CN110760006B - 一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗 - Google Patents

一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。该非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗的主要原料为非洲猪瘟融合蛋白，本发明的非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.3所示的序列。该非洲猪瘟融合蛋白具有免疫效果好等优点。

Description

一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)自2018年8月传入我国，现已严重影响了畜牧业的发展和人民的生活。该病从1921年被发现至今近百年，但目前全球尚无获批疫苗和特效药。随着现代生物学的发展，ASF疫苗研发取得了较大的研究进展。鉴于现有的研究，开发有效的灭活ASF疫苗似乎不太可能。现研发方向主要集中在减毒疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗以及核酸疫苗等。
减毒活疫苗具有能有效激活机体免疫系统的优点，主要分为传统减毒和重组减毒活疫苗，但这两类疫苗都存着毒力返强的可能性，均不是高安全性的首选；尤其是传统减毒活疫苗，如使用不当可能会衍生出新的强毒。核酸疫苗可产生持久性的免疫应答，但目前安全性及有效性无法保证。病毒活载体疫苗相对于减毒活疫苗虽较安全，但现阶段还缺乏对其长期安全性、有效性的研究，且活载体疫苗多采用细胞表达，成本高。
亚单位苗包括：传统方式是采用微生物培养后用物理和化学方法提取有效抗原成分制成疫苗；现代生物学方法是将病原的基因和蛋白进行分析后，利用基因工程技术将病原保护性抗原基因序列插入合适的表达质粒，高效稳定表达，生产抗原制成亚单位疫苗。亚单位疫苗是公认最安全的疫苗，但ASFV编码多达170种蛋白质，因此很难选择可诱导保护的抗原，目前已经研究报道了几种ASFV蛋白是ASFV的中和位点，并对这些蛋白质的免疫保护能力做了测试。但由于不能很好地刺激细胞免疫以及中和位点中多个空间构象难以保持正确形态的问题，效果均不理想。
非洲猪瘟疫苗研发的难点在于病毒基因组大，蛋白多，结构复杂，难大规模培养，传代易变异，病毒免疫逃逸机制不清，且毒株使用对研究硬件要求高。截至2019年9月1日，国内除农业部下属的哈尔滨兽医研究所有条件进行减毒、基因缺失苗的研发外，其他研究机构均缺少必要的研究硬件，亚单位苗的研发成为其他团队唯一可行的选择。而非洲猪瘟亚单位苗研发的难点在于如何有效的激活猪的细胞免疫、产生高水平的中和抗体并避免某些抗体加速病毒感染(ADE效应)。
文献《Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteinsp30,p54,and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection》J.G.Neilan等，《Virology》319(2004),P337-342)公开了用杆状病毒表达致病性ASFVPr4株的p30、p54、p72和p22蛋白免疫猪，在免疫组动物中检测到ASFV特异性中和抗体，但用104TCID50剂量的Pr4攻毒，免疫组和对照组的所有动物在7-10DPI之间死亡，表明针对上述蛋白的中和抗体不足以进行抗体介导的保护。
中国专利文献CN 103172749A公开了一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备，该非洲猪瘟蛋白工程疫苗通过利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白p72、p54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。该蛋白不含有目前主流研究公认的重要抗原P30，在免疫时，理论上存在保护抗体谱窄的问题。另外，重组蛋白对体液免疫刺激不足的问题也没有通过设计进行解决，存在一免后抗体效价较低的问题。
发明内容
本发明提供一种非洲猪瘟融合蛋白，该非洲猪瘟融合蛋白用于制作疫苗时，免疫效果更好，以解决现有技术中亚单位疫苗免疫效果差的问题。
本发明的非洲猪瘟融合蛋白采用如下技术方案：一种非洲猪瘟融合蛋白，所述非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。
优选的，所述非洲猪瘟蛋白还包括T细胞激活表位，所述T细胞免疫激活表位包括但不限于Np147-155(氨基酸序列为TYQRTRALV)。T细胞免疫激活表位有助于被免疫动物细胞免疫应答的产生，从而可解决亚单位疫苗诱导低或无细胞免疫应答的难题。
作为上述2项技术方案的进一步优选的方案，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括巨噬细胞靶向表位，所述巨噬细胞靶向表位包括但不限于Tuftsin(氨基酸序列为TKPR)。巨噬细胞靶向表位可提高免疫细胞抗原摄入效率，克服亚单位疫苗免疫原性差的缺点，诱导机体快速、高效产生中和抗体。
优选的，所述非洲猪瘟融合蛋白还包括柔性连接臂和/或纯化标签。
优选的，所述柔性连接臂的氨基酸序列选自KK或/和GGGSGGG；所述纯化标签的氨基酸序列为HHHHHH。
优选的，所述非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-7中任意一项所示。
本发明的第二目的在于提供上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白的制备方法，具体技术方案为：采用基因工程的方法，通过原核表达系统表达非洲猪瘟融合蛋白。本领域技术人员应当得知，除原核表达系统外，还可通过真核表达系统或化学合成法按照本发明的融合蛋白的氨基酸序列制备上述非洲猪瘟融合蛋白。
本发明的第三目的在于提供一种核酸，具体技术方案为：所述核酸编码如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白。根据本领域常识，本领域技术人员可根据上述所公开的非洲猪瘟中和表位融合蛋白的氨基酸序列得到编码相应的氨基酸序列的核苷酸序列，进而获取所述核酸分子。本发明在制备所述非洲猪瘟中和表位融合蛋白的过程中，即通过向生物工程技术公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)提供所述非洲猪瘟中和表位融合蛋白的氨基酸序列，由上海生工根据所采用的不同表达系统，对密码子进行优化，并合成了相应的核苷酸序列和重组质粒(载体)。
本发明的第四目的在于提供一种非洲猪瘟免疫系统基因工程疫苗，具体技术方案为所述疫苗的原料包括如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白。应当说明的是，除所述非洲猪瘟融合蛋白外，所述疫苗还可包括赋形剂，载体或稀释剂等成分。进一步的，任选地包含一种或多种合适的佐剂，例如：201佐剂(法国赛比克公司)、化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。
