CN113150171B

CN113150171B - 含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用

Info

Publication number: CN113150171B
Application number: CN202110446849.1A
Authority: CN
Inventors: 常惠芸; 张光磊; 邵军军; 刘伟; 常艳燕
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113150171A

Abstract

本发明涉及含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用，属于生物技术制药领域，所述重组蛋白由非洲猪瘟病毒p30和mp54(修饰的p54)与铜绿假单胞菌的外膜蛋白I融合而成。所述的重组蛋白具有通式：OprI‑(Linker)n‑p30‑(Linker)n‑mp54。其中，所述连接肽Linker序列选自GGGGS或GGSGG，优选为GGGGS；n为1、2、3或4，优选为3。实验证明，该重组蛋白能够显著促进树突状细胞的成熟与分化及细胞因子的分泌。利用本发明重组蛋白制备的疫苗免疫动物可激发机体产生产生高水平的中和抗体以及细胞免疫应答，可用于非洲猪瘟病毒诊断试剂、预防或治疗性药物的制备。

Description

含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用。

背景技术

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swinefever virus, ASFV）引起的一种猪的急性烈性传染病，死亡率可达100%，目前尚无商品化的疫苗。该病于2018年8月传入我国，并迅速蔓延至我国三十多个省份和地区，造成直接经济损失达数百余亿元。目前ASF在我国仍呈现流行的态势，对我国的养猪业构成严重威胁，急需安全有效的疫苗用于防控该病。非洲猪瘟疫苗早期的研究经验表明：（1）灭活非洲猪瘟病毒作为疫苗不能诱导免疫保护；（2）减毒性活疫苗虽能诱导较好的免疫保护，但生物安全性较差。（3）多种非洲猪瘟病毒亚单位抗原能诱导部分免疫保护，且具有良好的生物安全性，为开发安全有效的非洲猪瘟疫苗提供了可能。随着对非洲猪瘟病毒保护性免疫应答研究的深入，非洲猪瘟亚单位疫苗的研究也已经取得了很大的进步，其中能够诱导高水平中和抗体和特异性细胞免疫的亚单位疫苗成为最具有发展前景的疫苗之一。

亚单位抗原由于成分单一，其免疫原性较差，从而诱导的免疫应答常不足以完全抵御病原体的入侵。一个设计合理的亚单位疫苗主要包括三种成分：亚单位抗原，递呈系统，以及佐剂。对于亚单位疫苗，由于传统佐剂缺乏特异性免疫的增强作用，因此提出了分子内佐剂的疫苗设计理念。因此，在亚单位免疫原中构建一种既具有靶向功能又具有传统佐剂免疫增强作用的内置佐剂，从而通过刺激具有抗原提呈作用的免疫细胞，提高亚单位免疫原诱导保护性体液免疫和细胞免疫的能力。OprI作为铜绿假单胞菌的一部分，其强大的免疫刺激能力受到密切关注，其可以通过TLR-2依赖途径刺激刺激树突状细胞的活化，促进抗原提呈分子（例如MHC分子）和共同刺激分子（例如CD40、CD80、CD86）的表达，以及炎性细胞因子(TNF-α和IL-12p70)的分泌。OprI作为一种有效的免疫佐剂，能够诱导强烈的混合型Th1/Th2免疫应答，在免疫调节和增强免疫应答的研究中已发挥重要作用。

发明内容

针对现有非洲猪瘟病毒亚单位疫苗免疫性差的问题，本发明的目的一在于提供一种重组蛋白OPM，目的二在于提供所述重组蛋白编码基因的表达载体，目的三在于提供所述重组蛋白在制备用于诊断或预防非洲猪瘟病毒的药物或试剂盒中的应用。所述重组蛋白OPM是将非洲猪瘟病毒亚单位抗原p30和mp54(修饰的p54)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI串联形成，能够促进树突状细胞成熟和分化，激发机体产生更高水平的识别p30和p54的中和抗体和细胞免疫，有利于非洲猪瘟病毒感染的预防、诊断和治疗。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种重组蛋白，所述重组蛋白由非洲猪瘟病毒亚单位抗原p30、mp54和铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI通过连接肽Linker融合而成，所述重组蛋白具有以下通式：OprI-(Linker)n -p30-(Linker)n-mp54；所述连接肽序列选自GGGGS、GGSGG中的一个，优选为GGGGS；n为1、2、3或4，优选为3。

