anticuerpo comprenden el epítopo altamente conservado de la

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glucoproteína E2 tal como se describe por Qi et al. (Qi Y et al. 2009 Acta Virol 53(4): 241-246). En una realización particular, el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV comprende un fragmento N- terminal de la proteína E2, más particularmente una región N-terminal de 136 aminoácidos tal como se describe por Lin et al. (Lin M et al. 2005 Clin Diagn Lab Immunol 12(7): 877-881).

Los reactivos detectores según la invención pueden estar deshidratados o en forma seca.

Como entiende el experto, un reactivo detector debe poder producir una señal que pueda detectarse visualmente o mediante un dispositivo instrumental, es decir, un reactivo detector comprende una sonda o etiqueta que proporciona una señal. En una realización particular, el reactivo detector comprende una partícula, en el que dicha partícula proporciona una señal detectable. Por tanto, los reactivos detectores de la invención comprenden partículas seleccionadas del grupo que comprende partículas de látex pequeñas, carbono o coloide de oro. En una realización particular alternativa, estas partículas también pueden incluir cromógenos colorimétricos o fluorescentes; catalizadores; compuestos luminiscentes (por ejemplo, fluorescentes, fosforescentes, etc.); compuestos radiactivos; partículas huecas, enzimas o sustratos, o partículas de látex de polímeros orgánicos; liposomas u otras vesículas que contienen sustancias productoras de señales; y similares. En algunas realizaciones, las sondas de detección comprendidas por el reactivo detector pueden contener un compuesto fluorescente que produce una señal detectable. El compuesto fluorescente puede ser una molécula fluorescente, polímero, dendrímero, partícula, y similares. Las sondas, tales como las descritas anteriormente, pueden usarse solas o junto con una partícula (algunas veces denominada “perlas” o “microperlas”). Si son lo bastante pequeñas, pueden usarse partículas que se producen de manera natural tales como núcleos, micoplasma, plásmidos, plástidos, células de mamífero (por ejemplo, fantasmas de eritrocitos), microorganismos unicelulares (por ejemplo, bacterias), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), y similares. En una realización particular preferida, pueden usarse partículas de látex que tienen una etiqueta de colorante fluorescente o coloreado.

El componente de sonda de un reactivo detector puede modificarse con determinados miembros de unión específica que se adhieren al mismo para formar sondas conjugadas. Los miembros de unión específica se refieren generalmente a un miembro de una pareja de unión específica, es decir, dos moléculas diferentes en las que una de las moléculas se une química y/o físicamente a la segunda molécula. Los miembros de unión específica inmunorreactivos pueden incluir, por ejemplo, antígenos, haptenos, aptámeros, anticuerpos (primarios o secundarios), y complejos de los mismos, incluyendo los formados mediante métodos de ADN recombinante o síntesis de péptidos.

Otras parejas de unión específica comunes incluyen, pero no se limitan a, biotina y avidina (o derivados de las mismas), biotina y estreptavidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias (incluyendo secuencias de ácido nucleico de sonda y captura usadas en ensayos de hibridación de ADN para detectar una secuencia de ácido nucleico diana), secuencias peptídicas complementarias incluyendo las formadas mediante métodos recombinantes, moléculas efectoras y receptoras, hormona y proteína de unión a hormonas, cofactores enzimáticos y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas, y similares. Las parejas de unión específica pueden incluir miembros que son análogos del miembro de unión específica original; puede usarse un derivado o fragmento del analito, es decir, un análogo de analito, siempre que tenga al menos un epítopo en común con el analito.

Los miembros de unión específica pueden fijarse generalmente a las sondas de detección usando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. La fijación covalente de los miembros de unión específica a las sondas de detección (por ejemplo, partículas) puede lograrse usando grupos carboxílicos, amino, aldehído, bromoacetilo, yodoacetilo, tiol, epoxídico y otros grupos funcionales de unión o reactivos, así como radicales libres residual y cationes de radicales, mediante lo cual puede lograrse una reacción de acoplamiento de proteínas. También puede incorporarse un grupo funcional de superficie como comonómero funcionalizado porque la superficie de la sonda de detección puede contener una concentración en superficie relativamente alta de grupos polares. Además, aunque con frecuencia las sondas de detección se funcionalizan tras la síntesis, en determinados casos, tales como politiofenol, las partículas pueden realizar una unión covalente directa con una proteína sin necesidad de modificación adicional. La activación y/o el acoplamiento de anticuerpo puede producirse en un tampón, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) (por ejemplo, pH de 7,2) o ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) (por ejemplo, pH de 5,3). Este procedimiento forma una sonda de detección conjugada, en la que el anticuerpo está covalentemente unido a la sonda.

También pueden usarse técnicas de fijación distintas de la unión covalente, tales como adsorción física, en la presente invención. En el caso de coloide de oro, proteínas tales como anticuerpos se unen bien a su superficie mediante una combinación de fuerzas, incluyendo unión dativa a través de interacciones azufre-oro, atracción de cargas y unión hidrófoba.

En una realización particular, el antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-ASFV, el antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV, y/o el reactivo de control, está unido a una partícula, o alternativamente, recubren independientemente, total o parcialmente, una partícula, en la que dicha partícula está comprendida por dicho reactivo detector, en la que dicha partícula se selecciona del grupo que comprende microesferas y nanoesferas. En

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particular, la partícula se selecciona de una partícula de látex y una partícula de oro coloidal, más particularmente, de una partícula de látex coloreada y una partícula de oro coloidal coloreada. Más particularmente, dicha partícula se selecciona de micropartículas de látex coloreadas, nanopartículas de látex coloreadas, micropartículas de oro coloidal y nanopartículas de oro coloidal.

En una realización particular preferida, tanto el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV como el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV están unidos a y/o recubren, parcialmente o totalmente, microesferas y/o nanoesferas, en la que dichas microesferas y/o nanoesferas son microesferas coloreadas y/o nanoesferas coloreadas. En una realización, el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV están unidos a y/o recubren, parcialmente o totalmente, microesferas y/o nanoesferas, en la que las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV están coloreadas con el mismo color que las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV. En una realización particular preferida, el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y el antígeno del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV están unidos a y/o recubren, parcialmente o totalmente, microesferas y/o nanoesferas, en la que las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV están coloreadas con un color diferente al de las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV.

En una realización particular, el antígeno específico para un anticuerpo anti-ASFV o el antígeno específico para un anticuerpo anti-CSFV del reactivo detector están unidos a las microesferas o a las nanoesferas mediante conjugación, en la que la conjugación se realiza mediante métodos conocidos por el experto.

En una realización particular, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende un reactivo de control, preferentemente una proteína de control, en la que dicho reactivo de control está ubicado en la almohadilla de muestra o en la almohadilla de conjugado, preferentemente en la almohadilla de conjugado, al menos un reactivo detector de control que se une específicamente a dicho reactivo de control, en la que el reactivo detector está ubicado en la almohadilla de conjugado, y al menos un reactivo de captura de control que se une específicamente a dicho reactivo de control, en la que dicho reactivo de captura de control está ubicado en la zona de control de la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica de la invención. Por tanto, la zona de control de la tira inmunocromatográfica de la invención, que comprende el reactivo de captura de control que se une específicamente al reactivo de control, permite la detección de un reactivo de control tal como una proteína de control, en la que la detección de dicha proteína de control es indicativa de confirmación de la migración cuando el flujo lateral a lo largo de la tira inmunocromatográfica se ha producido adecuadamente, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en la muestra analizada por medio de dicha tira. En una realización alternativa particular, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende un reactivo de control ubicado en la almohadilla de conjugado, en la que dicho reactivo de control comprende partículas coloreadas, y un reactivo de captura, ubicado en la zona de control de la almohadilla de detección de señal, en la que dicho reactivo de captura se une específicamente al reactivo de control.