本发明的目的还在于提供了如上述任意一项所述的非洲猪瘟融合蛋白的用途，具体技术方案为：所述非洲猪瘟融合蛋白在制备非洲猪瘟单克隆抗体和非洲猪瘟检测试纸条或检测卡或试剂盒中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的非洲猪瘟融合蛋白利用p54、p72和p30蛋白的中和抗原表位精确定位，可有效防止抗体依赖(ADE)效应，且免疫效果好，首免后即可产生显著高于对照组(生理盐水)的体液和细胞免疫。其中，SEQ ID NO.3不仅是p30蛋白的中和抗原表位，还是细胞免疫表位，有助于增强本发明的非洲猪瘟融合蛋白的细胞免疫。
通过使所述非洲猪瘟融合蛋白在包括p54、p72和p30蛋白的中和抗原表位的基础上增加T细胞免疫激活表位，有助于增强细胞免疫应答，解决亚单位疫苗诱导低或无细胞免疫应答的难题。
通过使所述非洲猪瘟融合蛋白在包括p54、p72和p30蛋白的中和抗原表位的基础上(或在非洲猪瘟融合蛋白在包括p54、p72和p30蛋白的中和抗原表位以及T细胞免疫激活表位的基础上)增加巨噬细胞靶向表位，可提高免疫细胞抗原摄入效率，克服亚单位疫苗免疫原性差的缺点，诱导机体快速、高效产生中和抗体，提高机体的体液和细胞免疫效果。
本发明选用的柔性连接臂KK和/或GGGSGGG连接所述非洲猪瘟融合蛋白的不同组成片段，可起到保持各表位空间结构的作用。
本发明选用201佐剂与所述非洲猪瘟融合蛋白配制成疫苗，免疫效果好。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在没有其他明确说明的情况下，本发明所列出的所有氨基酸序列均按照N端-C端的顺序排列。
实施例1获取p72蛋白、p54蛋白和p30蛋白的抗原表位
1.1从p72蛋白、p54蛋白和p30蛋白的氨基酸序列中筛选合适的中和抗原表位，进而设计本发明的非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列。
p72蛋白的氨基酸序列为：MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPVGFEYNKVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRPIVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVNLAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNL FVKRVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST(SEQ IDNO.28)；
p54蛋白的氨基酸序列为：MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILIAIVVLVIIIIVLIYLFSSRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSL(SEQ ID NO.29)；
p30蛋白的氨基酸序列：MDFILNISMKMEVIFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFE QEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK(SEQ IDNO.30)。
发明人经无数次实验研究，筛选到了下述序列，当融合蛋白至少包括下述3个序列时，即可产生高效、快速的体液和细胞免疫：
选自p72蛋白的片段-SEQ ID NO.1：RRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHN LFVKRVRFSLIRVHKTQ(中和抗原表位)；
选自p54蛋白的片段-SEQ ID NO.2：MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTIL(中和抗原表位)；
选自p30蛋白的片段-SEQ ID NO.3：NETNECTSSFETLFEQEPSSE(既是细胞免疫表位，也是中和抗原表位)。
在上述氨基酸序列的基础上，融合蛋白的氨基酸序列还可包括T细胞免疫激活表位和/或巨噬细胞靶向肽结合表位以及选自p72蛋白、p54蛋白和p30蛋白中的任意一个或多个B细胞抗原表位。
1.2融合蛋白除包括上述片段外，还包括用于将融合蛋白的各个氨基酸片段连接起来的柔性连接臂、纯化标签等非抗原性片段(必要时还可包括接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等)。其中，柔性连接臂的氨基酸序列可为KK或GGGSGGG等，纯化标签可为HHHHHH等。
1.3举例说明本发明的非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列(对下述列出的非洲猪瘟融合蛋白的不同片段之间排列的顺序不做具体限定，不同片段之间的顺序可任意变换)：
1.3.1 p54+p72+p30:
MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILGGGSGGGRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELY INNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQGGGSGGGNETNECTSSFETLFEQEPSSEGGGSGGGHHHHHH(SEQ IDNO.4)；
1.3.2巨噬细胞靶向肽结合表位+p54+p72+p30+T细胞免疫激活表位：
TKPRKKMDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILGGGSGGGRRNIRFKPWFIPGVINEISL TNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQGGGSGGGNETNECTSSFETLFEQEPSSEKKTYQRTRALVGGGSGGGHHHHHH(SEQ ID NO.5)
1.3.3巨噬细胞靶向肽结合表位+p54+p72+p30：
TKPRKKMDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILGGGSGGGRRNIRFKPWFIPGVINEISL TNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQGGGSGGGNETNECTSSFETLFEQEPSSEGGGSGGGHHHHHH(SEQ ID NO.6)
1.3.4 p54+p72+p30+T细胞免疫激活表位：
MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILGGGSGGGRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELY INNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQGGGSGGGNETNECTSSFETLF EQEPSSEKKTYQRTRALVGGGSGGGHHHHHH(SEQ ID NO.7)
1.3.5在1.3.1-1.3.4任意一项所举例列出的氨基酸序列的基础上，选自p72蛋白的片段还可包括除SEQ ID NO.1之外的其他片段、选自p54蛋白的片段也可包括除SEQ IDNO.2之外的其他片段、选自p30蛋白的片段还可包括除SEQ ID NO.3之外的其他片段，示例如下：
TKPRKKMDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILGGGSGGG VSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDAGGGSGGGMEVIFKTDLRSSSQVVFHAG GGGSGGG RRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFS LIRVHKTQGGGSGGG LRQRNTYTHKDLENSLGGGSGGGNETNECTSSFETLFEQEPSSEKKTYQRTRALVGGGSGGGHHHHHH(SEQ ID NO.8)
具体的，
1.3.5.1针对细胞免疫表位还可包括以下序列：
(1)选自P72蛋白的下述氨基酸序列:
171-184:NAYRNLVYYCEYPG(SEQ ID NO.22)；
451-465:HDEKLMSALKWPIEY(SEQ ID NO.23)；
601-615:SRAREFYISWDTDYV(SEQ ID NO.24)；
(2)选自P54蛋白的序列:166-180:ENLRQRNTYTHKDLE(SEQ ID NO.25)；
(3)选自P30蛋白的序列:
156-170:DFNKVIRAHNFIQTI(SEQ ID NO.26)；
161-175:IRAHNFIQTIHGTPL(SEQ ID NO.27)；
1.3.5.2针对中和抗原表位还可以包括：
(1)p72蛋白中和表位肽：
SEQ ID NO.9：MASGGAFCLIANDGKADKI；
SEQ ID NO.10：NVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPVGFEYNKVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHD；
SEQ ID NO.11：HSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRPIVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERL；
SEQ ID NO.12：VSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDA；
(2)p30蛋白中和表位肽：
SEQ ID NO.13：MEVIFKTDLRSSSQVVFHAG；
SEQ ID NO.14：KSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTS；
SEQ ID NO.15：EQEPSSEVPKDS；
SEQ ID NO.16：QYGKAPDF；SEQ ID NO.17：TIYGTPLKEEEKEV；
(3)p54蛋白中和表位肽：
SEQ ID NO.18：MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMY；
SEQ ID NO.19：FSSRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPAT；
SEQ ID NO.20：NKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQT；
SEQ ID NO.21：LRQRNTYTHKDLENSL；
实施例2按照设计得到的融合蛋白的氨基酸序列采用原核表达系统表达、纯化融合蛋白
(1)原核表达质粒的构建：将本发明的非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司，由该公司根据所提供的氨基酸序列合成相应的编码上述非洲猪瘟融合蛋白的核苷酸序列，并将合成的核苷酸克隆到合适的质粒载体上。
(2)非洲猪瘟融合蛋白的表达：将合成的含有编码所述非洲猪瘟融合蛋白的质粒转入BL21(DE3)，构建表达工程菌，以1％的接种量接种至含100μg/mL Kan(卡那霉素)的100mL LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至A600为0.6时，加入0.05mmol/L IPTG，15℃，120r/min的条件下初步表达24h。表达结束后，4℃，6800×g离心10min，收集菌体，经10mL10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)洗涤2次，重悬菌体，0℃进行超声破碎。破碎液于4℃，10600×g离心30min，得到含有融合蛋白的上清。
(3)融合蛋白的分离纯化：将工程菌于最适条件下进行表达，收集菌体进行超声破碎，破碎液于4℃，10600×g离心30min，沉淀用8M尿素溶解后经0.45μm的滤膜过滤后，负载上Ni-NTA柱，用10倍柱体积的结合缓冲液(8M尿素，20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑，pH 8.0)冲洗柱子，收集流出液；用6倍柱体积的洗涤缓冲液(8M尿素，20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0)冲洗柱子，收集流出液；最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(8M尿素，20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH 8.0)对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至无蛋白检出。利用疏水介质对其进行纯化，除去内毒素，得到融合蛋白。具体方法是：疏水介质选用GE公司的Octyl Sepharose CL-4B介质，上样液及柱平衡液均选用含1.4M硫酸铵的8M尿素；洗脱液选用8M尿素，洗脱物即为低内毒素目的蛋白。将目的蛋白用含0.3M精氨酸、0.05M CaCl2的pH 7.2PBS透析过夜，离心上清则为最终纯化到的蛋白。
实施例3
3.1制备非洲猪瘟疫苗：取实施例2制备得到的非洲猪瘟融合蛋白溶液，稀释成0.2mg/ml，与201佐剂(法国赛比克公司)等体积混合，并经乳化器乳化25min。
3.2验证制备得到的非洲猪瘟疫苗的免疫效果
免疫方法：取30头猪分为6组进行免疫，采用耳后颈部肌肉注射；在左右双耳分别注射1mL，免疫两次(第1天、第15天)，每次间隔14天；第14、28天时前腔静脉采血，用于后续检测。
分组情况：30头猪随机平均分入6组。分组情况如下表1所示：
表1
组别 类型 所用候选物
1 实验组1 SEQ ID NO.4
2 实验组2 SEQ ID NO.5
3 实验组3 SEQ ID NO.6
4 实验组4 SEQ ID NO.7
5 对照组1 SEQ ID NO.8
6 对照组2 PBS+佐剂
3.2.1验证本发明的疫苗对体液免疫的影响