在根据本发明的一个实施方案中，所述铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI的的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；所述非洲猪瘟病毒亚单位抗原p30的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述非洲猪瘟病毒亚单位抗原mp54的是将非洲猪瘟病毒亚单位抗原p54的跨膜区His30-Phe52替换连接肽(GGGGS)3而得到，其序列为SEQ ID NO：6。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；优选地，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由骨架质粒可修饰地连接编码上述重组蛋白的核苷酸序列形成；优选地，所述骨架质粒选自pET系列载体，更优选为pET-30a(+)。

本发明还提供了上述重组蛋白在制备用于诊断或预防非洲猪瘟病毒的药物方面的应用。优选地，所述药物为用于预防或治疗非洲猪瘟病毒的亚单位疫苗。

本发明此外还提供上述重组蛋白在制备用于诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂盒中的应用。

采用上述技术方案，本发明具有如下的优点：

OPM表达质粒可以在原核表达系统（大肠杆菌）中诱导表达；选择pET载体系列时，OPM以融合蛋白形式表达；表达载体的C端接有6个组氨酸（His），所表达的重组融合蛋白中就含有一个His标签，此标签的分子量仅有0.84kDa，对融合蛋白的功能没有影响，最大限度保持了重组蛋白的免疫原性；而且使得纯化步骤简单，纯化出来的OPM纯度大于90％；OPM在体外能够刺激DC细胞的成熟和分化，以及细胞因子的分泌。OPM能够在动物体内诱导产生高水平的特异性抗体和细胞免疫。

利用本发明OPM制备的亚单位疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度IgG抗体。并经中和试验证实，所述基因工程重组蛋白疫苗诱导产生的抗体对非洲猪瘟病毒具有中和作用。为进一步的联合疫苗和多亚单位融合疫苗研究打下基础，同时对诊断试剂盒的研制及应用具有重要的作用。

附图说明

图1是重组质粒pET-30a(+)-OPM的双酶切鉴定结果图；其中，泳道1： pET-30a(+)-OPM，泳道2： pET-30a(+)-OPM NdeI-XhoI双酶切；泳道M： DNA分子量标准(Marker)；

图2是 OPM表达及纯化的SDS-PAGE检测结果图；泳道M：蛋白分子量标准(Marker)；泳道1：OPM诱导前；泳道2：OPM诱导后；泳道3：OPM超声上清；泳道4：OPM超声沉淀；泳道5：OPM包涵体溶解；泳道6：纯化的OPM；

图3是体外刺激树突状细胞后TNFα水平的检测图；

图4是各免疫组血清样品p30特异性IgG的动态变化图；

图5是各免疫组血清样品p54特异性IgG的动态变化图；

图6是各免疫组脾淋巴细胞经抗原刺激后细胞因子IL-2水平图；

图7是各免疫组脾淋巴细胞经抗原刺激后细胞因子IFN-γ水平图；

图8是各免疫组脾淋巴细胞经抗原刺激后细胞因子TNF-α水平图；

图9是各免疫组脾淋巴细胞经抗原刺激后增殖水平图；

图10是各免疫组血清样品（1:5稀释）在体外对非洲猪瘟病毒的中和率对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1 重组质粒的构建与鉴定

1 . 根据GenBank现有非洲猪瘟病毒ASFV-SY18 (登录号：MH766894.1)的序列，选取p30和p54的氨基酸序列，其中p54的跨膜区His30-Phe52替换连接肽(GGGGS)₃得到mP54，将mP54通过连接肽(GGGGS)₃依次与p30的C端以及OprI序列（登录号：X13748.1）的C端相连，并将该串联的基因序列送南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，直接合成到pET-30a(+)表达载体上，两端的酶切位点是NdeI和XhoI，获得重组表达质粒pET-30a(+)-OPM。

合成的重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2；编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；在所述的重组蛋白含有一种非洲猪瘟疫苗新型分子内佐剂，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示，编码所述分子内佐剂的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示；非洲猪瘟病毒亚单位抗原p30的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；所述非洲猪瘟病毒亚单位抗原mp54的是将非洲猪瘟病毒亚单位抗原p54的跨膜区His30-Phe52替换连接肽(GGGGS)3而得到，其序列为SEQ ID NO：6。