El experto puede determinar reactivos de control adecuados para una tira según la invención y comprenden, sin limitación, biotina, avidina, estreptavidina, albúmina sérica bovina (BSA), albúmina sérica humana (HSA), hemocianina de lapa californiana (KLH) y ovoalbúmina (OVA). En una realización particular, el reactivo de control es biotina. En una realización alternativa, el reactivo de control es un anticuerpo, en la que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que comprende anticuerpo anti-biotina, anticuerpo anti-avidina, anticuerpo anti-estreptavidina, anticuerpo anti-BSA, anticuerpo anti-HSA, anticuerpo anti-KLH y anticuerpo anti-OVA.

En una realización particular, el reactivo de control se selecciona del grupo que comprende biotina, avidina, estreptavidina, BSA, HSA, KLH y OVA, y el reactivo de captura que se une específicamente a dicho reactivo de control se selecciona del grupo que comprende anticuerpo anti-biotina, avidina, estreptavidina, anticuerpo anti-BSA, anticuerpo anti-HSA, anticuerpo anti-KLH y anticuerpo anti-OVA.

El reactivo detector de control según la invención comprende cualquier reactivo que se une específicamente al reactivo de control. En una realización particular, el reactivo detector de control puede estar deshidratado o en forma seca. En una realización particular, el reactivo detector de control está unido a y/o recubre microesferas y/o nanoesferas. En una realización particular, dichas microesferas y/o nanoesferas son microesferas y/o nanoesferas coloreadas. En una realización más particular, dichas microesferas y/o nanoesferas coloreadas del reactivo detector de control están coloreadas con el mismo color que las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, y con el mismo color que las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV. En una realización alternativa, las microesferas y/o nanoesferas coloreadas del reactivo detector de control están coloreadas con un color diferente del color de las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti- ASFV. En otra realización alternativa, las microesferas y/o nanoesferas coloreadas del reactivo detector de control están coloreadas con un color diferente del color de las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV. En una realización alternativa preferida, las microesferas y/o

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nanoesferas coloreadas del reactivo detector de control están coloradas con un color diferente del color de las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y con un color diferente del color de las microesferas y/o nanoesferas en el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV.

Las microesferas disponibles comercialmente tienen varios tamaños y polímeros. Algunas consideraciones cuando se seleccionan microesferas apropiadas incluyen las siguientes:

- Se alcanza una velocidad de flujo óptima eligiendo microesferas 1/10 del tamaño de poro de la membrana a través de la cual migran, o más pequeñas.

- Colores óptimos para la visualización en diversos tipos de muestras.

Para minimizar el flujo impedido provocado por las interacciones hidrófobas inherentes entre membrana y partícula (en el caso de una membrana hidrófoba), con frecuencia es útil un tratamiento previo de la membrana con una sustancia que mantendrá una pequeña distancia entre las microesferas y la membrana, pero que puede rehidratarse fácilmente. Ejemplos de sustancias comúnmente usadas son sacarosa, diversos polímeros inertes solubles en agua, y tensioactivos. La idea es elegir una sustancia que sea estable en forma seca, pero que se disuelva fácilmente tras rehumedecerse para permitir que las microesferas unidas a anticuerpo fluyan fácilmente a través de la membrana tras la adición de la muestra.

Además de tratar las membranas, también pueden tratarse previamente las propias microesferas con tensioactivos, bloqueantes sintéticos o a base de proteínas. Si se realiza correctamente, esto puede ayudar a reducir el problema de la movilidad del reactivo tras la introducción de la muestra. Se ha realizado mucho trabajo para desarrollar mezclas óptimas de estos diversos polímeros, detergentes y bloqueantes.

Aunque puede usarse cualquier partícula de látex en la presente invención, las partículas de látex están normalmente formadas a partir de poliestireno, butadieno-estirenos, terpolímero de estireno-compuesto acrílico- vinilo, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), copolímero de estireno-anhídrido maleico, poli(acetato de vinilo), polivinilpiridina, polidivinilbenceno, poli(tereftalato de butileno), acrilonitrilo, cloruro de vinilo-acrilatos, y similares, o un derivado de aldehído, carboxilo, amino, hidroxilo o hidrazida de los mismos.

En una realización particular de la invención, el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti- ASFV, el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV y/o el reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control está(n) hidratado(s) o en forma seca. En una realización particular, dichos reactivos detectores se reconstituyen en contacto con la muestra de prueba y/o en contacto con una disolución tampón.

En una realización particular preferida de la invención, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende:

(i) un primer conjunto de partículas, coloreadas con un primer color, deshidratadas o en forma seca y susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba y/o una disolución tampón, en la que dichas primeras partículas están unidas a, recubiertas totalmente por o recubiertas parcialmente por, el antígeno, o fragmento del mismo, del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV,

(ii) un segundo conjunto de partículas, coloreadas con un segundo color, igual o diferente de dicho primer color, deshidratadas o en forma seca y susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba y/o una disolución tampón, en la que dichas segundas partículas están unidas a, recubiertas totalmente por o recubiertas parcialmente por, el antígeno, o fragmento del mismo, del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV, y

(iii) un tercer conjunto de partículas, coloreadas con un tercer color, igual o diferente de dichos colores primero y/o segundo, opcionalmente deshidratadas o en forma seca y susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba, y/o una disolución tampón, en la que dichas terceras partículas están unidas a, recubiertas totalmente por o recubiertas parcialmente por, un reactivo de control del reactivo detector.

En una realización particular, el primer conjunto de partículas del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, están coloreadas con un primer color, el segundo conjunto de partículas del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, están coloreadas con un segundo color, y el tercer conjunto de partículas del reactivo detector que se une específicamente a un reactivo detector de control, están coloreadas con un tercer color, en las que dichos colores primero, segundo y tercero son colores diferentes unos de otros. En una realización particular, dichas partículas se seleccionan del grupo que comprende microesferas y nanoesferas. En una realización más particular, dichas partículas se seleccionan del grupo que comprende microesferas de látex, nanoesferas de látex, microesferas de oro coloidal y nanoesferas de oro coloidal.

2.4 Almohadilla de detección de señal (3)

Un tercer elemento de la tira inmunocromatográfica según la invención es la almohadilla de detección de señal (3). En una realización particular, la almohadilla de detección de señal (3) está ubicada tras la almohadilla de conjugado

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(2). En una realización particular, la almohadilla de detección de señal (3) está acoplada a la almohadilla de conjugado (2). En una realización alternativa, tal como se muestra en la figura 1, la almohadilla de detección de señal (3) solapa parcialmente la almohadilla de conjugado (2).

En una realización, la almohadilla de detección de señal (3) de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende una zona de detección de señal. En una realización particular preferida, la almohadilla de detección de señal (3) de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende tanto una zona de detección de señal como una zona de control. En una realización más particular, la almohadilla de detección de señal (3) de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende al menos una zona de detección de señal, en la que dicha zona de detección de señal se selecciona del grupo que consiste en:

- una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia de un anticuerpo anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección de señal comprende al menos un reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV, y

- una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia de un anticuerpo anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección de señal comprende al menos un reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV.

En una realización particular preferida, la almohadilla de detección de señal (3) de la tira inmunocromatográfica según la presente invención comprende tanto una zona de detección de señal anti-ASFV como una zona de detección de señal anti-CSFV. En una realización más preferida, la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica según la presente invención comprende una detección de señal anti-ASFV, una zona de detección de señal anti-CSFV y una zona de control.

Adicionalmente, la almohadilla de detección de señal (3) de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende una zona de control (7), en la que dicha zona de control (7) comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en la muestra.

La almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica de la invención está constituida por una membrana, en la que dicha membrana comprende la(s) zona(s) de detección de señal (5, 6) y la zona de control (7) tal como se describió anteriormente.

Como reconoce el experto, las propiedades físicas y químicas de la membrana afectan a sus propiedades de flujo capilar. Las propiedades de flujo capilar afectan a su vez al depósito de reactivo, sensibilidad del ensayo, especificidad del ensayo y sistematicidad de la(s) línea(s) de prueba. En cambio, otras propiedades físicas de la membrana afectan a la integración en tiras reactivas acabadas.

Para tiras reactivas de flujo lateral, la membrana debe unirse de manera irreversible a reactivos de captura en la o las líneas de prueba y las líneas de control. El polímero a partir del cual se fabrica la membrana determina la mayor parte de sus características de unión. Si la membrana experimenta un proceso secundario que altera químicamente el polímero o lo entierra bajo un segundo polímero, las propiedades de unión a proteínas pueden verse drásticamente alteradas. Los polímeros típicos incluyen, sin limitación, nitrocelulosa (caracterizada por un mecanismo de unión primario electrostático), poli(fluoruro de vinilideno) (caracterizado por un mecanismo de unión primario hidrófobo), nailon tal como nailon con modificación de carga (caracterizado por un mecanismo de unión primario iónico/electrostático) y polietersulfona (caracterizada por un mecanismo de unión primario hidrófobo).

La capacidad de unión a proteínas de una membrana está determinada por la cantidad de área superficial de polímero disponible para la inmovilización. El área superficial de una membrana está determinada por el tamaño de poro, la porosidad (cantidad de aire en la estructura tridimensional), el grosor y, en menor medida, características estructurales únicas para el polímero. Si todos los demás parámetros son iguales, el área superficial disminuye de manera no lineal con el tamaño de poro, aumenta de manera lineal con el grosor y aumenta de manera no lineal con la porosidad.

El área superficial interna de estructuras porosas se notifica normalmente como m2/g de polímero. Para membranas, es relativamente fácil determinar el peso base en gramos/m2. Multiplicando el área superficial interna por el peso base se obtiene como resultado la razón de área superficial, expresada como m2 de área superficial interna/m2 de área frontal. Para membranas con tamaños de poro muy pequeños (de aproximadamente 0,1 pm), esta razón puede superar 2.000. En una realización particular, las membranas usadas en aplicaciones inmunocromatográficas tienen razones de área superficial en el intervalo de 50 a 200.

La capacidad de carga de una proteína sobre un área superficial dada depende de la compacidad de la estructura de la proteína y su radio de Stokes (diámetro efectivo). Para IgG, la capacidad de carga aproximada es de 1 Cg/cm2

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Multiplicando la capacidad de carga de IgG (1 pg/cm2) por la razón de área superficial de la membrana (50 - 200) se produce una capacidad de unión a IgG aproximada de 50 - 200 pg/cm2. En una tira reactiva inmunocromatográfica típica, la línea de prueba tiene 1 mm de anchura. Si la tira tiene 1 cm de anchura, la cantidad de reactivo de captura que puede unirse es de 5 - 20 pg (0,1 cm de anchura x 1 cm de longitud = 0,1 cm2). Esto es 10 - 100 veces superior a lo requerido para la mayoría de los ensayos. Por tanto, normalmente la capacidad de unión a proteínas no es un problema en el diseño de la prueba.

En una realización particular, la membrana de la almohadilla de detección de señal (3) es una membrana de nitrocelulosa. Las membranas de nitrocelulosa se unen a proteínas electrostáticamente mediante interacción del dipolo fuerte del éster de nitrato con el dipolo fuerte de los enlaces peptídicos de la proteína. Las membranas de nitrocelulosa son completamente neutras sin protones ácidos. Aunque su capacidad para adsorber proteínas es independiente del pH de la disolución de inmovilización, el pH puede afectar a la eficacia de inmovilización de una proteína particular alterando sus propiedades en disolución. Cuando se aplican reactivos de captura a membranas de nitrocelulosa, deben omitirse agentes caotrópicos tales como Tween® 20 y Tritón™ X-100 o usarse a concentraciones <0,01 % v/v. Estos compuestos pueden interferir físicamente con el contacto molecular entre la proteína y la nitrocelulosa. Si se requieren reactivos caotrópicos para prevenir interacciones no específicas o reducir el fondo, deben colocarse en la almohadilla de muestra.

La velocidad de flujo capilar es la velocidad a la cual se mueve un frente de muestra a lo largo de una tira de membrana cuando se introduce líquido en un extremo. Los parámetros que afectan a la velocidad de flujo capilar de una membrana son el tamaño de poro, la distribución de tamaño de poro, la porosidad.

2.5 Reactivos de captura de la almohadilla de detección de señal

Se inmovilizan reactivos de captura sobre la membrana de la almohadilla de detección de señal. El reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-ASFV se inmoviliza sobre una primera zona de detección de señal de la almohadilla de detección de señal y el reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-CSFV se inmoviliza sobre una segunda zona de detección de señal de la almohadilla de detección de señal, en la que dichas zonas de detección de señal primera y segunda son zonas de detección de señal diferentes, separadas. En una realización particular, la zona de detección de señal en la que se inmoviliza el reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-ASFV está ubicada más cerca de la almohadilla de conjugado que la zona de detección de señal en la que se inmoviliza el reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-CSFV. En una realización alternativa, la zona de detección de señal en la que se inmoviliza el reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-CSFV está ubicada más cerca de la almohadilla de conjugado que la zona de detección de señal en la que se inmoviliza el reactivo de captura que se une a un anticuerpo anti-ASFV.

En una realización particular, el reactivo de captura ubicado en la zona de detección de señal anti-ASFV y que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende la proteína VP72 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-ASFV.

En otra realización particular, el reactivo de captura ubicado en la zona de detección de señal anti-CSFV y que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV comprende la proteína E2 o un fragmento de la misma que puede unirse a dicho anticuerpo anti-CSFV.

En una realización particular, el reactivo de captura de control ubicado en la zona de control y que se une específicamente a un reactivo de control se selecciona del grupo que comprende una proteína, o un anticuerpo que se une específicamente a dicho reactivo de control. En una realización particular de la invención, el reactivo de captura que se une específicamente al anticuerpo anti-ASFV, el reactivo de captura que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV y el reactivo de captura que se une específicamente a un reactivo de control están deshidratados o en forma seca. En una realización particular, dichos reactivos de captura se reconstituyen en contacto con la muestra de prueba y/o en contacto con una disolución tampón.

Los tampones usados para la dilución de los reactivos de captura tienen que optimizarse para que la adsorción de proteína no se vea comprometida, se conserve la reactividad del reactivo y no se alteren las propiedades de flujo de la membrana.

Las disoluciones de reactivo de captura siempre deben tamponarse para alcanzar sistematicidad de la fabricación y rendimiento de la tira reactiva. Los tampones que pueden usarse para controlar el pH de disoluciones de reactivo de captura incluyen, sin limitación, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina tamponada con borato (BBS), solución salina tamponada con Tris y tampón carbonato. Cuando se selecciona el tampón apropiado, debe tenerse en cuenta que el reactivo de captura se seca sobre la membrana en presencia de las sales tampón. Pueden surgir problemas por interacciones químicas durante la evaporación, cuando la concentración de estas sales se vuelve temporalmente muy alta. Por ejemplo, si la disolución de reactivo se tampona con una amina primaria tal como TRIS o glicina, pueden producirse puentes de sales entre residuos ácidos de aminoácido (ácido glutámico y ácido aspártico) en el reactivo de captura y el grupo-NH3+ de la molécula de tampón, reduciendo la capacidad del reactivo de captura para unirse al analito. El sodio es un catión mejor que el potasio por el mismo motivo. Para

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reactivos de captura que pueden tratarse a un intervalo de pH de 4 a 6, puede usarse acetato de amonio.