将制备得到的疫苗中所用到的非洲猪瘟融合蛋白(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8)分别用pH9.5、0.05mol/L CB稀释至0.1ug/ml，100ul/孔加入酶板反应板，4℃包被过夜，第二天，洗涤液(pH7.0 0.01mol/LPB 0.1mol/L NaCl 0.1％tween-20)洗板一次，按115ul/孔加入含5％小牛血清的pH7.0 0.01mol/LPB封板，4℃封闭过夜，第二天吸净封板液，37℃干燥1小时，加干燥剂封装于铝箔袋中，包被完毕。检测时在酶标反应孔中先加入50ul pH7.00.01mol/L PB 0.1mol/L NaCl的PBS，然后加入50ul待检血清，阴性、阳性对照，37℃温育20分钟，用洗涤液洗板五次，拍干，用pH7.0PBS 1:500稀释羊抗猪酶标抗体，100ul/孔加入反应板，37℃温育20分钟，洗板同前，加入显色剂A、B液各1滴，37℃显色10分钟，显色剂A含H2O2，显色剂B含TMB，显色完成后，每孔加入1滴2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm波长读取结果OD450nm>2.1×阴性对照OD平均值者为阳性，OD450nm<2.1×阴性对照平均值为阴性。检测结果见下表2：
表2
3.2.2验证本发明的疫苗对细胞免疫的影响
在第14天和第28天分别采集上述3组猪的外周血，分离外周血淋巴细胞，采用Biosource Europe的Swine IFN Cytoset ELISPOT检测试剂盒进行检测。
具体步骤如下：
A.准备工作和封闭预包被孔板
(1)在支架上安装需要数量的孔条，用无菌PBS(200μl/孔)洗4次。剩余的孔条放在封闭袋中室温保存。
(2)用包含10％血清(血清与悬浮细胞的血清相同)的培养基(200μl/孔)封闭。在室温下孵育至少30分钟。
B.在孔板中孵育细胞
(1)移去封闭培养基，加入包含有抗原等可能的刺激因素的细胞悬液(终体积100～150μl/孔)。推荐使用试剂盒中的阳性对照，使用终浓度为100ng/ml。
(2)孔板放在37℃、5％CO2的增湿培养箱中赋予12～48h。孵育的时候不要移动孔板，使用铝箔纸包裹孔板以避免水分蒸发。
C、检测斑点
(1)排空孔板移除细胞，用无菌PBS清洗5次，200μl/孔。
(2)用包含0.5％胎牛血清的无菌PBS按照1：200稀释一步反应检测试剂。每孔加100μl。室温孵育2h。
(3)200μl/孔PBS清洗孔板5次。
(4)用0.45μm的滤膜过滤准备使用的底物裂解液(BCIP/NBT-plus),每孔加100μl。显像直到斑点出现；超过15min的显影能引起背景染色。用自来水冲洗使染色反应终止。移去板缝里面的水(孔板下面的软塑料)并且清洗薄膜的背面。
(5)晾干孔板。在显微镜(X40)或者在ELISpot计数器上检查并计数斑点。
检测结果如下表3所示：
表3
注：检测细胞数为106细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省生物工程技术研究中心
郑州倍赛泰生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn
1 5 10 15
Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val
20 25 30
Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu
35 40 45
Ile Arg Val His Lys Thr Gln
50 55
<210> 2
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr
20 25 30
Thr Ile Leu
35
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln
1 5 10 15
Glu Pro Ser Ser Glu
20
<210> 4
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr
20 25 30
Thr Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Arg Asn Ile Arg Phe
35 40 45
Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn
50 55 60
Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn
65 70 75 80
Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr
85 90 95
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser
100 105 110
Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly His His His His His His
130 135
<210> 5
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Lys Pro Arg Lys Lys Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr
1 5 10 15
Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe
20 25 30
Phe Ser Thr His Met Tyr Thr Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn
50 55 60
Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu
85 90 95
Ile Arg Val His Lys Thr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Glu
100 105 110
Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro
115 120 125
Ser Ser Glu Lys Lys Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly His His His His His His
145 150 155
<210> 6
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Lys Pro Arg Lys Lys Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr
1 5 10 15
Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe
20 25 30
Phe Ser Thr His Met Tyr Thr Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn
50 55 60
Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val
65 70 75 80
Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu
85 90 95