2 .重组质粒的转化

从-80℃冰箱取3支大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS感受态细胞(上海生工)，第一管加入pET-30a(+)质粒(Invitrogen)，作阳性对照；第二管加入1µL pET-30a(+)-OPM质粒；第三管不加外源DNA，作阴性对照。冰浴30min，42℃金属浴中热击60s，迅速冰浴2min。加入500µLLB无抗性培养基，混匀，置于37℃摇床中220rpm振摇45min。各取100µL涂布于卡那抗性的LB平板上，平板倒置于37℃培养箱中培养24h。阴性对照平板没有菌落出现；阳性对照平板长满菌落，说明感受态细胞状态良好，结果可信。挑取pET-30a(+)-OPM质粒转化平板上的单菌落，接种于卡那抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

3.双酶切鉴定

取37℃过夜培养的阳性菌液，根据说明书的步骤，采用快速质粒小提试剂盒(Omega Bio-Tek)提取阳性克隆的质粒。通过NdeI(NEB公司)和Xhol(NEB公司)进行酶切，37℃水浴2h。体系如下：

灌制含GoldViewⅠ的0.8％琼脂糖凝胶，将上述酶切反应体系中各加入2.5µL 5×Loading buffer，经琼脂糖凝胶130V电泳20min后，UV扫描仪观察酶切的结果。结果过发现阳性克隆的质粒被切成2个片段，大片段约5200bp为表达载体pET-30a(+)部分，小片段约1400bp，为插入的编码OPM的片段(图1)。

实施例2 OPM的表达与纯化

取10mL含阳性质粒的菌液转接到1000mL的卡那LB培养基中，继续37℃ 220rmp摇床培养，待菌液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.4mM，接着37℃220rmp摇床培养6h，8000rmp离心7min收集菌体，收集的菌体用PBS洗一遍后，加入50mLbinding buffer（300 mM NaCl, 20 mM NaH₂PO₄, 5 mM咪唑; pH 8.0）重悬菌体，将菌体超声裂解30min，经12000rmp离心20min分别收集包涵体和上清，并进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示OPM表达形式为包涵体形式。将包涵体在含6M盐酸胍的binding buffer中溶解，并按照Ni-excel亲和层析纯化柱（GE）说明书纯化重组蛋白OPM，纯化后的蛋白依次在含6M，4M，2M，0M的透析液(20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 2 mM β-mercaptoethanol, 0.4%arginine, 10% glycerol, pH 7.5)中复性重组蛋白。透析液每隔8h换一次液，直到透析至尿素浓度降为0M，收集复性后的重组蛋白。OPM经SDS-PAGE电泳检测大小约63kDa，与预期相符，见图2。经Western blotting验证能与抗ASFV猪血清发生免疫反应，说明OPM具有生物活性。

实施例3树突状细胞（DCs）体外刺激试验

选择SPF 级6～8 周龄C57BL/6小鼠，从小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓原代细胞制成单细胞悬液，离心收集的细胞经红细胞裂解和PBS洗涤后重悬至含20ng/mL rmGM-CSF、10ng/mL rmIL-4和10% FBS的RPMI1640中，调整细胞密度为1×10⁶/mL，置于37度5% CO₂中培养，每2天将1/2体积更换为新鲜培养基，并补充20ng/mL rmGM-CSF和10ng/mL rmIL-4。细胞培养至第6 天分化为骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）。收集BMDCs 重悬于含10% FBS的RPMI1640中，调整细胞密度为1×10⁶/mL，分别加入1µg/mL、5µg/mL和10µg/mL的OPM 37度孵育24h，同时设置不加刺激物和加入LPS（0.1µg/mL）的组为阴性和阳性对照。收集细胞培养上清，采用小鼠TNF-α检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）检测上清中TNF-α的含量，见图3。结果显示，不同浓度的OPM均能显著刺激DC细胞释放TNF-α，促进DC的成熟和分化。

实施例4疫苗制备及动物免疫：

1、疫苗的制备

实施例2得到的OPM经Bradford定量试剂盒定量后稀释成200µg/mL。取2份等体积（v）稀释好的重组蛋白，其中1份逐滴加入1倍体积的 Al(OH)₃佐剂（Thermo FisherScientific）搅拌吸附30min，另一份加入1倍体积 PBS混匀。设置Al(OH)₃佐剂加入等体积PBS混匀作为阴性对照，PBS作为空白对照。

、动物免疫

将32只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为4组（8只/每组），将制备好的疫苗以皮下免疫的方式，按照下列表中的免疫分组以及免疫剂量，初次免疫1次，14天后加强免疫1次。