Con respecto al pH del tampón del reactivo de captura, debe seleccionarse de manera apropiada con el fin de minimizar la solubilidad de proteínas y mantener una disolución estable, lo cual se logra habitualmente ajustando el pH a ±1 unidad del pI del reactivo de captura.

La concentración iónica del tampón del reactivo de captura debe reducirse lo más posible. Los iones en disolución pueden interferir con interacciones electrostáticas entre la membrana y los reactivos de captura. Además, las concentraciones fisiológicas de sales tampón y cloruro de sodio fomentan la solubilidad de la mayoría del as proteínas y reducen la atracción hidrófoba de la membrana de nitrocelulosa. Finalmente, a medida que aumenta la molaridad de la disolución del reactivo de captura, también aumenta la cantidad de residuo sólido que queda sobre la membrana tras la evaporación. El residuo sólido en los poros puede retrasar la humectación de la membrana y alterar sus propiedades de flujo cuando se realiza la prueba. Por tanto, debe reducirse la molaridad del tampón al mínimo requerido para mantener un pH estable (habitualmente <10 mM). Debe eliminarse el cloruro de sodio a menos que se requiera absolutamente para la estabilidad o solubilidad de proteínas.

La adición de una pequeña cantidad de alcohol (del 1 % al 10 % v/v de metanol, etanol o isopropanol) a la disolución de aplicación de reactivo puede ser extremadamente beneficiosa por tres motivos distintos. En primer lugar, el alcohol puede mejorar drásticamente la sistematicidad de la aplicación de reactivo reduciendo la viscosidad de la disolución, reduciendo la tensión superficial de la disolución (ambas de las cuales fomentan la entrada de la disolución en la membrana), y disminuyendo la repulsión estática. En segundo lugar, la adición de una pequeña cantidad de alcohol disminuye la solubilidad de proteínas sin provocar una desnaturalización o precipitación. También fomenta la adsorción de la proteína sobre la membrana de nitrocelulosa. En tercer lugar, la presencia incluso de una concentración baja de alcohol potencia el secado y la fijación de proteínas. Los beneficios de añadir alcohol debe determinarlos empíricamente el experto.

Ocasionalmente, la adición de una disolución de reactivo de captura desplaza al tensioactivo presente en la membrana, provocando que la línea de reactivo se humedezca más lentamente que las áreas adyacentes de membrana no tratada. Cuando esto sucede, el frente de flujo se deforma. En casos extremos, el frente de flujo se envuelve alrededor de la línea de reactivo de captura, atrapando aire (especialmente cuando la membrana está intercalada entre dos capas de plástico no poroso) y evitando el flujo sobre la línea. Para evitar esto, algunas veces resulta eficaz añadir una pequeña cantidad de detergente (por ejemplo, el 0,05 % de SDS o el 0,005 % de Triton™ X-100) para fomentar la rehumectación de la línea.

2.6 Almohadilla absorbente (4)

Un cuarto elemento de la tira inmunocromatográfica según la invención es la almohadilla absorbente (4). En una realización particular, la almohadilla absorbente (4) está ubicada tras la almohadilla de detección de señal (3). En una realización más particular la almohadilla absorbente (4) está acoplada a la almohadilla de detección de señal

(3). En una realización particular preferida, tal como se muestra en la figura 1, la almohadilla absorbente (4) solapa parcialmente la almohadilla de detección de señal (3).

La almohadilla absorbente se coloca normalmente en el extremo distal de la tira reactiva. La función principal de la almohadilla absorbente es aumentar el volumen total de muestra que entra en la tira reactiva. Este volumen potenciado puede usarse para eliminar mediante lavado partículas de detector no unidas de la(s) zona(s) de detección de señal (línea(s) de prueba) y zona de control (línea de control), reduciendo así el fondo y potenciando la sensibilidad del ensayo. Dado que el volumen de muestra que contribuye en última instancia a la señal se controla por el volumen requerido para solubilizar las partículas de detector, y no por el volumen total de muestra que entra en el dispositivo, la adición de la almohadilla absorbente puede no tener un impacto drástico sobre la sensibilidad global del ensayo.

La mayor parte de las almohadillas absorbentes se fabrican de filtros de celulosa. El material debe seleccionarse basándose en el grosor, la compresibilidad, la facilidad de fabricación, y, principalmente, la uniformidad del volumen de lecho. Una vez elegido el material absorbente, la optimización de la captación de volumen global para la tira reactiva se gestiona mejor cambiando las dimensiones (habitualmente la longitud) de la almohadilla absorbente.

2.7 Elementos adicionales/opcionales de la tira inmunocromatográfica de la invención

Los componentes adicionales, opcionales, de la tira inmunocromatográfica de la invención incluyen una tarjeta de soporte (9) (tal como una tarjeta de soporte de plástico o una tarjeta de soporte de plástico-adhesivo), un protector adhesivo (8), una cinta de cubierta (tal como una cinta de cubierta laminada) y una casete de alojamiento de tira.

Debido a la naturaleza delicada de los materiales usados en un ensayo de tira inmunocromatográfica así como a la necesidad de mantener un contacto preciso, directo, entre componentes para garantizar un flujo de muestra y reactivo apropiado, una tarjeta de soporte de algún tipo resulta adecuada. Habitualmente se fabrican tratando previamente con adhesivo sensible a la presión para su estabilidad en el ensayo y para garantizar que no lixivia

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productos químicos que pueden interferir con los resultados. Una preocupación relacionada es que el adhesivo sea lo bastante fuerte para unir apropiadamente los materiales a la tarjeta pero también que no fluya demasiado lejos al interior de los mismos e inhiba la acción capilar reduciendo el volumen de lecho disponible. La tarjeta adhesiva se cubre inicialmente con un revestimiento que puede ranurarse previamente para un ensamblaje más fácil de componentes de prueba. Los materiales adecuados incluyen, sin limitación, poliestireno, vinilo, poliéster (transparente u opaco) y Mylar.

La cinta de cubierta laminada es una cinta adhesiva que actúa como barrera protectora y evita la evaporación de reactivos y ayuda a limitar el flujo inverso de reactivos. Cuando se usan algunos materiales particularmente delicados una cinta de cubierta es esencial para mantener la integridad de la prueba. La cinta puede tener cualquiera de varios diseños impresos sobre la misma, tales como identificación de la prueba o nombres comerciales. Por motivos obvios, la cinta de cubierta debe ser transparente sobre las secciones de línea de prueba y de control del ensayo de tira inmunocromatográfica. Debe lograrse un equilibrio fino entre resistencia adhesiva y migración de los adhesivos para evitar interferencias con el ensayo y pérdida de volumen de lecho.

Un alojamiento de plástico se fabrica normalmente de dos piezas que se encajan entre sí y protegen el conjunto. La tira reactiva y almohadilla absorbente están contenidas dentro de este alojamiento que permite manipular la unidad más fácilmente y protege la tira frente a daño y contaminación por el entorno. Una ventana en el lado del alojamiento permite visualizar las partes de zona de prueba y de control de la tira. En algunos casos es poco más que un orificio en una mitad de la carcasa pero también puede ser una ventana de plástico transparente que protege la membrana frente a dañarse accidentalmente o salpicarse al tiempo que todavía permite la visualización de la tira.

Adicionalmente, las tiras inmunocromatográficas de la invención pueden almacenarse y/o sellarse en recipientes adecuados incluyendo, sin limitación, bolsas de aluminio, bolsas de plástico y recipientes adecuados conocidos por el experto.