Ile Arg Val His Lys Thr Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Glu
100 105 110
Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro
115 120 125
Ser Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly His His His His His His
130 135 140
<210> 7
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr
20 25 30
Thr Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Arg Asn Ile Arg Phe
35 40 45
Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn
50 55 60
Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn
65 70 75 80
Leu Phe Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr
85 90 95
Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser
100 105 110
Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Lys Lys Thr
115 120 125
Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly His
130 135 140
His His His His His
145
<210> 8
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Lys Pro Arg Lys Lys Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr
1 5 10 15
Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe
20 25 30
Phe Ser Thr His Met Tyr Thr Ile Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro Leu Leu Cys Asn Ile His Asp
50 55 60
Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp
65 70 75 80
Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn Pro Lys Phe Leu Ser Gln His
85 90 95
Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile
100 105 110
Thr Pro Ile Thr Asp Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Met Glu Val
115 120 125
Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro
145 150 155 160
Trp Phe Ile Pro Gly Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu
165 170 175
Leu Tyr Ile Asn Asn Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe
180 185 190
Val Lys Arg Val Arg Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys
210 215 220
Asp Leu Glu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asn Glu Thr
225 230 235 240
Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser
245 250 255
Ser Glu Lys Lys Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile
<210> 10
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr Leu Ser
1 5 10 15
Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe Lys Pro
20 25 30
Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His Thr Gly
35 40 45
Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln Tyr Gly
50 55 60
Asp Phe Phe His Asp
65
<210> 11
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met Gly
1 5 10 15
Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp Asp
20 25 30
Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro Phe
35 40 45
Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu Val
50 55 60
Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu
65 70
<210> 12
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro Leu Leu Cys Asn Ile His Asp
1 5 10 15
Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp
20 25 30
Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn Pro Lys Phe Leu Ser Gln His
35 40 45
Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile
50 55 60
Thr Pro Ile Thr Asp Ala
65 70
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val
1 5 10 15
Phe His Ala Gly
20
<210> 14
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala
1 5 10 15
Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr
20 25 30
Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu
35 40 45
Thr Asn Glu Cys Thr Ser
50
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val
1 5 10
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr
20 25 30
<210> 19
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile
1 5 10 15
Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro
20 25 30
Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly
35 40 45
Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr
50 55 60
<210> 20
<211> 49
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala
1 5 10 15
Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His
20 25 30
Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln
35 40 45
Thr
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asn Ala Tyr Arg Asn Leu Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile His Gly Thr Pro Leu
1 5 10 15
<210> 28
<211> 646
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Ala Ser Gly Gly Ala Phe Cys Leu Ile Ala Asn Asp Gly Lys Ala
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Leu Ala Gln Asp Leu Leu Asn Ser Arg Ile Ser Asn
20 25 30
Ile Lys Asn Val Asn Lys Ser Tyr Gly Lys Pro Asp Pro Glu Pro Thr
35 40 45
Leu Ser Gln Ile Glu Glu Thr His Leu Val His Phe Asn Ala His Phe
50 55 60
Lys Pro Tyr Val Pro Val Gly Phe Glu Tyr Asn Lys Val Arg Pro His
65 70 75 80
Thr Gly Thr Pro Thr Leu Gly Asn Lys Leu Thr Phe Gly Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Gly Asp Phe Phe His Asp Met Val Gly His His Ile Leu Gly Ala
100 105 110
Cys His Ser Ser Trp Gln Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met
115 120 125
Gly Ala His Gly Gln Leu Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp
130 135 140
Asp Asn Gln Thr Pro Leu Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro
145 150 155 160
Phe Gly Arg Pro Ile Val Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg Asn Leu
165 170 175
Val Tyr Tyr Cys Glu Tyr Pro Gly Glu Arg Leu Tyr Glu Asn Val Arg
180 185 190
Phe Asp Val Asn Gly Asn Ser Leu Asp Glu Tyr Ser Ser Asp Val Thr
195 200 205
Thr Leu Val Arg Lys Phe Cys Ile Pro Gly Asp Lys Met Thr Gly Tyr
210 215 220
Lys His Leu Val Gly Gln Glu Val Ser Val Glu Gly Thr Ser Gly Pro
225 230 235 240
Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys Pro
245 250 255
Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr Asn
260 265 270
Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile Gln
275 280 285
Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr Leu
290 295 300
Asp Ile Arg Arg Asn Val His Tyr Ser Cys Asn Gly Pro Gln Thr Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Tyr Gln Pro Pro Leu Ala Leu Trp Ile Lys Leu Arg Phe Trp
325 330 335
Phe Asn Glu Asn Val Asn Leu Ala Ile Pro Ser Val Ser Ile Pro Phe
340 345 350
Gly Glu Arg Phe Ile Thr Ile Lys Leu Ala Ser Gln Lys Asp Leu Val
355 360 365
Asn Glu Phe Pro Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly
370 375 380
Arg Pro Ser Arg Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro Gly
385 390 395 400
Val Ile Asn Glu Ile Ser Leu Thr Asn Asn Glu Leu Tyr Ile Asn Asn
405 410 415
Leu Phe Val Thr Pro Glu Ile His Asn Leu Phe Val Lys Arg Val Arg
420 425 430