实施例5抗体检测

第1次免疫后第7、21和28天，对所有免疫的BALB/C小鼠进行尾静脉采血，分离的血清用于ELISA检测小鼠免疫后p30 和p54特异性IgG抗体应答水平。

1)用包被缓冲液（碳酸盐缓冲液 pH=9.6）将纯化的重组p30 和mp54（单独表达并纯化）分别稀释为0.125µg/mL和0.5µg/mL；

2)包被：将稀释好的重组蛋白加入酶标板（Costar），每孔100μL，4℃过夜；

3)封闭：从4℃冰箱中取出酶标板，弃掉包被液并拍干，向酶标板中加入封闭液（5%脱脂奶粉）100μL/孔， 37℃孵育2小时；

4)孵一抗：弃掉酶标板中的封闭液，用PBST洗板5次并排干，将所有免疫小鼠血清按1∶100稀释后分别加入酶标板中，每孔100µL，37℃孵育1小时；

5) 孵二抗：弃掉酶标板中的液体，用PBST洗板5次后排干。向酶标板中加入1∶10000 稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG（Abcam），每孔100µL，37℃孵育1小时；

7)显色：弃掉酶标板中的二抗，用PBST洗板5次并排干，向酶标板中加入底物显色液(TMB)100μL/孔，室温避光反应10min；

9)检测：向酶标板中加入终止液(2M H₂SO₄)，每孔100μL，立即置于酶标仪上测定波长450nm处的OD值；

结果：如图4-5所示，OPM单独免疫组和OPM+Al(OH)₃组均诱导产生高水平的p30和p54特异性IgG抗体，而且在同一时间点两组所诱导的p30或p54特异性IgG抗体均无显著性差异（ p > 0.05）；说明本发明构建的重组蛋白OPM具有良好的免疫原性，即使在无佐剂辅助的情况下也能诱导高水平的体液免疫应答，这得益于其中分子内佐剂OprI的免疫增强作用。

实施例6细胞免疫评价

1）首次免疫28d后，从每组随机选取3只小鼠进行安乐死，在75%酒精中浸泡约5min；

2)无菌操作下切开小鼠皮肤及腹膜，取出脾脏；

3) 用灭菌的剪刀将置于尼龙网上的脾脏剪碎，再用5ml注射器活塞轻轻研磨，在研磨过程中脾脏始终浸润在小鼠淋巴细胞分离液中（达科为生物技术股份有限公司），得到脾细胞悬液;

4)将脾细胞悬液转入15mL离心管中，沿管壁轻轻加入1mL RPMI1640培养基覆盖到液面上层，800g离心30min；

5)弃上清，用10mL PBS重悬细胞，250g离心10min；

6)弃上清，加入含10% FBS的RPMI1640培养基重悬细胞并调整细胞密度至1×10⁶/mL或5×10⁵/mL；

7)细胞因子检测：将密度为1×10⁶/mL的细胞接种到12孔板中，每孔1mL，补加纯化的p30和mp54至浓度均为5mg/mL，37度 5% CO₂培养72h，收集上清，采用小鼠细胞因子检测试剂盒（欣博盛生物科技有限公司）检测上清中IL-2，IFN-γ和TNF-α的含量。

8）淋巴细胞增值检测：将密度为5×10⁵/mL的细胞接种到96孔板中，每孔80µL，补加纯化的p30和mp54至浓度均为2.5mg/mL，将每孔体积补足至100uL，同时将培养基，细胞不加刺激物和细胞+5mg/mL ConA的孔分别设为空白对照，阴性对照和阳性对照。37度 5% CO₂培养72h，每孔加入10µL CCK8反应液（APE×BIO），3.5h后检测OD₄₅₀，计算刺激指数SI=(实验组OD₄₅₀-空白对照OD₄₅₀) /(阴性对照OD₄₅₀-空白对照OD₄₅₀)。

结果：如图6-8所示，OPM单独免疫组和OPM+Al(OH)₃组都产生了高水平的IL-2，IFN-γ和TNF-α，而且两组所产生的同一种细胞因子无显著性差异（ p > 0.05）；在淋巴细胞增殖实验中，如图9所示，OPM单独免疫组和OPM+Al(OH)₃的脾淋巴细胞在刺激后增殖水平都显著增加，说明本发明构建的重组蛋白OPM具有良好的刺激细胞免疫的能力，在无佐剂的情况下也能诱导高水平的细胞免疫应答。