La tira inmunocromatográfica de la invención puede usarse para detectar anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en una muestra, o para diagnosticar una infección provocada por ASFV y/o por CSFV, o para distinguir entre ASFV y CSFV como agente causante de una infección en un sujeto.

3. Kits de la invención y usos de los mismos

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un kit (denominado “kit de la invención” a continuación en el presente documento) que comprende al menos una tira inmunocromatográfica según la invención, que se ha descrito anteriormente.

En la presente invención, un “kit” se entiende como un producto que comprende diferentes reactivos y materiales para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en una muestra de un sujeto. Dicho kit comprende al menos una tira inmunocromatográfica según la invención, que se ha descrito anteriormente.

En una realización particular, la tira inmunocromatográfica del kit está en un formato simple, es decir, que comprende una única tira. En una realización particular alternativa, la tira inmunocromatográfica del kit está en un formato múltiple, es decir, la tira está en un formato de 2 tiras, un formato de 3 tiras, un formato de 4 tiras, un formato de 5 tiras, un formato de 6 tiras, un formato de 7 tiras, un formato de 8 tiras e incluso más. Dicho formato de 2 tiras, formato de 3 tiras, formato de 4 tiras, formato de 5 tiras, formato de 6 tiras, formato de 7 tiras, formato de 8 y formato de 12 tiras es adecuado para sumergir dicho formato de tiras en una placa, tal como una placa de 6 pocillos, placa de 24 pocillos o placa de 96 pocillos. Preferentemente, la tiras inmunocromatográfica del kit está en un formato de 8 tiras, adecuado para sumergir dicho formato de 8 tiras en una placa de 96 pocillos.

Otro componente que puede estar presente en el kit es un envase que permite mantener la tira o tiras inmunocromatográficas apropiadamente almacenadas. Los materiales adecuados para preparar tales envases incluyen vidrio, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, pipetas, papel, sobres y similares. El kit de la invención puede contener adicionalmente instrucciones para usar la tira o tiras inmunocromatográficas de la invención y/o instrucciones para usar agentes adicionales necesarios para revelar una inmunocromatografía de flujo lateral por medio de dicha tira o tiras inmunocromatográficas de la invención. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de tal manera que puede leerlas un sujeto, tal como medios de almacenamiento electrónicos (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Los medios pueden contener adicional o alternativamente sitios web de Internet que proporcionan dichas instrucciones.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso del kit de la invención tal como se describió anteriormente para detectar anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV, por ejemplo, en una muestra de un sujeto; o para diagnosticar una infección provocada por ASFV y/o por CSFV, o para distinguir entre ASFV y CSFV como agente causante de una infección en un sujeto. En una realización particular, el uso del kit de la invención para detectar anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV, o para diagnosticar una infección provocada por ASFV y/o por

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CSFV, o para distinguir entre ASFV y CSFV como agente causante de una infección en un sujeto se realiza mediante un inmunoensayo basado en cromatografía de flujo lateral.

4. Métodos de inmunoensayo de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inmunoensayo (denominado “método de inmunoensayo de la invención” a continuación en el presente documento) para detectar la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en un sujeto, realizándose dicho método de inmunoensayo por medio de una tira inmunocromatográfica de la invención, comprendiendo dicho método

(i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

(ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, y

(iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y/o la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto.

Por tanto, en una primera etapa, el método de la invención comprende poner en contacto una muestra de un sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica de la invención, descrita anteriormente.

En una realización particular, el sujeto es un mamífero, particularmente un suido, en el que debe determinarse la presencia o ausencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV, indicativa de una infección por ASFV o CSFV, respectivamente. Las muestras según la invención se han descrito anteriormente. En una realización particular, la muestra de un sujeto que va a analizarse mediante el método de inmunoensayo de la invención se selecciona del grupo que comprende sangre completa, suero, plasma, jugos de carne y saliva. En una realización particular, el sujeto está vivo. En una realización alternativa particular, el sujeto está muerto.

El volumen de la muestra de un sujeto que se pone en contacto con la almohadilla de muestra de la tira, como entiende el experto, debe permitir la formación de complejos entre los anticuerpos anti-ASFV y/o los anticuerpos anti-CSFV, cuando están presentes en la muestra, y el reactivo detector de la tira en una cantidad suficiente como para capturarse mediante los reactivos de captura correspondientes y detectarse. Un volumen de muestra a modo de ejemplo está comprendido entre 5 y 100 pl.

Como entiende el experto, la muestra que va a analizarse puede ponerse en contacto con la almohadilla de muestra de la tira mediante goteo de dicha muestra sobre la almohadilla de muestra o sumergiendo la almohadilla de muestra de la tira en un recipiente que comprende una muestra, en el que dicho recipiente se selecciona del grupo que comprende tubos de ensayo, placas de cultivo, viales y cualquier otro recipiente de muestra conocido por el experto.

En una segunda etapa, el método de inmunoensayo de la invención comprende incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti- CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal. Las condiciones adecuadas para la formación de los complejos entre los anticuerpos y las regiones de detector correspondientes, y para la posterior formación de complejos con una región de captura, incluyen condiciones adecuadas de temperatura, humedad, etc., que pueden determinarse de manera rutinaria por el experto.

En una tercera etapa, el método de inmunoensayo de la invención comprende detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti- CSFV.

Tal como se describió anteriormente, la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica de la invención comprende una zona de detección de señal, que comprende al menos un reactivo de captura que se une

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específicamente a un anticuerpo anti-ASFV y/o al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, y una zona de control, que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control.

Si la muestra que está analizándose comprende anticuerpos anti-ASFV, se forma un complejo entre dichos anticuerpos anti-ASFV y el reactivo detector que se une específicamente a anticuerpos anti-ASFV, y dicho complejo migra a lo largo de la membrana hasta que alcanza la zona de detección de señal anti-ASFV, en la que el reactivo de captura que se une a anticuerpos anti-ASFV se une a, y retiene, el complejo. Por tanto, se visualiza o se detecta este complejo ya que, tal como se describió anteriormente, el reactivo detector del complejo puede detectarse visualmente o mediante un dispositivo instrumental. Por tanto, la detección de un complejo entre el anticuerpo anti- ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en un sujeto. De manera similar, la detección de un complejo entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de infección por ASFV en un sujeto.

De manera similar, si la muestra que está analizándose comprende anticuerpos anti-CSFV, se forma un complejo entre dichos anticuerpos anti-CSFV y el reactivo detector que se une específicamente a anticuerpos anti-CSFV, y dicho complejo migra a lo largo de la membrana hasta que alcanza la zona de detección de señal anti-CSFV, en la que el reactivo de captura que se une a anticuerpos anti-CSFV se une a, y retiene, el complejo. Este complejo también se visualiza y se detecta ya que, tal como se describió anteriormente, el reactivo detector del complejo comprende una sonda que puede detectarse visualmente o mediante un dispositivo instrumental. Por tanto, la detección de un complejo entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en un sujeto. De manera similar, la detección de un complejo entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de infección por CSFV en un sujeto.

En una realización particular preferida, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende un reactivo de control, un reactivo detector de control que se une específicamente a dicho reactivo de control, y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho reactivo de control. Si la inmunocromatografía se revela apropiadamente, es decir, el frente de muestra fluye a lo largo de la tira (de modo que los analitos de la muestra fluyen a través de la almohadilla de conjugado, los complejos de dichos analitos y sus reactivos detectores correspondientes fluyen a través de la almohadilla de detección hasta que alcanzan la zona de detección de señal de dicha almohadilla de detección y se retienen por sus reactivos de captura correspondientes), entonces el reactivo de control también fluye con el frente de migración y un complejo de dicho reactivo de control y el reactivo detector de control fluye a través de la almohadilla de conjugado, el complejo del reactivo de control y el reactivo detector de control fluye a través de la almohadilla de detección de señal hasta alcanzar la zona de control de detección de la almohadilla de detección, estando ubicada dicha zona de control de detección después de la zona de detección de señal. Durante una prueba mediante el método de la invención, si no se detecta ninguna señal en la zona de control de dicha tira, debe realizarse una nueva prueba siguiendo el método de la invención por medio de una nueva tira. En una realización alternativa, la tira inmunocromatográfica de la invención comprende un reactivo de control y un reactivo de captura, en la que dicho reactivo de control comprende una etiqueta, particularmente en la que dicho reactivo de control comprende partículas coloreadas a las que está unido el reactivo de control, o alternativamente, que el reactivo de control recubre total o parcialmente.