Phe Ser Leu Ile Arg Val His Lys Thr Gln Val Thr His Thr Asn Asn
435 440 445
Asn His His Asp Glu Lys Leu Met Ser Ala Leu Lys Trp Pro Ile Glu
450 455 460
Tyr Met Phe Ile Gly Leu Lys Pro Thr Trp Asn Ile Ser Asp Gln Asn
465 470 475 480
Pro His Gln His Arg Asp Trp His Lys Phe Gly His Val Val Asn Ala
485 490 495
Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg Asp
500 505 510
Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro Val
515 520 525
Thr Tyr Pro Ile Thr Leu Pro Ile Ile Lys Asn Ile Ser Val Thr Ala
530 535 540
His Gly Ile Asn Leu Ile Asp Lys Phe Pro Ser Lys Phe Cys Ser Ser
545 550 555 560
Tyr Ile Pro Phe His Tyr Gly Gly Asn Ala Ile Lys Thr Pro Asp Asp
565 570 575
Pro Gly Ala Met Met Ile Thr Phe Ala Leu Lys Pro Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Gln Pro Ser Gly His Ile Asn Val Ser Arg Ala Arg Glu Phe Tyr Ile
595 600 605
Ser Trp Asp Thr Asp Tyr Val Gly Ser Ile Thr Thr Ala Asp Leu Val
610 615 620
Val Ser Ala Ser Ala Ile Asn Phe Leu Leu Leu Gln Asn Gly Ser Ala
625 630 635 640
Val Leu Arg Tyr Ser Thr
645
<210> 29
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr His Met Tyr
20 25 30
Thr Ile Leu Ile Ala Ile Val Val Leu Val Ile Ile Ile Ile Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Leu Phe Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu
50 55 60
Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu
65 70 75 80
Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala
85 90 95
Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala
100 105 110
Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met
115 120 125
Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala
130 135 140
His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser
145 150 155 160
Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr
165 170 175
His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu
180
<210> 30
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys
1 5 10 15
Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu
20 25 30
Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr
35 40 45
Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys
50 55 60
Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln
65 70 75 80
Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu
85 90 95
Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr
100 105 110
Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr
130 135 140
Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val
145 150 155 160
Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys

Claims (5)

1.一种非洲猪瘟融合蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白包括选自p72蛋白的片段、选自p54蛋白的片段和选自p30蛋白的片段；所述选自p72蛋白的片段至少包括如SEQ IDNO.1所示的序列，所述选自p54蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.2所示的序列，所述选自p30蛋白的片段至少包括如SEQ ID NO.3所示的序列；所述非洲猪瘟融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-7中任意一项所示。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白的制备方法，其特征在于，采用基因工程的方法，通过原核表达系统表达非洲猪瘟融合蛋白。
3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白。
4.一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗，其特征在于，所述疫苗的原料包括如权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白。
5.根据权利要求1所述的非洲猪瘟融合蛋白的用途，其特征在于，所述非洲猪瘟融合蛋白在制备非洲猪瘟单克隆抗体和非洲猪瘟检测试纸条或检测卡或试剂盒中的应用。
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