实施例7病毒中和试验

将首次免疫28d后采集的小鼠血清用灭菌的PBS进行1：5稀释，置于56度孵育30min灭活补体。将100 PFU ASFV-CN/SC/2019（兰州兽医研究所）与灭活的小鼠血清混合后置于37度孵箱中过夜，同时将冻存的肺泡巨噬细胞复苏到24孔板中。弃掉细胞培养板中的液体，用无菌PBS清洗2遍。将孵育好的病毒混合接种至肺泡巨噬细胞单层中，每孔200uL，37度孵育1h，细胞培养板每隔10min摇动1次。将提前配制好的含0.8%琼脂和10% FBS的RPMI1640培养基缓慢加入各孔，待凝固后置于37度5% CO₂孵箱培养5天。每孔加入0.5 mL 2%结晶紫（含5%甲醛）,置于通风橱内过夜。用流水缓慢冲洗后以去除琼脂层，将细胞培养板晾干后统计各孔形成蚀斑的个数，计算病毒中和率：病毒中和率（%）=100-100*免疫血清孵育后蚀斑形成数量/未免疫血清孵育后蚀斑形成数量。

结果：如图10所示，OPM单独免疫组和OPM+Al(OH)₃组免疫血清对非洲猪瘟病毒的体外中和率均达到87%以上，且二者无显著性差异。说明本发明构建的重组蛋白OPM能够诱导良好的中和抗体反应，具有单独作为非洲猪瘟亚单位疫苗或治疗性药物的潜力。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 含分子内佐剂的非洲猪瘟病毒重组蛋白、表达载体及应用

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

catatgaaca acgttctgaa atttagcgcg ctggcgctgg cggcggtgct ggcgaccggt 60

tgcagcagcc acagcaagga aaccgaggcg cgtctgaccg cgaccgagga tgcggcggcg 120

cgtgcgcaag cgcgtgcgga cgaagcgtat cgtaaagcgg atgaagcgct gggtgcggcg 180

cagaaagcgc agcaaaccgc ggatgaagcg aacgagcgtg cgctgcgtat gctggaaaaa 240

gcgagccgta aaggtggcgg tggcagcggt ggcggtggca gcggtggcgg tggcagcatg 300

gacttcattc tgaacatcag catgaagatg gaagttatct tcaagaccga cctgcgtagc 360

agcagccaag tggttttcca cgcgggtagc ctgtacaact ggtttagcgt tgagatcatt 420

aacagcggcc gtattgtgac caccgcgatc aaaaccctgc tgagcaccgt gaagtatgac 480

attgttaaaa gcgcgcgtat ctacgcgggt cagggctata ccgaacacca ggcgcaagag 540

gaatggaaca tgattctgca cgtgctgttc gaggaagaga ccgagagcag cgcgagcagc 600

gaaaacatcc acgagaagaa cgataacgaa accaacgagt gcaccagcag cttcgaaacc 660

ctgtttgaac aagagccgag cagcgaggtt ccgaaggaca gcaaactgta catgctggcg 720

cagaaaaccg tgcaacacat tgaacagtat ggcaaggcgc cggatttcaa caaagttatc 780

cgtgcgcaca actttattca gaccatctac ggcaccccgc tgaaggaaga ggaaaaagag 840

gtggttcgtc tgatggtgat caagctgctg aagaaaaagg gtggcggtgg cagcggtggc 900

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ccggtgtatc cgcgccatta tggcgaatgt ctgagtccgg tgaccacccc gagctttttt 1020

agcaccggtg gcggtggcag cggtggcggt ggcagcggtg gcggtggcag cagcagccgc 1080

aaaaaaaaag cagccgcaat tgaagaagaa gatattcagt ttatcaaccc gtatcaggat 1140

cagcagtggg ttgaagtgac cccgcagccg ggtaccagta aaccggcagg tgcaaccacc 1200

gcaagtgtgg gtaaaccggt gaccggccgt ccggcaacca atcgtccggc caccaataaa 1260

ccggttaccg ataatccggt taccgaccgc ctggtgatgg ccaccggtgg tccggcagca 1320

gcaccggcag cagctagtgc accggcacat ccggcagaac cgtataccac cgtgaccacc 1380

cagaataccg ccagtcagac catgagcgcc attgaaaatc tgcgtcagcg taatacctat 1440

acccataaag atctggaaaa tagtctgctc gag 1473

<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 2

Met Asn Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Thr Gly Cys Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr

20 25 30

Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala

35 40 45

Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln

50 55 60

Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala

65 70 75 80

Ser Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Ser Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile

100 105 110

Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly

115 120 125

Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile

130 135 140

Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile

145 150 155 160

Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln

165 170 175

Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu

180 185 190

Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn

195 200 205

Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu

210 215 220

Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln

225 230 235 240

Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn

245 250 255

Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro

260 265 270

Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu

275 280 285

Leu Lys Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

290 295 300

Gly Gly Ser Met Asp Ser Glu Phe Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro

305 310 315 320

Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro

325 330 335

Ser Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

340 345 350

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Arg Lys Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu

355 360 365

Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu

370 375 380

Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala

385 390 395 400

Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala

405 410 415

Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met

420 425 430

Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala

435 440 445

His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser

450 455 460

Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr

465 470 475 480

His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu Leu Glu

485 490

<210> 3

<211> 249

<212> DNA

<213> 铜绿假单胞菌

<400> 3

atgaacaacg ttctgaaatt tagcgcgctg gcgctggcgg cggtgctggc gaccggttgc 60

agcagccaca gcaaggaaac cgaggcgcgt ctgaccgcga ccgaggatgc ggcggcgcgt 120

gcgcaagcgc gtgcggacga agcgtatcgt aaagcggatg aagcgctggg tgcggcgcag 180

aaagcgcagc aaaccgcgga tgaagcgaac gagcgtgcgc tgcgtatgct ggaaaaagcg 240

agccgtaaa 249

<210> 4

<211> 83

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌

<400> 4

Met Asn Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Thr Gly Cys Ser Ser His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr

20 25 30

Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala

35 40 45

Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln

50 55 60

Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala

65 70 75 80

Ser Arg Lys

<210> 5

<211> 194

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒ASFV-SY18

<400> 5

Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys

1 5 10 15

Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu

20 25 30

Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr

35 40 45

Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys

50 55 60

Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln

65 70 75 80

Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu

85 90 95

Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr

100 105 110

Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser

115 120 125

Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr

130 135 140

Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val

145 150 155 160

Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met Val Ile Lys Leu Leu Lys

180 185 190

Lys Lys

<210> 6

<211> 176

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒ASFV-SY18

<400> 6

Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Arg Lys

35 40 45

Lys Lys Ala Ala Ala Ile Glu Glu Glu Asp Ile Gln Phe Ile Asn Pro

50 55 60

Tyr Gln Asp Gln Gln Trp Val Glu Val Thr Pro Gln Pro Gly Thr Ser

65 70 75 80

Lys Pro Ala Gly Ala Thr Thr Ala Ser Val Gly Lys Pro Val Thr Gly

85 90 95

Arg Pro Ala Thr Asn Arg Pro Ala Thr Asn Lys Pro Val Thr Asp Asn

100 105 110

Pro Val Thr Asp Arg Leu Val Met Ala Thr Gly Gly Pro Ala Ala Ala

115 120 125

Pro Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala His Pro Ala Glu Pro Tyr Thr Thr

130 135 140

Val Thr Thr Gln Asn Thr Ala Ser Gln Thr Met Ser Ala Ile Glu Asn

145 150 155 160

Leu Arg Gln Arg Asn Thr Tyr Thr His Lys Asp Leu Glu Asn Ser Leu

165 170 175

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白由非洲猪瘟病毒亚单位抗原p30、mp54和铜绿假单胞菌外膜脂蛋白OprI通过连接肽Linker融合而成，所述重组蛋白具有以下通式：OprI-(Linker)n -p30-(Linker)n-mp54；所述连接肽序列选自GGGGS、GGSGG中的一个，n为1、2、3或4；

所述OprI的氨基酸序列为SEQ ID NO：4；所述p30的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；mp54是将非洲猪瘟病毒亚单位抗原p54的跨膜区His30-Phe52替换连接肽(GGGGS)₃而得到，其序列为SEQ ID NO：6。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述连接肽序列为GGGGS，所述n为3。

3.一种重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，编码所述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由骨架质粒及与其可修饰地连接编码权利要求1~3任意一种所述的重组蛋白的核苷酸序列形成。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述骨架质粒选自pET系列载体或pQE系列载体。

6.如权利要求1~3中任一项所述的重组蛋白在制备用于预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为用于预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的亚单位疫苗。

8.如权利要求1~3中任一项所述的重组蛋白在制备用于诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂盒中的应用。