En una realización particular, el intervalo de tiempo entre las etapas (i) y (iii) del método de la invención es de desde 2 hasta 45 minutos, preferentemente desde 5 hasta 30 minutos, más preferentemente desde 5 hasta 20 minutos, incluso más preferentemente de aproximadamente 10 minutos.

Según el método de inmunoensayo de la invención, la detección de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV en la zona de detección anti-ASFV de la tira es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto. Adicional o alternativamente, la detección de complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV en la zona de detección anti-CSFV de la tira es indicativa de la presencia de anticuerpos anti- CSFV en dicho sujeto.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inmunoensayo para distinguir entre el agente causante de una infección en un sujeto, en el que dicho agente causante se selecciona del grupo que consiste en ASFV, CSFV y combinaciones de los mismos, realizándose dicho método de inmunoensayo por medio de la tira inmunocromatográfica anteriormente mencionada proporcionada por la invención, comprendiendo dicho método

(i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

(ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección

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de señal de la tira inmunocromatográfica, y

(iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-ASFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es ASFV; y/o

en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-CSFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es CSFV.

Los datos particulares y las condiciones para realizar este método de inmunoensayo son los mismos que los del método de inmunoensayo de la invención que se incorporan en el presente documento.

Según este método de inmunoensayo de la invención, la detección de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV en la zona de detección anti-ASFV de la tira es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y, por consiguiente, la presencia de dichos anticuerpos anti-ASFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es ASFV.

Adicional o alternativamente, la detección de complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV en la zona de detección anti-CSFV de la tira es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto, y, por consiguiente, la presencia de dichos anticuerpos anti- CSFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es CSFV.

En una realización particular, el agente causante es ASFV. En otra realización particular, el agente causante es CSFV. En otra realización particular, el agente causante puede ser ASFV y CSFV.

La invención se detalla a continuación por medio de los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y de ninguna manera limitativos del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Prueba basada en inmunocromatografía para detectar la presencia de anticuerpos anti-ASFV o anti-CSFV en específicos una muestra

Los inventores de la presente invención han desarrollado una prueba basada en inmunocromatografía que puede detectar la presencia en una muestra de un sujeto de anticuerpos anti-ASFV y/o anti-CSFV específicos.

La prueba comprende el uso de tres tipos de microesferas: microesferas azules que están covalentemente unidas a proteína E2 de CSFV, microesferas rojas que están covalentemente unidas a proteína VP72 de ASFV, y microesferas verdes que están unidas a un reactivo de control y se usan como control de prueba.

Sobre la membrana, se imprimen dos líneas de prueba: T1 formada por la proteína E2 de CSFV y T2 formada por la proteína VP72 de ASFV. Además, la prueba contiene una línea de control formada por un anticuerpo monoclonal (AcM) específico para el reactivo de control (biotina).

Los anticuerpos presentes en la muestra reaccionan con las partículas de látex que están recubiertas con proteínas diana específicas. Este complejo fluye a través de la membrana. Dependiendo del tipo de anticuerpo presente en la muestra, aparecen diferentes líneas coloreadas. Estas líneas se usarán para interpretar los resultados de la prueba. La interpretación de los resultados debe realizarse de la siguiente manera 10 minutos tras la adición de la muestra.

Si aparecen tanto una línea verde como una segunda línea rosa/roja en el área de resultado, significa un resultado positivo para ASFV. La intensidad del color puede variar dependiendo de la concentración de anticuerpo.

Si aparecen tanto una línea verde como una segunda línea azul en el área de resultado, significa un resultado positivo para CSFV. La intensidad del color puede variar dependiendo de la concentración de anticuerpo.

Si aparece una única línea verde en el área de resultado, significa un resultado negativo. La línea de control, en este caso la línea verde, siempre debe aparecer.

Si no aparece ninguna línea verde, la prueba se considera inválida y debe repetirse usando un nuevo dispositivo. Adicionalmente, no debe considerarse ningún resultado después de 10 minutos.

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En la figura 1 se muestra un esquema de la tira cromatográfica según la invención.

1.1 Materiales y métodos Reactivos de captura

Se usaron la proteína E2 de CSFV y la proteína VP72 de ASFV como reactivos de captura de las líneas de prueba T1 y T2, respectivamente. Se diluyó la proteína VP72 a 50 Dg/ml en tampón Tris/HCI 20 mM a pH 7,5 que contenía sacarosa al 5 % y azida de sodio al 0,095 % como conservante. Se diluyó la proteína E2 a 150 pg/ml en el mismo tampón. Se usó el anticuerpo monoclonal IgG anti-biotina como reactivo de captura de la línea de control. Se diluyó a 1 mg/ml en el mismo tampón usado para las líneas de prueba. El objetivo de la línea de control era confirmar el éxito de la prueba.

Se dispensaron los reactivos de captura de prueba y de control en tres líneas paralelas sobre membrana de nitrocelulosa de 25 x 300 mm HiFlow Plus (HF120, Millipore) a 1 pl/cm. Tras secar durante 5 minutos a 45 °C, se sellaron las membranas y se almacenaron a temperatura ambiente en condiciones secas.

Preparación de micropartícula de látex conjugada

Los reactivos detectores consistieron en microesferas de látex modificadas con carboxilo, coloreadas, de 300 nm (PolymerLabs). La proteína VP72 se conjugó covalentemente a partículas de látex rojas mientras que la proteína E2 se unió a partículas de látex azules. Finalmente, para el control se usaron partículas verdes de látex para unirse a biotina. Las proteínas se conjugaron de la siguiente manera.

Se diluyeron 10 veces las partículas (al 10 % de sólidos) en tampón de acoplamiento (MES 10 mM pH 6,0) y se centrifugaron durante 15 minutos a 12.000 rpm. Volvió a suspenderse el sedimento en tampón MES hasta el 0,5 % de sólidos. Para activar la superficie, se añadieron simultáneamente EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropiljcarbodiimida) 1 mM y NHS (N-hidroxisuccinimida) 1 mM al látex y se incubaron durante 45 °C a temperatura ambiente con mezclado continuo. Se centrifugaron las microesferas activadas y volvieron a suspenderse de nuevo en tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) al 1 % de sólidos. Se diluyeron las proteínas en tampón de acoplamiento a 0,5 mg/m2 y se añadió el látex activado. Se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 2 horas con mezclado constante. Para inactivar la superficie se añadió imidazol 500 mM y se incubó durante 15 minutos. Finalmente, se lavaron las microesferas conjugadas con Tween® 20 al 0,1 % durante 30 minutos. Después de esto, se centrifugaron las partículas de látex (15 minutos a 12.000 rpm), se desechó el sobrenadante y volvió a suspenderse el sedimento en Tris/HCl 10 mM pH 8,2. Se obtuvieron los tres conjugados siguiendo el mismo procedimiento. Se almacenaron las disoluciones de microesferas a 4 °C antes de su uso.

Preparación de la almohadilla de conjugado

Para preparar la disolución de conjugado, se diluyeron el VP72-látex, E2-látex y biotina-látex anteriormente preparados hasta el 0,2 %, el 0,2 % y el 0,15 %, respectivamente, en un tampón Tris/HCl 25 mM pH 9,5 que contenía sacarosa al 35 %, Tween 20 al 1 %, caseína al 1,5 %, BSA (albúmina sérica bovina) al 3 % y azida de sodio al 0,095 %. Se dispensó la mezcla a la almohadilla de conjugado de rayón (M1546, 10 x 300 mm, Ahlstrom) a 9 pl/cm. Se secaron las almohadillas durante 30 minutos a 45 °C y se almacenaron a temperatura ambiente en condiciones secas.

Preparación de tiras inmunocromatográficas

Se ensambló una tarjeta maestra de la siguiente manera: sobre un soporte de plástico con adhesivo (76 x 300 mm) se pegaron membrana de nitrocelulosa (25 x 300 mm), almohadilla de conjugado (10 x 300 mm), almohadilla de muestra (Cytosep 1662, 25 x 300 mm) y almohadilla absorbente (papel de calidad 237, 29,5 x 300 mm) y se cubrieron con una película protectora (65 x 300 mm). Se cortó la tarjeta maestra en tiras de 4,2 nm de anchura. Entonces se colocaron las tiras en un alojamiento de plástico y se sellaron en una bolsa de aluminio en presencia de gel desecante y se almacenaron a temperatura ambiente.

Procedimiento de prueba

Se añadieron 10 pl de la muestra de suero (plasma, sangre completa) sobre la almohadilla de muestra y se aplicaron 3-4 gotas de tampón de corrida (Tris/HCl pH 7,5, NaCl, caseína y NaN3 al 0,09 % como conservante).

1.2 Resultados

Se han evaluado diferentes parámetros para determinar la precisión del ensayo. Es importante indicar que la presente prueba es un ensayo cualitativo, que da como resultado una decisión positiva o negativa.

Se ha evaluado la sensibilidad analítica usando anticuerpos monoclonales específicos para las proteínas diana

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usadas en la prueba (VP72-ASFV y E2-CSFV). Se usó un anticuerpo monoclonal anti-ASFV específico (AcM) (18BG3, Vidal MI & Oliva AG 1997 Sensors and Actuators B 38-39: 448-451) para determinar la sensibilidad para la línea de prueba de ASFV y se usó un anticuerpo monoclonal anti-CSFV específico Ac (18.4) para la línea de prueba de CSFV. Se usó una mezcla de ambos anticuerpos diluidos en el tampón de corrida, a concentraciones decrecientes. Se trató cada dilución como una muestra independiente. Tal como se muestra en la tabla 1, la cantidad mínima de AcM anti-ASFV que puede detectarse mediante la prueba fue de aproximadamente 8 ng/ml o 0,96 ng por prueba, teniendo en cuenta que el volumen añadido para llevar a cabo la prueba fue de 120 pl. Con respecto a la línea de prueba de CSFV, la cantidad mínima de anticuerpo específico detectada fue de 125 ng/ml (15 ng/prueba).

Tabla 1

Sensibilidad analítica para la prueba en dúplex usando anticuerpos monoclonales específicos (Acm)

[Acm] (pg/ml)

1,000

0,500 0,250 0,125 0,063 0,031 0,016 0,008

Línea de prueba de ASFV

positivo positivo positivo positivo positivo positivo positivo débil positivo débil

Línea de prueba de CSFV

positivo positivo positivo positivo positivo débil dudoso negativo negativo

Con el fin de determinar la sensibilidad de diagnóstico, se han evaluado dos paneles de sueros. Por un lado, se usaron 21 muestras de suero de infecciones experimentales por ASFV para determinar la especificidad para la prueba de ASFV, y por otro lado, se usaron 22 muestras de suero de infecciones experimentales por CSFV para determinar la sensibilidad de la línea de CSFV. Todas las muestras de suero usadas fueron de origen porcino. El primer panel de sueros consistió en 14 sueros positivos (2 muestras notificadas como positivos débiles) y 7 negativos para ASFV. Se determinó la positividad de estas muestras usando el ensayo ELISA de competición comercial 11.PPA.K3 (Ingezim PP Compac) como prueba de referencia. 11 de los 14 sueros positivos fueron positivos para la línea de ASFV, y 3 de ellos mostraron un resultado positivo débil. Las 7 muestras de suero que fueron negativas con la prueba de referencia también se notificó que eran negativas con la prueba de ASFV. Ninguna de las 21 muestras de suero presentó un resultado positivo para la línea de prueba de CSFV. Con respecto al segundo panel de sueros usados en la evaluación de la tira inmunocromatográfica de la invención (identificada por los inventores como “dispositivo de flujo lateral en dúplex” o simplemente “LFD en dúplex”), se sometieron a ensayo los 22 sueros con una prueba de ELISA de referencia y todos mostraron un resultado positivo. 20 de los 22 sueros mostraron un resultado positivo para la línea de prueba de CSFV, mientras que 2 de ellos mostraron un resultado positivo débil. No se observó ningún resultado positivo para la línea de prueba de ASFV. Los resultados de la evaluación de estas muestras de suero con la tira inmunocromatográfica de la invención (prueba de LFD en dúplex) se muestran en las tablas 2 y 3 (2A, 2B).

Tabla 2

Resultados cualitativos de la evaluación de la prueba de LFD en dúplex con muestras de infecciones __________________________experimentales por ASFV__________________________

ID de muestra

Prueba de referencia Línea de ASFV Línea de CSFV

1

positivo positivo negativo

2

positivo positivo negativo

3

positivo positivo negativo

4

positivo positivo débil negativo

5 débil

positivo positivo negativo

6

positivo positivo negativo

7

Positivo positivo Negativo

8

Positivo positivo débil Negativo

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Positivo positivo Negativo

17 débil

Positivo positivo Negativo

18

Positivo positivo Negativo

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Positivo positivo Negativo

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Positivo positivo débil Negativo

10

Positivo positivo Negativo

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Negativo negativo Negativo

12

Negativo negativo Negativo

ID de muestra

Prueba de referencia Línea de ASFV Línea de CSFV

13

Negativo negativo Negativo

14

Negativo negativo Negativo

15

Negativo negativo Negativo

20

Negativo negativo Negativo

21

Negativo negativo Negativo

Tabla 3

Resultados cualitativos de la evaluación de la prueba de LFD en dúplex con muestras de infecciones __________________________experimentales por CSFV__________________________

ID de muestra

Prueba de referencia Línea de ASFV Línea de CSFV

1

positivo negativo positivo

2

positivo negativo positivo

3

positivo negativo positivo

4

positivo negativo positivo

5

positivo negativo positivo

6

positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

9

positivo negativo positivo

10

positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

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positivo negativo positivo

21

positivo negativo positivo débil

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positivo negativo positivo

23

positivo negativo positivo débil

26

positivo negativo positivo

28

positivo negativo positivo

5

Especificidad analítica: No se observó ninguna reacción cruzada entre ASFV y CSFV para ninguna de las muestras de suero investigadas, ya que cada coloide reconoce específicamente los anticuerpos presentes en la muestra. Las pruebas positivas mostraron buenas líneas, azules para las muestras positivas para CSFV y rojas para las muestras de suero de ASFV positivas. Por otro lado, se analizaron 5 muestras de suero positivas para otros Pestivirus (BVDV 10 y BDV) y no se observó ninguna reactividad cruzada para ninguno de ellos.

Además, con el fin de determinar la especificidad de diagnóstico, también se sometieron a prueba 50 muestras de suero de ASFV y CSFV áreas geográficas libres de virus. Todas las muestras mostraron un resultado negativo para el nuevo dispositivo de flujo lateral (LFD). A la vista de estos resultados, una prueba de inmunoensayo basada en las 15 tiras inmunocromatográficas proporcionadas por esta invención (prueba de LFD en dúplex) muestra una sensibilidad de diagnóstico superior al 99 % y un 100 % de especificidad de diagnóstico.

Los resultados muestran que la prueba desarrollada ahora basada en las tiras inmunocromatográficas proporcionadas por esta invención (prueba de LFD en dúplex) proporciona un método de inmunoensayo fiable para 20 una detección rápida de anticuerpos anti-ASFV y anti-CSFV.

Claims (14)

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   1. Una tira inmunocromatográfica que comprende

   (i) una almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de muestra recibe la muestra que va a analizarse,

   (ii) una almohadilla de conjugado (2), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de muestra (1), en la que dicha almohadilla de conjugado comprende

   - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina africana (ASFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-ASFV, y/o

   - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), en la que dicho al menos un reactivo detector comprende un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por el anticuerpo anti-CSFV, y

   - al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control,

   (iii) una almohadilla de detección de señal (3), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de conjugado (2), en la que dicha almohadilla de detección de señal comprende

   - al menos una zona de detección de señal, seleccionada del grupo que consiste en:

   • una zona de detección de señal anti-ASFV (6), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-ASFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-ASFV, y

   • una zona de detección de señal anti-CSFV (5), en la que se detecta la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-CSFV en la muestra, y en la que dicha zona de detección comprende al menos un reactivo de captura que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, en la que dicho al menos un reactivo de captura se selecciona del grupo que consiste en un antígeno, o un fragmento del mismo, reconocido por dicho anticuerpo anti-CSFV,

   en la que dicha zona de detección de señal anti-ASFV (6) y zona de detección de señal anti-CSFV (5) son zonas de detección de señal diferentes, y

   - una zona de control (7), que comprende un reactivo de captura de control que se une específicamente a un reactivo de control, en la que se detecta la presencia de un reactivo de control si se ha realizado correctamente la prueba, independientemente de la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti- CSFV en la muestra,

   y,

   (iv) una almohadilla absorbente (4), acoplada a, o que solapa parcialmente, la almohadilla de detección de señal (3)

   en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV comprende o comprenden la proteína VP72 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti- ASFV, y

   en la que el reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV comprende o comprenden la proteína E2 o un fragmento de la misma capaz de unirse a dicho anticuerpo anti- CSFV.
2. 2. Tira inmunocromatográfica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

   - la almohadilla de conjugado (2) en (ii) comprende al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV, al menos un reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-CSFV, y al menos un reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control, y

   - la zona de detección de señal de la almohadilla de detección de señal (3) en (iii) comprende una zona de detección anti-ASFV (5), una zona de detección anti-CSFV (6) y una zona de control (7).
3. 3. Tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho reactivo de

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   captura y/o reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-ASFV, dicho reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV y/o dicho reactivo de captura y/o el reactivo detector que se une específicamente a un reactivo de control están deshidratados o en forma seca.
4. 4. Tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-ASFV, dicho antígeno o fragmento del mismo del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV, y/o dicho reactivo detector de control, están unidos a una partícula, o están recubriendo total o parcialmente una partícula, en la que dicha partícula está comprendida por dicho reactivo detector, y en la que dicha partícula se selecciona del grupo que comprende partículas de látex coloreadas y partículas de oro coloidal coloreadas.
5. 5. Tira inmunocromatográfica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que dichas partículas están deshidratadas o en forma seca.
6. 6. Tira inmunocromatográfica de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:

   (i) un primer conjunto de partículas, coloreadas con un primer color, estando dichas partículas deshidratadas o en forma seca y siendo susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba y/o una disolución tampón, en la que dichas primeras partículas están unidas a, totalmente recubiertas por, o parcialmente recubiertas por, el antígeno, o fragmento del mismo, del reactivo detector que se une específicamente a un anticuerpo anti-ASFV,

   (ii) un segundo conjunto de partículas, coloreadas con un segundo color, en la que dicho segundo color es el mismo que, o diferente de, dicho primer color, preferentemente dicho segundo color es diferente de dicho primer color, estando dichas partículas deshidratadas o en forma seca y siendo susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba y/o una disolución tampón, en la que dichas segundas partículas están unidas a, totalmente recubiertas por, o parcialmente recubiertas por, el antígeno, o fragmento del mismo, del reactivo detector que se une específicamente al anticuerpo anti-CSFV, y

   (iii) un tercer conjunto de partículas, coloreadas con un tercer color, en la que dicho tercer color es el mismo que, o diferente de, dicho primer y/o segundo color, preferentemente dicho tercer color es diferente de dicho primer color y de dicho segundo color, siendo los colores primero y segundo también diferentes uno de otro, estando dichas partículas opcionalmente deshidratadas o en forma seca y siendo susceptibles de reconstituirse mediante contacto con la muestra de prueba, y/o una disolución tampón, en la que dichas terceras partículas están unidas a, totalmente recubiertas por, o parcialmente recubiertas por, un reactivo de control del reactivo detector de control.
7. 7. Tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el reactivo de control se selecciona del grupo que comprende biotina, avidina, estreptavidina, BSA, HSA, KLH y OVA, y el reactivo de captura que se une específicamente a dicho reactivo de control se selecciona del grupo que comprende anticuerpo anti-biotina, avidina, estreptavidina, anticuerpo anti-BSA, anticuerpo anti-HSA, anticuerpo anti-KLH y anticuerpo anti-OVA.
8. 8. Un kit que comprende al menos una tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la tira inmunocromatográfica está en un formato simple o en un formato múltiple.
10. 10. Uso de una tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de un kit de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, para detectar anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en una muestra, o para diagnosticar una infección provocada por ASFV y/o por CSFV, o para distinguir entre ASFV y CSFV como agente causante de una infección en un sujeto.
11. 11. Uso de una tira inmunocromatográfica o kit de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la detección de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV, y/o el diagnóstico de infección se realiza mediante un inmunoensayo basado en cromatografía de flujo lateral.
12. 12. Un método de inmunoensayo para detectar la presencia de anticuerpos anti-ASFV y/o anticuerpos anti-CSFV en un sujeto, en el que dicho método de inmunoensayo se realiza por medio de una tira inmunocromatográfica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho método

    (i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

    (ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha

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    tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, y

    (iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

    en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y/o la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto.
13. 13. Un método de inmunoensayo para distinguir entre el agente causante de una infección en un sujeto, en el que dicho agente causante se selecciona del grupo que consiste en ASFV, CSFV y combinaciones de los mismos, en el que dicho método de inmunoensayo se realiza por medio de una tira inmunocromatográfica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo dicho método

    (i) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con una almohadilla de muestra de la tira inmunocromatográfica,

    (ii) incubar en condiciones adecuadas para la formación de complejos en la almohadilla de conjugación de dicha tira inmunocromatográfica entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo detector que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV, y la migración de dichos complejos a la almohadilla de detección de señal de la tira inmunocromatográfica, y

    (iii) detectar en la zona de detección de señal de dicha tira inmunocromatográfica la formación de complejos entre el anticuerpo anti-ASFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV y/o los complejos entre el anticuerpo anti-CSFV-reactivo detector y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV,

    en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-ASFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-ASFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-ASFV en dicho sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-ASFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es ASFV; y/o

    en el que la detección de dichos complejos entre el anticuerpo anti-CSFV y un reactivo de captura que se une específicamente a dicho anticuerpo anti-CSFV es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-CSFV en dicho sujeto, y la presencia de dichos anticuerpos anti-CSFV es indicativa de que el agente causante de dicha infección es CSFV.
14. 14. Método de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende sangre completa, suero, plasma, jugos de carne y saliva.